DOKTORI ÉRTEKEZÉS
Majláth Imre
2012
A növények stresszadaptációját kísérő génexpressziós és anyagcsereváltozások tanulmányozása PhD értekezés Készítette:
Majláth Imre
ELTE Biológia Doktori Iskola (Prof. Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Prof. Dr. Szigeti Zoltán)
Témavezető:
Dr. Szalai Gabriella tudományos tanácsadó
MTA ATK Mezőgazdasági Intézet 2012
Tartalomjegyzék 1.
Bevezetés............................................................................................................ 1
2.
Irodalmi áttekintés.............................................................................................. 2
2.1.
Stressz és stresszválasz növényekben ................................................................ 2
2.2.
Az alacsony hőmérséklet általános hatásai növényekben ................................... 2
2.3.
Az alacsony hőmérséklet elleni védekezés növényekben ................................... 7
2.3.1. ROS semlegesítés – az aszkorbát-glutation ciklus (AGC).................................. 7 2.3.2. Antioxidáns enzimek......................................................................................... 10 2.3.3. Fenolos vegyületek............................................................................................ 12 2.3.4. Növényi hormonok............................................................................................ 12 2.3.4.1. A szalicilsav (SA) hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe............. 12 2.3.4.2. Az etilén hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe ........................... 15 2.3.5. A poliaminok (PA) hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe ........... 17 2.3.6.
Ozmotikus védővegyületek ............................................................................... 18
2.4.
A fény biológiai szempontból fontos tulajdonságai .......................................... 18
2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. 2.4.4. 2.4.5. 2.4.6.
A fényérzékelés és jelátvitel folyamata............................................................. 19 A fényintenzitás hatása alacsony hőmérsékleten ............................................. 21 A fotoperiódus hatása és az alacsony hőmérséklet kapcsolata ......................... 22 Az árnyékkerülés (Shade Avoidance Syndrome, SAS) és a hőmérséklet kapcsolata .......................................................................................................... 23 Fénystressz (fénygátlás) .................................................................................... 25 A fény károsító hatása elleni védekező mechanizmusok .................................. 25
2.5.
A stresszfolyamatok vizsgálatának genetikai megközelítései............................ 27
2.5.1. Allélpolimorfizmus ............................................................................................ 27 2.5.2. Szegregációs populációk és a QTL térképezésben való szerepük ..................... 27 2.5.3. A globális génexpressziós vizsgálatok szerepe stressz szignalizáció vizsgálatában ...................................................................................................... 29 3.
A kutatások céljai ................................................................................................ 30
4.
Anyagok és módszerek........................................................................................ 31
4.1.
A növénynevelés körülményei, növényi anyag................................................... 31
4.1.1. Búza..................................................................................................................... 31 4.1.2. Arabidopsis mutánsok és transzgenikus vonalak ................................................ 31 4.1.3. A Ler (Cvi) NIL2-8 térképezési populáció .......................................................... 32 4.2.
QTL térképezés .................................................................................................... 34
4.2.1. DNS kivonás 96 well plate-en az F2 generációban.............................................. 34 4.2.2. DNS extrakció az F3 generációban ...................................................................... 34 4.2.3. Genotipizálás ........................................................................................................ 35 4.2.4. Fenotípus-vizsgálat............................................................................................... 36 4.3. Microarray vizsgálat............................................................................................. 36 4.3.1. RNS izolálás és microarray vizsgálat................................................................... 36 4.3.2. Microarray adatfeldolgozás.................................................................................. 37 4.3.3. A szekvenciák reannotációja ................................................................................ 37 4.3.4. GO analízis ........................................................................................................... 38 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3.
Fagyasztási tesztek .............................................................................................. 38 A fagyasztás körülményei ................................................................................... 38 Bonitálás……………………………………………………………………….. 38 Ionkiáramlás mérés ............................................................................................. 39
4.5.
Klorofilltartalom mérés ....................................................................................... 40
4.6.
Klorofill-fluoreszcencia indukció mérése ........................................................... 40
4.7.
