DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
BABINSZKY GERGELY
KESZTHELY 2011
1
2
PANNON EGYETEM GEORGIKON MEZİGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR Növénytudományi és Biotechnológia Tanszék
Állat-és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskola Iskolavezetı: Dr. habil. Anda Angéla Egyetemi tanár, az MTA doktora
Témavezetı: Dr. Csitári Gábor Egyetemi docens
Madár-botulizmus vizsgálata a Kis-Balaton területén
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
Készítette: Babinszky Gergely
Keszthely 2011
3
Madár-botulizmus vizsgálata a Kis-Balaton területén
Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében
Írta: Babinszky Gergely Készült a Pannon Egyetem Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskolája keretében Témavezetı: Dr. Csitári Gábor Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el,
Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen / nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: …........................ …................. igen / nem ………………………. (aláírás) ***Bíráló neve: …........................ ….................. igen / nem ………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el Veszprém/Keszthely,
…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke
A doktori (PhD) oklevél minısítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke
*** esetleges
4
TARTALOMJEGYZÉK KIVONAT............................................................................................................................. 7 ABSTRACT .......................................................................................................................... 8 INHALTSANGABE............................................................................................................. 9 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................................... 10 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŐZÉSEK ........................................................................... 12 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ......................................................................................... 15 2.1. A baktérium története ............................................................................................... 15 2.2. A baktérium rendszertani besorolása ...................................................................... 15 2.3. A baktérium morfológiája, törzseinek csoportosítása, biokémiai jellemzıi ........... 16 2.4. A toxin jellemzése ..................................................................................................... 21 2.4.1. A botulinum toxin................................................................................................ 21 2.4.2. A C2 és C3 toxinok............................................................................................... 25 2.4.3. A botulinum toxinnal szembeni természetes immunitás...................................... 27 2.5. Madár-botulizmus..................................................................................................... 28 2.5.1. Történet, elıfordulás .......................................................................................... 28 2.5.2. Kóroktan, járványtan.......................................................................................... 29 2.5.3. Kórfejlıdés, tünetek ............................................................................................ 30 2.5.4. Kórbonctan, kórjelzés......................................................................................... 31 2.5.5. Gyógykezelés, megelızés .................................................................................... 31 2.5.6. Humán kórtani jelentıség................................................................................... 32 2.5.7. Környezeti faktorok szerepe a madár-botulizmus megbetegedésekben.............. 32 2.5.7.1. Spórák .......................................................................................................... 34 2.5.7.2. A C típusú Clostridium botulinum szaporodásának környezeti feltételei .... 37 2.5.7.2.1. Levegı- és vízhımérséklet..................................................................... 37 2.5.7.2.2. Szervesanyag-tartalom.......................................................................... 39 2.5.7.2.3. pH, redoxpotenciál, sótartalom (vezetıképesség), oldott oxigén-szint. 39 2.5.7.2.4. Gerinctelen biomassza .......................................................................... 41 2.5.7.2.5. Egyéb mikroorganizmusok gátló hatása ............................................... 42 2.5.7.3. Fágok ........................................................................................................... 42 2.5.7.4. A lehetséges áldozat toxinfelvétele .............................................................. 45 2.5.7.5. A baktériumok és a toxin szétterjesztése ...................................................... 46 2.5.7.6. Egyéb faktorok ............................................................................................. 49 2.5.8. Madár-botulizmus Magyarországon .................................................................. 50 2.5.8.1. Madár-botulizmus a Kis-Balatonon............................................................. 53 2.6. A baktérium illetve toxinja jelenlétének kimutatása ............................................... 58 2.6.1. Egéroltás (mouse bioassay)................................................................................ 58 2.6.2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ................................................. 59 2.6.3. Molekuláris biológiai technikák ......................................................................... 59 2.6.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................................. 59 2.6.3.2. Ribotipizálás ................................................................................................ 63 2.6.4. Biokémiai tesztek ................................................................................................ 63 2.6.4.1. API ............................................................................................................... 64 2.6.4.2. RapID ANA II............................................................................................... 64 3. ANYAG ÉS MÓDSZER ................................................................................................ 65 3.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata............................................................ 65 3.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval......................................................................................................................... 67
5
3.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján............................ 67 3.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján .................. 69 3.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján....... 69 3.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók......................................................... 71 3.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel ..................................................................................................................... 72 4. EREDMÉNYEK............................................................................................................. 73 4.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata............................................................ 73 4.1.1. Vízminıségi adatok............................................................................................. 73 4.1.2. Meteorológiai adatok ......................................................................................... 75 4.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval......................................................................................................................... 76 4.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján............................ 76 4.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján .................. 79 4.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján....... 79 4.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók......................................................... 86 4.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel ..................................................................................................................... 86 5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK................................................................... 87 5.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata............................................................ 87 5.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval......................................................................................................................... 87 5.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján............................ 87 5.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján .................. 88 5.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján....... 88 5.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók......................................................... 89 5.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel ..................................................................................................................... 89 5.4. Javaslatok a madár-botulizmus megbetegedések megelızése illetve kártételének csökkentése érdekében..................................................................................................... 90 6. ÖSSZEFOGLALÁS....................................................................................................... 92 7. FELHASZNÁLT IRODALOM .................................................................................... 94 8. TÉZISPONTOK........................................................................................................... 114 8.1. Tézispontok magyarul ............................................................................................ 114 8.2. Thesis statement...................................................................................................... 115 9. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK, ELİADÁSOK .................................................................................................................. 116 10. FÜGGELÉK ............................................................................................................... 120 10.1. A diszkriminancia analízis vázlatos menete, GAÁL /2004/ alapján................... 120 10.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval....................................................................................................................... 126 10.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján........................ 126 10.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján .............. 126 10.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 127 10.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók..................................................... 128 10.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel ................................................................................................................... 130 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................... 131
6
KIVONAT A Clostridium botulinum egyes toxintípusai által okozott madár-botulizmus világszerte a vízimadarak egyik legjelentısebb bakteriális eredető megbetegedése. Közismert, hogy e kórforma kialakulását bizonyos környezeti tényezık nagyban segíthetik. Jelen kutatási programban ezért célul tőztük ki e faktorok és a madár-botulizmus kitörések közti kapcsolat feltérképezését a megbetegedések szempontjából endémiásnak tekinthetı KisBalaton területén, statisztikai számítások segítségével. Emellett kísérletet tettünk a kórokozó iszapmintákból, hagyományos mikrobiológiai valamint molekuláris biológiai módszerekkel történı detektálására, illetve utóbbi technikák alkalmazhatóságának összehasonlítására. A vizsgálatok során hazánkban elsıként mutattunk ki szoros összefüggéseket néhány környezeti paraméter (levegı- és vízhımérséklet, pH, oldott oxigén- és szervesanyagtartalom) és a madár-botulizmus fellépése között. A
Kis-balatoni
iszapmintákból
több,
Clostridium
botulinum-ra
emlékeztetı
Clostridium-fajt különítettünk el, ezek további vizsgálata azonban nem utalt botulinum toxin termelésére. Az általunk használt molekuláris biológiai módszerek egyikével kapcsolatban elıször számoltunk be fals pozitív eredményekrıl. E mellett elsıként ültettünk át egy hagyományos, PCR alapú diagnosztikai módszert egy olvadáspont-analízissel kiegészített, LightCycler-alapú real-time környezetbe, ezzel tovább növelve annak gyorsaságát, egyszerőségét és érzékenységét. Végül kísérletet tettünk egy, a madárbotulizmus kitörések igazolására használható, több szempontból új megközelítéső realtime PCR reakció kidolgozására.
7
ABSTRACT The aims of this research project were to compare some water quality parameters of high and low botulism risk areas of Lake ‘Kis-Balaton’ using statistical methods to determine their significance in the occurrence of avian botulism epizootics, and to detect and isolate the etiological agent Clostridium botulinum from mud samples derived from the above mentioned wetland site by conventional microbiological and various molecular techniques including a new LightCycler-based real-time PCR reaction.
8
INHALTSANGABE Die Ziele dieses Forschungsprogrammes waren, einige Einflussfaktoren der Wasserqualität auf Gebieten hohen und niedrigen Botulismusrisikos des Kleinen Plattensees mit Verwendung von statistischen Methoden zu vergleichen, sowie den Krankheitserreger des Clostridium botulinum aus den aus diesem Feuchtgebiet stammenden
Schlammmustern
mit
konventionellen
mikrobiologischen
und
verschiedenen molekularen Techniken, einschliesslich einer neuen LightCyclerbasierten Realtime-PCR-Reaktion, nachzuweisen und zu isolieren.
9
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ADP
adenozin-difoszfát
ANOVA
varianciaanalízis (analysis of variance)
BoNT/C1
C1 típusú botulinum neurotoxin (termelés)
bp
bázispár
BSA
bovin szérum albumin (bovine serum albumin)
BSM
botulinum szelektív tápközeg (botulinum selective medium)
CBI
Clostridium botulinum izolációs agar
CCFA
cikloszerin-cefoxitin-fruktóz agar
CM
fıtt hús (cooked meat)
dNTP
dezoxinukleotid-trifoszfát
DRCM
megerısített differenciáló clostridium tápközeg (differential reinforced clostridial medium)
EYA
tojásagar (egg yolk agar)
GTP
guanozin-trifoszfát
IEW
ioncserélt víz (ion-exchanged water)
ip.
intraperitoneális(an)
iv.
intravénás(an)
kDa
kilodalton
MLD
minimális letális dózis
NAD
nikotinsavamid-adenin-dinukleotid
ppt
trilliomod-rész, 10-12-ed rész (parts per trillion)
rDNS
riboszómális DNS
SNAP-25
szinaptoszómához kapcsolt fehérje (synaptosomal associated protein)
SNARE
oldható N-etilmaleimid-érzékeny faktorhoz kapcsolódó fehérje-receptorok (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)
TBE
trisz-bór-EDTA
10
TPGY
tripton-pepton-glükóz-élesztıkivonat agar (tryptone-peptone-glucose-yeast agar)
ttkg
testtömeg-kilogramm
U
egység (unit)
USGS
Az Egyesült Államok Geológiai Kataszteri Hivatala (United States Geological Survey)
11
1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŐZÉSEK
Az obligát anaerob Clostridium botulinum toxinjai által kiváltott madár-botulizmus az érintett madárfajok száma és a mortalitási adatok alapján világszerte a vízimadarak legjelentısebb bakteriális eredető megbetegedése, amely az 1994 és 1997 közötti idıszakban, csak az Egyesült Államok és Kanada területén több mint négymillió vízimadár életét követelte. Egyetlen, 1996-ban bekövetkezett kaliforniai kitörés során az orrszarvú pelikán (Pelecanus erythrorhynchos) teljes nyugati populációjának mintegy 15%-a pusztult el /ROCKE, 2006/. Az anyagi kár mellett a védett illetve veszélyeztetett fajok egyedeinek elhullásából adódó eszmei kár ugyancsak hatalmas lehet. Ebbıl a szempontból kiemelkedı jelentıségőek azok a védett területek, melyeken a madár-botulizmus esetek visszatérıen jelentkeznek. Hazánkban ezek közé tartozik a Balaton-felvidéki Nemzeti Park részét képezı Kis-Balaton régiója, ahol egy-egy kitörés vízimadarak ezreivel, olykor tízezreivel végzett /MAGYARI; szóbeli közlés/. Régóta ismert, hogy a megbetegedések kialakulását különféle biotikus és abiotikus tényezık kedvezıen befolyásolhatják. Amint azt WOBESER /1987/ megjegyezte, e feltételeknek nincs olyan egyszerő együttállása, ami az összes kitöréssel összefüggésbe hozható, de meghatározta azt az öt tényezıt, amely ebbıl a szempontból alapvetı fontosságú. Ezek a spórák megléte, a Clostridium botulinum szaporodásához szükséges környezeti faktorok, a baktériumok specifikus bakteriofággal történı fertızıdése, a lehetséges áldozat toxinfelvétele illetve a kórokozó és a toxin megfelelı vektorok által történı elterjesztése. Mindezek fényében meglepı lehet madár-botulizmus esetekrıl olvasni akkor, amikor ezt a környezeti tényezık egyáltalán nem indokolják, illetve a kitörések elmaradását tapasztalni a korábban említett feltételek akár legkedvezıbb együttállása során. A hazai és nemzetközi tapasztalatok alapján kijelenthetı, hogy a jelenség háttérben olyan komplex, élıhelyenként változó rendszerrel állunk szemben, melyben a kulcselemek mellett egyéb, eddig ismeretlen, vagy kevésbé jelentısnek tartott tényezık hatásaival is számolni kell. Bár a betegség etiológiája már csaknem egy évszázada ismert, a Clostridium botulinum természetes mintákból történı izolálásának nehézségei a madár-botulizmust a baktérium 12
oldaláról megközelítve is rejtélyessé teszik. Példaként megemlíthetı, hogy mindmáig nem létezik olyan szelektív táptalaj, melynek segítségével a C típusú, nem proteolitikus Clostridium botulinum törzsek nagy biztonsággal elkülöníthetık volnának a társflórától, s ezt csak tetézik a kórokozó szigorú anaerob voltából adódó módszertani komplikációk. E problémakört megkerülve, a diagnosztikai gyakorlatban a baktérium kimutatása helyett megelégszenek az általa termelt toxin detektálásával. Az egéroltáson alapuló toxinsemlegesítési vizsgálat a mai napig az egyetlen, széles körben elfogadott illetve alkalmazott
diagnosztikai
metódus,
legyen
szó
akár
humán,
akár
állati
megbetegedésekrıl. Az állatkísérletekkel szemben felmerülı aggályok azonban idırılidıre új, etikai, gazdasági és módszertani szempontból is megfelelıbb eljárások kifejlesztését sürgetik. Az immunológiai alapú vizsgálatok mellett ilyenek lehetnek a polimeráz-láncreakción (PCR) alapuló meghatározások, melyek a madár-botulizmus kitörések megerısítésében is egyre nagyobb tért hódítanak. Nem szabad azonban elfeledni, hogy e technikák zöme egyelıre csak egymással kombinálva nyújt kellı biztonságot a megbetegedések tényének igazolása során. Az értekezésben ismertetett kutatási program legfontosabb célja különféle biotikus és abiotikus környezeti tényezık, és a madár-botulizmus kitörések közötti kapcsolat feltárása a megbetegedések szempontjából endémiásnak tekinthetı Kis-Balaton területén. E vizsgálatok alacsony illetve magas kockázatú mintavételi pontok vízhımérséklet, szervesanyag-tartalom, pH, vezetıképesség és oldott oxigén-tartalom értékeinek, illetve a térség léghımérsékleti és csapadékeloszlási adatainak összevetését foglalják magukban, alacsony (kitörésmentes) illetve magas kockázatú (elhullással járó) években. Továbbá célul tőztük ki a Kis-balatoni megbetegedéseket kiváltó C típusú, neurotoxintermelı Clostridium botulinum baktériumok jelenlétének kimutatását, helyben győjtött iszapmintákból, hagyományos és real-time polimeráz-láncreakció segítségével; egyben elvégezve e technikák alkalmazhatóságának összehasonlítását. Mindezek mellett kísérletet
kívántunk
tenni
a
kórokozó
klasszikus
mikrobiológiai
módszerek
felhasználásával történı izolálására is. Az e tárgykörben magyar nyelven olvasható csekély számú publikáció arra sarkallt bennünket, hogy az értekezés témájának szakirodalmi feldolgozása a lehetı legteljesebb
13
képet nyújtsa, a kórokozó oldaláról tekintve éppúgy, mint az általa kiváltott megbetegedésérıl. A kutatási program eredményei reményeink szerint közelebb visznek a madárbotulizmus kialakulásának jobb megismeréséhez, a kitörések biztosabb elırejelzéséhez illetve az általuk okozott anyagi és eszmei károk mérsékléséhez.
14
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A baktérium története Bár a betegség tüneteit már a XIV. század elején leírták Német- és Oroszországban /NIKODÉMUSZ és mtsai., 1960/, az elsı adatokat errıl a baktériumfajról KERNER /1822/ publikálta. A botulizmus elnevezés is tıle származik, mivel összefüggést talált bizonyos kolbászféleségek fogyasztása (botulus = kolbász; latin) és egyes csoportos ételmérgezések között. A toxikoinfekcióért felelıs kórokozóról szóló bıvebb információkat elıször VAN ERMENGEM /1897/ írta le egy botulizmus járvány kapcsán, mely 1895. decemberében, a belgiumi Ellezelles városában egy zenés összejövetelen tört ki. Ötven ember betegedett meg, közülük hárman meghaltak. A baktériumot nyers sonkából tenyésztette ki és elnevezte Bacillus botulinus-nak, ami késıbb a Clostridium botulinum elnevezést kapta. Alig száz évvel KERNER elsı publikációját követıen bebizonyosodott, hogy e baktériumfaj egyes típusai különbözı állatokban is képesek megbetegedéseket okozni.
2.2. A baktérium rendszertani besorolása A Clostridium botulinum faj rendszertani besorolása a Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2. kiadása szerint /GARRITY és mtsai., 2004/, amely a 16S rRNS gén szekvenciahomológiák és eltérések alapján osztályozza a mikroorganizmusokat, a következı:
Domén:
Bacteria
Törzs:
Firmicutes
Osztály:
Clostridia
Rend:
Clostridiales
Család:
Clostridiaceae
Nemzetség:
Clostridium
Faj:
botulinum
15
2.3. A baktérium morfológiája, törzseinek csoportosítása, biokémiai jellemzıi A botulizmus kórokozóit a rendszertan egy speciesbe sorolja a tenyésztésbeli és biokémiai eltérések ellenére, mivel farmakológiailag azonos hatású neurotoxint termelnek. A fajt a toxinok szerológiai specificitása alapján osztották fel A, B, C1, D, E, F, G típusokra. Kezdetben a C2 típust is ide sorolták, de ma már nyilvánvaló, hogy a C2 toxin nem okoz idegrendszeri tüneteket. Eltekintve a toxinok szerológiai specificitása alapján elvégzett felosztástól, más, fıként biokémiai tulajdonságai alapján a Clostridium botulinum fajt négy csoportra osztották:
I.
proteolitikus, A, B, F toxintípusú törzsek
II.
nem proteolitikus, B, E, F toxintípusú törzsek
III.
nem proteolitikus, C, D toxintípusú törzsek
IV.
gyengén (egyáltalán nem) proteolitikus és nem szacharolitikus, G toxintípusú törzs (1. táblázat).
1. táblázat. A Clostridium botulinum törzseinek csoportosítása fenotípusos jellemzıik alapján (HATHEWAY /1990/ nyomán, módosítva). Csoport Toxintípus I II III IV
A, B, F B, E, F C, D G
Proteolitikus Glükóz- Lipáz Anyagcseretermékek* nem illó aktivitás bontás reakció illó + + + E, iVaj, V, iVal FP + + E, V +/+ + E, P, V + E, iVaj, V, iVal FE
Fenotípusosan rokon Clostridium -ok C. sporogenes C. novyi C. subterminale
*Savas anyagcsere-végtermékek PYG tápközegben. E: ecetsav, P: propionsav, iVaj: izo-vajsav, V: vajsav, iVal: izovaleriánsav, FP: fenil-propionsav, FE: fenil-ecetsav
A III. csoportba tartozó, nem proteolitikus C és D toxintípusú törzseknél, melyek közül elıbbiek a madár-botulizmus fı kórokozói /REILLY – BOROFF, 1967/, 0,5-0,7 x 3,47,9 µm nagyságú, peritrich csillóik segítségével mozgó egyenes pálcákat találunk. Gram-pozitívak, sejtfaluk DL-diamino-pimelinsavat tartalmaz. Spóráik oválisak, szubterminálisak. Felületi telepei kerekdedek, enyhén szabálytalanok, gyengén csipkézett szélőek, kissé kiemelkedık; áttetszı, szürkésfehér, sima, matt felületőek (1. kép). Nutrient vagy CM buillon-ban erjeszthetı szénhidrátok jelenlétében is mérsékelten növekednek. Fermentációs termékeik az ecetsav, propionsav és a vajsav. A zselatint
16
hidrolizálják; a tejet nem emésztik. Szaporodási optimum hımérsékletük 30-37°C. DNS-ük GC tartalma 26-28 mol % /BERGEY, 1974/. A pH-optimummal kapcsolatban pontos adatok a feldolgozott hazai és nemzetközi irodalomban nem találhatók.
1. kép. Lecitináz- és lipáz-aktív, C típusú Clostridium botulinum telepek (72h, EYA) /a szerzı felvétele/.
Az I. csoport törzsei A, B és F típusú toxint termelhetnek (1. táblázat). Az A típusú toxint termelı törzsek a kevéssé lakott, mezıgazdasági mővelésbe nem vont, nagy kiterjedéső füves pusztákon élnek. Az USA-ban a Mississippi-tıl nyugatra, valamint Argentína és Kína területén írták le jelenlétüket. A talajmővelés intenzívebbé válása elpusztítja ıket. A kórokozók fennmaradásában a legelı, illetve füves pusztán élı állatok játszanak szerepet, amelyek bélflórájából az ott jelenlévı – nem szaporodó – baktérium az állat elhullásakor kiszabadul, és a bomló szöveteket nagy tömegő vegetatív forma árasztja el, amely a tetem belsejében spórásodik. A spórák terjesztésében a dögbıl táplálkozó ragadozók, rovarok, rágcsálók egyaránt szerepet játszhatnak, ürülékükkel szennyezve a talajt /GULYÁS és mtsai., 1998/. A B toxintípusú törzsek a lombos erdık éghajlati övében, túlnyomórészt savanyú talajokon fordulnak elı. Ez a típus váltja fel az A toxin-termelı törzseket a mezıgazdasági mővelésbe fogott területeken. A proteolitikus B típus foglalja el a földmővelésbe vett, kiszárított tengerfenéken az E típus helyét. A természetben való fennmaradás mechanizmusa az A típuséhoz hasonló. A baktérium a bomló állati
17
szövetekben szaporodik jól, de növényi szövetekben is képes növekedni, és toxint termelni /GULYÁS és mtsai., 1998/. Európában – így hazánkban is – a B toxintípus okozza a humán megbetegedések többségét,
mely
általában
házi
állatvágások
során
kerül
be
a
különbözı
húskészítményekbe. Ha a Clostridium botulinum okozta ételmérgezés földrajzi elıfordulását figyeljük, azt tapasztalhatjuk, hogy az esetek zöme a Dunántúl déli megyéire, elsısorban Baranya és Tolna megyére korlátozódott egészen a legutóbbi évekig. 1993 óta azonban a Nyírségbıl is számos ételmérgezést jelentettek /GULYÁS és mtsai., 1998/.
A II. csoport törzsei B, E és F típusú toxint képezhetnek. A két utóbbi toxint termelı törzsek a hideg éghajlati övezet édesvizeinek és tengerpartjainak lakói. Dán szerzık vizsgálatai alapján az E típus Európában a Balti-tenger sekély öbleiben és az édesviző, gazdag állatvilággal benépesített tavakban tenyészik /HUSS, 1980/. Valódi vízi organizmus, mely a vízben és az iszapban 102/g csíraszámot is elérhet. Jelen van a vízi gerinctelen élılények és a halak bélcsatornájában, és az állat pusztulása után a tetemben elszaporodva toxint termel. A spórákat a halak és a vízáramlatok terjesztik. Az E típus Alaszka, Kanada és Szibéria területén is igen elterjedt. Az F típus Japán tengerpartjain és az USA-ban fordul elı.
A III. csoportba tartozó törzsek C és D típusú toxint állíthatnak elı. E törzsek a meleg éghajlaton, az iszapban és madarak, illetve emlısök bélcsatornájában élnek. A víz felmelegedése esetén a baktérium 15°C felett képes az iszapban levı elhalt élılények tetemein szaporodni, és toxint termelni. A gerinctelenekre a toxin hatástalan, ezek baktériumhordozóként szerepelnek. Az iszapban élı férgekbıl, rovarokból táplálkozó madarak a kórokozót, illetve a toxint elfogyasztják, beteggé és tartós baktériumürítıvé válnak, a fertızést nagy területeken széthurcolhatják. Az elhullott madártetemeken élı légyálcák a toxint nagy mennyiségben tartalmazzák. Ezek elfogyasztása ismét a madarakat mérgezi. A végeredmény tömeges madárpusztulás, amely mindaddig tart, amíg a fertızési lánc meg nem szakad. A madarak, elsısorban a fiatal egyedek, igen érzékenyek a toxinnal, és fogékonyak a baktériummal szemben.
A IV. csoport törzsei G típusú toxint termelhetnek, melyek fıleg kísérleti állatok megbetegedését, s igen ritkán emberi mérgezést is okoznak /GULYÁS és mtsai., 1998/. 18
A C típusú Clostridium botulinum törzsek biokémiai tulajdonságainak vizsgálatával kapcsolatban viszonylag kisszámú közlemény olvasható. Ennek okai egyrészt a baktérium izolálásának, fenntartásának és tenyésztésének nehézségében, másrészt pedig – valószínőleg épp ebbıl adódóan – a tenyésztést „megkerülı” diagnosztikai eljárások elterjedésében keresendık (lásd késıbb). A nemzetközi irodalomban, e témakörben fellelhetı eredményeket, melyek enzimreakciók, szénhidrát-hasznosítás és különféle anyagcseretermékek vizsgálatán alapulnak, a 2. táblázat foglalja össze. A táblázat adatait szemlélve szembetőnı eltérések figyelhetık meg az egyes törzsek biokémiai jellemzıi között. OGUMA és mtsai. /1986/ szerint például néhány munkában negatív lecitináz aktivitásról, illetve indolképzésrıl számolnak be, míg mások /SEGNER és mtsai., 1971a; NAKAMURA és mtsai., 1983/ minden esetben pozitív lecitináz reakcióról, egy törzs esetében pedig indol-pozitivitásról írnak. Bár a szénhidrát-fermentációs mintázatban az egyes izolátumok között tapasztalható különbségek – az eltérı enzimkészlet okán – még csak-csak magyarázhatók, azonos törzsek között azonban már aggodalomra adhatnak okot (468-as törzs: indolképzés, fruktóz- és maltózbontás; 6813-as és 6814-es törzsek: fruktózbontás – 2. táblázat). OGUMA és mtsai. /1986/ szerint e meglepı eredmények okai az eltérı vizsgálati módszerekben keresendık. E tények figyelembevételével szerencsés volna egy olyan nyilvános, világszerte követendı módszertani útmutató létrehozása, melynek segítségével az efféle anomáliák kiküszöbölhetık lennének. A fenti kételyek ellenére a különféle biokémiai alapú rendszerek (pl. API, Biolog) használata meglehetısen elterjedt.
19
2. táblázat. Szárazföldi és tengeri eredető, C típusú Clostridium botulinum törzsek biokémiai tulajdonságai. SEGNER et al., 1971
BERGEY, 1974
OGUMA et al., 1986
nem
468
571
6812
6813
6814
6816
Stockh.
468
CB19
203
D6F
6813
6814
proteolitikus
(Sz)
(Sz)
(T)
(T)
(T)
(T)
(?)
(Sz)
(Sz)
(?)
(?)
(T)
(T)
B, C, D, E, F
(G. I.)
(?)
(?)
(G. IV.)
(G. IV.)
(?)
(G. I.)
(G. II.)
(G. IV.)
(G. IV.)
(G. I.) (G. I.) (G. II.)
H2S-termelés
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
+
+
(+)
+
(+)
-
-
Ureáz
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Zselatin hidr.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Kazein hidr.
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
-
-
-
-
-
-
-
Nitrátred.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Acetoin (VP)
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Indol-képzés
-
-
-
-
-
-
-
+
+
(+)
+
(+)
-
-
Hemolízis
+
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
+
+
+
+
+
+
+
Lecitináz
v
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lipáz
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Adonit
n.v.
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Amygdalin
d
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Arabinóz
d
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Cellobióz
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Eszkulin
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Fruktóz
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
Galaktóz
d
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
Glükóz
+
+
+
+
+
+
+
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Glicerin
d
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Glikogén
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Inozit
d
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Inulin
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Laktóz
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Maltóz
d
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
+
+
+
-
-
+
+
Mannit
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Mannóz
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(+)
(+)
+
+
Melezitóz
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Melibióz
-
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
-
-
-
-
-
+
+
Raffinóz
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Rhamnóz
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Ribóz
d
-
-
+
+
+
+
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Szalicin
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Szorbit
d
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Szorbóz
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Keményítı
-
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Szacharóz
d
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Trehalóz
d
-
-
-
-
-
-
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
Xylóz n.v. n.v. n.v. d: a törzsek 11-89%-a pozitív; v: változó; n.v.: nem történt vizsgálat; (+): gyenge pozitivitás; (T): tengeri törzs;
n.v.
n.v.
n.v. (Sz):
n.v.
Dextróz Dulcit
szárazföldi törzs; (G. I-IV.): biokémiai tulajdonságok alapján történı csoportosítás (OGUMA et al., 1986)
20
2.4. A toxin jellemzése 2.4.1. A botulinum toxin A Clostridium botulinum háromféle toxint termel (botulinum toxin, C2 és C3 toxin). Mielıtt ezt felfedezték, egyes sajátosságokat, mint az ADP-riboziláció, ami valójában a C2 és C3 toxinokkal kapcsolatos, a botulinum toxinnak tulajdonították, mivel a botulinum toxin-készítmények e másik két toxinnal voltak szennyezve. Az ADP-riboziláció során a NAD-molekuláról szabaddá válik a nikotinsav-amid, a ribozilált fehérje amino-csoportjához pedig kovalens kötéssel egy ADP-ribóz molekula kapcsolódik. Az ADP-ribozilációs aktivitás a C2 és C3 toxinok mellett más toxinokra is jellemzı. Ilyenek például a diphteria- és a cholera-toxinok. Botulinum-toxin esetében a ribozilált aminosav arginin helyett aszparagin /SEKINE és mtsai., 1989/.