Az aszkorbáttartalom meghatározása.................................................................. 40
4.8. Az antioxidáns enzimek aktivitásának mérése.................................................... 41 4.8.1. Enzimkivonás ...................................................................................................... 41 4.8.2. 4.8.3. 4.8.4. 4.8.5. 4.8.6.
A glutation-reduktáz aktivitásának meghatározása............................................. 41 Az aszkorbát-peroxidáz aktivitásának meghatározása ........................................ 42 A mono-dehidroaszkorbát reduktáz aktivitásának meghatározása ..................... 42 A kataláz aktivitásának meghatározása............................................................... 42 A gvajakol-peroxidáz aktivitásának meghatározása ........................................... 42
4.9.
A szalicilsav mennyiségének mérése .................................................................. 43
4.10. A poliamintartalom meghatározása..................................................................... 44 4.11. Az ACC- és MACC-tartalom meghatározása ..................................................... 45 4.12. Az összfenol-tartalom mérése ............................................................................. 46 4.13. A prolintartalom meghatározása ......................................................................... 47 4.14. Statisztikai elemzések ......................................................................................... 47 5. Eredmények......................................................................................................... 49 5.1. A fény szerepe a búza hidegedzése alatt ............................................................. 49 5.1.1. A transzkripciós mintázat eltérései a fajták között eltérő fényintenzitás hatására…………. ............................................................................................... 49 5.1.2. A stresszhez kötődő anyagcseretermékek változásai a hidegedzés hatására a megvilágítás függvényében................................................................................. 54
5.1.2.1. 5.1.2.2.
Ozmoprotektánsok: prolin.............................................................................. 54 Antioxidáns vegyületek: összfenol-tartalom .................................................. 55
5.2.
A hideg- és fagytűrés élettani vizsgálata eltérő fagytűrésű Arabidopsis mutánsokban és transzgenikus vonalakban.................................................... 56 Fagyasztási tesztek ......................................................................................... 57 A fotoszintetikus apparátus szerepe ............................................................... 58
5.2.1. 5.2.2. 5.2.2.1. 5.2.2.2. 5.2.2.3.
A klorofilltartalom változásai......................................................................... 58 A PSII kvantumhasznosítási paraméterei (Fv/Fm és ∆F/Fm’)....................... 60 A fotoszintézishez kötődő paraméterek változásainak egymással való kapcsolata ............................................................................................... 63
5.2.3.
Az antioxidáns védekezőrendszer aktivitása – az aszkorbát-glutation ciklus vizsgálata ............................................................................................. 64
5.2.3.1. 5.2.3.2. 5.2.3.3. 5.2.3.4.
Glutation-reduktáz.......................................................................................... 64 Mono-dehidroaszkorbát reduktáz (MDHAR) ................................................ 65 Aszkorbát-peroxidáz ...................................................................................... 65 Az aszkorbátszint (AA) változásai ................................................................. 66
5.2.4.
A szalicilsavszint (SA) változásai .................................................................. 68
5.2.4.1. 5.2.4.2. 5.2.4.3.
Az orto-hidroxi fahéjsav (oHCA) mint a SA előanyaga ................................ 68 Az endogén SA mennyiségének változása..................................................... 68 Az oHCA és az SA változásának összefüggései ............................................ 70
5.2.5.
Poliaminok (PA)............................................................................................. 71
5.2.6.
Az etilénszintézis előanyagának vizsgálata (ACC és MACC)....................... 72
5.2.7.
A hasonlóság vizsgálat eredménye ................................................................ 73
5.3.
A hidegedzés hatása az Arabidopsis thaliana noa1 (Atnoa1) mutánsok esetén .............................................................................................. 75
5.3.1.
A fagyasztási teszt és a membránkárosodás mértéke...................................... 75
5.3.2.
A fotoszintetikus apparátus ............................................................................. 76
5.3.2.1. 5.3.2.2. 5.3.3. 5.3.4. 5.3.5.