A botulinum toxin az egyetlen a három közül, amely a neuronokra hat, így kétségtelenül ez a toxin a felelıs a betegség tüneteiért. Jóval toxikusabb is a másik kettınél. A botulinum toxinnak legkevesebb hét, szerológiailag eltérı típusa van (A, B, C1, D, E, F, G). Élettani hatásuk azonos: az idegvégzıdésen egy neurotranszmitter, az acetil-kolin felszabadulását gátolják /SALYERS – WHITT, 1994/. A dolgozatban – a könnyebb átláthatóság kedvéért – ahol erre csak mód nyílt, a „C1 toxin” kifejezés „C toxin”-ra lett változtatva, így a továbbiakban ezek egymás szinonimáinak tekintendık. A neuromuszkuláris szinapszisban az acetil-kolint tartalmazó vezikulumokat a synaptobrevin szállítja a preszinaptikus membrán felé. Ezt a fehérjét hasítja a toxin B, D, F, G típusa. A membránon a syntaxin és a SNAP-25 alkotják azt az aktív kötıhelyet, ahol a vezikulumok rögzítése és kiürítése végbemegy. Az A és E toxinok szubsztrátja a SNAP-25 molekula, míg a C toxin a syntaxint támadja meg /BENFENATI – VALTORTA, 1995/, bár ARNON és mtsai. /2001/ szerint utóbbi szubsztrátjaként a SNAP-25 szintén elképzelhetı (1. ábra).
A botulinum toxin mindegyik típusa cink-dependens metalloproteáz, így képes arra, hogy a neuroexocitózis folyamatában résztvevı fehérjekomponenseket jellegzetes helyeken hasítsa. A cink-ionok központi szerepet játszanak a peptid-kötések hidrolízisében /HUNTER – POXTON, 2002/. A „négykarú” cink-kötı hely, mely két hisztidin, egy glutamát- és egy vízmolekulát foglal magában, a könnyő láncon található. 21
Ugyancsak itt helyezkedik el a HELIH konszenzus aminosav-szekvencia, amely más, cink-függı metalloproteázokra szintén jellemzı (2. ábra) /PESTRONK, 2008/.
1. ábra. A botulinum toxinok hatásmechanizmusa és támadáspontjai a kolinerg idegvégzıdésen (ARNON és mtsai. /2001/ nyomán).
22
A botulinum toxin egy 150 kDa molekulasúlyú fehérje, amely része egy, a toxin mellett egyéb proteineket is tartalmazó komplexnek. A komplexet progenitor toxinnak, magát a toxint pedig derivatív toxinnak hívják. A derivatív toxin orálisan bejutva a szervezetbe a progenitor toxinnál kevésbé hatásos, injektálva viszont ennek épp a fordítottja tapasztalható. Ez vezetett ahhoz a feltételezéshez, hogy a progenitor toxin nem toxikus komponensei szerepet játszanak a derivatív toxin gyomorsavtól és a proteázoktól való védelmében, illetve a gyomor nyálkás felszínén történı átjutásban, majd a megkötıdésben. Az aktív derivatív toxin – csakúgy, mint oly sok más exotoxin – két fehérje alegységbıl áll, egy nehéz láncból (100 kDa) és egy könnyő láncból (50 kDa), melyek egy diszulfidhíddal kapcsolódnak. A nehéz lánc két további alegységbıl áll (HcN (Hc1) és HcC (Hc2); 2. ábra), ezek közül az utóbbi felelıs a megkötıdésért /HUNTER – POXTON, 2002/.
A derivatív toxint a baktérium inaktív fehérje formájában szintetizálja és választja ki. A fehérje proteolitikus hasítása aktiválja a toxint, amely megvalósulhat a Clostridium-ok által termelt és a gyomorban keletkezı proteázoktól is. A toxin kötıdési helye a nehéz lánc C-terminálisa közelében található. Úgy gondolják, hogy a lánc N-terminálisa egy csatornát képez a neuron membránjában, lehetıvé téve a könnyő lánc belépését a sejtbe /SALYERS – WHITT, 1994/.
A botulinum toxin igen mérgezı anyag. Nemzetközi egysége (1 U=1 LD50) az a mennyiség, amely 20 g-os nıstény Swiss-Webster egereknek beadva a kísérleti csoport felét 4 napon belül elöli. Az A típusú tisztított neurotoxin 1 ng-ja 2,5 LD50 hatáserısségő1 a Botox (USA) készítményben, a brit Dysport toxin pedig 40 MLD/kg erısségő. Az ember letális dózisa 30-40 MLD/kg az A toxintípusból /GULYÁS és mtsai., 1998/. Az A, B és D típusok egéren mért toxicitása azonos mértékő, a C, E és F típusú toxinok negyed-, illetve tizedakkora toxicitási értékek között mozognak /TOPLEY – WILSON, 1990/.
1
LD50: az a méregadag mg/testtömeg kg-ban (vagy ml/kg-ban, mmol/kg-ban) kifejezve, amely a kezelt, kísérletbe vont állatok 50%-át elpusztítja (Dosis Lethalis 50) /VÁRNAGY – BUDAI, 1995 nyomán/
23
A C típusú toxin 4,4x107 MLD/mg protein toxicitású; a tisztított toxin molekulasúlya 141 kDa (98 kDa (nehéz lánc) + 53 kDa (könnyő lánc)) /SYUTO – KUBO, 1977/.
2. ábra. A botulinum toxin szerkezete (PESTRONK /2008/ nyomán).
A C és D típusú toxinok molekulái a neurotoxin és egy nem toxikus, nem hemagglutináló, vagy egy nem toxikus, hemagglutináló komponensbıl állnak. Disszociációjukat lúgos közegben (pH=8-nál) figyelték meg. A nem toxikus, hemagglutináló komponens egy nem toxikus, nem hemagglutináló komponensbıl és a hemagglutinációs aktivitást biztosító alkomponens(ek)bıl tevıdik össze. A C és D típusú toxinok, illetve a nem toxikus rész termelése bakteriofágok által irányított /OGUMA és mtsai., 1980/ (bıvebben lásd késıbb).
Annak ellenére, hogy több szerzı szerint a Clostridium botulinum C és D típusai csak állatokat betegítenek meg /ROCKE, 1983; SALYERS – WHITT, 1994/, beszámoltak néhány olyan humán esetrıl, melyet a C típus okozott. Kettı az 1960-as években, a Szovjetunióban; egy Franciaországban, egy pedig az Egyesült Államokban történt
24
/JENSEN – PRICE, 1987/, de HOLEMAN /1970/ szerint ezek nem voltak kellıen alátámasztva. OGUMA és mtsai. /1990/ ezzel szemben C típusú botulizmusról számoltak be egy 171 napos leánycsecsemınél, akit hirtelen légzésbénulással szállítottak kórházba. A beteg székletébıl kitenyésztették a Clostridium botulinum C típusát, s a kísérleti egéroltások is ugyanerre az eredményre vezettek. MAKSYMOWYCH
és
SIMPSON
/1998/
szerint
a
megbetegedések
az
emésztırendszerben található C típusú toxin-receptorok jelenlétéhez köthetık, s a csekély humán esetszám egyik lehetséges magyarázata épp e receptorok hiánya, melynek okán a toxin nem tud a keringésbe transzlokálódni.
2.4.2. A C2 és C3 toxinok A C2 és C3 a botulinum toxinnal együtt található meg néhány Clostridium botulinum törzsben. Klinikai jelentıségük tisztázatlan. A C2, amely csak sporuláció idején termelıdik (lásd késıbb), s melynek génje a bakteriális kromoszómán helyezkedik el, egy A-B toxin, tehát könnyő lánc-nehéz lánc struktúrájú. Az A részt I-es, a B-t pedig IIes komponensnek is nevezik. A C2 B része (tehát a II-es komponens) kötıdik a különféle sejtekhez, az A rész pedig ADP-ribozilálja az intracelluláris aktint. Ez megzavarja a normális, mikrofilamentumok által biztosított szerkezetet, s a toxin a sejt roncsolódását okozza /SALYERS – WHITT, 1994/. OHISHI és mtsai. /1980/ számításai szerint az I-es komponens molekulasúlya 55 kDa, a II-es komponensé pedig 105 kDa. A C2 protoxinként keletkezik, toxicitása tripszinezve több mint 2000-szeresére növelhetı (az alap-toxicitás 1:2,5 arányú I-II keveréknél a legmagasabb: 2,2x104 egér ip. LD50/mg). A tisztított C2 iv. hatásosabb, mint ip. (5,4 ng ill. 49 ng egér LD50) /OHISHI és mtsai., 1980/.
A C2 két komponense külön-külön nem, vagy alig toxikus (még tripszinezést követıen sem), együttmőködve viszont halálosak: tripszinezést követıen a II-es komponens nagyon alacsony toxicitású volt, az I-es pedig nem bizonyult toxikusnak, sem tripszinezés elıtt, sem azután. A tripszinezett I-es és a nem tripszinezett II-es komponens keveréke nem halálos egerekben, fordítva viszont a tripszinezett C2 toxicitásának 82%-át mérték. A maximális
25
aktiválás 1:2 arányú toxin-tripszin keveréknél, 30 perces inkubáció után, pH=8-nál jött létre /OHISHI és mtsai., 1980/.
A C2-nek számos hatása van: amellett, hogy úgy hat, mint egy klasszikus enterotoxin (azaz elısegíti a folyadékok kiszabadulását a bél nyálkahártyáján), ún. vaszkuláris permeabilitási (VP) aktivitással bír, mely az erek áteresztıképességének növekedésével jár. OHISHI és SAKAGUCHI /1982/ kísérletükben 14-féle C és D típusú törzset vizsgáltak. A 14 törzsbıl 10-nek volt VP aktivitása, mely minden esetben semlegesíthetı volt anti-C2 szérummal, illetve az I-es és II-es komponensekre specifikus antiszérumokkal, de anti-C-vel és anti-D-vel nem. Annak a 4 törzsnek, amelynek nem volt VP aktivitása, tripszinezve sem volt semmilyen hatása (még úgy sem, hogy tripszinezett I-es, illetve II-es komponenst adtak hozzájuk), tehát e törzsek sem I-es, sem II-es komponenst nem termeltek. Ezekbıl az eredményekbıl is világosan kitőnik, hogy a VP aktivitás csak a C2-termelı C és D típusú törzsek jellemzıje.
A C2 talán segít a botulinum toxin szervezetben történı terjedésében azzal, hogy növeli az erek permeabilitását, de önmagában – mivel nem neurotoxin – nem játszik fontos szerepet a botulizmus tüneteinek létrehozásában.
A C3 (25 kDa) jóval kisebb a C2-nél és a botulinum toxinnál. A toxin – mely valójában egy exoenzim – génje a C1 és D típusú toxinokéhoz hasonlóan bakteriofágon kódolt. /HUNTER – POXTON, 2002/ A C2 A részéhez hasonlóan a C3 is ADP-ribozilációs aktivitással bír. Eddig ismeretlen módon egy 21 kDa molekulasúlyú GTP-kötı fehérjét ribozilál, ahogy azt a gazdasejtek több típusánál is észlelték. A C3 toxikus hatásával megakadályozza néhány GTP-kötı fehérje jelátalakítását és –közvetítését, ezzel befolyásolva az emlısök sejtjeinek metabolizmusát, amelyet épp ezek a fehérjék szabályoznak. A tényt, amely szerint a C3 szervezeten kívülrıl bejuttatva nem toxikus az emlısök sejtjeire, azzal magyarázzák, hogy képtelen e sejtekhez kötıdni, majd beépülni. A C3 olyan, mint egy toxin A alegysége, mely elvesztette B alegységét. A C3 emlıs sejtekbe történı bejuttatása elektroforetikusan vagy ozmotikus sokk létrehozásával megváltoztatja a sejtszerkezetet, de nem ismert, hogy e változásoknak bármilyen
26
patológiai jelentısége lenne. Ezért, ha lehet, a C3 botulizmusban játszott szerepe még kevésbé meghatározható, mint a C2-é /SALYERS – WHITT, 1994/.
Régebben sok zavar támadt a Clostridium botulinum különbözı típusai, különösen a Cα, Cβ és D izolálásával kapcsolatban. A C típust szinte egyszerre különítette el BENGSTON /1922/ a fémzöld döglégy (Lucilia caesar) lárváiból az Egyesült Államokban és SEDDON /1922/ szarvasmarhákból Ausztráliában. Az izolátumok két szubtípust tartalmaztak, melyek Cα és Cβ néven váltak ismertté. SMITH, L. DS. és SUGIYAMA egy 1988-ban megjelent munkájukban nem javasolják az α és β terminológiát, helyette inkább csak C típus-t használnának, s egyben rámutatnak arra, hogy a Cα törzsek C1 és C2 toxint is termelnek, melyek közül csak egy (C1) a neurotoxin, a Cβ törzsek egyedül C2 toxint termelnek, elhagyva a C1-termelést irányító bakteriofágot.
2.4.3. A botulinum toxinnal szembeni természetes immunitás A fogékony állatokban és az emberben az ellenanyag-válasz elindításához a letális dózisnál nagyobb toxinmennyiség szükséges, ezért a halál a humorális védelem kialakulása elıtt következik be, és a botulizmusból gyógyultak általában nem mutatnak védettséget a toxinnal szemben. Bizonyos dögevı madarak és emlısök azonban képesek ilyen hullákkal táplálkozni szemmel látható megbetegedés nélkül. OHISHI és mtsai. /1979/ Clostridium botulinum toxinokal szemben természetesen megjelenı ellenanyagokat találtak pulykakeselyőben (Cathartes aura), prérifarkasban (Canis
latrans)
és
rövidcsırő
varjúban
(Corvus
brachyrhynchos)
passzív
hemagglutinációval, és ezt szérumneutralizációs próbával is megerısítették. A passzív hemagglutinációval a 20 pulykakeselyőbıl 18 (90%), a 12 rövidcsırő varjú közül 5 (42%) és a 110 prérifarkasból 25 (23%) savója adott pozitív reakciót az egyes botulinum toxin típusokkal. Valamennyi szeropozitív keselyő protektív ellenanyagokkal rendelkezett a C és D típusú toxinokkal szemben, míg az E, A és F típusokkal szemben 33-42%-uk. A B típusú toxin esetében ez az érték csak 22% volt. A prérifarkasok 1457%-a rendelkezett szérumneutralizációs ellenanyagokkal az A, C, D, E típusú toxinokkal szemben, de nem voltak antitestjeik a B és F típusokkal szemben. Bizonyos dögevı állatok tehát ismeretlen természető szerzett immunitás révén védettek. A fenti eredmények alapján felmerül, hogy a vérükben keringı ellenanyagok védhetik 27
ıket, de a védelemnek nem ez lehet az egyedüli mechanizmusa. KALMBACH /1939/ azt találta, hogy a pulykakeselyők nagymértékben rezisztensek parenterálisan adott botulinum toxinokkal szemben. Ezt a megállapítást PATES /1967/ erısítette meg, aki a rezisztenciát nem tudta a vérben levı ellenanyagoknak vagy nem specifikus detoxikáló anyagoknak, esetleg a keringésbıl eltőnt toxin hiányának tulajdonítani. COHEN /1970/ szerint a keselyők A típusú toxinnal szembeni toleranciája a paraszimpatikus idegvégzıdések rezisztenciájával magyarázható. Nem ismeretes, hogy vajon az antitest-termelés az elfogyasztott preformált toxinra, vagy a keselyők béltraktusában növekvı Clostridium botulinum által termelt toxinra alakul-e ki válaszul. A kísérletben a baktérium kitenyésztésére irányuló vizsgálatok negatív eredménnyel zárultak. Az antitoxin jelenléte más fajokban aligha magyarázható szerzett rezisztenciával. Az egyik lehetséges feltételezés szerint a szeropozitív madarak és emlısök életük korai szakaszában toxinhatásnak voltak kitéve, amikor a rezisztencia – ismeretlen okból – magas lehetett. SUGIYAMA /1977/ közölte, hogy újszülött egér béltraktusában a Clostridium botulinum könnyen tenyészthetı, de az állaton a toxintermelés ellenére sem fedezhetık fel a botulizmus tünetei. Humán újszülöttekrıl is ismert, hogy tolerálják az intestinalis Clostridium botulinum fertızést, bár közülük néhány klinikai tüneteket mutat /OHISHI és mtsai., 1979/.
2.5. Madár-botulizmus 2.5.1. Történet, elıfordulás A kacsákat és egyéb vízimadarakat érintı botulizmus évenkénti kitöréseirıl az 1900-as évek elsı felétıl kezdıdıen jelentek meg publikációk, melyek Kanada és az Egyesült Államok nyugati államainak vizes élıhelyein fordultak elı /HOBMAIER, 1932/. A megbetegedés akkoriban „nyugati kacsa-betegség” néven volt ismert, melyrıl úgy gondolták, hogy nagy koncentrációban jelen levı lúgos sók által kiváltott vegyi toxikózis. A betegség etiológiája csak az elsı leírások után 20 évvel tisztázódott. Észak-Amerikán kívül a vadmadarakat érintı elsı megbetegedésekrıl 1934-ben Ausztráliából /PULLAR, 1934/, 1957-ben a Szovjetúnióból /KUZNETZOV, 1992/, majd 1963-ban Svédországból /JENSEN – PRICE, 1987/, röviddel késıbb pedig Dániából (1965), Nagy-Britanniából (1969) és Hollandiából (1970) számoltak be.
28
Megerısített eseteket jelentettek Dél-Afrikából (1965), Új-Zélandról (1971), Japánból (1973), Argentínából (1979) és Brazíliából is (1981). Mára a C típusú botulizmust a világ legkevesebb 28 országában, az Antarktisz kivételével minden földrészen diagnosztizálták /ROCKE, 2006/. Ezek a kitörések gyakran több százezer, esetenként egy millió madár életét követelték (3. táblázat).
3. táblázat. Az 50000 egyednél nagyobb mértékő elhullással járó, C típusú madárbotulizmus kitörések (ROCKE /2006/ nyomán). Helyszín Utah és Kalifornia, USA Malheur-tó, Oregon, USA Nagy Sós-tó, Utah, USA Tulare-medence, Kalifornia, USA Tule-tó, Kalifornia, USA Kalifornia, USA Montana, USA Nagy Sós-tó, Utah, USA Kaszpi-tenger, az egykori Szovjetúnió Pakowki-tó, Alberta, Kanada Whitewater-tó, Manitoba, Kanada Old Wives-tó, Saskatchewan, Kanada Nagy Sós-tó, Utah, USA
Idıpont
Becsült elhullás
1910 1925 1929 1941 1948 1969 1970 1980 1982 1995 1996 1997 1997
> 1 000 000 100 000 100 000 - 300 000 250 000 65 000 - 150 000 140 000 100 000 110 000 1 000 000 100 000 117 000 1 000 000 514 000
2.5.2. Kóroktan, járványtan A botulizmus által megbetegített madárfajok száma igen nagy: KALMBACH és GUNDERSON /1934/ 69 fajt sorolnak fel, amelyek 21 rendszertani családba tartoznak, ROCKE /2006/ azonban már 264 fajról és 39 családról tesz említést, melyek közül 22-ben találhatók vízimadarak. Legérzékenyebbek a kacsafélék (Anatidae), az érintett, hazánkban is honos fajok közül a nyílfarkú réce, böjti réce, tıkés réce, kanalas réce említhetı meg, de érzékenyek a sirályok, szárcsák, gulipánok, kormoránok is /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A londoni, St. James’s Park-beli kitörésben, melynek során több mint 400 madár pusztult el, a megbetegedés legalább 21 fajt, fıleg kacsákat érintett /KEYMER és mtsai., 1972/. REILLY és BOROFF a témában mérföldkınek számító, 1967-ben lefolytatott kísérleteik során igazolták, hogy a vízimadarak botulizmusának fı kórokozója a C típusú Clostridium botulinum C1 toxin-termelı Cα szubtípusa, bár a Michigan-tó partján
29
élı vöcskök és sirályok botulizmusáért E típusú kórokozó volt felelıs, pelikánokban pedig D típusú baktérium okozta megbetegedésekrıl számoltak be. Bár a botulizmus nem fertızı eredető betegség, lefolyása nagyban hasonlít azokéhoz. Ebben nagy szerepet játszanak az érintett területen található, toxintartalmú madártetemek,
illetve
azok
a
megbetegedett,
legyengült
egyedek,
amelyek
csipkedésével a még egészséges madarak szintén toxint vehetnek fel (bıvebben lásd a 2.5.7.4. és a 2.5.7.5. fejezetben).
2.5.3. Kórfejlıdés, tünetek Amint az a 2.4. fejezetben részletesen olvasható, a megbetegedést a szájon át felvett toxin
okozza,
a
neuromuszkuláris
szinapszisokban
gátolva
az
acetil-kolin
felszabadulását. Ebbıl fakadóan a madár-botulizmus legjellemzıbb tünete a mozgásképtelenség; az állatok szárnya lóg, fejüket jellegzetesen, petyhüdten tartják (limberneck vagy limp neck (puha nyak); 2. kép), erıs könnyezés tapasztalható, a pislogóhártya bénult, rendellenes pupillamozgások figyelhetık meg, a kloáka nyílásából nagy mennyiségő, vízszerő ürülék távozik /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.
2. kép. Limberneck vagy limp neck – a madár-botulizmus egyik jellegzetes tünete (LEIGHTON /2000/; fotó: WOBESER).
30
KURAZONO és mtsai. /1987/ kísérletileg bizonyították, hogy csirkékben és fácánokban az egyes toxintípusok közül kizárólag C2 okoz folyadék-felhalmozódást és nyálkahártya-elhalásokat a bélben, ezzel nagymértékben elısegítve a hasmenés kialakulását.
2.5.4. Kórbonctan, kórjelzés A madár-botulizmusban elhullott madarak kórboncolása során szerzett hazai és nemzetközi tapasztalatok egybevágnak a tekintetben, hogy a heveny szívgyengeségre utaló nagyvérköri pangáson kívül elváltozást általában nem lehet megállapítani (2.5.8. fejezet). A parenchymás szervek, valamint a központi idegrendszer kórszövettani vizsgálata szintén negatív eredményre vezet /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A megbetegedés kórjelzésének jelenlegi egyetlen elfogadott módszere a toxinkimutatás, amelyet egyéb, molekuláris biológiai illetve immunológiai alapú vizsgálatokkal lehet kiegészíteni (2.6. fejezet).
2.5.5. Gyógykezelés, megelızés A megbetegedett madarak kezelésében az elveszített folyadék pótlása kulcsfontosságú. Az állatok ugyanis részben az izombénulásból fakadó nyelési nehézség, részben a hasmenés folytán igen gyorsan kiszáradnak. Ebbıl következıen vérük koncentráltabbá válik, ez pedig szívbénuláshoz, s a madarak elhullásához vezet /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A hazai tapasztalatok alapján, a kondíció javítására, az ivóvízzel mindenképp érdemes fehérjekoncentrátumot adni, amelyet késıbb már darabos táplálékkal is ki lehet váltani (2.5.8.1. fejezet). Tenyésztett állományokban, megelızés céljából hazánkban is használják az eredetileg nyércek immunizálására kifejlesztett, C illetve D típusú toxoidot tartalmazó vakcinát (Botumink®, USA). Ennek alkalmazásakor azonban figyelembe kell venni, hogy az állatokat két ízben kell beoltani a szükséges védettség kialakulásához. Könnyen belátható, hogy a gyakran hatalmas, nyílt területeken, nagy számban élı vadmadarak ily módon történı védelme – a finanszírozás nehézségei mellett – gyakorlatilag is kivitelezhetetlen.
31
2.5.6. Humán kórtani jelentıség Amint az a 2.4.1. fejezetben már említésre került, a C típusú botulizmus humán kórtani jelentısége – ellentétben más (A, B, E, F) toxintípusokéval – igen csekély. Ezt a kijelentést az a tény is bizonyítja, hogy napjainkig mindössze egyetlen, toxinkimutatással is megerısített eset került publikálásra /OGUMA és mtsai., 1990/, amelyben a C típus szerepe volt igazolható.
2.5.7. Környezeti faktorok szerepe a madár-botulizmus megbetegedésekben Ahhoz, hogy egy adott élıhelyen madár-botulizmus kitörések forduljanak elı, számos elıfeltételnek kell teljesülnie. Az ebben a témakörben végzett vizsgálatok jó néhány ilyen faktor szerepét erısítették meg, vagy vetették el. A jelenleg ismert elképzelések három fı elméletre vezethetık vissza:
1) az ún. „iszapágy-elmélet” szerint a nyári, csapadékszegény idıszakban a tavak vízszintje lecsökken, így a víz könnyebben átmelegszik. A felmelegedı, oxigénszegény víz és a bomló vízi növényzetbıl származó szerves anyag kedvezı feltételeket teremt a spórák kicsírázásához és a vegetatív alakok toxintermeléséhez, mely tömeges vízimadár-pusztulásokhoz vezet /HAAGSMA és mtsai., 1972/; 2) tavaszi áradások alkalmával az elárasztott terület víz alá került növényzete, ezek és az elpusztult állatok bomlásából következı anaerob körülmények, illetve az iszapban vagy a kérdéses területen elıforduló spórák jelentik a kitörések forrását, a „spóra-hordozóként” szereplı talajlakó, vagy talajjal táplálkozó élılények mellett /„mikrokörnyezet-elmélet”; BELL és mtsai., 1955/; 3) a talajból felvett spóra a madarak bélcsatornájába kerül, s azok bármilyen okból történı pusztulását követıen kicsírázik, a dögökben, mint fertızési forrásokban nagy mennyiségő toxint termelve. Ebben az esetben – ellentétben az elızı kettıvel – a spóráknak nem kell jelen lenniük a helyszínen, hiszen azokat a madarak testükben vagy ürülékükkel „szállítják” a kitörés helyszínére. Részben ezzel magyarázható madár-botulizmus fellépése olyan területeken is, ahol korábban efféle megbetegedésekre nem volt példa /”madártetem-elmélet”; ROSEN, 1971; SMITH és mtsai., 1975/.
32
Jól látható, hogy az elméletek a környezeti igények tekintetében nem különböznek – ez érthetı is, hiszen a kórokozó fejlıdése (és ezzel együtt toxintemelése) elengedhetetlen a megbetegedések
létrejötte
szempontjából.
A
kitörések
kialakulásában
valószínősíthetıen szerepet játszó egyéb faktorokról a 3. ábra tájékoztat.
3. ábra. A madár-botulizmus kitörések kialakulására ható biotikus és abiotikus környezeti tényezık (WESTPHAL /1991/ nyomán, módosítva).
33
Ezzel együtt érdemes felhívni a figyelmet arra az érdekes tényre, hogy megbetegedések olyan esetekben is elıfordulnak, amikor ezt a környezeti feltételek alapján egyáltalán nem várnánk, és elmaradhatnak e faktorok legoptimálisabb megléte esetén is /ROCKE és mtsai., 1999/. A vízhımérséklet, pH, sótartalom, redoxpotenciál és gerinctelen biomassza befolyásolja a madár-botulizmus fellépését /ROCKE és mtsai., 1999; ROCKE – SAMUEL, 1999/, de néhány faktor nem különbözik következetesen a kitörések által érintett és az azoktól mentes élıhelyeken /ROCKE és mtsai., 1999/, így más, eddig ismeretlen tényezık szerepével is számolni kell. Amint azt WOBESER /1987/ kiemelte, nincs a környezeti tényezıknek olyan egyszerő együttállása, ami az összes kitöréssel összefüggésbe hozható, de meghatározta azt az öt feltételt, amely ebbıl a szempontból kulcsfontosságú. Ezek a spórák megléte, a Clostridium botulinum szaporodásához
szükséges
környezeti
feltételek,
a
baktériumok
specifikus
bakteriofággal történı fertızıdése, a lehetséges áldozat toxinfelvétele illetve a baktériumok és a toxin megfelelı vektorok által történı szétterjesztése. A továbbiakban e faktorok részletesebb bemutatása következik.
2.5.7.1. Spórák MEYER és DUBOVSKY /1922/ úttörı jelentıségő, a Clostridium botulinum különféle toxintípusú törzseinek kimutatását célzó talajtani vizsgálatait késıbb számtalan másik követte, s ezek végkövetkeztetései mind-mind arra mutattak, hogy a C típusú Clostridium botulinum világszerte elterjedt a különféle vizes élıhelyeken (4. táblázat). Ezt a baktérium spóraképzı tulajdonsága nagyban elısegíti, amely formában védett körülmények között akár a szél, akár a madarak közvetítésével nagy távolságokat tehet meg, újabb területeket kolonizálva /lásd „madártetem-elmélet”: ROSEN, 1971; SMITH és mtsai., 1975/.
A Clostridium botulinum spóraképzésre nagymértékben hajlamos. Spórái ovoid alakúak, rendszerint szubterminálisak, ritkábban centrálisak, viszont a spóraérés idıszakában terminálisak. Méretük 0,6-1,0 x 1,2-1,4 µm között váltakozik /SEGNER SCHMIDT, 1971/ (3. kép). Egyes törzsek spórái (például az E, a nem proteolitikus B és F típusú spórák) rendelkeznek exospóriummal, míg mások (ilyenek az A, a proteolitikus B, C, D és F típusú törzsek spórái) nem. Az E típusú spórák felületén jellegzetes függelékek is megfigyelhetık. 34
Ellenállnak a sugárzásnak, az UV fénynek, az alkoholoknak, fenolnak és a kvaterner ammóniavegyületeknek; viszonylag érzékenyek a hipokloritokra, az etilén-oxidra és a formaldehidre /SMITH, 1987/.
3. kép. A típusú Clostridium botulinum sejt hosszmetszete, a benne fejlıdı spórával. (A C típusú spórák nem rendelkeznek exospóriummal („E” ill. nyilak)). „CY”: citoplazma; „OC”: külsı spóraköpeny; „IC”: belsı spóraköpeny; „CX”: kortex. A segédvonal hossza 0,2 µm (STEVENSON – VAUGHN, 1972).
Érdekes módon a C2 toxin termelése kizárólag a sporuláció idején figyelhetı meg, s a legmagasabb toxintiter a legtöbb spórát képzı tenyészetekben mérhetı /NAKAMURA és mtsai., 1978/. A toxint a spóraköpenybıl vonták ki, ami azt sugallja, hogy az talán része a spóra struktúrfehérjéinek /YAMAKAWA és mtsai., 1983/. A feldolgozott hazai és nemzetközi irodalom alapján a spóraképzés és a toxintermelés összefüggései tárgykörében egyéb publikációk nem láttak napvilágot, bár a téma érdekessége további kutatásokat tenne indokolttá.
A spórás formájú baktérium negatív környezeti hatásokkal szembeni nagyfokú ellenálló képességét bizonyítja SEGNER és SCHMIDT /1971/ kísérlete is, melyben a szerzık tengeri és szárazföldi eredető, C típusú Clostridium botulinum spórák hıtőrését vizsgálták. Eredményeikbıl kitőnik, hogy a szárazföldi törzsek hıtőrése nagyobb, mint tengeri „társaiké”: az elıbbi csoport tagjai között 1,0 percig tartó, 120°C-os hıkezelést követıen is maradtak túlélık, míg az utóbbiak csak 1,2 percig tartó, 104°C-os hıkezelést voltak képesek elviselni. Általánosságban elmondható, hogy a szárazföldi és
35
a tengeri C típusú törzsek hıtőrésének mértéke az A, a proteolitikus B illetve az E típusú spóráké között helyezkedik el.
4. táblázat. A Clostridium botulinum C típusának vizes élıhelyek talajában történı elıfordulása (WOBESER és mtsai. /1987/ nyomán, módosítva). Helyszín Botswana Anglia London Norfolk Broads Különféle Mersey Estuary Franciaország Camargue Hollandia Indonézia
A vizes élıhely típusa Édesvíz
Pozitív (toxintartalmú) / össz mintaszám
1/8
Hivatkozás SMITH /1982/
Édesvíz Nem meghatározott sótartalom Édes- és sós víz Brakkvíz
12 / 69 23 / 45 14 / 379 19 / 98
SMITH - MORYSON /1975/ BORLAND és mtsai. /1977/ SMITH és mtsai. /1982/ WOBESER és mtsai. /1987/
Édesvíz Édesvíz (botulizmusos terület) Édesvíz (nem botulizmusos terület) Édesvíz Sós víz Édes- és sós víz Édesvíz "Iszap" Édesvíz Édesvíz
0 / 44 184 /237 6 / 141 1 / 50 2 / 46 0 / 55 129 / 230 42 / 108 5 / 17 5 / 18
SMITH - MORYSON /1977/ WOBESER és mtsai. /1987/ WOBESER és mtsai. /1987/ HAQ - SUKADI /1981/ HAQ - SUKADI /1981/ SMITH és mtsai. /1978/ SERIKAWA és mtsai. /1977/ ITOH és mtsai. /1978/ SMITH /1982/ SMITH /1982/
0/7 2 / 77
SMITH - MORYSON /1975/ SMITH és mtsai. /1978/
5 /4*
WILLIAMSON és mtsai. /1999/
26 / 467 2 / 43 121 / 90*
MARION és mtsai. /1983/ SMITH és mtsai. /1978/ ZECHMEISTER és mtsai. /2005/
Írország Japán Nakagawa folyó Mauritius Nigéria Skócia Edinburgh Édesvíz Különféle Édes- és sós víz Egyesült Államok Kalifornia, É-Dakota Nem meghatározott sótartalom (nem botulizmusos terület)
Florida Foszfátbánya-tavak Wales Édes- és sós víz Ausztria Sós víz *Toxinkimutatás helyett a toxintermelés génjének kimutatása.
A kimutatási technika eltérései ellenére HAAGSMA /1973/, SMITH – MORYSON /1975/ és WOBESER és mtsai. /1987/ eredményei megegyeznek abban, hogy a Clostridium botulinum C típusának elıfordulási aránya a botulizmusos illetve nem botulizmusos vizes élıhelyek talajában 11-17:1 (5,9-9,1%) /WOBESER és mtsai., 1987/. Más tanulmányok alapján (lásd 4. táblázat) általánosságban elmondható, hogy a nem botulizmusos területekrıl származó minták 1-5%-a pozitív C típusú spórák jelenlétére nézve. A talaj és az iszap kémiai és biológiai természete szükségszerően sokféle, s MEYER /1956/ hangsúlyozta, hogy a Clostridium botulinum kimutatásának esetleges
36
sikertelensége nem bizonyítja az organizmus hiányát – amely kijelentés a hagyományos módszerek esetében a mai napig helytálló. MEYER /1956/ szerint a C, D, E típusok kimutatásának kudarca a korai kutatásokban valószínőleg a minták elızetes túlmelegítésének következménye volt. Úgy gondolta, hogy ıt is egy kivételesen nagy véletlen segítette a kaliforniai mintáiból kimutatott 30%-os eredményhez. WOBESER és mtsai. /1987/ szerint a toxin kimutatásának esetleges negatív volta szintén nem bizonyítja, hogy a baktérium nincs jelen egy adott élıhelyen.
WOBESER és mtsai. /1987/ hangsúlyozzák, hogy kísérleteikben 10-bıl 8 minta bizonyult pozitívnak olyan mocsarak vizsgálata során, melyek néhány éve kiszáradtak, egy pedig olyan élıhelyrıl származott, ahol már 11 éve nem tapasztaltak madárbotulizmust. Összefoglalva tehát a C típusú Clostridium botulinum spórák széles körő elterjedtsége és nagyfokú ellenálló képessége a kitörések szempontjából veszélyeztetetté tesz minden olyan vizes élıhelyet, ahol valaha madár-botulizmus fordult elı, azonban – megfelelı feltételek mellett – lehetıvé teszi a madarak megbetegedését olyan területeken is, ahonnan korábban még nem jelentettek ilyen eseteket.
2.5.7.2. A C típusú Clostridium botulinum szaporodásának környezeti feltételei 2.5.7.2.1. Levegı- és vízhımérséklet Mivel a C típusú Clostridium botulinum szaporodásának alsó határa 15°C /KEYMER és mtsai., 1972/, optimuma pedig 30-37°C között van /POPOFF, 1995/, a kellıen magas levegı- és vízhımérséklet elengedhetetlenül fontos a baktérium szaporodása és toxinképzése szempontjából. A felmelegedı víz oxigénszegénnyé válik (lásd késıbb), amely további kedvezı feltételeket teremt a kórokozó fejlıdése szempontjából (anaerob körülmények, halpusztulás /CSABA, 1996/). Sok esetben feltőnı korreláció tapasztalható a madár-botulizmus kitörések és a forró, száraz nyarak, illetve tartósan magas hımérséklető periódusok között /pl. PULLAR, 1934; LEHOCZKINÉ, 1959; BLAKER, 1967; FEILER – KÖHLER, 1977; ONO és mtsai., 1982; HÄLTERLEIN – HEINZE, 1983; REICHHOLF, 1983; GRÜLL és mtsai., 1987; HAAGSMA, 1987; NIESS, 1987; SMITH, 1987/. Az elsı esetek mindig egy forró idıszak alatt vagy közvetlenül utána jelentkeznek, de a további történésekre az alacsony levegıhımérséklet (a késı ıszi megbetegedések kivételével) már nincs gátló
37
hatással /FEILER – KÖHLER, 1977; HÄLTERLEIN – HEINZE, 1983; REICHHOLF, 1983; GRÜLL és mtsai., 1987/. A legnagyobb mortalitás általában július és szeptember hónapok között figyelhetı meg /WESTPHAL, 1991/. Ha a napi átlagos vízhımérséklet 20°C, vagy annál magasabb, a madártetemekben 22,7szer nagyobb valószínőséggel fejlıdnek toxintartalmú légyálcák, mint 20°C alatt. A növekvı vízhımérséklettel a lárvák fejlıdése szignifikánsan felgyorsul, s így hamarabb válnak elérhetıvé a még egészséges madarak számára /SOOS – WOBESER, 2006/.
Ezek fényében zavarba ejtı lehet a megbetegedések késı ıszi, téli vagy kora tavaszi jelentkezése, hiszen ilyen esetekben a környezeti jellemzık látszólag teljesen ellentmondanak a nyári periódusokban tapasztalhatókénak. A megoldás a toxin „áttelelésében” keresendı: HUBÁLEK és HALOUZKA /1988/ kísérletei során a toxin +5°C-on 6 hónap után, míg -20°C-on több mint 5 év után érte el a 99%-os inaktiválódási határt. GRAHAM és SMITH /1978/ 1975. májusától, félig természetes körülmények között inkubált C típusú Clostridium botulinum tartalmú iszapmintáiban a toxin 344 nap múltán, egy teljes téli periódust átvészelve is stabil maradt.
A toxin téli rezervoárjaiként különféle gerinctelenek, többek között egyes légy fajok (Lucilia sericata, Calliphora vomitoria, Fannia canicularis, Phaenicia sericata, Lucilia illustris) és redıs szúnyogok (Ptychopteridae) lárvái, pióca fajok (Hirundinidae) és a közönséges víziászka (Asellus aquaticus), említhetık meg /HUBÁLEK – HALOUZKA, 1991/. Hasonló késı ıszi - téli - kora tavaszi toxinforrást jelentenek a botulizmusban elpusztult madarak tetemei, részben a szöveteikben feldúsult toxin, részben a tetemekben védett körülményekre lelı légyálcák okán, melyekrıl közismert, hogy igen nagy mennyiségő toxint képesek felhalmozni /WOBESER és mtsai., 1983/. A légyálcák megfelelı körülmények között, diapauzált prepupális lárvákként akár -9 - -11°C-on is áttelelhetnek /DAVIES, 1929; RING, 1972; BLOCK és mtsai., 1988/. A vízben elpusztult madarak tetemeibıl kifejlıdı nyüvek lesüllyedve az iszapban hosszú ideig közel érintetlenül fennmaradhatnak (131 nap; novembertıl márciusig), s tíz ilyen lárva elegendı toxint tartalmaz ahhoz, hogy tavasszal elpusztítson egy madarat /HUBÁLEK – HALOUZKA, 1991/. Ezt a lehetıséget támasztják alá azok a megfigyelések is, melyek szerint a tavaszi kitörésekben megbetegedett fajok az ún. bukó récékhez tartoznak (búbos réce - Aythya affinis, kontyos réce - Aythya fuligula), amelyek az iszapból szerzik táplálékukat /HUBÁLEK – HALOUZKA, 1988; WOBESER és mtsai., 1983/. 38
Azt a korábban általánosan elfogadott elméletet, amely szerint a légyálcák toxicitása a bebábozódással megszőnik /HAAGSMA és mtsai., 1972; DUNCAN – JENSEN, 1976; WOBESER és mtsai., 1983/, HUBÁLEK és HALOUZKA /1991/ egy 1988-89-ben bekövetkezett kitörés vizsgálata során sikeresen cáfolta meg.
A hővösebb periódusokban elıforduló megbetegedések további kiváltó oka lehet a hıszennyezés, például atomerımővek hőtıvizének természetes vizekbe történı kijuttatása /KÖHLER és mtsai., 1977; HAAGSMA, 1987/. Mivel ezek a területek télen is jégmentesek, ott nem ritkán nagy tömegben győlnek össze különbözı fajú vízimadarak.
2.5.7.2.2. Szervesanyag-tartalom Az egyes vizes élıhelyeken különféle okokból felszaporodó bomló növényi vagy állati szervezetek bıséges tápanyagforrást, e mellett védett, anaerob rezervoárt jelentenek a Clostridium botulinum számára. Madár-botulizmus kitörések helyszínein gyakran tapasztalható a szokottnál magasabb szervesanyag-tartalom /ROCKE – SAMUEL, 1999; KÖHLER és mtsai., 1977; BARTHA – SZTOJKOV, 1978/, amely többek között származhat hal- és madárpusztulásból /BALL és mtsai., 1998/, mélyebben fekvı területek növényzetének nagyobb esızések vagy hóolvadás következtében történı elöntésébıl /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/ illetve humán tevékenységbıl is (pl. elégtelenül tisztított szennyvíz bevezetése /WESTPHAL, 1991/, vízszintszabályozás /ROCKE és mtsai., 1999; SANDLER és mtsai., 1993/, vadásztavak létesítése /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/).
2.5.7.2.3. pH, redoxpotenciál, sótartalom (vezetıképesség), oldott oxigén-szint Bár SEGNER és mtsai. /1971b/ úgy találták, a C típusú Clostridium botulinum szárazföldi törzsei még 5,62-es pH-jú közegben is képesek voltak szaporodni, a baktériumokról általánosan elmondható, hogy szaporodási pH optimumuk a semleges, vagy gyengén lúgos tartományokba esik. Ezt támasztják alá BARTHA és SZTOJKOV /1978/ megfigyelései is, akik nagyszámú irodalmi adatra hivatkozva jelentik ki: a megbetegedések által érintett területeken a víz kémhatása rendszerint lúgos. ROCKE és SAMUEL /1999/ 32, botulizmusos és nem botulizmusos vizes élıhely-párt összehasonlítva arra a következtetésre jutott, hogy nı a botulizmus kialakulásának
39
veszélye, ha a víz pH-ja 7,5 és 9,0 közötti, a redoxpotenciál negatív és a vízhımérséklet 20°C-nál magasabb. A kockázat csökken, ha a redoxpotenciál nı (+100 mV feletti), a vízhımérséklet 10-15°C, a pH 7,5-nél alacsonyabb vagy 9,0-nél magasabb, a sótartalom pedig kisebb, mint 2,0 ppt. Ennek ellenére madár-botulizmus megbetegedések az átlagosnál magasabb sótartalmú élıhelyeken is elıfordulhatnak /GRÜLL és mtsai., 1987; ZECHMEISTER és mtsai., 2005/, s ezt mi sem bizonyítja jobban annál, mint hogy a C típusú Clostridium botulinum törzsek egy részét tengeri üledékbıl izolálták. A SEGNER és mtsai. /1971b/ által vizsgált szárazföldi és tengeri eredető, C típusú Clostridium botulinum törzsek maximális sótőrése igen magas, sorrendben 2%-os (2,0x107 ppt) illetve 2,5%-os (2,5x107 ppt) értéket mutatott. WOBESER és mtsai. /1987/ úgy találták, hogy azok az élıhelyek, ahonnan sikerült C típusú botulinum toxint kimutatni, magasabb sótartalmúak voltak (átl. vezetıképesség = 3463 ± 4108 µS/cm), mint azok, amelyek a toxin jelenlétére negatívnak bizonyultak (átl. vezetıképesség = 1799 ± 1280 µS/cm), bár a különbség nem volt szignifikáns. 1985. júliusában 14 botulizmusos területet megmintázva az átlagos vezetıképesség 2670 µS/cm-nek adódott (750-5500 µS/cm) /WOBESER, 1988/. SHAW 1929-ben számolt be arról, hogy a botulizmusban megbetegedett madarak plazma-klorid szintje megemelkedik. COOCH /1964/ feltevése szerint a sós vizet ivó állatok a botulinum toxin szubletális dózisától pusztulnak el, a sómirigy nem megfelelı mőködése, ebbıl következıen pedig a plazma ozmolaritásának szabályozási képtelensége miatt. Az elmélet ésszerőnek tőnik annak fényében, hogy a madarak sómirigyét az acetil-kolin stimulálja /HOKIN – HOKIN, 1959/, a botulinum toxin pedig gátolja az acetil-kolin felszabadulását /SIMPSON, 1984/. Ebbıl kiindulva WOBESER /1988/ botulinum toxinnal fertızött madarakkal botulizmusos területeken mért vezetıképességő (3460-13500 µS/cm) vízmintákat itatva vizsgálta a sós víz és a botulizmus tüneteinek súlyossága közti kapcsolatot. Bár az eredmények alapján relatíve kicsi additív vagy szinergista hatást figyelt meg, a toxin-sómirigy kapcsolatot mégsem tartja elvetendınek.
A pH-t tekintve ROCKE és SAMUEL /1999/ illetve SEGNER és mtsai. /1971b/ eredményeit támasztják alá WOBESER és mtsai. /1987/ megfigyelései is. A szerzık által mért legalacsonyabb, 6-os pH-val 6 élıhely rendelkezett, melyek közül 4-ben
40
mutatták ki a Clostridium botulinum C típusú toxinját, míg a toxin-pozitív területeken mért legmagasabb pH 9-nek adódott. Ezzel együtt ROCKE és mtsai. /1999/ nem tapasztaltak jelentıs eltérést botulizmusos és nem botulizmusos területeken illetve idıszakokban mért iszap és víz pH-értékek között.
Bár a Clostridium botulinum obligát anaerob faj, s így joggal hihetnénk, hogy egy alacsonyabb redoxpotenciálú közegben gyorsabb szaporodásra képes, in vitro kísérletek alapján /SMOOT – PIERSON, 1979/ úgy tőnik, oxigénmentes környezetben a redoxpotenciál magában nem, csak más faktorokkal (pl. sótartalom, pH) együttesen hathat limitáló tényezıként a baktérium szaporodására. ROCKE és mtsai. /1999/ úgy gondolják, a madár-botulizmus kitörések és a redoxpotenciál között talán indirekt kapcsolat áll fenn, a vizes élıhelyeken elıforduló egyéb mikrobák kompetitív, vagy akár szinergista viselkedésének köszönhetıen.
Az 1970-es évek elején felerısödı madár-botulizmus esetek gyakran az emberi hatásra kialakuló vízterhelésre, -szennyezésre is visszavezethetık. A Clostridium botulinum szaporodásához oxigénszegény és tápanyagban gazdag környezetre van szükség, ez pedig az eutrofizált vizekre nagyon jellemzı. Ennek fényében nem meglepı, hogy Közép-Európában a madár-botulizmus kitörések korrelálnak az erıs eutrofizációval /WESTPHAL,
1991/.
Úgy
gondolhatnánk,
a
víz
oldott
oxigén-tartalma
a
megbetegedések során minden esetben csökken, néhány alkalommal azonban a mérések épp ennek ellenkezıjét bizonyították: KEYMER és mtsai. /1972/ illetve MARION és kollégái /1983/ botulizmusos területeket megmintázva a víz oxigén-ellátottságát megfelelınek találták. Ennek fényében kérdésessé vált, hogy az oldott oxigén-tartalom csökkenése magában növeli a megbetegedések kockázatát.
2.5.7.2.4. Gerinctelen biomassza ROCKE és mtsai. /1999/ kitöréses területeken, illetve a megbetegedések idıszakában nagyobb mennyiségő totál és iszaplakó gerinctelen biomasszát mértek, mint a botulizmus által nem érintett területeken vagy idıszakokban, s úgy találták, hogy ez a faktor kedvez a madár-botulizmus megbetegedéseknek. Korábbi megfigyelések, melyek szerint az iszapban élı gerinctelenek populációs csúcsát követı, valószínőleg az oxigénhiány következtében bekövetkezı hirtelen pusztulása megfelelı szubsztrátot
41
teremtett a bakteriális szaporodás, majd a toxinképzés számára, szintén megerısíteni látszanak e kijelentést /JENSEN – ALLEN, 1960/.
2.5.7.2.5. Egyéb mikroorganizmusok gátló hatása A C típusú Clostridium botulinum új élıhelyeken történı kolonizációját és további populációdinamikáját
különféle
gátló
hatású
mikroszervezetek
jelenléte
is
befolyásolhatja /MOULTON és mtsai., 1976/. GRAHAM /1978/ 105 iszapmintát inokulált C típusú Clostridium botulinum baktériumokkal, s 28 napos inkubálást követıen a minták több mint 50%-ából sikertelenül próbálta visszaizolálni azokat. Ezekbıl a mintákból különbözı Bacillus-fajokat tenyésztett ki, amelyek in vitro körülmények között bakteriocin-termelınek bizonyultak a baktérium C típusával szemben. SANDLER és mtsai. /1998/ különféle vizes élıhelyekrıl származó 1600 üledékminta 32%-ából izoláltak aerob (élıhelyenként átlagosan 12%), illetve fakultatív vagy obligát anaerob mikroorganizmusokat (élıhelyenként átlagosan 23%), köztük Bacillus-, Streptococcus-, Clostridium-fajokat és sugárgombákat. Ezzel együtt a szerzık úgy vélik, hogy az általuk megmintázott területeken a szaporodást gátló mikrobák nem befolyásolták szignifikánsan a Clostridium botulinum populációkat.
2.5.7.3. Fágok Bár fágokat a Clostridium botulinum négy csoportja közül háromban (I-III.; lásd 1. táblázat) azonosítottak, a toxintermeléssel csak a III. csoportban hozhatók összefüggésbe /EKLUND és mtsai., 1989; SUNAGAWA – INOUE, 1992/. A C és D típusú Clostridium botulinum toxintermelése specifikus, pszeudolizogén, konvertáló (átalakító) bakteriofágok jelenlétéhez kötött (4. ábra, 4. kép) /EKLUND és mtsai., 1971; EKLUND és mtsai., 1972; INOUE – IIDA, 1970; INOUE – IIDA, 1971/. Mivel a madár-botulizmus megbetegedések kialakulásában a toxin szerepe kulcsfontosságú, a toxinogenezist kiváltó bakteriofágok szerepe hasonlóan jelentıs. Pszeudolizogén (más néven instabil lizogén) fágok esetében a gazda-fág kapcsolat instabil, és a fág könnyen eltőnik a gazdasejtbıl. A fág - gyakran spontán - elvesztése egyben a toxintermelı képesség elvesztését is jelenti, de egyben érzékenyebbé is teszi a baktériumot az esetleges újrafertızıdésre. Toxintermelı törzsek passzálásával nyert, atoxikus Clostridium botulinum baktériumok fágokkal történı újrafertızése a toxinogén tulajdonság visszatérését eredményezi,
42
azonban bakteriofágok hiányában az atoxicitás stabil és permanens állapot. A fágvesztés in vitro körülmények között hıkezelés, ultraibolya-sugárzás, akridin-oranzs vagy fág-specifikus antiszérum hatására is bekövetkezik /EKLUND és mtsai., 1971; EKLUND és mtsai., 1972/.
4. ábra. A Clostridium fágok morfológiája. A C és D típusokkal a CEβ jelő faj rokonítható (ACKERMANN – DUBOW /1987/ illetve ACKERMANN /1974/ nyomán, módosítva).
Toxint nem termelı, Clostridium botulinum-hoz hasonló Clostridium-okat gyakran izolálnak a környezetbıl; toxintermelı kultúrák pedig laboratóriumban, különösen többszöri passzálást követıen, atoxikussá tudnak válni. Ezek a tapasztalatok egyaránt arra utalnak, hogy a fág nem kapcsolódik stabilan a gazda kromoszómájához. /HUNTER – POXTON, 2002/ Érdekes módon, a C és D típusú Clostridium botulinum-törzsek között ún. interkonverzió is felléphet, melyet a természetben a pszeudolizogén állapot segíthet elı /EKLUND – POYSKY, 1974; HUNTER – POXTON, 2002/: az atoxikus törzseket a C és D típusú fágok egyaránt megfertızhetik. Ennek eredményeképp a C és D típusú törzsek háromféle toxint termelhetnek: C-t, C2-t és D-t.
43
4. kép. A Clostridium botulinum C és D típusának fágjai: 1) 3Ctox+, 2) 4Ctox+, 3) 1Dtox+, 4) 2Dtox+. 142600X-os nagyítás. A segédvonal hossza 50 nm (EKLUND – POYSKY, 1974).
JANSEN /1971/ számolt be arról, hogy egy Cα típusú törzs C, C2 és D típusú toxint termelt, míg egy Cβ típusú törzs csak C2-t, egy D típusú törzs pedig C és D típusú toxinokat. Késıbb kimutatták, hogy néhány D típusú törzs C2 toxint is képes szintetizálni /EKLUND – POYSKY, 1972/. A jelenség molekuláris biológiai hátterét MORIISHI és mtsai. /1996a, 1996b/ vizsgálták, míg a C típusú fág genomját és a pszeudolizogenitás molekuláris mechanizmusát SAKAGUCHI és kollégái /2005/ térképezték fel. TAKEDA és kutatócsoportja /2005/ madár-botulizmus esetek kapcsán izolált Clostridium botulinum törzsek neurotoxin-génjének elemzése során arra a
44
megállapításra jutott, amely szerint az kétharmad részben a C típusú, míg egyharmad részben a D típusú neurotoxin génjébıl épül fel. 1993-ban HAUSER és mtsai. bebizonyították, hogy a C3 toxin termelésének génje is egyaránt megtalálható a C és D típusú fágokon.
HARIHARAN és MITCHELL /1976/ szerint az egyes C típusú Clostridium botulinum törzsek toxigenitásában fellelhetı különbségek a fágok által indukált lízis eltérı mértékére vezethetık vissza, ennek teljessége viszont megfelelı környezeti feltételeket (hımérséket, ionkoncentráció, pH stb.) igényel. E kijelentés alapján, az egyes élıhelyeken vizsgált környezeti paraméterek szerepe még inkább felértékelıdik, hiszen a baktériumok mellett a bakteriofágok környezeti igényei is befolyásolhatják a madárbotulizmus megbetegedések elıfordulását és mértékét.
2.5.7.4. A lehetséges áldozat toxinfelvétele Ha a baktérium az iszapban is elkezd szaporodni, a toxin ott is feldúsulhat. A vízben, botulizmusban elpusztult madarak tetemébıl származó, a fenékre lesüllyedı légyálcák is magukkal vihetik, majd bomlásuk során szennyezhetik az iszapot a toxinnal. A madárdögök nagymértékben toxikussá váló szöveteibıl szintén kioldódhat a toxin az azokat
körülvevı
vízbe.
HUBÁLEK
és
HALOUZKA
/1991/
8
LD50/ml
toxinmennyiséget mértek egy olyan vízmintában, melyet egy madártetemtıl 1 méterre győjtöttek, azonban az 5 méterrıl, vagy annál távolabbról származó minták (víz, iszap és gerinctelenek) már nem tartalmaztak toxint. A toxin legfıbb forrását a légyálcák és egyéb gerinctelenek (pl. piócák, szúnyoglárvák, víziászkák) jelentik, amelyekre nézve a toxin hatástalan, így az nagymértékben dúsulhat fel bennük, egyebek mellett létrehozva az ún. „tetem-lárva” (carcass-maggot) ciklust illetve a késı ıszi – téli – kora tavaszi kitöréseket (lásd késıbb). A
dögökbıl
kifejlıdı
légyálcák
igen
nagy
veszélyt
jelentenek
az
egyes
madárpopulációkra nézve, hiszen azokat az állatok elıszeretettel fogyasztják (5., 6. kép). A helyzetet tovább súlyosbítja, hogy a megbetegedett, és így lelassult, elgyengült madarakat fajtársaik gyakran csipkedik, ezzel felvéve a véráramukba került toxint.
45
2.5.7.5. A baktériumok és a toxin szétterjesztése A kanadai Nicholson’s sziget fácántartó telepén történt sorozatos kitörések kapcsán FISH és mtsai. /1967/ jegyezték meg, hogy ha az elpusztult madarakat nem győjtötték be idıben, hamarosan a szigeten igen gyakori Lucilia illustris lárvái fejlıdtek ki bennük, s nem ritkán további 10-20 olyan madár tetemét találták körülöttük, amelyek ezeket a légyálcákat fogyasztották el – a bennük felhalmozódott C típusú toxinnal együtt.
5. kép. Madár-botulizmusban elpusztult kacsa tetemén kifejlıdött légyálcák tömege – a megbetegedés újabb forrásai (LEIGHTON /2000/; fotó: BOLLINGER).
A fácánok csillapíthatatlan étvággyal csipegetik fel a lárvákat, otthagyva minden más táplálékot. Egy nap leforgása alatt egy fácán akár nyüvek százait is bekebelezheti, de ezek közül nem egészen tíz darab elegendı lehet egy madár elpusztításához /BOROFF – REILLY, 1962/. A szerzık az eset helyszínérıl származó légyálcákat egészséges fácánokkal megetetve sikeresen hozták létre a botulizmus jellegzetes tüneteit. A madártetemeken található légyálcák akár 400000 egér LD50/g toxint is tartalmazhatnak /DUNCAN – JENSEN, 1976/. A C típusú botulinum toxin vízimadarakra vonatkoztatott LD50 értéke becslések szerint 36000 – 43000 LD50/ttkg /ROCKE és mtsai., 2000/, így akár egyetlen toxikus légyálca elfogyasztása is végzetes következményekkel járhat.
46
A legtöbb vízimadár közvetlenül nem fogyaszt gerincesek tetemébıl, nem úgy a rajtuk kifejlıdı légyálcákból. Így a vízimadarak botulizmusa – a tetem-lárva cikluson keresztül - gyakran válik önfenntartóvá, ismerve azt a tényt, hogy a toxikus lárvák játsszák a legnagyobb szerepet a hatalmas egyedszámot érintı madárpusztulások létrejöttében /WOBESER, 1997/.
6. kép. Az elfogyasztott toxin-tartalmú légyálcáktól elpusztult nyílfarkú récék. A képen látható lárvák 1g-ja 10000 egér elpusztítására képes (LEIGHTON /2000/; fotó: WOBESER).
A tetem-lárva ciklust számos faktor befolyásolja, többek között a légy-sőrőség és környezeti feltételek, mint például a hımérséklet és a szélsebesség, melyek elısegítik a legyek peterakását, a lárvák fejlıdését és a tetemekbıl történı szétterjedését /REED – ROCKE, 1992; WOBESER és mtsai., 1997/. Ezzel együtt, a legkritikusabb tényezı a toxinogén tetemek sőrősége – olyan dögöké, amelyek Clostridium botulinum spórákat
47
tartalmaznak, s ezek vegetatív formává alakulva toxint termelnek /REED – ROCKE, 1992/. DUNCAN és JENSEN /1976/ vizsgálatai alapján a lárvákkal borított madártetemek 85-90%-a tartalmazott toxikus légyálcákat, míg egy másik tanulmány szerint ez az arány 29-69% között változik /REED – ROCKE, 1992/. Bár nem minden tetem válik lárvákkal fertızötté, vagy bocsát ki toxikus lárvákat, azok a tényezık, amelyek csökkentik a toxikus tetemek hozzáférhetıségét egy adott élıhelyen, úgymint a dögevı ragadozók jelenléte vagy a tetemek összegyőjtése, csökkenthetik a vízimadarak botulinum toxinnal szembeni kitettségét /ROCKE, 2006/.