A klorofilltartalom változása........................................................................... 76 Fluoreszcencia indukciós paraméterek............................................................ 76 Antioxidáns enzimek....................................................................................... 78 Szalicilsav........................................................................................................ 80 Poliaminok ...................................................................................................... 81
5.4.
Az árnyékkerülés (Shade Avoidance Syndrome, SAS) és hőmérséklet: az alacsony hőmérséklet hatása a SAS-ra ........................................................ 82 A SAS1 QTL térképezése ................................................................................ 82
5.4.1.
5.4.2. 5.4.3.
Bulk szegregációs analízis................................................................................ 82 SAS1 jellegek fenotípusos vizsgálata .............................................................. 84
6.
Az eredmények megvitatása............................................................................. 86
6.1.
A fény hatása a búza hidegedzése alatt ............................................................ 86
6.1.1.
A hideg indukálta génexpressziós változások .................................................. 86
6.1.2.
Ozmotikumok, antioxidánsok .......................................................................... 89
6.2. 6.2.1. 6.2.2. 6.2.3. 6.2.4. 6.2.5. 6.2.6.
Az alacsony hőmérséklet élettani hatásai Arabidopsisban .............................. 90 Fagytűrésbeli különbségek ............................................................................... 90 A hideg hatása a fotoszintézis működésére: klorofillszint és kvantumhatékonyság ........................................................................................ 92 Az aszkorbáttartalom és az enzimatikus ROS-mentesítés ............................... 94 A szalicilsav és hidegstressz ............................................................................ 96 A poliaminok szerepe a hideg elleni védekezésben ......................................... 97 Etilén-anyagcsere és hidegstressz .................................................................... 99
6.3.
A hideg hatása az Arabidopsis NOA1 mutánsokra ........................................ 100
6.4.
Az árnyék-kerülésért felelős gének térképezése ............................................ 101
6.5.
További tervezett vizsgálatok Arabidopsisban .............................................. 102
7.
Összefoglalás.................................................................................................. 105
8.
Summary ........................................................................................................ 106
9.
Felhasznált irodalom ...................................................................................... 107
10.
Melléklet......................................................................................................... 133 Köszönetnyilvánítás ....................................................................................... 135
Rövidítések jegyzéke/Abbreviations A dolgozatban használt rövidítések többsége az adott fejezetben történő első említésnél is magyarázatra került. Az alábbi lista a szövegben való könnyebb tájékozódást segíti. AA: aszkorbát,
GA: giberellinsav,
ABA: abszcizinsav,
GLOáz: aszkorbáttúltermelő-transzgenikus
ACC: 1-aminociklopropán-1-karboxilsav,
vonal,
AGC: aszkorbát-glutation ciklus,
GPX: gvajakol peroxidáz,
APRR1: Arabidopsis pseudo-response
GR: glutation reduktáz,
regulator1,
GS: glutation (redoxállapotának
APX: aszkorbát peroxidáz,
megjelölése nélkül),
CAT: kataláz,
GSH: redukált állapotú glutation,
Chl: klorofill,
GSSG: oxidált állapotú glutation,
CK: citokinin,
GST: glutation-S-transzferáz,
cry: kriptokrómok,
HR: hiperszenzitív reakció,
cyt: citokróm,
IAA: auxinok,
DAF: Days after freezing – a fagyteszt
ICS: izokorizmát-szintáz,
utáni napok,
JA: jázmonsav,
DHA: dehidroaszkorbát,
LD: long-day – hosszúnappalos
DHAR: dehidroaszkorbát reduktáz,
megvilágítás,
eds5: enhanced disase susceptibility –
LFS: Light Foraging Strategy – a
fokozott patogénérzékenységgel
fénygyűjtés hatékonyságát fokozó
rendelkező mutáns,
stratégiák,
ER: Erecta gének,
LL: alacsony fényintenzitás,
ERL: Erecta-like gének,
LOV: Light-Oxygen-Voltage domén,
FC: fold-change érték,
MACC: malonil-1-aminociklopropán-1-
FLC: Flowering Locus C gének,
karboxilsav,
FR: Far-Red – távoli vörös fény,
MDHAR: mono-dehidroaszkorbát
FRI: (FRIGIDA) flowering time regulator
reduktáz,
– a virágzás idejét szabályozó gének, Fv/Fm: a PSII maximális kvantumhatékonyságát kifejező paraméter sötétadaptált minták esetén,
Me-SA: metil-szalicilsav, NahG: szalicilsav degradáló transzgenikus vonal,
NIL: Near Isogenic Lines – közel azonos genotípusok,
SNP: Single Nucleotide Polymorphism – egypontos nukleotid polimorfizmus,
NL: normál fényintenzitás,
SOD: szuperoxid-dizmutáz,
noa1: nitric oxide associated - nitrogén-
Spd: spermidin,
monoxid anyagcseréhez kapcsolódó
Spn: spermin,
mutáns,
TOC1: timing of CAB expression,
NPQ: nem-fotokémiai kioltás,
vtc2-1: aszkorbát-hiányos mutáns,
oHCA: orto-hidroxi fahéjsav,
VRN: vernalizációs gének,
PA: poliaminok,
ZTL: zeitlupe fehérjék,
PAS: Per–Arnt–Sim domén,
∆F/Fm’: a PSII aktuális
PCA: Principal Component Analysis – főkomponens analízis, phy: fitokrómok, Ppd: fotoperiódus gének, PR: pathogenesis related – kórokozóhoz kapcsolódó, PSI: I fotokémiai rendszer, PSII: II fotokémiai rendszer, Put: putreszcin, QTL: Quantitative Trait Loci – mennyiségi jellegekért felelős lókuszok, R: Red light – vörös fény, ROS: Reactive Oxygen Species – reaktív oxigén fajták, SA: szalicilsav, SAM: S-adenozil-metionin, SAR: Systemic Acquired Resistance – szisztémás szerzett rezisztencia, SAS: Shade Avoidance Syndrome – árnyékelkerülési tünetegyüttes, SD: short-day – rövidnappalos megvilágítás, sid2: izokorizmát-szintáz mutáns,
kvantumhatékonyságát kifejező paraméter fényadaptált minták esetén
1. Bevezetés Éghajlat és természetes növénytakaró – időjárás és termésmennyiség. A lépték más, a hatás hasonló. Az abiotikus környezeti tényezők változása és a növények fejlődése szorosan összefügg. A globális klímaváltozásnak köszönhetően világszerte egyre gyakoribbak az éves hőmérsékleti vagy csapadékeloszlási szélsőségek. Az
időjárás
szélsőségei
hazánkat
sem
kímélik.
Az
utóbbi
évtized
egyik
legszélsőségesebb példája a 2010. év késő tavaszi-kora nyári országosan hűvös és rendkívül csapadékos időjárása. A XXI. század második felére melegedés várható mind a nyári, mind a téli hónapokra. A modelleredmények valószínűsítik az éven belüli csapadékeloszlás átrendeződését a XXI. század végére. Egyes éghajlat-változási modellek szerint a következő évtizedekben a legcsapadékosabb évszak a tél, míg a legszárazabb várhatóan a nyár lesz. Az éghajlat változása a természetes növénytakaró jelentős változását okozhatja, illetve komoly károkat jelenthet a mezőgazdaság számára. A gyorsan változó környezeti tényezők a növényekben új adaptációs folyamatokhoz vezetnek. Az ennek hatására bekövetkező morfológia és élettani változások a haszonnövények esetén
a
minőséget
és
mennyiséget
kedvezőtlenül
befolyásolhatják,
amely
a
növénynemesítőket és a gazdákat újabb, jelentős kihívások elé állítja. A növényélettani kutatások terén kiemelt jelentősége van a stresszélettani kutatásoknak. Több fontos gazdasági növény – például a búza, illetve a kukorica – esetén jelentős környezeti tényező az alacsony hőmérséklet, illetve a megvilágítás erőssége, melyek a túlélést és fejlődést is befolyásolják. Az Arabidopsis thaliana az élettani kutatások gyakran használt modellnövénye. Ismert genetikai háttere, valamint számos mutáns és transzgenikus változata sokféle molekuláris és élettani probléma megismerésének vizsgálatára alkalmassá teszi, habár az Arabidopsisban kapott eredmények nem mindig általánosíthatók más fajokra, különösen nem az egyszikűekre. A fenti tények figyelembevételével éppen ezért az őszi és tavaszi búzavonalak, valamint Arabidopsis modell-rendszer párhuzamos tanulmányozása mellett döntöttünk. Vizsgálataink során a túléléshez szükséges fagytűrés kialakulása alatt bekövetkező génexpressziós és anyagcsereváltozásokat tanulmányoztuk. Búza esetén a fény génexpresszióra gyakorolt hatását, Arabidopsisban az antioxidáns, a hormonális, illetve más metabolikus védekezési utakhoz kapcsolódó változásokat figyeltük meg. Búzában a stresszválasz genetikai-, míg az Arabidopsisban az élettani hátterére fókuszáltunk.