REED és ROCKE /1992/ szerint spórás formájú baktériumot hordozhat a vizes élıhelyeken fellelhetı élılények zöme, beleértve a gerincteleneket, például különféle vízi rovarokat, puhatestőeket és rákokat és sok gerincest, többek között madarakat és halakat. NOL és mtsai. /2004/ három egymást követı évben végzett vizsgálatai arra mutattak, hogy a botulizmus szempontjából endémiás, Dél-kaliforniai Salton Sea területén élı tilapia-k (Oreochromis mossambicus) béltartalma 1-9%-ban tartalmazta a C típusú botulinum toxin termeléséért felelıs gént. Kedvezıtlen környezeti feltételek mellett (például alacsony oldott oxigén-tartalom, kék- vagy zöldalga-virágzás) esetlegesen fellépı halpusztulások során a haltetemekben levı spórák könnyen fejlıdésnek indulhatnak, s a dögök – a madártetemekhez hasonlóan – nagy mennyiségő botulinum toxin forrásai lehetnek. SMITH és TURNER /1989/ azonos kiindulási mennyiségő, C típusú Clostridium botulinum spórát inkubáltak egér-, madár-és haltetemekben, azt vizsgálva, hogy az egyes gerinces fajok milyen mértékben képesek elısegíteni a baktériumok toxigenezisét. A legmagasabb toxintitert az egértetemekben mérték, majd a madár- és a haltetemek következtek. Ezzel együtt kísérletileg is bizonyították, hogy a haltetemek megfelelı rezervoárt jelenthetnek a botulizmus kórokozói számára. Bár a halakból közvetlen toxinkimutatás nem történt, mégis elgondolkodtató az a tény, amely szerint a hal- és (botulizmus kapcsán elıforduló) madárpusztulások a Kis-Balaton területén néha egy idıben jelentkeznek /CSABA, 1996/. Amint az korábban már említésre került, a madártetemek mellett – a baktérium spóráinak egyes élıhelyek között történı átvitelével – az élı egyedek is szerepet játszanak a C típusú Clostridium botulinum terjesztésében /ROSEN, 1971; SMITH és mtsai., 1975/. 48
2.5.7.6. Egyéb faktorok A melegebb idıszakokban egyes fonalas kékalga-fajok által okozott vízvirágzás és a madár-botulizmus kitörések közötti összefüggés számos kutatás tárgyát képezte. Az Erie- és Huron-tavon rendszeresen jelentkezı megbetegedésekkel egyidejőleg több ízben jelentettek Anabaena, Aphanizomenon és Microcystis-fajok által kiváltott masszív kékalga-virágzást /BRITTAIN és mtsai., 2000/. Egy londoni kitörés kapcsán az Oscillatoria agardhii kékalgafaj jelenlétérıl számoltak be KEYMER és mtsai. /1972/, melynek toxicitása madarakon nem igazolódott, egértoxikus volta azonban igen. KÖHLER és mtsai. /1977/ szintén kék algával túlszaporodott öblöket jelöltek meg az 1975-ös, Berlin környéki madárpusztulások helyszíneiként. MURPHY és mtsai. /2000/ mutattak rá arra, hogy bár a botulizmus és a toxikus kékalgák közti kapcsolat bizonytalan, a microcystin-termelı fajok érzékenyebbé tehetik a madarakat a megbetegedéssel szemben. A Kis-Balaton területén a korábban felsorolt fajok szintén képviseltetik magukat, gyakran okozva nyári vízvirágzásokat /MÁTYÁS, 1996/. WOO és mtsai. /2010/ egy 93 madarat érintı Dél-koreai kitörés során hét elhullott tıkés récébıl mutattak ki peszticideket (diazinont és forátot), két foltoscsırő récébıl (Anas poecilorhyncha) pedig madárinfluenza vírust, melyek szintén érzékenyíthették az állatokat. A növényvédı szerek a vízi élılények elpusztításán keresztül a szervesanyagtartalom
emelkedéséhez
is
hozzájárulhattak,
ezzel
növelve
a
megbetegedés
kialakulásának kockázatát.
Nem nehéz belátni, hogy a madarak sőrősége szintén befolyásolhatja a madárbotulizmus kitörések létrejöttét és annak mértékét. Ha egy élıhely eltartó-képességét megközelíti, vagy meghaladja az ott fellelhetı madarak száma, a megbetegedés, járványszerő jellegébıl adódóan jóval könnyebben, gyorsabban és nagyobb mértékben tizedelheti meg a jelen lévı madárpopulációt. A több madár potenciálisan több madárdögöt is jelent, s bár a kitöréseket elindító elsıdleges szubsztrát máig ismeretlen, az általánosan elfogadott nézet szerint azt az elpusztult madarak tetemei jelentik /WESTPHAL, 1991; REED – ROCKE, 1992; EVELSIZER, 2003; SOOS – WOBESER, 2006/. Ezért a bármilyen okból elhullott madarak
begyőjtése
kulcsfontosságú a madár-botulizmus megbetegedések megelızése, vagy a fertızési lánc (tetem-lárva ciklus) megszakítása érdekében /SOOS – WOBESER, 2006; EVELSIZER, és mtsai., 2010/.
49
2.5.8. Madár-botulizmus Magyarországon Bár hazánkban a botulizmus – több más országgal ellentétben – az intenzív tartású broilerekben nem okoz gondot, a természetes élıhelyeken élı, illetve ahhoz hasonló körülmények között tartott fácánok és vízimadarak esetében több ezres egyedszámot érintı pusztulásokat, s ezzel igen jelentıs gazdasági károkat idéz elı. Magyarországon a LEHOCZKINÉ által dokumentált elsı estet, amely 1959-ben, a Szeged környéki Fehér-tó természetvédelmi területen jelentkezett, az 1960-as évek elejétıl továbbiak követték. Ellentétben az irodalmi adatokkal, a megbetegedések nem vízi vadmadarak között, hanem halastavakon tartott házikacsa-állományokban fordultak elı. Erre az idıszakra esett egy új termelési ág, a halastavi kacsatenyésztés kezdete, amely tenyésztési forma Európában egyedülálló volt. Ez a tartási mód abban állt, hogy a vízfelület nagyságától függıen több ezer kacsa négyhetes korában kikerült a halastavakra, ahol a vízen úszó önetetıkbıl táplálkoztak, és gyakorlatilag csak éjszakára húzódtak ki a partra, vagyis a vadmadarakhoz igen hasonló körülmények között éltek. A kihelyezést kora tavasztól nyár végéig állandóan ismételték. A pozitívumokat az alacsony munkaerı- illetve állóeszköz-befektetésben látták, és abban bíztak, hogy a halak és a kacsák együttes tartása további kölcsönös elınyöket fog biztosítani. Valószínő, hogy az ilyen célra igénybe vett tavakon már akkoriban elıfordult a betegség a vadkacsák között, arányai azonban kisebbek voltak. A vadmadarak megbetegedésének felfedezése elmaradt, talán azért is, mert a szervezett környezet- és természetvédelemre korábban még nem fordítottak kellı figyelmet. Már az 1960-as években történtek vizsgálatok, amelyek a betegség kóreredetét kívánták tisztázni, azonban ezek nem jártak eredménnyel. Japán szerzık cikkeinek hatására felmerült a kék algák, illetve a kék-zöld algák toxinjának szerepe is, de a toxikológiai vizsgálatok ezt nem igazolták: a betegség jelentkezésekor az érintett tavakból vett vízvalamint iszapminták itatása, illetve megetetése egészséges állatokkal soha nem okozott mérgezést. Így a hazai szakmai nyelvben a „tavi bénulás” kifejezés terjedt el, ami a kóroktan pontos tisztázásáig a halastavakon tartott kacsák között elıforduló, jellegzetes klinikai képben megnyilvánuló betegséget jelölte. A megbetegedés kezdetben csak bizonyos körzetekben jelentkezett, nevezetesen a Tiszántúlon, majd az évek során lassan megjelent a Duna-Tisza közén és a Dunántúl néhány halastaván is. Azokon a tavakon, ahol elıfordult, azután gyakorta lépett fel, mindig nyár végén, augusztus-szeptember hónapban, de a melegebb nyarú években már
50
júliusban is. A veszteség egy-egy érintett állományban nem ritkán az 50%-ot is meghaladta /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.
Az elhullások megelızésére különféle gyakorlati módszereket próbáltak alkalmazni, mérsékelt sikerrel. Ezek egyike volt, hogy a vízfelületen motorcsónakkal jártak, a hullámzás fokozásával „átlevegıztetve” azt. Kísérleteztek azzal is, hogy a sekéllyé vált partszegélyt, ahol az alacsony vízmagasság miatt a víz felmelegedése különösen nagymértékő, kimélyítsék, a kacsák partra jutását pedig stégek kialakításával próbálták megkönnyíteni. Minthogy az eredmény legtöbbször elmaradt, a még egészséges egyedeket a partra kellett kihajtani, befogni, takarmánnyal és vízzel ellátni, ami több ezres állományok esetén nem könnyő feladat, különösen miután az állatok tetemes része már mozgásában korlátozott /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.
A továbbiakban ismertetésre kerülı hazai esetek kapcsán is érdemes megfigyelni, hogy a környezeti tényezık – a korábban leírtakkal összhangban – miként segítették elı a megbetegedések létrejöttét, illetve idı- és térbeli kiterjedését.
A mai Kiskunsági Nemzeti Parkhoz tartozó Péteri-tóról 1977. augusztusában jelezték, hogy nagyszámú mozgásképtelen vadkacsát és egyéb vízimadarat látnak; a vízben és a környezı nádasban pedig számos madártetem található. A szerzık helyszíni vizsgálataik során megállapították, hogy a tó partszegélye az eredetihez viszonyítva mintegy 15-20 méterrel beljebb húzódott, s a vízszint csak 15-25 cm magas volt. A part közelében sok tıkés réce és cigányréce ült az iszapban, jellegzetes paralitikus testtartásban. A parton számos vízimadár-hulla volt látható. A járvány mintegy három hétig tartott, ez idı alatt becslések szerint mintegy 900 különbözı víziszárnyas, zömmel kacsafélék hullottak el /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A laboratóriumi vizsgálatra került 12 réce és 1 gulipán tetem kórboncolása során a heveny szívgyengeségre utaló nagyvérköri pangáson kívül elváltozást nem lehetett megállapítani. Hasonlóképp negatív eredménnyel zárult a parenchymás szervek (lép, máj, vesék), valamint a központi idegrendszer kórszövettani vizsgálata és a bakteriológiai vizsgálatok is /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.
A második eset a Balaton déli partján, egy gazdaság vadásztavára kihelyezett vadkacsák között fordult elı, ugyancsak 1977-ben. Ezek korábban mély fekvéső, mezıgazdasági 51
mővelésbe vont területek voltak. A tavakat úgy alakították ki, hogy a növényi vegetációt egyszerően vízzel elárasztották. A betegség itt 4 év óta ismételten jelentkezett, az elhullás 1976-ban 3000 körüli volt /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. Minthogy az adott élıhelyen madár-botulizmus a korábbi években is elıfordult, számítani lehetett a járványra és ezért 1977-ben a szerzık rendszeresen mérették a levegı és a víz hımérsékletét. A megbetegedések itt is augusztusban jelentkeztek, amikor a víz hımérséklete már mintegy 30 napja tartósan 20°C felett volt. A klinikai kép és a 26 vadkacsát érintı kórbonctani észlelések a Péteri-tavi járványban tapasztaltakhoz hasonlóak voltak /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.
Botulinum toxin kimutatása céljából a Péteri-tavi esetbıl hat, míg az utóbbi járvány kapcsán négy beteg vadkacsa vérsavójából és izomszuszpenziójából készített vizes kivonattal történt kísérleti egéroltás és in vitro toxinsemlegesítési vizsgálat. A vizsgálati anyagokat ip. oltották kifejlett egerekbe. Az antitoxinok szovjet gyártmányúak voltak. Az in vitro semlegesítést a vizsgálati anyag és az antitoxin 37°C-on 30 percig történı inkubációjával végezték. Mind a Péteritavi, mind a Balaton környéki esetben a beteg madarak vérsavója (a Péteri-tavinál izomszuszpenziója is) toxikus volt. A toxinhatást C típusú antitoxinnal a neutralizációs teszt keretében semlegesíteni lehetett. Az A és B típusú antitoxin nem védte az állatokat /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. Mindkét területrıl származó iszap- és vízmintákat is vizsgáltak hasonló technikával, de toxint egyikbıl sem sikerült kimutatni. Amikor azonban az iszapmintákat folyékony táptalajon, anaerob módon tenyésztették hét napig, a baktériummentes felülúszó olyan mennyiségben tartalmazott botulinum toxint, hogy azt a szokásos mennyiségő antitoxinnal nem lehetett semlegesíteni. A szőrlet 1000-szeres hígításával végezve a próbákat a védetlen állatok elpusztultak, a C típusú antitoxinnal védettek fele, míg a C, A és B típusú antitoxinnal kombináltan védett madarak mindegyike életben maradt. Ez arra utal, hogy az iszapmintákban A és/vagy B típusú Clostridium botulinum spórák is voltak /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A balatoni gazdaság tavain a járvány 1978 nyarán megismétlıdött. Az elvégzett toxinkimutatási vizsgálatok és neutralizációs tesztek ez alkalommal is a C típusú botulinum toxin szerepét igazolták /BARTHA- SZTOJKOV, 1978/.
52
2.5.8.1. Madár-botulizmus a Kis-Balatonon A Fenékpuszta és Balatonhídvég közti vízfelületet elıször a Balaton 1833-ban készült térképe nevezi Kis-Balatonnak. Erre az idıre az egykori balatoni öböl nyilván már annyira eltérı jellegő volt a Balaton egyéb vízfelületeitıl, hogy megkülönböztetése indokolttá vált. Ekkortájt a Zala Balatonhídvég alatt beleveszett a nádasokkal és szabad vízfelületekkel tarkított mocsárba, így a vize a természetes mocsárvilágon át kellıen megszőrve jutott a Balatonba. Az 1960-as évekig tartó szabályozási munkák következtében azonban a Kis-Balaton és a környezı berkek vízminıségvédı funkciója megszőnt. Ehhez járultak különbözı civilizációs ártalmak: a vízgyőjtın folyó intenzív mezıgazdasági kemizálás, a fokozódó urbanizáció, a Balaton-üdülıterület rohamos fejlıdése és terjedése, az infrastruktúra hiányosságai, melyek együttesen a Balatonba jutó vizek minıségének jelentıs romlását okozták. Ennek elsı látványos jele a Keszthelyi-öbölben 1966-ban megfigyelt vízvirágzás volt. A kutatási eredmények alapján bebizonyosodott, hogy az eutrofizációért a nagy mennyiségben jelen levı tápanyagok (foszfor, nitrogén stb.) és egyéb hordalékok felelısek. A Balaton vízutánpótlásának 45 %-át a vízgyőjtı felérıl, az összes terhelés kb. felét kitevı tápanyaggal, hordalékkal (10000 - 15000 t) együtt a Zala folyó szállítja a Keszthelyi-öbölbe, ami az öböl sajátos áramlási viszonyai miatt nagyrészt ott is marad. Ennek szem elıtt tartásával készítette el a Nyugat-dunántúli Környezetvédelmi és Vízügyi Igazgatóság a Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer (KBVR) koncepciótervét, melynek alapgondolata az volt, hogy a hajdan öbölként, illetve mocsárként létezett Zala-völgy ismételt elárasztásával kialakuló mocsaras-nádas terület a Zala folyón érkezı tápanyagokat feldolgozza. A világon egyedülálló vízvédelmi rendszerrel az eddig a Balatonban – fıleg a Keszthelyi-öbölben – lejátszódó folyamatokat a Balaton elé, a Zala folyó alsó szakaszán kialakításra került KBVR területére helyezték át. Ez a megoldás a mintegy 200 évvel korábbi, természetes állapothoz hasonló viszonyokat hoz létre. A Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer I. üteme (Hídvégi-tó) 1985 óta üzemel. Ennek tározójából egy mőtárgyon át jut a Zala vize a II. ütem (Fenéki-tó) területére. A Zala-folyó természetes völgyében, Balatonhídvég és a Zala-torkolat közti területen létesül a Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer II. ütemének tározója, melynek kivitelezése 53
1984-ben kezdıdött. Pénzügyi okok miatt a munkálatok nem követték az elıre meghatározott ütemet, ezért a Balaton vízminıségének érdekében szükségmegoldás született. Ennek során 1992-ben elızetesen elárasztásra került egy 16 km2-nyi terület. A megtisztított, alacsonyabb tápanyag-tartalmú víz innen egy mőtárgyon keresztül jut a Zala-folyóba, majd a Balatonba (5. ábra) /NYUDUVIZIG, 2003/.
A Kis-Balaton egyedülálló madártani és természetvédelmi jelentıségő vizes élıhely, melyet 1951-ben nyilvánítottak védetté. 1986 óta tájvédelmi körzet, 1997-tıl a Balatonfelvidéki Nemzeti Park része. A védett, illetve fokozottan védett madárfajok tucatjainak otthont adó terület 1979-ben, a Ramsari Egyezmény keretén belül felkerült a nemzetközi jelentıségő vadvizek listájára. Bár madár-botulizmus szempontjából a Kis-Balaton gyakorlatilag endémiásnak tekinthetı, s a megbetegedések nem ritkán egymást követı években is felléptek a területen, az 1996 és 2006 közötti idıszakban például teljesen megszőntek (5. táblázat). A továbbiakban az 1993-ban bekövetkezett, részletesen dokumentált kitörés bemutatása következik. A környezeti faktorok szerepét ebben az esetben is érdemes megfigyelni. A KBVR II. ütemének 1992 ıszén történt részleges elárasztása során a vízszint 25-30 cm-t emelkedett, s a vízborítás alá került növénytársulások (magassásosok) bomlásnak indultak, eközben pedig nagy mennyiségő fehérje szabadult fel. Csapadék nem hullott, a Zala vízutánpótlása is le volt zárva. A növények bomlása, az alacsony vízállás, a meleg anaerob feltételeket teremtett, s ez kedvezett a Clostridium botulinum elszaporodásának. (A toxint késıbb az Országos Állategészségügyi Intézet a különbözı fajú madarakból vett vérsavó és a tetemekbıl vett légyálcák laboratóriumi vizsgálatával kimutatta.) Az elsı megbetegedett egyedeket 1993. június 22-én fedezték fel az Ingói-csatornán. Ettıl kezdıdıen a pusztulás intenzitása nagymértékben függött az idıjárástól. Hővösebb napokon, csapadék hullása után lecsökkent; meleg, kánikulai periódusokban megnıtt. Augusztusban a botulizmus kiterjedt az I. ütem területére is. Itt a sekély, növénymentes iszapzátonyokon az 5-10 cm-es vízborításnál a hımérséklet alkalmanként elérte a 40°Cot is. Bár kiterjedésre nézve az I. ütemen lényegesen nagyobb terület kedvezett a botulizmus elterjedésének, az elhullás mértéke mégis kisebb volt (az elpusztult 1001
54
madárból 192 hullott el itt). A pusztulás véglegesen csak az ıszi lehőlés és a jelentıs csapadék-utánpótlás után szőnt meg.
5. ábra. A KBVR I. és II. ütemének elhelyezkedése, illetve néhány madár-botulizmus kitörés helyszíne (ZLINSZKY /1997/ nyomán).
A kis-balatoni megfigyelések szerint a madarak utolsó erejükkel valamilyen védett helyre (szigetre, töltésoldalba) kivergıdve pusztulnak el. Az elhullott példányok 90%-ban ilyen helyeken fordultak elı. Nyílt vízen, nádasban (a korábban ismertetett két esettel ellentétben) viszonylag ritkán találtak madártetemeket. Szerencsés lett volna, ha nagy mennyiségő friss, oxigéndús vizet tudnak juttatni a területre, de ez ilyen nagyságrendben sajnos nem volt kivitelezhetı. Az I. ütem
55
területérıl lehetett volna ugyan vizet leengedni, ez esetben viszont ott szaporodott volna el a baktérium. Július végén kisebb mennyiségő vizet mégis leengedtek a I. tározóról a II. ütem területére. Sajnálatos módon a várt hatás elmaradt.
5. táblázat. Madár-botulizmus megbetegedések elıfordulása a Kis-Balaton területén, 1977 és 2007 között (MAGYARI; szóbeli közlés). A kitörés idıpontja 1977 1978 1988 1993 1994 1995 1996 2006 2007
Elpusztult madarak száma kb. 7000 kb. 50 499 1001 84 301 48 > 150** kb. 10
Megjegyzés tisztítatlan szennyvíz átemelése tisztítatlan szennyvíz átemelése az I. ütem elárasztása; rothadó növényzet a II. ütem részleges elárasztása; pusztuló magassásosok lásd az elızı évet tisztítatlan szennyvíz*; pusztuló magassásosok bőzös, opálos víz; H2S-termelı baktériumok elszaporodása rövid ideig tartó kitörés; megbetegedési gócpontok hiánya
*A sármelléki szovjet laktanya tisztítatlan szennyvize évtizedeken át ide került **E mellett a töltésoldalban, 150 m hosszan hevertek madártetemek
A C típusú antitoxin beszerzése és a megbetegedett állatokba történı bejuttatása is akadályokba ütközött. Preventív megelızési módszerként a fertızési gócot jelentı és viszonylag jól behatárolható, 2 km2-nyi területtıl (Ingói-csatorna és környéke) megpróbálták távol tartani a madarakat oly módon, hogy egy-két naponta, lehetıleg nagy zajjal (motorcsónakkal) többen mozogtak a területen, de az eljárás csak részben volt hatásos. A megbetegedett állatokat folyamatosan begyőjtötték, hiszen a területen maradó tetemek további fertızési gócokat hoztak volna létre. Az elpusztult egyedeket a balatonmagyaródi dögkútba szállították. A beteg, de még élı példányokat részben a Közép-Dunántúli Természetvédelmi Igazgatóság fenékpusztai csónakházánál kialakított „segélyhelyen”, részben a Magyar Madártani és Természetvédelmi Egyesület Zala megyei helyi csoportja által mőködtetett fenékpusztai győrőzıtáborban ápolták. A kezelés a következıkbıl állt: a begyőjtött madarakat megitatták. Mivel a megbetegedésbıl adódóan nyelési reflexük nem váltódott ki, nyelıcsövükön vékony gumicsövet bocsátottak le, melynek végére fecskendıt erısítettek. Elsı néhány alkalommal a kondíció javítására fehérjekoncentrátumot alkalmaztak, óvatosan, az esetleges félrenyelés veszélyét szem elıtt tartva. A madarak, állapotuktól függıen 1-2 óra, illetve 1 nap múlva már darabos táplálékot is kaptak.
56
A réceféléket, ludakat és szárcsákat vízben áztatott kukoricával tömték meg. Elıször 4-5 szemet kaptak, majd folyamatosan növelték a mennyiséget. A tömést óvatosan kellett végrehajtani, vigyázva arra, nehogy a táplálék a légcsıbe jusson, majd a szemeket óvatosan behúzni a begybe. Az áztatóvízbe kevés sót és étolajat tettek. A cankóféléket elıször szintén fehérjekoncentrátummal itatták, majd apróra vágott gilisztával etették meg ıket. Ideális módszer lett volna a pépesítés. A gémfélék apró halakat kaptak. A stressz miatt az elsı napokban kiöklendezték ıket. Ezt megakadályozandó, győrőt helyeztek el a nyakukon. A módszer nem vált be, mert a madarak igyekeztek megszabadulni tıle, s csırük állandóan beleakadt. Ehelyett a csır végét ragasztószalaggal áttekerték, majd azt az emésztés végeztével eltávolították. A gyógyuló madarakat ládákban helyezték el, ügyelve arra, hogy egy-egy ládába maximum 4 állat kerüljön, ezzel kerülve el, hogy egymást zavarják. Ideiglenes szállásaikba tálcákat tettek, melyeket tiszta vízzel töltöttek fel, s kukoricát, búzát és békalencsét szórtak bele. A fenti módszerrel – a madarak állapotától függıen – 3-6 nap alatt el lehetett érni a tünetmentességet, s a 151 élve begyőjtött állatból 77-et (51%) sikerült meggyógyítani. Az egészséges egyedeket győrőzés után olyan területeken engedték szabadon, ahol a megbetegedés veszélye már nem állt fenn. Ennek ellenére szerencsés volna a botulizmusból felépült madarakat a járvány végéig erre alkalmas röpdében tartani, hiszen ezek az egyedek újra megfertızıdhetnek /HORVÁTH és mtsai., 1994/.
A magyarországi madár-botulizmus esetek közül az Árpádhalmi Vadgazdaságban történt, 1978. májusi kitörés jelentkezett a legkorábban. Azévben az aszályos tavaszt hirtelen kánikula követte. Az 1979 és 1991 közötti 12 éves periódusban lezajlott hazai kitörések idıpontjainak vizsgálata az alábbi eredményekhez vezetett: 8 évben tapasztaltak megbetegedéseket a július 10-e és 31-e, míg 4 évben az augusztus 1-je és 21-e közti 3 hetes intervallumban. Ebben az idıszakban a legkorábbi esetrıl június 3-án (1989), míg a legkésıbbirıl október 5-én (1987) számoltak be /SZTOJKOV; szóbeli közlés/.
57
2.6. A baktérium illetve toxinja jelenlétének kimutatása A madár-botulizmus in vitro diagnosztizálása során felhasznált módszerek szinte kivétel nélkül a humán botulizmus megbetegedések kapcsán kifejlesztett technikák átvételével és továbbfejlesztésével jöttek létre. A baktérium kimutatását – annak lassúsága és nehézsége miatt – a gyakorlatban ritkán alkalmazzák, ezért inkább a toxintermelés képességének detektálásán alapuló metódusok terjedtek el. Ezek jobbára molekuláris biológiai illetve immunológiai alapokon nyugszanak. A megbízhatóság növelése érdekében az egyes technikákat sok esetben egymással kombinálva alkalmazzák. A továbbiakban a leggyakrabban használt módszerek áttekintése következik.
2.6.1. Egéroltás (mouse bioassay) Jelenleg az egyetlen standard módszernek tekinthetı, széles körben elfogadott és alkalmazott metódus a botulinum toxin kimutatására /ARNON és mtsai., 2001; FERREIRA és mtsai., 2003; BARR és mtsai., 2005/, legyen szó akár humán-, akár madár-botulizmus megbetegedésekrıl. A vizsgálat során a kísérletbe vont egereket ip. oltják be a kérdéses mintákkal. Ezt követıen az egerek egyik csoportját egyedenként különbözı szerotípusú monovalens botulinum antitoxinokkal védik, majd mindkét csoport egyedeit megfigyelik. Ha egy adott minta a minimális letális dózisnál nagyobb mennyiségben tartalmaz botulinum toxint, az ellenanyaggal nem védett egereken kifejlıdnek a botulizmus tünetei, majd az állatok elpusztulnak. Hasonló sorsra jutnak az eltérı szerotípusú antitoxinnal kezelt egerek is, a megfelelı típusú ellenanyagot kapott állatok azonban megbetegedés nélkül vészelik át a kísérletet. Ha a pozitív mintában nagy mennyiségben van jelen botulinum toxin, a tünetek általában 8 órán belül megjelennek. Alacsonyabb toxintiter esetén azonban a klinikai tünetek jóval lassabban fejlıdnek ki, így a negatív eredmény kimondása elıtt az egereket 4 napon át megfigyelés alatt kell tartani. A módszer legnagyobb elınye érzékenysége; hátrányai közt a viszonylagos lassúság, a nagyszámú kísérleti állat elpusztítása, a speciális állatházak igénye és az állatoltás, mint veszélyforrás említhetık meg /BARR és mtsai., 2005/.
58
2.6.2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Az ELISA-teszt, mint az egéroltás in vitro alternatívája, szintén immunológiai alapokon nyugszik. E vizsgálatok valójában olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek mőanyag felülethez vannak kötve, és a reakció enzimmel kapcsolt antitest segítségével követhetı nyomon. A szakirodalom direkt és indirekt ELISA-eljárásokat különböztet meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt módszer esetén az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az antitestet felismeri. Mindkét csoporton belül többféle változat lehetséges /KFDT, 2008/. Az ELISA gyorsabb, mint az egéroltás, érzékenységérıl azonban erısen megoszlanak a vélemények. Több kutatócsoport szerint /THOMAS, 1991; FERREIRA és mtsai., 2003; FERREIRA és mtsai., 2004/ általában kevésbé szenzitív, s ezért jelenleg inkább elızetes, screening módszerként alkalmazzák, melynek eredményeit egéroltással is szükséges megerısíteni. Más szerzık azonban humán- /DEZFULIAN és mtsai., 1984/ és
madár-botulizmus megbetegedések vizsgálata során /ROCKE és mtsai., 1998;
ZECHMEISTER és mtsai., 2002; ZECHMEISTER és mtsai., 2005; TRAMPEL és mtsai., 2005/ ennek épp az ellenkezıjét tapasztalták.
2.6.3. Molekuláris biológiai technikák 2.6.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) Napjainkban a különféle toxintípusú Clostridium botulinum baktériumok kimutatására felhasználható, polimeráz láncreakción alapuló molekuláris biológiai technikák igen nagy népszerőségnek örvendenek /SZABO és mtsai., 1993; KAKINUMA és mtsai., 1997; LINDSTRÖM és mtsai., 2001; AKBULUT és mtsai., 2004; NOL és mtsai., 2004; PRÉVOT és mtsai., 2007/. Ez a C típusú kórokozók által létrehozott madár-botulizmus megbetegedések
kapcsán
sincs
másként
/WILLIAMSON
és
mtsai.,
1999;
ZECHMEISTER és mtsai., 2002; ZECHMEISTER és mtsai., 2005; TRAMPEL és mtsai., 2005; OCEPEK és mtsai., 2007; FRANCIOSA és mtsai., 1996; LINDBERG és mtsai., 2010/. Mivel a betegség tüneteit kizárólag toxintermelı baktériumtörzsek képesek kiváltani, e reakciók mindegyike a Clostridium botulinum neurotoxin-termelés génjének egy-egy adott szakaszára specifikus primerek felhasználásán alapul,
59
függetlenül attól, hogy a kérdéses gén a bakteriális kromoszómán, esetleg egyéb elemen (plazmidon vagy bakteriofágon) kódolódik.