1
2. Irodalmi áttekintés 2.1. Stressz és stresszválasz növényekben A stressz fogalma már korábban is ismert volt, azonban az első operatív elméletet a magyar származású Selye János alkotta meg az 1970-es évek elején (Selye 1973). A stressz az élőlény nem specifikus válasza minden olyan hatásra vagy hatásokra, mely(ek) az egyensúlyi állapotából kibillentik és alkalmazkodásra kényszerítik. A stresszválaszt kiváltó tényezőket stresszoroknak nevezzük, melyek lehetnek biotikus vagy abiotikus eredetűek. Az előzőre példák a patogének vagy a növényevők, utóbbira az élőlény számára az optimálistól eltérő hőmérséklet vagy megvilágítás. A stresszválasz lehet specifikus vagy általános. Az optimálistól eltérő fény és hőmérséklet jelentős stresszor lehet a növények számára, melyek helyhez kötöttségük miatt más módon kénytelenek a környezetükhöz alkalmazkodni, mint a helyváltoztatásra képes élőlények. A stressz állapota alatt a növények rövid, átmeneti károsodások után regenerálódhatnak és ellenállóbbá válhatnak, ha a stresszhatás mértéke a tűrőképesség határát illetve az egyed adaptív kapacitását nem haladja meg (Larcher 1987, Lichtenthaler 1998, Mandre 2002). Az akklimáció fontos folyamat a stressz káros hatásainak elkerülésére. Ha az akklimáció során az örökítőanyag is megváltozik és a változás öröklődő lesz, akkor már adaptációról beszélünk. Az állatokkal szemben alapvető különbség, hogy a növények képesek a kimerülési szakasz utáni regenerációra. Ennek sikeressége függ a stresszhatás erősségétől, illetve az élőlény felkészültségi állapotától (edzettségétől). Számos metabolikus és morfogenetikus folyamat alakult ki a stresszhatások elkerülésére, illetve a kialakult károsodások mértékének csökkentésére vagy megszűntetésére. 2.2. Az alacsony hőmérséklet általános hatásai növényekben A növényekben a fagypont feletti alacsony hőmérséklet (az ún. chilling) okozta morfológiai, molekuláris és élettani változások már hosszú ideje az érdeklődés középpontjában vannak, melyekből számos tanulmány született (Thomashow 1999, Mahajan és Tuteja 2005, Verlues és mtsai. 2006, Ruelland és mtsai. 2009). Az alacsony hőmérséklet a káros hatásokon kívül fontos fejlődésélettani folyamatokat is indukál, úgy, mint a csírázás (Finch-Savage és Leubner-Metzger 2006) és a vernalizáció (Alexandre és Hennig 2008, Schmitz és Amasino 2007). 2
A 0 és 15 °C közötti hőmérséklet jelentős károsodásokat okozhat az erre érzékeny növényekben (pl. a kukoricában). Egyes károsodások már a látható változások előtt megtörténhetnek a fotoszintetikus apparátusban vagy az anyagcsere folyamatok terén. A hideg okozta károsodások reverzíbilisek és irreverzíbilisek lehetnek. Ha a chilling periódust egy magasabb hőmérsékleti periódus követi (mint például a természetben a nappalok és az éjszakák), akkor a hideg indukált anyagcserezavarok megszűnnek. Ha azonban hosszabb idejű hidegstressznek tesszük ki az arra érzékeny növényeket, akkor irreverzíbilis károsodást szenvedhetnek. A stressztűrést az adott szövet vagy szerv kora is befolyásolhatja. Kukoricában a mezofillsejtek érzékenyebbek a hidegre, mint a hüvelyparenchima sejtek (Kratsch és Wise 2000). A növény anyagcseréjének számos folyamata valamilyen membránhoz kötődik. A hideg általános hatásai közé tartozik a biokémiai reakciók sebességének csökkenése, a termodinamikai egyensúly felbomlása, ezáltal a fehérjék apoláros oldalláncainak a citoszól felé történő növekvő kitettsége, amely a globuláris fehérjék stabilitását csökkenti, mely összességében a metabolikus szabályozás felborulásához vezet (Siddiqui és Caviocchioli 2006). Régóta ismert, hogy a membránokban lejátszódó folyamatoknak kulcsszerepük van a hidegkárosodás kialakulásában, illetve az alacsony hőmérséklethez történő alkalmazkodásban (Lyons és Raison 1970, Lyons 1973, Lyons és mtsai. 1979, Murata és mtsai. 1983). A membrán lipid fázisátmenet hipotézis szerint a membránlipidek valószínőleg folyadék kristályos állapotban vannak (Lyons 1973), azonban hidegérzékeny növényeknél egy kritikus hőmérsékleten
a
membránlipidek
egy
gélszerű
állapotba
mennek
át,
amely
a
membráműködést zavarja (szeparáció, grádiens- és fehérje környezet fenntartása). Más eredmények szerint a fázisátmenet hipotézis magasabbrendű növényeknél eléggé kétséges (Martin 1987). A jelenlegi álláspont szerint az alacsony hőmérsékletre érzékeny növények hidegkárosodásánál a membránlipidek nagy részénél nem történik fázisátmenet, bár előfordulhat, hogy kisebb lipidfrakciók lokálisan fázisátalakulást szenvedhetnek alacsony hőmérsékleten (Quinn 1988). A fagypont alatti alacsony hőmérséklet a foszfatidil-kolin, foszfatidil-etanolamin és a foszfatidil-glicerol csökkenését, míg a foszfatidsav és a lizofoszfolipidek mennyiségének növekedését okozza. A foszfatidil-kolin és a foszfatidsav arányának változása növeli a membránok dezorganizációját (Welti és mtsai. 2002). Újabban a szfingolipidek
stresszszignalizációban,
membrántranszportban
és
stresszellenes
folyamatokban való szerepét is kimutatták. A fagytűrés kialakulásában ugyancsak jelentős szerepük van. Minami és mtsai. (2010) kimutatták, hogy hidegstressz hatására a 3
plazmamembrán domének összetétele és elrendeződése átalakul. Az alacsony hőmérséklet a membránok
rigiditásához
vezet
búzában
(Janda
és
mtsai.