Az ún. real-time (valós idejő) PCR módszer alkalmazása során a termék(ek) mennyiségi elemzése minden ciklusban megtörténik, így láthatóvá válik a reakció kinetikája, ami informatívabb, mint a hagyományos PCR esetén a reakciótermék mennyisége a végpontban (telített reakció). Az a ciklusszám, amelynél (az ún. áttörési vagy áthajlási pontban (crossing point)) a szignál eléri a logaritmikus PCR fázist, a target DNS (RNS) kiindulási mennyiségének függvénye. Ennek ismeretében lehetıvé válik a target nukleinsav kiindulási mennyiségének pontos mérése /BME/. A továbbiakban a real-time PCR technika bıvebb bemutatása következik, az értekezésben található molekuláris biológiai vizsgálatok során használt LightCycler™ System mőködésén keresztül. A LightCycler™ egy fotométerrel kombinált gyors thermocycler, melyben a főtés és hőtés szabályozása forró és hideg levegı váltakozó alkalmazásával történik. A hıátadó közeg alacsony tömege miatt ezzel az eljárással rendkívül nagy hıátadási sebesség érhetı el (20°C/sec). A rendszer ugyanakkor reakcióedényként bórszilikát kapillárisokat használ, melyekben a nagy felszín/térfogat arány miatt igen hatékony a hıátadás. Az alkalmazott hıátadó közeg és a bórszilikát kapillárisok együttesen teszik lehetıvé az ultra-gyors ciklusváltásokat. Ebbıl adódóan a LightCycler™ teljesítménye eléri a 30-40 PCR ciklust 20-30 perc alatt, detektálást is beleértve! A bórszilikát kapillárisok egyidejőleg szignál-győjtı optikai elemként is szolgálnak, a száloptikához hasonlóan vezetve és a kapilláris hegyére koncentrálva a reakció során keletkezı
fényjeleket,
lehetıvé
téve
a
mikrotérfogatú
minták
fluoreszcens
monitorozásához elegendı fénykibocsátást. A minták a mintatárcsába kerülnek, mely 32 kapillárist képes egyszerre befogadni. A mintatárcsa a mintabetöltéshez a mőszerbıl kiemelhetı. A LightCycler™ System tartozéka egy felhasználóbarát szoftverrel ellátott PC is, ami biztosítja az analízis egyszerő és pontos kivitelezését. A hıciklusok alatt az egyes kapillárisokban lezajló reakció monitorozása on-line úgy történhet meg, hogy egy preciziós léptetı motor a (zárt) kapillárist, adott idıközönként, a mintatárcsa elforgatásával, pontosan a fluoriméter optikája fölé juttatja, a fluoreszcencia mérése céljából. 60
A fluoriméterben egy LED fényforrás (470 nm) valamint három (530-640-710 nm) szőrı található, multiplex detektálást téve lehetıvé. A szoftver minden mérési pontban valós idıben jeleníti meg a fluoreszcens jeleket. A mintából érkezı jelek mérése tehát olyankor történik, amikor a kapilláris az optikai egység fölé kerül. A hıciklusok alatt a fluoreszcencia minden kapillárisban ciklusonként mérhetı, a mért értékek a képernyın azonnal megjelennek és minden ciklus után tovább íródnak (kinetikus görbe). Az így keletkezı adatokat a számítógép a további elemzéshez tárolja.
A rendszer alkalmas szinte az összes, ún. real-time detektálási technológia felhasználására, így például SYBR Green, FRET (Fluoresence Resonance Energy Transfer), TaqMan, Molecular Beacon, Scorpion alkalmazások is futtathatóak rajta. A SYBR Green I festék az etidium bromidhoz hasonlóan interkalálódó molekula, amely a dupla szálú (ds) DNS-hez kötıdik az amplifikáló elegyben. Bekötıdve, adott monokróm fénnyel indukálva 530 nm hullámhosszúságú fényt emittál. Az ebbıl keletkezı mérhetı fluoreszcens jel nagysága a PCR folyamán felszaporodó dsDNS mennyiségével arányosan növekszik. A real-time mennyiségi meghatározás érdekében a fluoreszcencia mérése minden ciklusban megtörténik. Optimalizálásra kiválóan megfelel, s mivel nem igényel extra próbákat, relatív olcsósága miatt igen népszerő.
A LightCycler™ System segítségével olvadáspont-analízis is végezhetı a keletkezett PCR termékek elemzésére. Minden DNS fragmentumra jellemzı az olvadáspontja (Tm), mely definíciószerően az a hımérséklet, melyen az adott DNS fragmens 50%-a egyszálú. Az olvadáspontot leginkább befolyásoló tényezık: a fragmens G+C tartalma, valamint hossza. A LightCycler™ készülék a hımérséklet celsius-fokonkénti emelése közben képes folyamatosan monitorozni a keletkezı fluoreszcenciát. Amikor a kapillárisban a hımérséklet eléri a vizsgált fragmens Tm értékét, a fluoreszcencia emisszió hirtelen csökkenni kezd, az alkalmazott fluoreszcens technikától függıen vagy azért, mert a (duplaszál-specifikus) SYBR Green I leválik az amplikonról, vagy azért, mert a hibridizációs próbák az amplikonról leolvadva már nincsenek többé energiaátadásra alkalmas közelségben. Az olvadáspont-analízis egyebek mellett felhasználható a keletkezett termékek megkülönböztetésére, mivel a rövidebb termékek (pl. primer-dimerek) Tm értéke
61
alacsonyabb, mint a specifikus fragmensé, illetve ezek azonosítására, termékspecifikus Tm értékek kimérését követıen /BME/.
Az Invitrogen (USA) által kifejlesztett, ún. LUX (Light Upon eXtension) primerek új megközelítéső, fluoreszcens detektálási mechanizmuson alapuló real-time PCR reakciók elvégzését teszik lehetıvé. A LUX rendszerben minden primer-pár egy, a 3’ végéhez közel (a 2. vagy 3. nukleotidon) fluorofórral jelölt, fluorogén primerbıl, illetve egy megfelelı, jelöletlen primerbıl áll. A fluorogén primer 5’ végén egy rövid, 6-8 nukleotidból álló farki rész található. Az ennek segítségével létrejövı másodlagos hairpin-struktúra biztosítja a fluorofór optimális kioltását (quenching). Amikor a primer a PCR reakció során a kettıs szálú DNS termékkel kapcsolatba kerül, a fluorofór kioltódása megszőnik, ezzel akár tízszeres fluoreszcens jel-növekedést eredményezve (6. ábra) /PRIMERDIGITAL.COM, 2011/.
6. ábra. A LUX primer-alapú detektálási rendszer alapjai – relatív fluoreszcencia a primer térszerkezetének függvényében (INVITROGEN HOME PAGE /2011/).
A LUX primer-rendszer érzékenysége vetekszik a kettıs jelöléső próbákat alkalmazó platformokéval (pl. TaqMan, Molecular Beacon), ára az egyszeres jelölésbıl adódóan alacsonyabb, specificitása azonban némileg elmarad azokétól, ugyanezen okból kifolyólag. Mivel a SYBR Green I minden kettıs szálú DNS termékhez kapcsolódik, specificitása
alacsonyabb
a
LUX
rendszerénél,
amely
egyben
érzékenyebb
meghatározást is lehetıvé tesz. Költségeit, alkalmazásának egyszerőségét illetve olvadáspont-analízissel történı összekapcsolhatóságát tekintve azonban az utóbbi két módszer között nincs jelentıs különbség. Mindezek ellenére, a madár-botulizmus diagnosztikájában LUX primer-rendszeren alapuló metódus még nem került 62
publikálásra. Mi több, egészen a közelmúltig maga a real-time PCR sem szerepelt a kimutatási módszerek között. LINDBERG és mtsai. 2010-ben publikálták az elsı, BoNT/C gén-specifikus reakciókon alapuló kísérleteiket, melyek egyben a BoNTC/D kiméra szekvenciák detektálására is alkalmasak. Érdekes módon a három, általuk tanulmányozott svédországi eset egyikében sem a kizárólag C típusú, hanem éppen a C/D mozaik toxin szerepe volt igazolható. E tény figyelembe vételével a jövıbeli kutatásokat hazánkban is érdemes volna ebbe az irányba kiterjeszteni.
2.6.3.2. Ribotipizálás Az élılények filogenetikai rendszerezésében már évtizedek óta használt kis riboszóma alegység 16S RNS-ét kódoló gén vizsgálata a Clostridium botulinum egyes toxintípusainak elkülönítésében is a kutatók segítségére lehet /HIELM és mtsai., 1999; SKINNER és mtsai., 2000; POURSHABAN és mtsai., 2002; POURSHAFIE és mtsai., 2005/. E mellett alkalmas olyan, a Clostridium botulinum-tól eltérı Clostridium-fajok azonosítására is, amelyek képesek botulinum toxint termelni (ilyenek például a Clostridium butyricum és a Clostridium baratii /HALL és mtsai., 1985; McCROSKEY és mtsai., 1991; TRETHON és mtsai., 1995; TSUKAMOTO és mtsai., 2002/).
2.6.4. Biokémiai tesztek A klasszikus biokémiai alapú vizsgálatok során az egyes mikroorganizmusok azonosítása enzimkészletük feltérképezésével végezhetı el. E kísérletek folyamán a tiszta tenyészetben levı mikrobákat különbözı szubsztrátokat – leggyakrabban szénhidrátokat – tartalmazó közegekbe oltják, majd az eredményeket általában színváltozás alapján értékelik. Ugyancsak diagnosztikus értékőek lehetnek a mikrobák életfolyamatai során keletkezı különféle anyagcseretermékek, például az indol, az acetil-metil-karbinol (acetoin), az ammónia vagy a kén-hidrogén. A sokszor hıérzékeny szubsztrát-oldatok
körülményes
elkészítése
felgyorsította
olyan
gyorstesztek
megszületését, melyekben elıre elkészített kiindulási anyagok segítik a kutatók munkáját.
63
2.6.4.1. API Az API 20 A rendszer (bioMérieux SA, Franciaország) 21 teszt gyors és egyszerő elvégzését teszi lehetıvé, anaerob mikroorganizmusok biokémiai azonosításához. A dehidratált szubsztrátoknak a vizsgálni kívánt mikroorganizmus szuszpenziójával történı beoltását, majd a 24 órás, meghatározott körülmények között történı inkubálást, illetve a szükséges reagensek hozzáadását követıen az eredmények színváltozás alapján értékelhetık. A meglevık mellett egyéb vizsgálatokat (telep- és mikroszkópos morfológia, Gram-festés stb.) szükséges elvégezni, és az azokból levonható következtetéseket az azonosítás megerısítéséhez vagy kiegészítéséhez kell felhasználni. Az API Rapid ID 32 A az API 20 A-val alapjaiban megegyezı, de annál gyorsabb azonosítást tesz lehetıvé: a vizsgált anaerob tenyészetek 32-féle biokémiai jellemzıje már 4 órás, meghatározott körülmények között történı inkubálást, illetve a megfelelı reagensek hozzáadását követıen leolvasható a tesztcsíkról.
2.6.4.2. RapID ANA II A RapID ANA II rendszer (Innovative Diagnostics Systems, USA) szintén hagyományos és kromogén szubsztrátok segítségével teszi lehetıvé a vizsgált mikroorganizmus azonosítását, a beoltást, majd a meghatározott feltételek mellett történı inkubálást követı 4-5 óra elteltével, a szükséges reagensek hozzáadása után. Az eredmények értékelése, csakúgy, mint a korábbi tesztcsíkok esetében vizuálisan, vagy spektrofotométerrel történik.
Bár a fent ismertetett biokémiai azonosító rendszerek valóban gyors és meglehetısen egyszerő alternatívát jelenthetnek más technikákhoz képest, a különféle toxintípusú Clostridium
botulinum
illetve
egyéb
Clostridium-fajok
ily
módon
történı
azonosításának megbízhatósága többek szerint erısen kétséges /BRETT, 1998; LINDSTRÖM és mtsai., 1999/. Ezért talán a legszerencsésebb azokat egyéb módszerek segítségével már azonosított Clostridium botulinum törzsek biokémiai vizsgálatához felhasználni.
64
3. ANYAG ÉS MÓDSZER
3.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata Amint arról korábban már szó esett, a C típusú Clostridium botulinum szaporodására, és ezen keresztül a madár-botulizmus kitörések kialakulására bizonyos környezeti feltételek serkentıleg hathatnak. A dolgozat egyik célja e tényezık szerepének vizsgálata a Kis-Balaton területén bekövetkezett megbetegedésekben. Ehhez a Nyugatdunántúli Környezetvédelmi és Vízügyi Igazgatóság (NYUDUVIZIG) Keszthelyi Üzemmérnöksége által rendszeresen győjtött vízminıségi adatok, illetve a Keszthelyi Meteorológiai Állomás napi idıjárási adatai kerültek felhasználásra. A korábbi kitörések helyszíneinek figyelembe vételével (5. ábra) a Kis-Balaton teljes területe alacsony (AK) illetve magas kockázatú (MK) régiókra lett felosztva, melyekben a NYUDUVIZIG stabil mintavételi pontjai közül 5-5 került kiválasztásra (7. ábra).
7. ábra. Magas (●) és alacsony (■) kockázatú mintavételi pontok elhelyezkedése a KisBalaton területén. 65
A vizsgálatok során e stabil mintavételi pontok vízminıségi paramétereinek (vízhımérséklet, pH, vezetıképesség, oldott oxigén- és szervesanyag-tartalom) a NYUDUVIZIG Keszthelyi Üzemmérnöksége által heti-kétheti gyakorisággal győjtött adatai kerültek kiértékelésre, 5-5 magas (madárpusztulással járó; MK) illetve alacsony kockázatú (elhullással nem járó; AK) évben (6. táblázat). Mivel a megbetegedések legtöbbször június és szeptember hónapok között fordultak elı, az elemzés alá vont intervallumok minden évben ehhez igazodtak. A mintavételi helyek és az évek kombinációjával négy csoport került kialakításra (7. táblázat).
6. táblázat. A vizsgált magas (MK) és alacsony kockázatú (AK) évek. Vizsgált évek 1993 1994 1995 1996 2006 1997 1998 1999 2000 2001
Kockázat MK AK ● ● ● ● ●
Elpusztult madarak száma 1001 84 301 48 > 150* -
● ● ● ● ● *E mellett a töltésoldalban, 150 m hosszan hevertek madártetemek
7. táblázat. A vizsgált mintavételi helyek és évek kombinációjával létrejött csoportok. Csoport 1) MK pontok - MK évek 2) MK pontok - AK évek 3) AK pontok - MK évek 4) AK pontok - AK évek
Mintavételi pontok 6, 9, 10, 202, 203 6, 9, 10, 202, 203 4, 7, 205, 210, z27 4, 7, 205, 210, z27
Vizsgált évek 1993, 1994, 1995, 1996, 2006 1997, 1998, 1999, 2000, 2001 1993, 1994, 1995, 1996, 2006 1997, 1998, 1999, 2000, 2001
Az egyes csoportok statisztikai analízise az SPSS 16.0 statisztikai programcsomag segítségével,
egytényezıs
varianciaanalízis,
kétmintás
párosított
t-próba
és
diszkriminancia analízis felhasználásával valósult meg. A vizsgálatok menetérıl a 8. ábra tájékoztat. Az ugyanezen évek azonos periódusaiból származó meteorológiai adatok (napi minimum-, maximum- és középhımérséklet illetve napi csapadékösszeg) kiértékelése szintén egytényezıs varianciaanalízis és kétmintás párosított t-próba segítségével történt. 66
A
forrásadatok,
az
SPSS
statisztikai
programcsomag
próbaverziójának
elérhetısége illetve a statisztikai számítások a mellékelt CD-n találhatók. A diszkriminancia analízis vázlatos menete a függelékben olvasható.
8. ábra. Az egyes csoportok statisztikai elemzésének vázlata.
3.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval 3.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján A vizsgálatokhoz kapcsolódó mintavételek a Kis-Balaton területének öt, a madárbotulizmus szempontjából magas kockázatú pontján történtek. Az üledék felsı 10 cmébıl, kézi iszapmintavevı segítségével 100-100 g került begyőjtésre, majd 4-5 órán belül -20°C-on történı fagyasztásra. A totál DNS kivonása a minták 0,25 g-jából, a golyósmalom elvén alapuló, így mechanikai feltárást is végzı PowerSoil™ DNS izoláló kit (MoBio, USA) felhasználásával történt, a gyártó javaslatai szerint. A szóban forgó kit nagy elınye, hogy a DNS kivonás során megköti azokat a talajban elıforduló
67
humuszanyagokat (pl. huminsav, fulvonsav), amelyek máskülönben gátolnák a PCR reakciók lefolytatását. Az alább ismertetésre kerülı polimeráz láncreakciók a BoNT/C1-gén egy 225 bp mérető szakaszának amplifikációját célozták. A 20 µl végtérfogatú PCR reakcióelegyek az alábbi összetevıket tartalmazták: 2 µl 10x PCR puffert (1x: 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl [pH 8.8] és 0,1% Triton X-100; Finnzymes, Finnország), 2,0 mM-t az egyes dNTP-kbıl, 20 pM-t az egyes primerekbıl (Metabion, Németország), 0,4 U DynaZyme DNS polimerázt (Finnzymes, Finnország) és 20 ng DNS templátot. A reakciók 0,2 ml-es, vékony falú polipropilén PCR csövekben (AHN, Németország), DNS thermal cycler (RoboCycler; Stratagene, USA) segítségével kerültek lejátszásra, nested reakciók során a kezdı PCR termék 2 µl-ének felhasználásával. A kezdı illetve nested PCR reakciók amplifikációs profilját a függelék tartalmazza. A
BoNT/C1-gén
specifikus
primerek
a
leírtakkal
megegyezı
formában
és
kombinációkban kerültek alkalmazásra, melyek szekvenciái ugyancsak a függelékben találhatók. Pozitív kontrollként a C típusú Clostridium botulinum 468-as, illetve 2145-ös törzsei szolgáltak (források: T. E. Rocke és J. L. Williamson, USGS National Wildlife Health Center, Madison, Wis, USA (468); F. Gessler, Georg August University of Goettingen, Institute for Applied Biotechnology in the Tropics, Göttingen, Németország (2145)). A keletkezett PCR termékek elkülönítése 1,5%-os agaróz gél-elektroforézissel történt, 0,5x-es TBE pufferben (HU25; Scie-Plas, Egyesült Királyság). Ezt a termékek 20 percig tartó festése követte etidium-bromid oldatban, majd vizualizálásuk és fényképezésük, géldokumentációs rendszer felhasználásával (Gene Genius Bio Imaging System; Syngene, Egyesült Királyság).
A minták begyőjtésével egyidıben két tıkés réce pusztult el a Kis-Balaton területén, nem sokkal azután, hogy felépültek a madár-botulizmusból. Vakbéltartalmuk feldolgozása az elızıekben leírtak szerint ugyancsak megtörtént. Ezzel párhuzamosan valamennyi üledék- és vakbéltartalom minta 4 napig tartó tenyésztésnek lett alávetve, Schaedler táplevesben (Scharlau, Spanyolország), 30°C-on, anaerob körülmények között. A tenyésztést megelızıen a minták egyik része 70°C-os vízfürdıben 15 percig tartó hıkezelésen esett át, a vegetatív sejtek elpusztítása céljából.
68
A tenyésztést követıen a hıkezelt és hıkezeletlen minták Schaedler agar lemezekre lettek szélesztve (Scharlau Chemie, Spanyolország), majd 3 napig 30°C-on anaerob körülmények között kerültek inkubálásra. Az agarlemezekrıl izolált telepek feldolgozása a tenyésztés nélküli minták esetében ismertetett metodika szerint történt.
3.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján A módszer vizsgálatához felhasznált DNS izolátumok a korábban említett, tenyésztett és tenyésztés nélküli, hıkezelt illetve hıkezeletlen üledék- és vakbéltartalom-mintákból származtak. Az 50 µl végtérfogatú PCR reakcióelegyek összetétele megegyezett a FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által leírtakéval, egy különbséggel: esetünkben a PCR puffer 1% Triton X-100-at is tartalmazott, a MgCl2 mellett. A reakcióelegyek alkotórészei: 10x PCR puffer (1x: 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl [pH 8.8] és 0,1% Triton X-100; Finnzymes, Finnország), 200 µM az egyes dNTP-kbıl, 1 µM az egyes primerekbıl (Metabion, Németország), 0,4 U DynaZyme DNS polimeráz (Finnzymes, Finnország) és 2 µl DNS templát. A reakciók 0,2 ml-es, vékony falú polipropilén PCR csövekben (AHN, Németország), DNS thermal cycler (RoboCycler; Stratagene, USA) segítségével kerültek lejátszásra. A változatlan formában átvett amplifikációs profilt, illetve a BoNT/C1-gén jelenlétére utaló, 615 bp mérető PCR terméket eredményezı primerek szekvenciáit a függelék tartalmazza.
Csakúgy, mint korábban, pozitív kontrollként a C típusú Clostridium botulinum 468-as, illetve 2145-ös törzsei szolgáltak. A
keletkezett
PCR
termékek
elkülönítése
ugyancsak
1,5%-os
agaróz
gél-
elektroforézissel történt, 0,5x-es TBE pufferben (HU25; Scie-Plas, Egyesült Királyság). Ezt a termékek 20 percig tartó festése követte etidium-bromid oldatban, majd vizualizálásuk és fényképezésük, géldokumentációs rendszer felhasználásával (Gene Genius Bio Imaging System; Syngene, Egyesült Királyság).
3.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján A FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által publikált hagyományos PCR metódus vizsgálata során szerzett pozitív tapasztalatok vezettek real-time környezetbe történı átültetésének kísérletéhez. Ennek keretében a hagyományos PCR reakciók során felhasznált primerek
69
kerültek alkalmazásra, ebben az esetben azonban egy LightCycler® 1.5 készülékre optimalizált, SYBR Green I alapú real-time rendszerben, olvadáspont-analízissel kiegészítve. A LightCycler®FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche, Németország) felhasználásával összeállított, 20 µl végtérfogatú PCR reakcióelegyek a következı reagensekbıl álltak: 2 µl reakciópuffer (ez egyben tartalmazza az enzimet és a dNTP-t is), 2,4 µl MgCl2, 2 µl az egyes primerekbıl (20 pM végkoncentrációban), 9,6 µl PCRvíz illetve 2 µl DNS templát. Annak érdekében, hogy a reakciók során a lehetı legkevesebb nemspecifikus termék keletkezzen, mind a reakcióelegy összetétele, mind a reakció profilja optimalizálási lépéseken esett át. Ezek során a kapcsolódási (annealing) hımérséklet, illetve a MgCl2 és a primerek koncentrációjának aprólékos és szisztematikus változtatása történt meg. Az optimalizálást követıen kialakult, a célnak leginkább megfelelı PCR profil a függelékben olvasható. A módszer specificitásának vizsgálata 16, humán patogén baktériumfaj DNS-ének bevonásával történt, amelyek a következık voltak: Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Streptococcus
pyogenes,
Streptococcus
pneumoniae,
Enterococcus
faecium,
Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphteriae, Neisseria meningitidis és Legionella pneumophila. Az egyes DNS-ek részben az Országos Epidemiológiai Központ, részben a Magyar Honvédség győjteményébıl származtak. A fenti módszert alkalmazva a Kis-Balaton területérıl származó iszapminták ugyancsak feldolgozásra kerültek. A totál DNS kivonása a minták 0,25 g-jából, PowerSoil™ DNS izoláló kit (MoBio, USA) felhasználásával történt, a gyártó javaslatai szerint. Pozitív kontrollként minden esetben a C típusú Clostridium botulinum 2145-ös, illetve 2279-es törzsei szolgáltak (forrás: F. Gessler, Georg August University of Goettingen, Institute for Applied Biotechnology in the Tropics, Göttingen, Németország). A metódus érzékenységének meghatározása e két kontroll törzs DNS-ébıl készített, öt tagú (101x – 105x) hígítási sor olvadáspont-analízisével történt, a TAPONEN és mtsai. /2009/ által leírt összefüggés segítségével. A szóban forgó DNS-ek kiindulási koncentrációjának meghatározásához NanoDrop ND-2000 spektrofotométer (Thermo Scientific, USA) került felhasználásra.
70
A PCR reakciók során keletkezett termékek elkülönítése chip-elektroforézissel, Agilent 2100 Bioanalyzer készülék (Agilent, USA) segítségével került lefolytatásra.
3.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók A C. botulinum BoNT/C1 génjére specifikus LUX primerek megtervezése az Invitrogen D-LUX
primertervezı
programjával
(http://escience.invitrogen.com/lux/index.jsp)
történt. Az eredmények Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/) illetve Oligo Analyzer programok (http://www.softpedia.com/get/ScienceCAD/Oligo-Analyzer.shtml) segítségével lefolytatott visszaellenırzését követıen, a primerek GC arányának és olvadáspontjának közelítése vált szükségessé. Ennek érdekében, a fent említett programok felhasználásával, némileg módosított primerek kerültek megtervezésre, majd legyártásra (Kromat, Magyarország). A reverse, fluorogén primer szintetizálására a LUX mintájára, FAM (foszforamidit) fluorofórral jelölve került sor, míg a forward primer jelöletlen maradt. A D-LUX program által tervezett illetve a módosított primerek szekvenciái a függelékben találhatók. A LightCycler® 1.5 készüléken lefuttatott real-time PCR reakciók 20 µl végtérfogatú reakcióelegyeinek összetétele (a kezdeti sikertelenséget tapasztalva) folyamatosan változtatásra, finomításra került – csakúgy, mint maguk a PCR protokollok. Az optimalizálás részleteit a függelék tartalmazza. A reakciómixhez felhasznált összetevık a következık voltak: PicoMaxx High Fidelity PCR System – ez egyben tartalmazza a 2,5 U/µl koncentrációjú enzimet és a 10x-es reakciópuffert is (Agilent, USA), MgCl2 (Thermo Scientific, USA), dNTP (Fermentas, USA), BSA (10%; Calbiochem, USA), forward és reverse primerek, illetve PCR víz (AccuGENE; Lonza, Svájc). A vizsgálatok során pozitív kontrollként a C típusú Clostridium botulinum 2145-ös és 2279-es törzsei szolgáltak.
71
3.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel E munka célja C típusú, toxintermelı Clostridium botulinum törzsek izolálása volt, a Kis-Balaton területének különbözı pontjairól származó iszapmintákból, klasszikus mikrobiológiai módszerek felhasználásával. Az egyes iszapokból egyenként kb. 3,5 g nedves tömegő mintarészlet került bemérésre 10-10, egyenként 5 ml DRCM-et vagy Holmann táplevest tartalmazó csıbe. A csövek paraffinnal történı lezárását követıen 70°C-on, 15 percig tartó hıkezelés következett vízfürdıben, a vegetatív formájú baktériumok elpusztítása céljából, majd 24-48 órán át tartó inkubálás, 37°C hımérsékleten. Ezt követıen a mintákból egyenként 50 µl szélesztése történt FeCl3-dal kiegészített, módosított McClung-Toabe EYA illetve CCFA táptalajok felszínére, majd a lemezek anaerob edényben (Merck, Németország) történı inkubálása következett 37°C-on, 48 órán át, aerob kontroll alkalmazása mellett. A módosított EYA összetételét a függelék tartalmazza. A lecitináz és lipáz pozitivitást mutató telepek TPGY táplevesben kerültek inkubálásra, 37°C-on, 48 órán át. Az egyes telepek és az azokat létrehozó mikrobák telepmikroszkóp illetve fáziskontraszt mikroszkóp segítségével történı morfológiai vizsgálatára az inkubálást követıen került sor. A hemolízis vizsgálatára a TPGY táplevesben nevelt tenyészetekbıl egyenként 50 µl szélesztése történt meg, 3% birkavért tartalmazó Columbia véresagarra, anaerob feltételek mellett tenyésztve, 37°C-on, 48 órán át, aerob kontroll alkalmazása mellett. A β-hemolízist mutató telepek felszaporítása 37°C-on, 24 órán át tartott TPGY illetve Holmann táplevesben, majd ezek vizsgálata következett API 20A gyorsteszt (bioMérieux, Franciaország), illetve a FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által kidolgozott, BoNT/C1 gén-specifikus PCR reakció segítségével.
72
4. EREDMÉNYEK
4.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata 4.1.1. Vízminıségi adatok Bár egyik vízminıségi paraméter esetében sem volt felfedezhetı szignifikáns különbség abban az esetben, ha egytényezıs varianciaanalízis segítségével azok vizsgálata együtt történt (8. táblázat), a kétmintás párosított t-próbák szignifikáns (P<0,05) különbséget mutattak a vízhımérsékletben, pH-ban, az oldott oxigén- és a szervesanyag-tartalomban a MK mintavételi helyek – MK évek és a MK mintavételi helyek – AK évek között (1. és 2. csoport), illetve a pH-ban, az oldott oxigén- és a szervesanyag-tartalomban az AK mintavételi helyek – MK évek és az AK mintavételi helyek – AK évek között (3. és 4. csoport; 9. táblázat), ha a mintavételi pontok vizsgálata külön-külön zajlott. A 9. táblázat adatai ugyanakkor arra is rávilágítanak, hogy az eredmények nem mindig korrelálnak a madár-botulizmus kitörésekkel. Annak ellenére, hogy az oldott oxigéntartalom értékek két esetben szignifikánsan (P<0,05) magasabbak voltak a MK, mint az AK mintavételi ponton, egy esetben ennek épp a fordítottja jelentkezett. A szervesanyag-tartalom értékek a 3-ból csak 2 esetben voltak szignifikánsan magasabbak a MK, mint az AK mintavételi ponton. Meglepı módon, szignifikánsan alacsonyabb vízhımérsékleti érték adódott egy MK mintavételi ponton, mint az AK párjánál, és 5bıl 5 MK ponton szignifikánsan alacsonyabb pH értékek mutatkoztak, mint AK párjaikon. Ezzel együtt, az utóbbiak még mindig a magas kockázatú, pH 7,5-9,0 intervallumban mozogtak /ROCKE, 2006/. A további kombinációk (1.-3., 2.-4., 1.-4. és 2.-3. csoport) esetében – a várakozásnak megfelelıen – a kétmintás párosított t-próbák valamennyi esetben szignifikáns különbséget mutattak, egy kivétellel: a 2. és 3. csoport közti vezetıképességgel.
8.
táblázat.
Szignifikancia-értékek
a
vízminıségi
paraméterek
varianciaanalízise során. Paraméter vízhımérséklet pH vezetıképesség oldott oxigén-tartalom szervesanyag-tartalom
F-érték 0,758 0,700 2,067 0,230 2,050
73
Szignifikancia 0,534 0,566 0,145 0,874 0,147
egytényezıs
9. táblázat. Szignifikáns (P<0,05) különbséget mutató vízminıségi paraméterek az 1.-2. illetve a 3.-4. csoport között. Összehasonlított csoportok 1. csoport; 2. csoport 1. csoport; 2. csoport 1. csoport; 2. csoport 3. csoport; 4. csoport 3. csoport; 4. csoport 3. csoport; 4. csoport
Mintavételi Vízhımérséklet pontok (°C) 9 202 203 19,40; 20,30 205 210 z27
pH 7,71; 8,37 7,58; 7,97 7,62; 8,06 7,64; 7,94 7,95; 8,17
Oldott oxigén Szerves anyag (mg/l) (mg/l) 89,00; 127,10 2,45; 6,29 0,97; 1,55
65,30; 22,20 51,90; 41,90
2,11; 1,38
Mivel az egytényezıs varianciaanalízis csupán a paraméterek elkülönült vizsgálatát teszi lehetıvé, azok együttes elemzése diszkriminancia analízis segítségével történt. A predikciós értékek a kezdeti csoportosítás (7. táblázat) helyességét együttesen 70,1%-ban igazolták (egyenként 58,5% illetve 11,6%; 10. táblázat). Amint azt a diszkrimináló függvények megmutatták, a kezdetben csoportosított mintavételi pontok 80,0%-ban (16/20) helyesen kerültek az 1., 2., 3. vagy 4. csoportba (11. táblázat), ekképpen erısítve meg a korábban feltételezett kapcsolatot a madár-botulizmus kitörések és a mintavételi helyek vízminıségi jellemzıi között. A fennmaradó esetekben egyéb, eddig nem vizsgált faktorok (pl. vízszint-ingadozások, áramlási viszonyok, növényborítottság, a vegetáció faji összetétele) szerepével is számolni kell. Az egyes csoportok diszkrimináló függvények szerinti elkülönülését a 9. ábra mutatja.
10. táblázat. A diszkrimináló függvények jellemzıi.
DF1
3,514
Kanonikus korreláció (r=λ/(1+λ)) 0,882
DF2
1,056
0,717
11,6
70,1
DF3
0,099
0,301
0,2
70,3
Diszkrimináló Sajátérték fgv.-ek (DF) (λ)
A predikció Predikció % Kumulatív szignifikanciája (λr2/Σλ) % (P<0,05) 58,5 58,5
11. táblázat. A kezdeti illetve a diszkriminancia analízisen alapuló csoportosítás összehasonlítása. Kezdeti csoportosítás 1 2 3 4
1 4 0 0 0
A predikált csoportok összetétele 2 3 4 1 0 0 5 0 0 0 4 1 1 1 3
74
Összesen 5 5 5 5 20
9. ábra. Az egyes csoportok elkülönülése a diszkrimináló függvények által.
4.1.2. Meteorológiai adatok Bár szignifikáns különbségek nem adódtak az AK és MK évek június és szeptember közti idıszaka napi minimum-, maximum- és középhımérsékleteinek egytényezıs varianciaanalízissel történı összevetése során, a legalább 15°C minimum hımérséklető napok száma szignifikánsan (P<0,05) magasabb volt a MK, mint az AK években. Ez az eredmény mindenképp figyelemre méltó annak tükrében, hogy a C típusú Clostridium botulinum minimális szaporodási hımérséklete KEYMER és mtsai. /1972/ szerint épp 15°C. A legalább 30°C maximum hımérséklető illetve legalább 25°C középhımérséklető napok száma ugyancsak magasabb értéket mutatott a MK, mint az AK években, de ezek a különbségek nem bizonyultak szignifikánsnak. Érdekes módon, a legalább kétnapos és 30°C maximum hımérséklető periódusok száma magasabb volt az AK, mint a MK években, bár a különbség nem volt szignifikáns, a periódusok átlagos hossza pedig nagyobbnak mutatkozott a MK, mint az AK években. A konkrét értékekrıl a 12. táblázat tájékoztat.
75
12. táblázat. A vizsgált hımérsékleti paraméterek konkrét értékei. A vizsgált paraméter
MK évek AK évek
A napi minimum hım.-ek átlaga (°C) A napi maximum hım.-ek átlaga (°C) A napi középhım.-ek átlaga (°C) A legalább 15°C minimum hım.-ő napok száma A legalább 30°C maximum hım.-ő napok száma A legalább 25°C átlaghım.-ő napok száma A minimum kétnapos, legalább 30°C max. hım.-ő periódusok száma A legalább 30°C maximum hım.-ő periódusok átlagos hossza (nap)
13,16 24,86 18,90 192 92 35 15 5,07
12,85 24,94 18,95 179 83 30 21 3,67
Szignifikancia (P<0,05)
Minden elızetes várakozással ellentétben, a madár-botulizmus megbetegedések kialakulása szempontjából kedvezıbb csapadék-értékek minden esetben az AK évekhez kapcsolódtak: a napi csapadékösszeg egytényezıs varianciaanalízise során a MK évek (nem szignifikánsan) magasabb értéket mutattak, a száraz (csapadék nélküli) napok száma pedig szignifikánsan magasabb volt az AK, mint a MK években. Kétmintás párosított t-próbákat alkalmazva, a legalább kétnapos száraz periódusok száma és átlagos hossza szintén az AK évek fölényét mutatta, bár ezek a különbségek nem bizonyultak szignifikánsnak (13. táblázat).
13. táblázat. A vizsgált csapadék-eloszlási paraméterek konkrét értékei. A vizsgált paraméter
MK évek AK évek
A napi csapadékösszegek átlaga (mm) A száraz (csapadékmentes) napok száma A legalább kétnapos száraz periódusok száma A legalább kétnapos száraz periódusok átlagos hossza (nap)
2,32 382 71 4,91
2,26 417 77 5,02
Szignifikancia (P<0,05)
4.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval 4.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján A tenyésztés nélküli vizsgálatok kapcsán hét-hét minta (5 üledék és 2 vakbéltartalom; hıkezelve illetve hıkezelés nélkül) feldolgozása történt meg, a BoNT/C1 gén jelenlétére nézve, 390 reakció során. A jellegzetes, 225 bp mérető amplifikációs termék egy hıkezelt illetve egy hıkezeletlen üledékmintában volt megtalálható (10. ábra). Amint azt a PCR reakciók mutatták, a tenyésztési és izolációs procedúrát követıen három minta tartalmazta a kérdéses DNS fragmentumot (11. ábra). Az elkülönített termékek
76
16S rDNS analízise, amely az Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Mikrobiológiai Tanszékén került lefolytatásra, mindhárom törzset Escherichia coliként azonosította (12. ábra; 14., 15., 16. táblázat).
10. ábra. A Kis-Balaton iszapjából izolált, BoNT/C1 gén jelenlétét bizonyító, 225 bp mérető fragmentumok (tenyésztés nélküli PCR).
11. ábra. A kis-Balaton iszapjából izolált, BoNT/C1 gén jelenlétét bizonyító, 225 bp mérető fragmentumok (tenyésztést követı PCR). 77
12. ábra. 225 bp mérető DNS fragmentumok, C típusú C. botulinum kontroll törzsekbıl és a fals pozitivitást mutató izolátumokból elkülönítve (1: 100 bp DNS létra; 2: C. botulinum 468; 3: C. botulinum 2145; 4, 5, 6: Escherichia coli).
14. táblázat. A 16S rDNS szekvenálások eredményei (a tíz legvalószínőbb találat): „ZÉ 1” (4-es minta).
15. táblázat. A 16S rDNS szekvenálások eredményei (a tíz legvalószínőbb találat): „ZÉ 2A” (5-ös minta).
78
16. táblázat. A 16S rDNS szekvenálások eredményei (a tíz legvalószínőbb találat): „ZÉ 3B” (6-os minta).
4.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján A többféle mintatípust érintı, 58 mérést magába foglaló vizsgálat során a WILLIAMSON és mtsai. /1999/ módszerével kapott, a BoNT/C1 gén jelenlétére nézve negatív eredményeket e metódus is megerısítette, egy lényeges különbséggel: a korábban tapasztalt fals pozitív reakciók minden esetben negatívnak bizonyultak.
4.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján Mivel a C típusú Clostridium botulinum genomjának szekvenálása jelenleg is folyik, a különféle adatbázisokban csak részleges, ún. shotgun-szekvenciák találhatók. A módszer érzékenységének meghatározásához mindössze a SEBAIHIA és mtsai. /2007/ által publikált, A típusú Clostridium botulinum „Hall” törzsének (ATCC 3502) teljes genom-szekvenciája állt rendelkezésre. Ez, a 3886916 bp mérető kromoszóma került kiegészítésre a BoNT/C1-termelésért felelıs 4463 bp mérető génnel, melynek szekvenciáját HAUSER és mtsai. /1990/ írták le. A további számítások lefolytatásához az ily módon 3891379 bp-nak adódó genom-méret szolgált alapul. Az érzékenység vizsgálata céljából a C típusú Clostridium botulinum 2145-ös és 2279es törzseinek DNS-ébıl öttagú (101-105x-es), tovafutó hígítási sor került elkészítésre. Az ezek PCR vizsgálata során létrejött amplifikációs görbéket, illetve az azokhoz tartozó crossing point értékeket a 13.-14. ábrák mutatják.
79
13. ábra. A 2145-ös C. botulinum kontroll törzsbıl kivont DNS különbözı hígításainak amplifikációs görbéi és crossing point értékei.
14. ábra. A 2279-es C. botulinum kontroll törzsbıl kivont DNS különbözı hígításainak amplifikációs görbéi és crossing point értékei. Amint az a 15.-17. ábrákon látható, a 2145-ös törzs DNS-e egészen a 104x-es hígításig kimutatható, míg a 2279-es törzs esetében a kimutathatóság határa a 103x-os hígítás. A szóban forgó DNS-ek kiindulási koncentrációja sorrendben 46,5 illetve 29,1 ng/µl–nek adódott. Mivel egy-egy reakcióhoz 2 µl templát került felhasználásra, a kimutatási határ a 2145-ös törzsnél 9,3 pg, a 2279-es törzsnél pedig 58,2 pg DNS. Az érzékenység meghatározásához a TAPONEN és mtsai. /2009/ által leírt összefüggés szolgált alapul:
80
, ahol:
n: a célszekvencia kópiáinak száma µl-enként (kópia/ µl), NA: Avogadro-állandó (mol-1) {6,023x1023}, m: a target DNS tömege a reakcióelegyben (g) {2145: 9,13x10-12; 2279: 5,82x10-11} Mw: 1 bp átlagos moláris tömege (g/mol) {kettıs szálú DNS esetén kb. 660}, L: a target DNS hossza (bp) {jelen esetben 3891379}
A rendelkezésre álló adatok alapján elvégzett számítások szerint a továbbfejlesztett realtime módszer kimutatási határa mindössze 0,0802 genom-ekvivalens (C. botulinum 2145) illetve 1,2 genom-ekvivalens (C. botulinum 2279), szemben a FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által leírt hagyományos PCR reakció 15 spórás értékével.
15. ábra. A 2145-ös és 2279-es C. botulinum kontroll törzsekbıl kivont DNS különbözı hígításainak olvadáspont-analízise.
81
16. ábra. A 2145-ös C. botulinum kontroll törzsekbıl kivont DNS különbözı hígításainak olvadáspont-analízise.
82
17. ábra. A 2279-es C. botulinum kontroll törzsekbıl kivont DNS különbözı hígításainak olvadáspont-analízise.
A
módszer
olvadáspont-analízissel
történı
specificitás-vizsgálata
során
bebizonyosodott, hogy a kísérletbe vont fajok egyike sem rendelkezik a C típusú Clostridium botulinum-ra jellemzı melting görbével. Az elektroferogramok értékelése ugyancsak megerısítette a metódus specifikus voltát. A konkrét eredményekrıl a 18.-19. ábra, illetve a 17. táblázat számol be.
83
18. ábra. A specificitás-vizsgálat során kapott olvadáspont-görbék.
17. táblázat. Az olvadáspont-analízishez kapcsolódó pontos melting értékek. A minta száma 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
A vizsgált kórokozó faja
Clostridium botulinum 2145 Clostridium botulinum 2279 Clostridium difficile Clostridium perfringens Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Campylobacter jejuni Escherichia coli O157:H7 Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Corynebacterium diphteriae Neisseria meningitidis Legionella pneumophila Negatív kontroll
84
Olvadáspont (°C) 76,82 76,69 81,78 81,43 87,84 96,54 82,09 87,92 87,47 87,20 83,32 82,71 84,65 89,41 81,62 91,38 85,94 83,23 81,91
19. ábra. A specificitás-vizsgálathoz kapcsolódó elektroferogramok. A felsı, vízszintes sorban található számokhoz tartozó minták a következık: 1) Clostridium botulinum 2145, 2) Clostridium botulinum 2279, 3) Clostridium difficile, 4) Clostridium 85
perfringens, 5) Pseudomonas aeruginosa, 6) Klebsiella pneumoniae, 7) Campylobacter jejuni, 8) Escherichia coli O157:H7, 9) Bacillus anthracis, 10) Bacillus subtilis, 11) Bacillus thuringiensis, 12) Streptococcus pyogenes, 13) Streptococcus pneumoniae, 14) Enterococcus faecium, 15) Staphylococcus aureus, 16) Corynebacterium diphteriae, 17) Neisseria meningitidis, 18) Legionella pneumophila, 19) Negatív kontroll.
A Kis-Balaton területérıl származó 175 iszapminta DNS-ének feldolgozása során sem az olvadáspont-analízis, sem az azt követı chip-elektroforézis nem utalt C típusú Clostridium botulinum jelenlétére. Érdekes módon, a vizsgálatok egy részében az irodalomban közölt, 615 bp mérető termékhez képest a kontroll törzsek néhány tíz bp eltérést mutattak. Ezzel együtt, az elektroferogramok értékelhetıségét ez a (módszer jellegébıl adódó) eltérés jelentısen nem befolyásolta.
4.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók Bár a LUX primerek tervezése során rendelkezésre álló adatok a BoNT/C1 gén-specifikus reakciók sikeres lezajlásával kecsegtettek, a gyakorlat sajnos mégsem igazolta a kezdeti optimizmust. Értékelhetı eredmények a PCR profil egyes elemeinek és a reakcióelegy összetételének szisztematikus változtatásával, finomításával sem születtek.
4.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel Bár a klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok során több olyan baktériumtörzset sikerült izolálni, amely morfológiailag (akár mikroszkóposan, akár makroszkóposan) illetve fıbb biokémiai tulajdonságait tekintve ráillett a Clostridium botulinum C típusára (obligát anaerob, nem proteolitikus, lecitináz és lipáz aktív, β-hemolizáló – lásd 2. táblázat), sem az API 20A-val nyert szénhidrát-fermentációs mintázatok, sem a BoNT/C1 gén-specifikus PCR reakciók nem erısítették meg a toxintermelı, C típusú Clostridium botulinum jelenlétét. Elıbbi vizsgálatok a következı mikrobákat azonosították: C. perfringens, C. paraputrificum, C. sordellii és C. cadaveris.
86
5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK
5.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata A vizsgált idıszakok vízminıségi és meteorológiai adatainak elemzése hazánkban is megerısíteni látszik a korábbi nemzetközi tapasztalatokat. Bár néhány esetben sikerült statisztikailag megalapozott eltérésekre bukkanni a madár-botulizmus szempontjából alacsony illetve magas kockázatú években, máskor a megbetegedések a látszólag legkedvezıbb feltételek együttállása esetén is elmaradtak, ugyanakkor a legmostohább körülmények között is felléptek. Annak ellenére, hogy a meteorológiai adatok a legtöbb esetben sokkal könnyebben győjthetık és hozzáférhetık, mint egy adott élıhely vízminıségi paraméterei, a vizsgálati eredmények alapján önmagukban kevésbé megbízhatóan használhatók a kitörések környezeti szempontból történı igazolására, illetve elırejelzésére.
5.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval 5.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján A tény, hogy egy adott DNS fragmentum a cél organizmustól
eltérı
(mikro)organizmusokban is fellelhetı, mindenképpen különös figyelmet érdemel, fıként akkor, ha – mint ebben az esetben – egy screening módszerrıl van szó. A fenti tapasztalatok figyelembe vételével kijelenthetı, hogy a szóban forgó BoNT/C1 génspecifikus PCR metódus önmagában nem alkalmazható a madár-botulizmus etiológiai megerısítésére. E technika további módszerekkel (például egéroltás, ELISA, 16S rDNS szekvenálás) kombinálva megbízhatóbb eredményeket adhat. Sajnálatos módon csak kisszámú közlemény olvasható e PCR alapú metódus más módszerekkel történı összevetésével kapcsolatban. ZECHMEISTER és mtsai. /2002; 2005/ jóval több üledék- és ürülékmintát találtak pozitívnak a fent ismertetett, BoNT/C1
gén-specifikus, tenyésztés nélküli és tenyésztést követı PCR-rel, mint ELISA-val vagy egéroltással (az összes minta 75%-a, 83%-a, 56%-a illetve 53%-a, sorrendben). Olyan, jelentısnek tartott faktorok mellett, mint a felhasznált módszer érzékenysége, a BoNT/C1 gén bevitelére alkalmas Clostridium illetve egyéb mikrobafajok jelenléte, az
87
esetleges fals pozitív eredményeket adó fakultatív vagy szigorú anaerob mikrobák is befolyásolhatják e vizsgálatok eredményeit.
5.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján Kísérleteinkben a módszer a nested technikánál könnyebben és gyorsabban kivitelezhetınek mutatkozott, emellett nagy elınyeként említhetı meg, hogy az utóbbi metódus kapcsán tapasztalt fals pozitív reakciók sem jelentkeztek. Mindezek alapján úgy tőnik, e módszer a madár-botulizmus megbetegedések diagnosztikájában nagyobb biztonsággal használható.
5.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján A módszer egyik legfıbb elınye gyorsaságában rejlik: a real-time környezetbe átültetett mérés mindössze harmad annyi ideig tart, mint az eredeti reakció: elıbbi 68 percet vesz igénybe (a melting analízist is beleértve), szemben a hagyományos reakció 205 perces idıtartamával. Mivel a megbízhatóan mőködı olvadáspont-analízis szükségtelenné teszi a gél-elektroforézis elvégzését, e lépés elhagyásával további idıt (és költséget) takaríthatunk meg. A PCR reakciók során felhasznált LightCycler®FastStart DNA Master SYBR Green I kit összetétele a rekcióelegy összeállítását még egyszerőbbé és gyorsabbá teszi, hiszen a reakciópuffer már tartalmazza az enzimet és a dNTP-t is. Egyetlen hátrányát viszonylag magas ára jelenti, ezért az ennek helyettesítésére használható, megfelelı minıségő kitek keresése jelenleg is folyik. A módszer érzékenységét befolyásoló genom-méret addig sajnos csak becsülhetı, amíg a C típusú Clostridium botulinum teljes genom-szekvenciája feltárásra nem kerül. A rendelkezésre álló adatok alapján elvégzett számítások a FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által leírt hagyományos PCR reakció kimutatási határhoz képest legalább tízszeres érzékenység-emelkedést mutatnak a továbbfejlesztett real-time metódus esetében. Bár az értékelhetıséget jelentısen nem befolyásolja, a chip-elektroforézis során a publikált és jelen dolgozatban néhány esetben tapasztalt termék-hossz beli eltérés feltárására a kérdéses fragmentumok szekvenálása mindenképp megnyugtató volna; az erre irányuló vizsgálatok folyamatban vannak.
88
5.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók Talán a tervezés során elıre vetített eredmények és a késıbbi alkalmazhatóság között tapasztalt éles ellentét az oka, hogy a LUX primerek használata más real-time rendszerekével összehasonlítva kevésbé elterjedt. Tény, hogy a BoNT/C1 gén viszonylagos rövidsége és nukleotid-sorrendje nem segíti elı a legmegfelelıbb indító szekvenciák létrehozását. Ennek figyelembevételével a LUX primer rendszer alkalmazhatóságát – a jelölés sikerességének, illetve a tervezés egyes lépéseinek még gondosabb ellenırzésével – érdemes volna tovább vizsgálni, akár egy új cél-gén keresésének árán is.
5.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel A hagyományos, „tenyésztéses” izolálási módszer alkalmazásáról a feldolgozott nemzetközi irodalomban alig esik említés (pl. FRANCIOSA és mtsai. /1996/). Utóbbi esetben a munka madár-botulizmus kitörések során győjtött mintákon került lefolytatásra, ezért – a kórokozó nagymértékő felszaporodása révén – annak megtalálási valószínősége is jelentısen megnıtt. Amennyiben, mint jelen dolgozat esetében is, az így idızített mintavételek nem megoldhatók, a talaj (illetve iszap) legtöbbször népes Clostridium-flórájából igen nagy próbatételt jelent egy adott faj elkülönítése.
OCEPEK és mtsai. /2007/ eredményei szintén ezt a tényt erısítik meg. Bár a szerzık több olyan Clostridium-fajt (C. botulinum/C. sporogenes, C. glycolicum, C. sporogenes, C. perfringens, C. subterminale és C. hastiforme) izoláltak, melyek – részben API 20Aval nyert – biokémiai tulajdonságai megegyeztek a Clostridium botulinum C típusáéval, a BoNT/C1 gén-specifikus PCR reakciók ezekben az esetekben sem utaltak toxintermelésre. A kísérletek alapjául szolgáló iszapminták csak a megbetegedéseket követı évben kerültek begyőjtésre, ugyanakkor egy, a madár-botulizmus kitörés során elhullott tıkés récébıl a kórokozó elkülönítése sikeresen megtörtént. Ebbıl adódóan a kutatócsoport a feldolgozott minta típusát, a mikrobák felszaporodásának lehetıségét (akár a madártetemekben, akár a talajban/iszapban), illetve ehhez kapcsolódóan a mintagyőjtés idejét az izolálás eredményessége szempontjából alapvetı fontosságúnak tekinti.
89
A korábban említett hátrányokhoz társulva sajnos mindmáig nem létezik olyan szelektív táptalaj, amely a C típusú (illetve egyéb, nem proteolitikus) Clostridium botulinum törzsek könnyebb izolálását tenné lehetıvé. Bár az A, B, F és G típusú, proteolitikus törzsek vizsgálatára a CBI és BSM agarok elterjedten használtak, ezek trimetoprimtartalma a nem proteolitikus mikrobák szaporodását gátolja /VU, 2006/. Részben a fent felsorolt indokokból fakadóan, az izolálás és identifikálás nagy szakmai gyakorlatot igénylı feladatait a rutin diagnosztikában szinte minden esetben elhagyják, helyette a toxinkimutatást, esetleg molekuláris biológiai technikákat alkalmazva. Ezzel együtt az efféle vizsgálatok az egyes Clostridium botulinum törzsek biokémiai tulajdonságainak
megismeréséhez,
illetve
összehasonlításához
elengedhetetlenül
fontosak volnának – a megfelelı, egységes vizsgálati metodika kidolgozását követıen…
5.4. Javaslatok a madár-botulizmus megbetegedések megelızése illetve kártételének csökkentése érdekében A madár-botulizmussal kapcsolatba kerülı állattartók illetve természetvédelmi és egyéb szakemberek számára – a saját vizsgálatok és a szakirodalmi tapasztalatok alapján – a következı intézkedések javasolhatók a megbetegedések létrejöttének kiküszöbölésére és azok negatív hatásainak csökkentésére:
a. A madár-botulizmus gyanújának felmerülését követıen a lehetı leghamarabb meg kell kezdeni az érintett állományok lehajtását a fertızött terület(ek)rıl, biztosítva a madarak elzárását, táplálékkal illetve ivóvízzel történı ellátását. Mivel természetes élıhelyeken ennek kivitelezésére általában nincs lehetıség, ezekben az esetekben a fertızési gócpontoktól való folyamatos távol tartással (pl. motorcsónakkal történı közlekedés) hasonló eredmény érhetı el.
b. Amennyiben a kérdéses területen madártetemek találhatók, úgy azokat haladéktalanul és rendszeresen el kell távolítani és meg kell semmisíteni, hiszen az elhullott madarak további fertızési forrást jelentenek. A beteg, legyengült állatokat fajtársaik 90
elıszeretettel csipkedik, eközben toxint véve fel azok véráramából. Ezért a megbetegedett madarakat mindenképpen el kell különíteni, s lehetıség szerint gondoskodni kell gyógykezelésükrıl.
c. A sekély, könnyen felmelegedı (és így oxigénszegénnyé váló) viző parti sávokat és egyéb, alacsony vízborítottságú területeket meder- és partszegély-rendezéssel ki kell mélyíteni. Amennyiben az állattartó telepen elárasztással kívánnak tavakat létrehozni, annak megkezdése elıtt a növényzetet maradéktalanul ki kell irtani.
d. A madár-botulizmus kitörések fertızı betegségekhez hasonló lefolyása miatt az állattartó telepeken az állományméretek gondos megválasztása javasolt. Természetes élıhelyeken törekedni kell annak elkerülésére, hogy egy adott területen túl sok madár zsúfolódjon össze.
e. Az állattartó telepeken a vízfelszínen elhelyezett etetık helyét folyamatosan változtatni kell, a táplálékból származó szervesanyag-utánpótlás megszüntetésére. Emellett rendszeresen el kell végezni az itatók vizének ellenırzését, s azok talajjal történı szennyezıdése esetén a vizet haladéktalanul le kell cserélni.
f. Bár tenyésztett állományokban lehetıség van a madarak vakcinával történı védelmére, természetes élıhelyeken ennek alkalmazása – a hatalmas anyagi terhek és a nagy kiterjedéső területek okán - sajnos gyakorlatilag kizárt.
91
6. ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk során hazánkban elsıként mutattunk ki statisztikailag is igazolható összefüggéseket néhány környezeti paraméter (levegı- és vízhımérséklet, pH, oldott oxigén- és szervesanyag-tartalom) és a madár-botulizmus fellépése között a Kis-Balaton területén, ahol e megbetegedés rendszeresen elıfordul. További eredményeink megerısítik azokat a nemzetközi irodalomban publikált következtetéseket, melyek szerint bár a vízhımérséklet, pH, sótartalom, redoxpotenciál és gerinctelen biomassza befolyásolja a madár-botulizmus kitörések kialakulását /ROCKE és mtsai., 1999; ROCKE – SAMUEL, 1999/, néhány faktor mégsem különbözik következetesen a megbetegedések által érintett és az azoktól mentes élıhelyeken /ROCKE és mtsai., 1999/. E tapasztalatokból kiindulva a jövıben más, eddig ismeretlen tényezık szerepének vizsgálata is indokolt lehet. A kórokozó klasszikus mikrobiológiai módszerek segítségével, a Kis-Balaton magas megbetegedési kockázatot jelentı pontjairól származó iszapmintákból történı kimutatása kapcsán több, Clostridium botulinum-ra emlékeztetı Clostridium-fajt különítettünk el, ezek további vizsgálata azonban nem utalt botulinum toxin termelésére. Szerencsés lett volna a mintavételeket konkrét kitörésekhez kapcsolódóan elvégezni, erre azonban esetünkben nem nyílt lehetıség. OCEPEK és mtsai. /2007/ szintén a mintavételek idızítésének fontosságára hívták fel a figyelmet, miután egy, a madár-botulizmusban elhullott tıkés récébıl a baktérium elkülönítését sikeresen elvégezték, ugyanakkor az azt követı évben, iszapmintákból sikertelenül próbálták meg izolálni a kórokozót. A C típusú, neurotoxin-termelı Clostridium botulinum mikrobák jelenlétének iszapmintákból, molekuláris biológiai módszerekkel történı detektálása céljából néhány, a nemzetközi irodalomban fellelhetı metódus alkalmazhatóságát vizsgáltuk, Magyarországon elsıként. A minták szintén a Kis-Balaton madár-botulizmus szempontjából magas megbetegedési kockázatú pontjairól kerültek begyőjtésre. A WILLIAMSON és mtsai. /1999/ által leírt nested PCR technika alkalmazása során fals pozitív eredményeket kaptunk. Az elkülönített termékek 16S rDNS analízise Escherichia coli organizmusok jelenlétét igazolta, így a fent említett módszer megbízhatósága kérdésessé vált.
92
Tapasztalataink alapján a FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által publikált hagyományos PCR metódus az elızınél egyszerőbbnek és érzékenyebbnek bizonyult. Így ennek alapjait felhasználva elsıként dolgoztunk ki egy olyan, olvadáspont-analízissel kiegészített, LightCycler-alapú real-time PCR módszert, amely jellegénél fogva még egyszerőbben, gyorsabban és nagyobb érzékenységgel képes a C típusú, neurotoxintermelı Clostridium botulinum jelenlétének kimutatására. Mindezek mellett kísérletet tettünk egy általunk tervezett, hairpin-struktúrájú primer-pár segítségével lefolytatható real-time PCR reakció kidolgozására is, amely madárbotulizmus esetek kapcsán ezideig nem került publikálásra. Kutatásaink eredményeképpen, a már meglévı technikák mellett az általunk továbbfejlesztett real-time procedúra egy újabb eszköz lehet a megbetegedések hátterének pontosabb feltárásában.
93
7. FELHASZNÁLT IRODALOM
ACKERMANN, H.-W. /1974/: La classification des bactériophages de Bacillus et Clostridium. Panthol. Biol., 22. 909. pp.
ACKERMANN, H.-W. – DUBOW, M. S. /1987/: Viruses of Prokaryotes, Vol. II.: Natural Groups of Bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, California. 82-84. pp.
AKBULUT, D. – GRANT, K. A. – MCLAUCHLIN, J. /2004/: Development and application of Real-Time PCR assays to detect fragments of the Clostridium botulinum types A, B, and E neurotoxin genes for investigation of human foodborne and infant botulism. Foodborne Pathog. Dis., 1. 247-257. pp.
ARNON, S. S. – SCHECHTER, R. – INGLESBY, T. V. – HENDERSON, D. A. – BARTLETT, J. G. – ASCHER, M. S. – EITZEN, E. – FINE, A. D. – HAUER, J. – LAYTON, M. – LILLIBRIDGE, S. – OSTERHOLM, M. T. – O'TOOLE T. – PARKER, G. – PERL, T. M. – RUSSELL, P. K. – SWERDLOW, D. L. – TONAT, K. /2001/: Botulinum Toxin as a Biological Weapon: Medical and Public Health Management. JAMA, 285. 1059-1070. pp.
BALL, G. T. – BOLLINGER, M. – CONLY, B. – MACFARLANE, B. – MURKIN, H. – MURPHY, T. – PYBUS, M. J. – ROCKE, T. – SAMUEL, M. – SHARP, D. – WOBESER, G. /1998/: Report to the Prairie Habitat Joint Venture by the working group on avian botulism. Canadian Cooperative Wildlife Health Centre, Saskatoon, Saskatchewan, Canada.
BARR, J. R. – MOURA, H. – BOYER, A. E. – WOOLFITT, A. R. – KALB, S. R. – PAVLOPOULOS, A. – MCWILLIAMS, L. G. – SCHMIDT, J. G. – MARTINEZ, R. A. – ASHLEY, D. L. /2005/: Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis., 11. http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol11no10/04-1279.htm (2008. 02. 04.)
BARTHA,
T.
–
SZTOJKOV,
V.
/1978/:
Botulizmus
víziszárnyasoknál. Egészségtudomány, 22. 405-415. pp.
94
járványos
elıfordulása
BELL, J. – SCIPLE, G. – HUBERT, A. /1955/: A microenvironment concept of the epizoology of avian botulism. J. Wild. Man., 19. 352-357. pp.
BENFENATI, F. – VALTORTA, F. /1995/: Neuroexocytosis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 195. 195-220. pp.
BENGSTON, I. A. /1922/: Preliminary note on a toxin-producing anaerobe isolated from the larvae of Lucilia caesar. Public Health Rep., 37. 164-170. pp.
BERGEY’S
MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY,
8th edition /1974/. Co-editors:
BUCHANAN, R. E. – GIBBONS, N. E. The Williams & Wilkins Company, Baltimore. 559561. pp.
BLAKER, D. /1967/: An outbreak of botulinus poisoning among waterbirds. The Ostrich, 38. 144. p.
BLOCK, W. – ERZINCLIOGLU, Y. Z. – WORLAND, M. R. /1988/: Survival of freezing in Calliphora larvae. Cryo-Lett., 9. 86-93. pp.
BME (BUDAPESTI MŐSZAKI EGYETEM) /2011/: A PCR technika és alkalmazási területei. http://oktatas.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/mezgaz/dnsklon/laborgyak/A%20PCR%20tec hnika%20%E9s%20alkalmaz%E1si%20ter%FCletei2.pdf (2011. 01. 06.)
BORLAND, E. D. – MORYSON, C. J. – SMITH, G. R. /1977/: Avian botulism and the high prevalence of Clostridium botulinum in the Norfolk Broads. Vet. Rec., 100. 106-109. pp.
BOROFF, D. – REILLY, J. /1962/: Studies of the toxin of Clostridium botulinum. Int. Arch. Allergy, 20. 306-313. pp.
BRETT, M. M. /1998/: Evaluation of the use of the bioMerieux Rapid ID32 A for the identification of Clostridium botulinum. Lett. Appl. Microbiol., 26. 81-84. pp.
BRITTAIN, S. M. – WANG, J. – BABCOCK-JACKSON, L. – CARMICHAEL, W. W. – RINEHART, K. L. – CULVER, D. A. /2000/: Isolation and characterisation of microcystins, 95
cyclic heptapeptide hepatotoxins from a Lake Erie strain of Microcystis aeruginosa. J. Great Lakes Res., 26. 241-249. pp.
COHEN, G. /1970/: Studies on the resistance of roosters and vultures to type A botulinal toxin. Ph. D. dissertation; The Florida State University, College of Arts and Sciences.
COOCH, F. G. /1964/: A preliminary study of the survival value of a functional salt gland in prairie Anatidae. Auk, 81. 380-393. pp.
CSABA, GY. /1996/: Halpusztulások vizsgálata a Kis-Balatonon (1991-1995). 2. KisBalaton Ankét, 1996. (Összefoglaló értékelés a KBVR 1991-1995 közötti kutatási eredményeirıl.) Pannon Agrártudományi Egyetem SZTIK Nyomdája, Keszthely. 472481. pp.
DAVIES, W. M. /1929/: Hibernation of Lucilia sericata (Mg.). Nature (London), 123. 759-760. pp.
DEZFULIAN, M. – HATHEWAY, C. L. – YOLKEN, R. H. – BARTLETT, J. G. /1984/: Enzymelinked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum type A and type B toxins in stool samples of infants with botulism. J. Clin. Microbiol., 20. 379-383. pp.
DUNCAN, R. M. – JENSEN, W. I. /1976/: A relationship between avian carcasses and living invertebrates in the epizootiology of avian botulism. J. Wildl. Dis., 12. 116-126. pp.
EKLUND, M. – POYSKY, F. /1972/: Activation of a toxic component of Clostridium botulinum types C and D by tripsin. Appl. Microbiol., 24. 108-113. pp.
EKLUND, M. W. – POYSKY, F. T. – REED, S. M. – SMITH, C. A. /1971/: Bacteriophage and the toxicity of Clostridium botulinum type C. Science, 172. 480-482. pp.
EKLUND, M. W. – POYSKY, F. T. – REED, S. M. /1972/: Bacteriophage and the toxicity of Clostridium botulinum type D. Nature New Biol., 235. 16-17. pp.
96
EKLUND, M. W. – POYSKY, F. T. /1974/: Interconversion of Type C and D Strains of Clostridium botulinum by Specific Bacteriophages. Appl. Microbiol., 27. 251-258. pp.
EKLUND, M. W. – POYSKY, F. T. – HABIG, W. H. /1989/: Bacteriophages and plasmids of Clostridium botulinum and Clostridium tetani and their relationship to production of toxins. In: SIMPSON, L. L. (ed.): Botulinum Neurotoxin and Tetanus Toxin. Academic Press, London. 25-51. pp.
EVELSIZER, D. D. /2003/: Management of avian botulism and survival of molting mallards. Dissertation, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada.
EVELSIZER, D. D. – CLARK, R. G. – BOLLINGER, T. K. /2010/: Relationships between local carcass density and risk of mortality in molting mallards during avian botulism outbreaks. J Wildl Dis., 46. 507-513. pp.
FEILER, M. – KÖHLER, B. /1977/: Massensterben von Wasservögeln durch Botulismus auf der Potsdamer Havel im Sommer 1975. Der Falke, 24. 226-240. pp.
FERREIRA, J. – MASLANKA, S. – JOHNSON, E. – GOODNOUGH, M. /2003/: Detection of botulinal neurotoxins A, B, E, and F by amplified enzyme-linked immunosorbent assay: collaborative study. J. AOAC Int., 86. 314-331. pp.
FERREIRA, J. L. – ELIASBERG, S. J. – EDMONDS, P. – HARRISON, M. A. /2004/: Comparison of the mouse bioassay and enzyme-linked immunosorbent assay procedures for the detection of type A botulinal toxin in food. J Food Prot., 67. 203206. pp.
FISH, N. – MITCHELL, W. – BARNUM, D. /1967/: A report of a natural outbreak of botulism in pheasants. Can. Vet. J., 1. 10-16. pp.
FRANCIOSA, G. – FENICIA, L. – CALDIANI, C. – AURELI, P. /1996/: PCR for detection of Clostridium botulinum type C in avian and environmental samples. J. Clin. Microbiol., 34. 882-885. pp.
97
GAÁL, M. /2004/: A biometria számítógépes alkalmazásai a környezeti és agrártudományokban. Aula Kiadó, Budapest. 121-126. pp.
GARRITY, G. M. – BELL, J. A. – LILBURN, T. G. /2004/: Taxonomic Outline of the Prokaryotes. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, Release 5.0. Springer-Verlag, New York. 24, 140-141.pp. DOI: 10.1007/bergeysputline200405
GRAHAM, J. M. /1978/: Inhibition of Clostridium botulinum type C by bacteria isolated from mud. J. Appl. Bacteriol., 45. 205-211. pp.
GRAHAM, J. M. – SMITH, G. R. /1978/: Avian botulism in winter and spring and the stability of Clostridium botulinum type C toxin. Vet. Rec., 102. 40-41. pp.
GRÜLL, A. – RAUER, G. – SAGMEISTER, H. /1987/: Ökologische Untersuchungen am Wasservogel-Botulismus im Seewinkel (Neusiedlerseegebiet). Arbeitsgemeinschaft Gesamtkonzept Neusiedler See – Forschungsprojekt BC 7a ’Botulismus’ – Endbericht 1984-1986.
GULYÁS, M. – NÉMETH, ZS. – RODLER, M. – SIMON, J. – NOVOTNY, T. /1998/: A botulizmus
kialakulásának
környezeti
feltételei
és
a
megelızés
lehetıségei.
Egészségtudomány, 42. 249-259. pp.
HAAGSMA, J. /1973/: Die Etiologie En Epidemiologie Van Botulismus Bij Vatervogels In Nederland. Proefschrift; Faculteit der Diergeneeskunde, Rijksuniversiteit, Utrecht, Netherland. 205. pp.
HAAGSMA, J. /1987/: Avian botulism in the Netherlands. In: EKLUND, M. W.
AND
DOWELL, V. R. (eds.): Avian Botulism: An International Perspective. Charles C. Thomas, Springfield, Illinois. 153-165. pp.
HAAGSMA, J. – OVER, H. J. – SMITH, T. – HOEKSTRA, J. /1972/: Botulism in waterfowl in the Netherlands in 1970. Neth. J. Vet. Sci., 5. 12-33. pp.
98
HALL, J. D. – MCCROSKEY, L. M. – PINCOMB, B. J. – HATHEWAY, C. L. /1985/: Isolation of an organism resembling Clostridium barati which produces type F botulinal toxin from an infant with botulism. J. Clin. Microbiol., 21. 654-655. pp.
HAQ, I. – SUKADI, F. /1981/: Incidence of Clostridium botulinum in coastal and inland areas of west Java. Jap. J. Med. Sci. Biol., 34. 231-235. pp.
HARIHARAN, H. – MITCHELL, W. R. /1976/: Observations on Bacteriophages of Clostridium botulinum Type C Isolates from Different Sources and the Role of Certain Phages in Toxigenicity. Appl. Environ. Microbiol., 32. 145-158. pp.
HATHEWAY, C. L. /1990/: Toxigenic clostridia. Clin. Microbiol. Rev., 3. 66-98. pp.
HAUSER, D. – EKLUND, M. W. – KURAZONO, H. – BINZ, T. – NIEMANN, H. – GILL, D. M. – BOQUET, P. – POPOFF, M. R. /1990/: Nucleotide sequence of Clostridium botulinum C1 neurotoxin. Nucl. Acids Res., 18. 4924. p.
HAUSER, D. – GIBERT, M. – EKLUND, M. W. – BOQUET, P. – POPOFF, M. R. /1993/: Comparative analysis of C3 and botulinal neurotoxin genes and their environment in Clostridium botulinum types C and D. J. Bacteriol., 175. 7260-7268. pp.
HÄLTERLEIN, B. – HEINZE, G. /1983/: Massensterben von Vögeln durch Botulismus. Ber. Dtsch. Sekt. Int. Rat. Vogelschutz, 23. 131-158. pp.
HIELM, S. – BJÖRKROTH, J. – HYYTIÄ, E. – KORKEALA, H. /1999/: Ribotyping as an identification tool for Clostridium botulinum strains causing human botulism. Int. J. Food Microbiol., 47. 121-131. pp.
HOBMAIER, M. /1932/: Conditions and control of botulism (duck disease) in waterfowl. Calif. Fish and Game, 18. 5-21. pp.
HOKIN, L. E. – HOKIN, M. R. /1959/: Evidence for phosphaditic acid as the sodium carrier. Nature (London), 184. 1068-1069. pp.
99
HOLEMAN, L. /1970/: The ecology and natural history of Clostridium botulinum. J. Wildl. Dis., 6. 1076-1081. pp.
HORVÁTH, J. – LELKES, A. – FUTÓ, E. – LAKATOS, J. /1994/: Botulizmus okozta madárpusztulások a Kis-Balatonon. Aquila, 101. 201-204., 225-226. pp.
HUBÁLEK, Z. – HALOUZKA, J. /1988/: Thermal sensitivity of Clostridium botulinum type C toxin. Epidem. Inf., 101. 321-325. pp.
HUBÁLEK, Z. – HALOUZKA, J. /1991/: Persistence of Clostridium botulinum type C toxin in blow fly (Calliphoridae) larvae as a possible cause of avian botulism in spring. J. Wildl. Dis., 27. 81-85. pp.
HUNTER, L. – POXTON, I. /2002/: Clostridium botulinum types C and D and the closely related Clostridium novyi. Rev. Med. Microbiol., 13. 75-90. pp.
HUSS, H. /1980/: Distribution of Clostridium botulinum. Appl. Environ. Microbiol., 39. 764-769. pp.
INOUE, K. – IIDA, H. /1970/: Conversion to toxigenicity in Clostridium botulinum type C. Jap. J. Microbiol., 14. 87-89. pp.
INOUE, K. – IIDA, H. /1971/: Phage conversion of toxigenicity on Clostridium botulinum types C and D. Jap. J. Med. Sci., 24. 53-56. pp.
ITOH, T. – SAITO, K. – INABA, M. – SAKAI, S. /1978/: Demonstration of type C Clostridium botulinum from sludges and fresh-water fish in the River Nakagawa in Tokyo. Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P. H., 29. 13-18. pp.
INVITROGEN HOME PAGE /2011/: D-LUX™ Gene Expression Assays http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nuclei c-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/qRT-PCR/qPCR/D-LUX-Assays.html? CID=fl-lux (2011. 01. 22.)
100
JANSEN, B. /1971/: The toxic antigenic factors produced by Clostridium botulinum types C and D. Onderstepoort J. Vet. Res., 38. 93-98. pp.
JENSEN, W. I. – ALLEN, J. P. /1960/: A possible relationship between aquatic invertebrates and avian botulism. Trans. N. Am. Wildl. Nat. Res. Conf., 171-180. pp.
JENSEN, W. – PRICE, J. /1987/: The global importance of type C botulism in wild birds. In.: EKLUND, M. – DOVELL, V., Jr. (eds.): Avian Botulism: An International Perspective. CC Thomas, Springfield, Illinois. 33-54. pp.
KAKINUMA, H. – MARUYAMA, H. – YAMAKAWA, K. – NAKAMURA, S. – TAKAHASHI, H. /1997/: Application of nested polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of infant botulism type B. Acta Paediatr. Jpn., 39. 346-348. pp.
KALMBACH, E. /1939/: American vultures and the toxin of Clostridium botulinum. J. Am. Vet. Med. Assoc., 94. 187-191. pp.
KALMBACH, E. – GUNDERSON, M. /1934/: Western Duck Sickness: a Form of Botulism. USDA Tech. Bull., 411. 81. p.
KERNER, J. /1822/: Das Fettgift oder die Fettsäure und ihre Wirkungen auf den tierischen Organismus. Ein Beytrag zur Untersuchung des in verdorbenen Würsten giftig wirkenden Stoffes. Cotta, Stuttgart und Tübingen. 368. p.
KEYMER, I. F. – SMITH, G. R. – ROBERTS, T. A. – HEANEY, S. I. – HIBBERD, D. J. /1972/: Botulism as a factor in waterfowl mortality at St. James's Park, London. Vet Rec., 90. 111-114. pp.
KFDT (KEMPELEN FARKAS DIGITÁLIS TANKÖNYVTÁR) /2008/: ELISA-módszerek. http://www.hik.hu/tankonyvtar/site/books/b133/ch14s04s05.html (2008. 02. 05.)
KÖHLER, B. – FEILER, M. – FRIEDRICHS, F. – BÖTTCHER, E. /1977/: Ausbruch von Botulismus bei Wasservögeln. Monatschefte für Veterinärmedizin, 5. 178-182. pp.
101
KURAZONO, H. – HOSOKAWA, M. – MATSUDA, H. – SAKAGUCHI, G. /1987/: Fluid accumulation in the ligated intestinal loop and histopathological changes of the intestinal mucosa caused by Clostridium botulinum C2 toxin in the pheasant and chicken. Res. Vet. Sci., 42. 349-353. pp.
KUZNETZOV, E. A. /1992/: Botulism in wild waterfowl in the USSR. In: Diseases and Parasites of Wild Animals. Ministry of Ecology and Natural Resources of Russia, Moscow. 112-122. pp.
LEHOCZKINÉ PERÉNYI K. /1959/: A botulismus. Magyar Állatorvosok Lapja, 8-9. 300303. pp.
LEIGHTON, F. A. /2000/: Type C botulism in birds. http://wildlife1.usask.ca/wildlife_health_topics/botulism/botulismc.php (2008. 01. 16.)
LINDBERG, A. – SKARIN, H. – KNUTSSON, R. – BLOMQVIST, G. – BÅVERUD, V. /2010/: Real-time PCR for Clostridium botulinum type C neurotoxin (BoNTC) gene, also covering a chimeric C/D sequence–Application on outbreaks of botulism in poultry. Vet. Microbiol., 146. 118-123. pp.
LINDSTRÖM, M. K. – JANKOLA, H. M. – HIELM, S. – HYYTIÄ, E. K. – KORKEALA, H. J. /1999/: Identification of Clostridium botulinum with API 20 A, Rapid ID 32 A and RapID ANA II. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 24. 267-274. pp.
LINDSTRÖM, M. – KETO, R. – MARKKULA, A. – NEVAS, M. – HIELM, S. – KORKEALA, H. /2001/: Multiplex PCR assay for detection and identification of Clostridium botulinum types A, B, E, and F in food and fecal material. Appl. Environ. Microbiol., 67. 56945699. pp.
MAKSYMOWYCH, A. – SIMPSON, L. /1998/: Binding and transcytosis of botulinum neurotoxin by polarised human colon carcinoma cells. J. Biol. Chem., 34. 21950-21957. pp.
102
MARION, W. R. – O’MEARA, T. E. – RIDDLE, G. D. – BERKHOFF, H. A. /1983/: Prevalence of Clostridium botulinum type C in substrates of phosphate-mine settling ponds and implications for epizootics of avian botulism. J. Wildl. Dis., 19. 302-307. pp.
MÁTYÁS, K. /1996/: A Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer fitoplankton vizsgálatának eredményei 1991-1995 között. 2. Kis-Balaton Ankét, 1996. (Összefoglaló értékelés a KBVR 1991-1995 közötti kutatási eredményeirıl.) Pannon Agrártudományi Egyetem SZTIK Nyomdája, Keszthely. 472-481. pp.
MCCROSKEY, L. M. – HATHEWAY, C. L. – WOODRUFF, B. A. – GREENBERG, J. A. – JURGENSON, P. /1991/: Type F botulism due to neurotoxigenic Clostridium baratii from an unknown source in an adult. J. Clin. Microbiol., 29. 2618-2620. pp.
MEYER, K. /1956/: The status of botulism as a world health problem. Bull. World Health Organ., 15. 281-298. pp.
MEYER, K. – DUBOVSKY, B. /1922/: The distribution of the spores of B. botulinus in the United States. J. Infect. Dis., 31. 559-594. pp.
MORIISHI, K. – KOURA, M. – FUJII, N. – FUJINAGA, Y. – INOUE, K. – SYUTO, B. – OGUMA, K. /1996a/: Molecular cloning of the Gene Encoding the Mosaic Neurotoxin, Composed of Parts of Botulinum Neurotoxin Types C1 and D, and PCR Detection of This Gene from Clostridium botulinum Type C Organisms. Appl. Environ. Microbiol., 62. 662667. pp.
MORIISHI, K. – KOURA, M. – ABE, N. – FUJII, N. – FUJINAGA, Y. – INOUE, K. – OGUMA, K. /1996b/: Mosaic structures of neurotoxins produced from Clostridium botulinum types C and D organisms. Biochim. Biophys. Act., 1307. 123-126. pp.
MOULTON, D. W. – JENSEN, W. I. – LOW, J. B. /1976/: Avian botulism epizootiology on sewage oxidation ponds in Utah. J. Wildl. Man., 40. 735-742. pp.
103
MURPHY, T. – LAWSON, A. – NALEWAJKO, C. – MURKIN, H. – ROSS, L. – OGUMA, K. – MCINTYRE, T. /2000/: Algal toxins – Initiators of avian botulism? Environ. Toxicol., 15. 558-567. pp.
NAKAMURA, S. – SERIKAWA, T. – YAMAKAWA, K. – NISHIDA, S. – KOZAKI, S. – SAKAGUCHI, G. /1978/: Sporulation and C2 toxin production by Clostridium botulinum type C strains producing no C1 toxin. Microbiol. Immunol., 22. 591-596. pp.
NAKAMURA, S. – KIMURA, I. – YAMAKAWA, K. – NISHIDA, S. /1983/: Taxonomic relationships among Clostridium novyi types A and B, Clostridium haemolyticum and Clostridium botulinum type C. J. Gen. Microbiol., 129. 1473-1479. pp.
NIESS, H. /1987/: Gefahren für den Entenbesatz – Vier Jahre Botulismus auf der Alster. Wild und Hund, 89. 38-43. pp.
NIKODÉMUSZ, I. – CSABA, K. – ORMAY, L. /1960/: Laboratóriumi vizsgálatokkal igazolt botulizmus. Orvosi Hetilap, 101. 1856-1858. pp.
NOL, P. – ROCKE, T. E. – GROSS, K. – YUILL, T. E. /2004/: Prevalence of neurotoxic Clostridium botulinum type C in the gastrointestinal tracts of tilapia (Oreochromis mossambicus) in the Salton Sea. J. Wildl. Dis., 40. 414-419. pp.
NYUDUVIZIG (NYUGAT-DUNÁNTÚLI KÖRNYEZETVÉDELMI
ÉS
VÍZÜGYI IGAZGATÓSÁG)
/2003/: a Kis-Balaton honlapja. http://www.kisbalaton.hu (2008. 02. 01.)
OCEPEK, M. – HARI, A. – KRT, B. – PATE, M. – ZDOVC, I. /2007/: Detection of Clostridium botulinum type C in an aquatic area a year after an outbreak of botulism in waterfowl using conventional and molecular methods. IJEP, 31. 65-74. pp.
OGUMA, K. – SYUTO, B. – IIDA, H. – KUBO, S. /1980/: Antigenic similarity of toxins produced by Clostridium botulinum type C and D strains. Infect. Immun., 30. 656-660. pp.
104
OGUMA, K. – YAMAGUCHI, T. – SUDOU, K. – YOKOSAWA, N. – FUJIKAWA, Y. /1986/: Biochemical Classification of Clostridium botulinum type C and D Strains and Their Nontoxigenic Derivatives. Appl. Environ. Mivrobiol., 51. 256-260. pp.
OGUMA, K. – YOKOTA, K. – HAYASHI, S. – TAKESHI, K. – KUMAGAI, M. – ITOH, N. – TACHI, N. – CHIBA, S. /1990/: Infant botulism due to Clostridium botulinum type C toxin. Lancet, 336. 1449-1450. pp.
OHISHI, I. – SAKAGUCHI, G. – RIEMANN, H. – BEHYMER, D. – HURVELL, B. /1979/: Antibodies to Clostridium botulinum toxins in free-living birds and mammals. J. Wildl. Dis., 15. 3-9. pp.
OHISHI, I. – IWASAKI, M. – SAKAGUCHI, G. /1980/: Purification and characterization of two components of botulinum C2 toxin. Infect. Immun., 30. 668-673. pp. OHISHI, I. – SAKAGUCHI, G. /1982/: Production of C2 toxin by Clostridium botulinum types C and D as determined by its vascular permeability activity. Infect. Immun., 35. 14. pp.
ONO, T. – AZUMA, R. – KATO, T. – TAKEUCHI, S. – SUTO, T. /1982/: Outbreaks of type C botulism in waterfowl in Japan. Nat. Inst. Anim. Health Q (Yatabe), 22. 102-114. pp.
PATES, A. /1967/: The documentation of avian resistance to botulism. Yearly report to the United States Army Medical Research and Development Command.
PESTRONK, A. /2008/: Neuromuscular home page. http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/bot.htm (2008. 01. 30.)
POPOFF, M. /1995/: Ecology of neurotoxigenic Clostridia. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 195. 1-31. pp.
POURSHAFIE, M. – VAHDANI, P. – POPOFF, M. /2005/: Genotyping Clostridium botulinum toxinotype A isolates from patients using amplified rDNA restriction analysis. J. Med. Microbiol., 54. 933-936. pp. 105
POURSHABAN, M. – FRANCIOSA, G. – FENICIA, L. – AURELI, P. /2002/: Taxonomic identity of type E botulinum toxin-producing Clostridium butyricum strains by sequencing of a short 16S rDNA region. FEMS Microbiol. Lett., 27. 119-125. pp.
PRÉVOT, V. – TWEEPENNINCKX F. – VAN NEROM, E. – LINDEN, A. – CONTENT, J. – KIMPE, A. /2007/: Optimization of polymerase chain reaction for detection of Clostridium botulinum type C and D in bovine samples. Zoon. Pub. Health, 54. 320327. pp.
PRIMERDIGITAL.COM /2011/: Design and properties of LUX (fluorogenic) PCR primers. http://primerdigital.com/fastpcr/m15.html (2011.01.22.)
PULLAR, E. /1934/: Enzootic botulism amongst wild birds. Austr. Vet. J., 10. 128-135. pp.
REED, T. M. – ROCKE, T. E. /1992/: The role of avian carcasses in botulism epizootics. Wildl. Soc. Bull., 20. 175-182. pp.
REICHHOLF, J. /1983/: Ausbrüche von Enten-Botulismus im Sommer 1982 in Bayern. Anz. Orn. Ges. Bayern, 22. 37-56. pp.
REILLY, J. – BOROFF, D. /1967/: Botulism in a Tidal Estuary in New Jersey. Bull. Wildl. Dis. Assoc., 3. 26-29. pp.
RING, R. A. /1972/: Relationship between diapause and super-cooling in the blowfly, Lucilia sericata (Mg.). Can. J. Zool., 50. 1601-1605. pp.
ROCKE, T. /1983/: Clostridium botulinum. In: GYLES, C. – THOEN, C. (eds.): Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 86-96. pp.
106
ROCKE, T. E. /2006/: The global importance of avian botulism. In: BOERE, G. C. – GALBRAITH, C. A. – STROUD, D. A. (eds.): Waterbirds around the world. The Stationery Office, Edinburgh, UK. 422-426. pp. ROCKE, T. E. – SMITH, S. R. – NASHOLD, S. W. /1998/: Preliminary evaluation of a simple in vitro test for the diagnosis of type C avian botulism in wild birds. J. Wildl. Dis., 34. 744-751. pp.
ROCKE, T. E., JR. – EULISS, N. H. – SAMUEL, M. D. /1999/: Environmental characteristics associated with the occurrence of avian botulism in wetlands of a Northern California refuge. J. Wildl. Man., 63. 358-368. pp.
ROCKE, T. E., JR. – SAMUEL, M. D. /1999/: Water and sediment characteristics associated with avian botulism outbreaks in wetlands. J. Wildl. Man., 63. 1249-1260. pp.
ROCKE, T. E. – SAMUEL, M. D. – SWIFT, P. K. – YARRIS, G. S. /2000/: Efficacy of a type C botulism vaccine in green-winged teal. J. Wildl. Dis., 36. 489-493. pp.
ROSEN, M. /1971/: Botulism. In: DAVIS, J. – ANDERSON, R. – KARSTAD, L. – TRAINER, D. (eds.): Infectious and Parasitis Diseases of Wild Birds. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 100-117. pp.
SAKAGUCHI, Y. – HAYASHI, T. – KUROKAWA, K. – NAKAYAMA, K. – OSHIMA, K. – FUJINAGA, Y. – OHNISHI, M. – OHTSUBO, E. – HATTORI, M. – OGUMA, K. /2005/: The genome sequence of Clostridium botulinum type C neurotoxin-converting phage and the molecular mechanisms of unstable lysogeny. PNAS, 102. 17472-17477. pp.
SALYERS, A. – WHITT, D. /1994/: Bacterial pathogenesis: a molecular approach. ASM Press, Washington, D. C. 130-137. pp.
SANDLER, R. J. – ROCKE, T. E. – SAMUEL, M. D. – YUILL, T. M. /1993/: Seasonal Prevalence of Clostridium botulinum Type C in Sediments of a Northern California Wetland. J. Wildl. Dis., 29. 533-539. pp.
107
SANDLER, R. J. – ROCKE, T. E. – YUILL, T. M. /1998/: The Inhibition of Clostridium botulinum Type C by Other Bacteria in Wetland Sediments. J. Wildl. Dis., 34. 830-833. pp.
SEBAIHIA, M. – PECK, M. W. – MINTON, N. P. – THOMSON, N. R. – HOLDEN, M. T. G. – MITCHELL, W. J. – CARTER, A. T. – BENTLEY, S. D. – MASON, D. R. – CROSSMANN, L. – PAUL, C. J. – IVENS, A. – WELLS-BENNIK, M. H. J. – DAVIS, I. J. – CERDEÑO-TÁRRAGA, A. M. – CHURCHER, C. – QUAIL, M. A. – CHILLINGWORTH, T. – FELTWELL, T. – FRASER, A. – GOODHEAD, I. – HANCE, Z. – JAGELS, K. – LARKE, N. – MADDISON, M. – MOULE, S. – MUNGALL, K. – NORBERTCZAK, H. – RABBINOWITSCH, E. – SANDERS, M. – SIMMONDS, M. – WHITE, B. – WHITHEAD, S. – PARKHILL, J. /2007/: Genome sequence of a proteolytic (Group I) Clostridium botulinum strain Hall A and comparative analysis of the clostridial genomes. Gen. Res., 17. 1082-1092. pp.
SEDDON, H. E. /1922/: Bulbar paralysis in cattle due to the action of a toxicogenic bacillus, with a discussion on the relationship of the condition to forage poisoning (botulism). J. Comp. Pathol. Therap., 35. 147-190. pp.
SEGNER, W. – SCHMIDT, C. /1971/: Heat Resistance of Spores of Marine and Terrestrial Strains of Clostridium botulinum Type C. Appl. Microbiol., 22. 1030-1033. pp.
SEGNER, W. – SCHMIDT, C. – BOLTZ, J. /1971a/: Enrichment, Isolation and Cultural Caharacteristics of Marine Strains of Clostridium botulinum Type C. Appl. Microbiol., 22. 1017-1024. pp.
SEGNER, W. – SCHMIDT, C. – BOLTZ, J. /1971b/: Minimal Growth Temperature, Sodium Chloride Tolerance, pH Sensitivity, and Toxin Production of Marine and Terrestrial Strains of Clostridium botulinum Type C. Appl. Microbiol., 22. 1025-1029. pp.
SEKINE, A. – FUJIWARA, M. – NARUMIYA, S. /1989/: Asparagine residue in the rho gene product is the modification site for botulinum ADP-ribosyltransferase. J. Biol. Chem. 264. 8602-8605. pp.
108
SERIKAWA, T. – NAKAMURA, S. – NISHIDA, S. /1977/: Distribution of Clostridium botulinum type C in Ishikawa Prefecture, and applicability of agglutination to identification of non-toxigenic isolates of Clostridium botulinum type C. Microbiol. Immunol., 21. 127-136. pp.
SHAW, P. A. /1929/: Duck disease studies. 1. Blood analysis in diseased birds. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 27. 6-7. pp.
SIMPSON, L. L. /1984/: Molecular basis for the pharmacological actions of Clostridium botulinum type C2 toxin. J. Pharm. Exp. Ther., 230. 665-669. pp. SKINNER, G. E. – GENDEL, S. M. – FINGERHUT, G. A. – SOLOMON, H. A. – ULASZEK, J. /2000/: Differentiation between types and strains of Clostridium botulinum by riboprinting. J. Food Prot. 63. 1347-1352. pp.
SMITH, G. R. /1982/: Botulism in waterfowl. Symp. Zool. Soc. Lond., 50. 97-119. pp.
SMITH, G. R. /1987/: Botulism in water birds and its relation to comparative medicine. In: EKLUND, M. W. and DOWELL, V. R. (eds.): Avian Botulism: An International Perspective. Charles C. Thomas, Springfield, Illinois. 73-86. pp.
SMITH, G. R. – HIME, J. M. – KEYMER, I. F. – GRAHAM, J. M. – OLNEY, P. J. S. – BRAMBELL, M. R. /1975/: Botulism in captive birds fed commercially-bred maggots. Vet. Rec., 97. 204-205. pp.
SMITH, G. R. – MORYSON, C. J. /1975/: Clostridium botulinum in the lakes and waterways of London. J. Hyg. (Camb.), 75. 371-379. pp.
SMITH, G. R. – MORYSON, C. J. /1977/: A comparison of the distribution of Clostridium botulinum in soil and in lake mud. J. Hyg. (Camb.), 78. 39-41. pp.
SMITH, G. R. – MILLIGAN, R. A. – MORYSON, C. J. /1978/: Clostridium botulinum in aquatic environments in Great Britain and Ireland. J. Hyg. (Camb.), 80. 431-438. pp.
109
SMITH, G. R. – OLIPHANT, J. C. – WHITE, W. R. /1982/: Clostridium botulinum type C in the Mersey estuary. J. Hyg. (Camb.), 89. 507-511. pp.
SMITH, G. R. – TURNER, A. /1989/: The production of Clostridium botulinum toxin in mammalian, avian and piscine carrion. Epidem. Inf., 102. 467-471. pp.
SMITH, L. DS – SUGIYAMA, H. /1988/: The natural occurrence of Clostridium botulinum. In: BALOWS, A. (ed.): Botulism: the organism, its toxins, the disease, 2nd edition. Charles C. Thomas, Springfield, Illinois. 11-21. pp.
SMOOT, L. A. – PIERSON, M. D. /1979/: Effect of oxidation-reduction potential on the outgrowth and chemical inhibition of Clostridium botulinum 10755A spores. J. Food Sci., 44. 700-704. pp.
SOOS, C. – WOBESER, G. /2006/: Identification of Primary Substrate in the Initiation of Avian Botulism Outbreaks. J. Wildl. Man., 70. 43-53. pp.
STEVENSON, K. E. – VAUGHN, R. H. /1972/: Exosporium Formation in Sporulating Cells of Clostridium botulinum 78A. J. Bacteriol., 112. 618-621. pp.
SUGIYAMA, H. /1977/: Presentation at the Interagency Botulism Research Coordinating Committee Meeting. Bear River Research Station, Brigham City, Utah.
SUNAGAWA, H. – INOUE, K. /1992/: Biological and biophysical characteristics of phages isolated from Clostridium botulinum type C and D strains, and physicochemical properties of the phage DNAs. J. Vet. Med. Sci., 54. 675-684. pp.
SYUTO, B. – KUBO, S. /1977/: Isolation and molecular size of Clostridium botulinum type C toxin. Appl. Environ. Microbiol., 33. 400-405. pp.
SZABO, E. A. – PEMBERTON, J. M. – DESMARCHELIER, P. M. /1993/: Detection of the Genes Encoding Botulinum Neurotoxin Types A to E by the Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol., 59. 3011-3020. pp.
110
TAKEDA, M. – TSUKAMOTO, K. – KOHDA, T. – MATSUI, M., - MUKAMOTO, M. – KOZAKI, S. /2005/: Characterization of the neurotoxin produced by isolates associated with avian botulism. Avian Dis., 49. 376-381. pp.
TAPONEN, S. – SALMIKIVI, L. – SIMOJOKI, H. – KOSKINEN, M. T. – PYÖRÄLÄ, S. /2009/: Real-time polymerase chain reaction-based identification of bacteria in milk samples from bovine clinical mastitis with no growth in conventional culturing. J. Dairy Sci., 92. 2610–2617. pp.
THOMAS, R. J. /1991/: Detection of Clostridium botulinum types C and D toxin by ELISA. Aust. Vet. J., 68. 111-113. pp.
TOPLEY
AND
WILSON’S
PRINCIPLES OF BACTERIOLOGY, VIROLOGY AND IMMUNITY,
8th
edition, vol. 3.: Bacterial diseases /1990/. PARKER, M. T. – COLLIER, L. H.(general eds.); SMITH, G. R. – EASMAN, C. S. F. (vol. 3. eds.). B. C. Decker Inc., Philadelphia. 221. p.
TRAMPEL, D. W. – SMITH, S. R. – ROCKE, T. E. /2005/: Toxicoinfectious botulism in commercial caponized chickens. Avian Dis., 49. 301-303. pp.
TRETHON, A. – BUDAI, J. – HERENDI, Á. – SZABÓ, V. – GÉCZY, M. /1995/: Csecsemıkori botulizmus. Orvosi Hetilap, 136. 1497-1499. pp.
TSUKAMOTO, K. – MUKAMOTO, M. – KOHDA, T. – IHARA H. – WANG X. – MAEGAWA, T. – NAKAMURA, S. – KARASAWA, T. – KOZAKI, S. /2002/: Characterization of Clostridium butyricum neurotoxin associated with food-borne botulism. Microb. Pathog., 33. 177184. pp.
VAN ERMENGEM, E. /1897/: Ueber einen neuen anäeroben Bacillus und seine Beziehungen zum Botulismus. Z. Hyg. Infekt., 26. 1-4. pp.
VÁRNAGY L. – BUDAI P. /1995/: Agrárkémiai higiénia. Mezıgazdasági vegyi anyagok egészség- és méregtana. Mezıgazda Kiadó, Budapest. 19-20. pp.
111
VU, T. L. A. /2006/: Incidence of Clostridium botulinum Spores in Honey and Infant Food Samples Collected from Vietnam and Germany. Ph. D. dissertation; GeorgAugust-University, Göttingen, Institute of Agronomy and Animal Production in the Tropics and Subtropics. http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/2006/vu/vu.pdf (2010.12.29.)
WESTPHAL, U. /1991/: Botulismus bei Vögeln. AULA-Verlag GmbH, Wiesbaden. 1-78. pp.
WILLIAMSON, J. L. – ROCKE, T. E. – AIKEN, J. M. /1999/: In Situ Detection of the Clostridium botulinum Type C1 Toxin Gene in Wetland Sediments with a Nested PCR Assay. Appl. Environ. Microbiol., 65. 3240-3243. pp.
WOBESER, G. A. /1987/: Control of botulism in wild birds. In: EKLUND, M. W. and DOWELL, V. R. (eds.): Avian Botulism: An International Perspective. Charles C. Thomas, Springfield, Illinois. 339-348. pp.
WOBESER, G. /1988/: Effects of botulism on ducks drinking saline water. J. Wildl. Dis., 24. 240-245. pp.
WOBESER, G. A. /1997/: Avian botulism – another perspective. J. Wildl. Dis., 33. 181186. pp.
WOBESER, G. – RAINNIE, D. J. – SMITH-WINDSOR, T. B. – BOGDAN, G. /1983/: Avian botulism during late autumn and early spring in Saskatchewan. J. Wildl. Dis., 19. 90-94. pp.
WOBESER, G. – MARSDEN, S. – MACFARLANE, R. J. /1987/: Occurrence of toxigenic Clostridium botulinum type C in the soil of wetlands in Saskatchewan. J. Wildl. Dis., 23. 67-76. pp.
WOBESER, G. – BAPTISTE, K. – CLARK, E. G. – DEYO, A. W. /1997/: Type C botulism in cattle in association with a botulism die-off in waterfowl in Saskatchewan. Can. Vet. J., 38. 782. p.
112
WOO, G. H. – KIM, H. Y. – BAE, Y. C. – JEAN, Y. H. – YOON, S. S. – BAK, E. J. – HWANG, E. K. – JOO, Y. S. /2010/: Outbreak of botulism (Clostridium botulinum type C) in wild waterfowl: Seoul, Korea. J Wildl Dis., 46. 951-955. pp.
YAMAKAWA, K. – NISHIDA, S.– NAKAMURA, S. /1983/: C2 toxicity in extract of Clostridium botulinum type C spores. Infect. Immun., 41. 858-860. pp.
ZECHMEISTER, T. C. – FARNLEITNER, A. H. – ROCKE, T. E. – PITTNER, F. – ROSENGARTEN, R. – MACH, R. L. – HERZIG A. – KIRSCHNER, A. K. T. /2002/: PCR and ELISA - in vitro alternatives to the mouse-bioassay for assessing the botulinumneurotoxin-C1 production potential in environmental samples? ALTEX, 19. (Suppl.), 4954. pp.
ZECHMEISTER, T. C. – KIRSCHNER, A. K. T. – FUCHSBERGER, M. – GRUBER, S. G. – SÜß, B. – ROSENGARTEN, R. – PITTNER, F. – MACH, R. L. – HERZIG A. – FARNLEITNER, A. H. /2005/: Prevalence of Botulinum Neurotoxin C1 and its Corresponding Gene in Environmental Samples from Low and High Risk Avian Botulism Areas. ALTEX, 22. 185-195. pp.
ZLINSZKY, SZ. /1997/: Madárbotulizmus a Kis-Balaton területén (szakdolgozat). ELTE Tanárképzı Fıiskolai Kar, biológia-kémia szakpár.
113
8. TÉZISPONTOK
8.1. Tézispontok magyarul
a. A Kis-Balaton területérıl, madár-botulizmus szempontjából alacsony (elhullással nem járó) illetve magas kockázatú (botulizmusos) évekbıl származó vízminıségi és meteorológiai adatok értékelése során szignifikáns (P<0,05) kapcsolatot mutattunk ki néhány paraméter (levegı- és vízhımérséklet, pH, oldott oxigén- és szervesanyagtartalom) és a betegség megjelenése között.
b. A WILLIAMSON és mtsai. /1999/ által leírt nested PCR módszer alkalmazása során fals pozitív eredményeket kaptunk. Az elkülönített termékek 16S rDNS analízise Escherichia coli organizmusok jelenlétét igazolta.
c. A FRANCIOSA és mtsai. /1996/ által publikált, hagyományos PCR módszert továbbfejlesztve, azt LightCycler-alapú real-time PCR metódussá alakítottuk át. A technikát olvadáspont-analízissel is kiegészítve a kiindulási módszer méginkább leegyszerősödött, felgyorsult, ugyanakkor érzékenyebbé vált.
d. Tapasztalataink alapján elvégeztük a korábban ismertetett molekuláris biológiai módszerek
madár-botulizmus
megbetegedések
alkalmazhatóságának összehasonlító vizsgálatát.
114
diagnosztikájában
történı
8.2. Thesis statement
a. In some cases, significant (P<0.05) differences were found between several environmental factors (air- and water temperature, pH, water-soluble oxygen and organic matter content) and the occurrence of avian botulism outbreaks. The values of these parameters were recorded periodically in high (HR) and low (LR) avian botulism risk areas of Lake ‘Kis-Balaton’. Data derived from both HR and LR years (with or without documented botulism-caused avian losses) were processed.
b. False positive results were detected in the course of nested PCR work according to Williamson et al. /1999/. 16S rDNA analysis of the separated PCR products verified the presence of Escherichia coli organisms.
c. The conventional PCR method described by Franciosa et al. /1996/ was upgraded to a LightCycler-based real-time technique including melting analysis to get a faster, more simple and sensitive reaction.
d. In the light of the results, applicability of these molecular techniques in diagnosis of avian botulism cases was also investigated.
115
9. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK, ELİADÁSOK
Referált szakfolyóiratban megjelent közlemények BABINSZKY, G. – MÉSZÁROS, Á. – GULYÁS, M. – CSITÁRI, G. /2006/: Immunohistochemistry-based mouse model for the detection of Clostridium botulinum type B toxin in animal tissues – could it be used to demonstrate type C and to diagnose avian botulism? G. for Agric., 16., 1-12. pp.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – JÓZSA, S. /2008/: Observations on environmental factors in connection with avian botulism outbreaks in a Hungarian wetland habitat. Acta Microbiol. et Immunol. Hung., 55., 455–464 pp.
BABINSZKY, G. /2009/: Madár-botulizmus: hazai és nemzetközi vonatkozások. Ornis Hung., 17-18., 21-32. pp.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – GULYÁS, M. E. /2011/: The environmental background of type C avian botulism outbreaks in wetlands. Aquila (közlésre elfogadva)
Az értekezés témakörében megtartott elıadások BABINSZKY, G. /2003/: A madár-botulizmus immunhisztokémiai vizsgálata. 2003. évi Intézményi Tudományos Diákköri Konferencia, Keszthely. 42. p.
BABINSZKY, G. /2004/: A madár-botulizmus immunhisztokémiai vizsgálata. IX. Országos
Felsıoktatási
Környezettudományi
Diákkonferencia;
Eötvös
Lóránd
Tudományegyetem, Budapest. 32. p.
BABINSZKY,
G.
/2004/:
A
madár-botulizmus
elıfordulása
és
kimutatása
Magyarországon. X. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely. CD kiadvány.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – GULYÁS, M. /2004/: Madár botulizmus diagnosztizálása immunhisztokémiai módszerrel. XLVI. Geogikon Napok, Keszthely (CD kiadvány, ISBN 963-9096-962).
116
BABINSZKY, G. /2005/: A madár-botulizmus immunhisztokémiai vizsgálata. 2005. évi Országos Tudományos Diákköri Konferencia, Szarvas. 91. p.
BABINSZKY, G. /2005/: A madár-botulizmus története Magyarországon. A Romániai Magyar Doktorandusok és Fiatal Kutatók Országos Szövetsége VI. Országos Konferenciája, Kolozsvár. 28. p.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – TÓTH, SZ. – PÁL, L. – DUBLECZ, K. /2005/: Takarmánykiegészítık hatása broilerek vakbéltartalmának mikroflórájára. XI. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely. CD kiadvány.
Konferencia összefoglalók GULYÁS, M. – NÉMETH, ZS. – BABINSZKY, G. – MAJOR, P. – RODLER, M. – CSITÁRI, G. /2005/: Morphological, biochemical and cultural properties of Hungarian Clostridium botulinum strains. Acta Microbiol. Immunol. Hung., 52. (Suppl.), 51. p.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – JÓZSA, S. /2008/: The first findings on the effect of several environmental factors to the occurrence of avian botulism outbreaks in a Hungarian wetland habitat. Clostridium botulinum – Epidemiology, Diagnosis, Genetics, Control and Prevention, Helsinki, Finland. 65. p.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – JÓZSA, S. /2008/: Különféle vízminıségi paraméterek és a madár-botulizmus kitörések közti kapcsolat vizsgálata a Kis-Balaton területén. 50. Jubileumi Georgikon Napok, Keszthely (CD-kiadvány, ISBN 978-963-9639-32-4).
Egyéb, nem az értekezés témakörében megjelent publikációk DUBLECZ, K. – BARTOS, Á. – PÁL, L. – WÁGNER, L. – BÁNYAI, A. – TÓTH, SZ. – BABINSZKY, G. /2004/: Modification the fatty acid composition of different tissues in broiler chicks. XII. World’s Poultry Congress, Istanbul, Turkey. 424. p.
KESERŐ, M. – BUDAI, P. – VÁRNAGY, L. – BABINSZKY, G. /2004/: Növényvédı szerek méreghatásának vizsgálata házityúk embriókon. XIV. Keszthelyi Növényvédelmi
117
Fórum. 80. p.
KESERŐ, M. – BUDAI, P. – VÁRNAGY, L. – SZABÓ, R. – JUHÁSZ, É. – BABINSZKY, G. /2004/: Teratogenicity study of some pesticides in chicken embryos. 56th International Symposium on Crop Protection. Ghent, Belgium. 236. p.
KESERŐ, M. – BUDAI, P. – VÁRNAGY, L. – SZABÓ, R. – JUHÁSZ, É. – BABINSZKY, G. – PONGRÁCZ, A. /2004/: Teratogenicity study of some pesticides in chicken embryos. Comm. Appl. Biol. Sci., Ghent Univ., 69., 803-806. pp.
PÁL, L. – BARTOS, Á. – BÁNYAI, A. – BABINSZKY, G. – DUBLECZ, K. /2004/: A tökmagolaj alkalmazásának lehetıségei. Baromfiágazat, 1., 34-39. pp.
BABINSZKY, G. – CSITÁRI, G. – TÓTH, SZ. – WÁGNER, L. – PÁL, L. – DUBLECZ, K. /2005/: Effect of different feed additives on the caecal microflora of broiler chickens. Proceedings of the 15th European symposium on Poultry Nutrition, Balatonfüred, Hungary. 395-397. pp.
CERNÁK, I. – FEHÉR, E. – BABINSZKY, G. – WOLF, I. – POLGÁR, ZS. – ALFÖLDI, Z. – TALLER, J. /2005/: Development of RAPD markers linked to a new Rysto locus in potato. 16th EAPR Conference, Bilbao, Spain. 470. p.
CERNÁK, I. – FEHÉR, E. – BABINSZKY, G. – WOLF, I. – POLGÁR, ZS. – ALFÖLDI, Z. – TALLER, J. /2005/: Egy Solanum stoloniferum eredető immunitás gén molekuláris markerezése a burgonyában. A Romániai Magyar Doktorandusok és Fiatal Kutatók Országos Szövetsége VI. Országos Konferenciája, Kolozsvár. 30. p.
CERNÁK, I. – FEHÉR, E. – BABINSZKY, G. – WOLF, I. – POLGÁR, ZS. – ALFÖLDI, Z. – TALLER, J. /2005/: Molekuláris rezisztencianemesítés a Georgikonban II. Az Rysto lókuszhoz kapcsolt RAPD markerek detektálása a burgonyában. XI. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest. 50. p.
GULYÁS, M. E. – NÉMETH, ZS. – BABINSZKY, G. – KEREKES, J. – MAJOR, P. – CSITÁRI,
118
G. /2006/: Detection of vancomycin resistant Gram positives from environmental samples. Acta Microbiol. Immunol. Hung., 53. (Suppl.), 270-271. pp.
TÓTH, SZ. – DUBLECZ, K. – BARTOS, Á. – PÁL, L. – BÁNYAI, A. – BABINSZKY, G. /2006/: Növényi eredető hozamfokozók hatása brojler csirkék termelési eredményeire. XII. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely. CD kiadvány.
CERNÁK, I. – TALLER, J. – WOLF, I. – FEHÉR, E. – BABINSZKY, G. – ALFÖLDI, Z. – CSANÁDI, G. – POLGÁR, ZS. /2008/: Analysis of the applicability of molecular markers linked to the PVY extreme resistance gene Rysto, and the identification of new markers. Acta Biol. Hung., 59., 195-203. pp.
119
10. FÜGGELÉK
10.1. A diszkriminancia analízis vázlatos menete, GAÁL /2004/ alapján Adatbevitel:
4 csoport: 1) botulizmusos terület, botulizmusos idıszak („a” jelő mintavételi helyek) 2) botulizmusos terület, nem botulizmusos idıszak („b” jelő mv. helyek) 3) nem botulizmusos terület, botulizmusos idıszak („c” jelő mv. helyek) 4) nem botulizmusos terület, nem botulizmusos idıszak („d” jelő mv. helyek) (A táblázatban az egyes paraméterek június és szeptember hónapok közti idıszakban mért értékeinek számtani átlagai szerepelnek). Azt vizsgáljuk, hogy az eredeti csoportok statisztikai szempontok alapján is ugyanígy különülnek-e el.
120
További beállítások: - Statistics: - Descriptives: - Means (csoportonkénti átlag és szórás számítása a változókra), - Univariate ANOVAs (változónként egytényezıs varianciaanalízis a csoportok várható értékének egyezésére) - Function Coefficients: - Fisher’s (standardizált együtthatókat számol a diszkrimináló függvényekhez, konstans tag nincs) - Classify: - Prior Probabilities (az újrabesorolásnál számolt valószínőségeknél azonos vagy különbözı elemszámú csoportokat vegyen figyelembe): Compute from group sizes - Display: - Casewise results (minden elemre megadja az eredeti csoportot, a várt csoportot és néhány statisztikát), - Summary table (összefoglaló táblázat az eredeti és a diszkrimináló függvények alapján várható besorolásról) - Plots: - Combined-groups (az elsı két diszkrimináló függvény szerint kirajzolja az összes csoportot egy ábrába)
121
Csoportstatisztikák:
Minden csoportra változóként megadja az átlagot, szórást és az elemszámot.
A csoportok egyezése (ANOVA):
Minden változóra elvégez egy egytényezıs varianciaanalízist a csoportátlagok egyezésére vonatkozóan (H0: megegyeznek). A szignifikancia szint alapján egyik vízminıségi paramétert tekintve sincs különbség a csoportok között 95%-os megbízhatósági szinten.
122
Analysis 1 Summary of Canonical Discriminant Functions A diszkrimináló függvények vizsgálata:
A vizsgálatban 4 csoport (m) és 5 változó (N) szerepel, ezért egy háromdimenziós tér lesz a diszkrimináns tér, amelyre a megfigyeléseket vetítjük, és ehhez három diszkrimináló függvényt használhatunk. A sajátértékek alapján az elsı diszkrimináló függvény a variancia 75,3%-át tudja magyarázni, a második 22,6%-ot, a harmadik már csak 2,1%-ot, tehát a csoportok szétválasztásában csak az elsı kettınek van szerepe.
A diszkrimináns hatás (mennyire hatásosan választják szét a csoportokat a függvények) vizsgálatára a Wilks-féle lambda értéket használják, vagy a χ2 próbát. Az értékek alapján az 1-3 függvény együttesen szignifikáns (jó szétválasztó), még a 2-3 is, de önmagában a harmadik nem jelentıs.
A diszkrimináló függvények az eredeti változók lineáris kombinációjaként állnak elı, ezek együtthatóit tartalmazza a táblázat. Pl. az elsı függvény y= -2,951x1 – 2,149x2 + 0,248x3 + 5,097x4 + 0,091x5 formában írható fel, ahol x1, x2, x3, x4, x5 az eredeti változókat jelentik a táblázatban megadott sorrendben.
123
A csoportok vizsgálata: Összehasonlíthatjuk az eredeti besorolást a diszkrimináló függvények segítségével létrehozható besorolással. Ha a kétféle besorolás között az eltérés kicsi, akkor az eredeti besorolás a felhasznált változókkal jól magyarázható.
A táblázatban a Case number oszlop mutatja a mintavételi helyeket az adatállományban található sorrend szerint, az Actual Group jelenti az eredeti besorolást (1: botulizmusos terület, botulizmusos idıszak; 2: botulizmusos terület, nem botulizmusos idıszak; 3: nem botulizmusos terület, botulizmusos idıszak; 4: nem botulizmusos terület, nem botulizmusos idıszak), a Predicted Group pedig a diszkrimináló függvények általi besorolást. A kétféle besorolás a **-gal jelzett négy mintavételi pont (2, 15, 17, 19) esetén nem egyezik meg.
A besorolásokról a program egy összefoglaló táblázatot is készít, amit soronként kell olvasni. A felsı részében a megfigyelések száma szerint mutatja a besorolásokat, az alsó részben százalékosan. A kétféle csoportosítás eltérései itt is nyomon követhetık: az 1-es csoport egy tagja inkább a 2-es csoportba, a 3-as csoport egy tagja inkább a 4-es
124
csoportba, míg a 4-es csoport egy tagja inkább a 2-es, egy tagja pedig inkább a 3-as csoportba tartozna a diszkrimináló függvények szerint. A táblázat alján látható, hogy összességében 80,0%-ban volt helyes az eredeti csoportosítás.
A csoportok kirajzoltathatók az elsı két diszkrimináló függvény alapján is. Több függvény esetén is mindig az elsı kettı a legjobban szétválasztó, tehát ezek szerint érdemes vizsgálni a csoportok szétválását.
125
10.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval 10.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján A kezdı reakció PCR-profilja: hımérséklet 94°C 95°C 55°C 72°C 72°C
idıtartam 1 perc 1 perc 1 perc 2 perc 10 perc
ciklusszám 1 30 1
A nested reakció PCR-profilja: hımérséklet 94°C 95°C 55°C 72°C 72°C
idıtartam 1 perc 1 perc 1 perc 2 perc 10 perc
ciklusszám 1 15 1
A reakciók során felhasznált primerek szekvenciái: irány Sense Antisense
szekvencia
primer* ToxC384 ToxC625 ToxC850R ToxC1049R
384
406
5' AAACCTCCTCGAGTTACAAGCCC 3' 625 648 5' CTAGACAAGGTAACAACTGGGTTA 3' 5' 850GAAAATCTACCCTCTCCTACATCA827 3' 5' 1049AATAAGGTCTATAGTTGGACCTCC1026 3'
*A primerek neve egyben a 468-as törzs BoNT/C1 génjén való elhelyezkedésüket is jelöli (GeneBank accession no. X53751.1)
10.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján A reakció PCR-profilja: hımérséklet 95°C 95°C 50°C 60°C 60°C
idıtartam 10 perc 1 perc 1 perc 4 perc 15 perc
ciklusszám 1 30 1
126
A reakciók során felhasznált primerek szekvenciái: irány Sense Antisense
szekvencia*
primer
5' 76205GCGGCACAAGAAGGATTTG76223 3' 5' 76819CGCCGTAACCGGAGTATAT76801 3'
CI CII
*A C típusú fág genomjában való elhelyezkedésükkel együtt (GeneBank accession no. NC_007581.1). A 468-as törzs esetében (X53751.1): 754-772; 1368-1350 bp között.
10.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján A reakció PCR-profilja: hımérséklet 95°C 95°C 55°C 72°C
idıtartam 10 perc 5 másodperc 20 másodperc 35 másodperc
ciklusszám 1
45
Az ezt követı olvadáspont-analízis menete: hımérséklet 95°C 40°C 95°C-ig 40°C
idıtartam 5 másodperc 30 másodperc 30 másodperc
megjegyzés
0,1°C/s-onként folyamatos jelgyőjtés cooling
127
10.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók Az Invitrogen D-LUX tervezı programjának eredményei:
A leginkább megfelelınek bizonyult primer-párt zöld keret jelöli. A GC arány és az olvadáspont értékek közelítése a forward primer utolsó A-jének elhagyását tette szükségessé: primer R eredeti F eredeti R módosított F módosított
szekvencia (5' - 3') CATAAAAGACTTGATTCTCTCCCG GCCATAAAGCAATAGATGGTAGATCA CATAAAAGACTTGATTCTCTCCCG GCCATAAAGCAATAGATGGTAGATC
128
hossz (nukleotid) 24 26 24 25
Tm (°C) 68,0 72,0 68,0 70,0
GC (%) 41,7 38,5 41,7 40,0
A reakcióelegyek összetétele: összetevı / primer konc. Enzim 10x PCR puffer dNTP (25mmol/µl) MgCl2 (25mmol/µl) BSA (1mg/ml)* F primer (10pmol/µl) R primer (10pmol/µl) PCR víz
5 pM 0,5 µl 2µl 0,3µl 2,8µl 6,5µl 0,5µl 0,5µl 4,9µl
10 pM 0,5 µl 2µl 0,3µl 2,8µl 6,5µl 1µl 1µl 3,9µl
*A reakciók BSA hozzáadása nélkül is lefolytatásra kerültek. Ekkor a BSA mennyiségét PCR víz helyettesítette.
A reakció PCR-profilja: hımérséklet 95°C 95°C 62°C* 72°C
idıtartam 2 perc 5 másodperc 30 másodperc 30 másodperc
ciklusszám 1
50
*2,5°C/s hımérséklet-emelkedéssel, 72°C-ig (62°C helyett 59, 55, 51 és 48°C annealing hımérséklettel is), VAGY 53-57°C között 2,5°C/s hımérséklet-emelkedéssel, 10 cikluson keresztül, majd 0,5°C/s hımérséklet-emelkedés
Az ezt követı olvadáspont-analízis lépései: hımérséklet 95°C 50°C 95°C-ig 40°C
idıtartam 30 másodperc 30 másodperc 30 másodperc
megjegyzés
0,2°C/s-onként folyamatos jelgyőjtés cooling
129
10.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel
A FeCl3-dal kiegészített, módosított McClung-Toabe EYA elkészítése: összetevı pepton vagy tripton Na2HPO4 NaCl MgSO4 (5%-os oldat) FeCl3 (5%-os oldat) glükóz agar desztillált víz
mennyiség 20,0 g 2,5 g 1,0 g 0,1 ml 0,1 ml 1,0 g 12,5 g 500,0 ml
A pH-t állítsuk 7,3-7,4-re, majd autoklávozzuk 121°C-on 15 percig. Hőtsük 60°C-ra, adjuk hozzá egy tojás sárgáját. Keverjük össze, s öntsünk belıle lemezeket. Mivel a táptalaj nem redukált, az elkészítéstıl számított 4 órán túli felhasználás esetén a lemezek anaerob tenyészedényben tárolandók.
130
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet témavezetımnek, Dr. Csitári Gábornak szakmai tanácsaiért, a nyugodt, családias és mégis inspiráló munkahelyi légkörért és munkám irányításáért. Hálával tartozom Dr. Gulyás Mártának, több mint egy évtizede tartó, önfeláldozó segítségéért, a mikrobiológia elméleti és gyakorlati kérdéseiben egyaránt. Köszönöm Csütörtökiné Rigó Erzsébetnek a vidám beszélgetéseket, a sok bátorítást, s hogy mindig a legtisztább és legmegfelelıbb anyagokkal, eszközökkel dolgozhattam – és hogy rábeszélt, jegyezzem el a feleségemet. Ugyancsak köszönöm Dr. Taller János, Dr. Cernák István, illetve a Pannon Egyetem, Növénytudományi és Biotechnológai
Tanszék
Biotechnológia
Laboratóriumában
dolgozó
kollégáik
segítségét. Köszönöm az Országos Epidemiológiai Központ Bakteriológia I. Osztályának anaerob laboratóriumából Dr. Barna Zsuzsanna és Szilágyi Krisztina fáradhatatlan részvételét a baktériumtörzsek izolálásában, Magyari Máté (Balatonfelvidéki Nemzeti Park) segítségét pedig az iszapminták begyőjtésében és a Kisbalatoni kitörésekkel kapcsolatos információk nyújtásában. Köszönet illeti Kárpáti Krisztinát az idegen nyelvő anyagok, publikációk lektorálásáért. Hálás vagyok BalázsNagy Ágnesnek és az MH HEK MBLK teljes állományának baráti segítségükért, végül, de nem utolsó sorban családomnak, a sok szeretetért, bíztatásért, s az áldozatos és mindenre kiterjedı támogatásért, amely nélkül ez a munka soha nem jöhetett volna létre. A dolgozatot ezúton szeretném édesanyám emlékének szentelni, aki ezt a pillanatot sajnos már nem érhette meg.
131