2007),
amely
a
transzportfolyamatokra (ioncsatornák, elektrontranszport) jelentős befolyással van. A membrán rigiditás ellen a növény a zsírsavösszetétel megváltoztatásával válaszol. Hidegérzékeny növények leveleinek foszfatidil-gliceridjei több
palmitin- és transz-∆3-
hexadekánsavat (t16:1) tartalmaztak, mint a hidegtűrő növényeké (Murata és mtsai 1982). Különböző fagyállóságú búzafajtákban és kromoszóma-szubsztitúciós vonalakban kapcsolatot találtak a transz-∆3-hexadekánsav tartalom és a fagyállóság között (Szalai és mtsai. 2001). Az alacsony hőmérsékleti edzés során kialakuló membránfluiditás növekedés szintén korrelál a fagyállósággal (Nishida és Murata 1996), amely a telítetlen lipidek arányának növekedéséből vagy a lipid/fehérje arány megváltozásából (tilakoid membránok) ered (Chapman és mtsai 1983). A fagypont alatti alacsony hőmérsékletnek az előzőnél is több, kedvezőtlen hatása van. A jég a sejtorganellumok károsodásához, ezáltal a sejtek halálához vezet (Gusta és mtsai. 2004). Az extracelluláris jégkristályképződés okozta kémiai potenciálkülönbség miatt a sejtből a víz az extracelluláris térbe vándorol, melynek a következménye a sejt dehidratációja (Dowgert és Steponkus 1984). A sejtben keletkező jégkristályok képződése ellen az úgynevezett ice-recrystallization proteinek hatnak, melyek a jégkristályhoz kötődve azok növekedését gátolják (Griffith és mtsai. 1997), melyek így pontos szerepet töltenek be a fagytolerancia kialakításában (Zhang és mtsai. 2010). A sejtekből távozott víz okozta intracelluláris hiperozmotikus környezet a makromolekulák számára kedvezőtlen lehet. Ennek kompenzálására ozmotikus hatású vegyületek képződnek. Az egyik ilyen a prolin, melynek összetett szerepe van a hidegstressz hatásainak kivédésében. A fagyhoz való sikeres alkalmazkodás komplex folyamatok eredménye. A mérsékelt övi területeken a hidegakklimáció már ősszel megtörténik. Ilyenkor a hosszabb-rövidebb idejű fagypont feletti alacsony hőmérséklet és a fotoperiódus rövidülése elég a fagytolerancia kialakulásához. A folyamatban a megvilágítás erőssége is kulcsfontosságú (Apostol és mtsai. 2006, Janda és mtsai. 2007, Szalai és mtsai. 2009). Alacsony fényintenzitás mellett az alacsony hőmérsékleti edzés kevésbé hatékony. Másrészről kimutatták, hogy fagyállóságot nemcsak alacsony hőmérsékleti edzéssel, hanem magas fényintenzitással is ki lehet alakítani (Veisz 1989, Gray és mtsai. 1997). Az Mv Emese őszi búzafajta esetén kimutatták, hogy alacsony fényintezitás mellett az alacsony hőmérsékleti edzés kevésbé hatékony, illetve a fagyállóság fokozható normál hőmérsékleten magas fényintenzitáson történő neveléssel is (Apostol és mtsai. 2006, Janda és mtsai. 2007). A fény pontos szerepe a fagytűrés 4
kialakulásában azonban még nem teljesen tisztázott. Az alacsony hőmérséklet csökkenti a fotoszintetikus
elektrontranszportlánchoz
kapcsolódó
elektronfelhasználó
folyamatok
sebességét, így a fény általi gerjesztési nyomás és gerjesztési energia egyensúlya felborulhat. A PSII maximális kvantumhatásfokával szemben az aktuális kvantumhatásfok és a fotokémiai kioltás értéke normál fényben hidegben csökkent, míg az alacsony megvilágítás melletti edzés során ezen paraméterek értéke magasabb volt, mint a kontroll, edzetlen növényekben (Janda és mtsai. 1994a,b). A gabonafélék adaptációs folyamatai arra vezetnek, hogy a hidegedzés után is minél nagyobb mértékben tudják a PSII-t oxidált állapotban tartani (Huner és mtsai. 1993, Janda és mtsai. 1994b). Stresszkörülmények között gyakran megfigyelhető a ciklikus elektrontranszportlánc fokozott működése, amely hozzájárul a nem-fotokémiai kioltáshoz (Apostol és mtsai. 2006). Kimutatták, hogy a gabonafélék fagyállósága összefüggést mutatott bizonyos antioxidáns enzimek, főként a GPX és APX aktivitásával. A GR és APX enzimek aktivitása akkor mutatta a legnagyobb mértékű emelkedést, amikor az edzés alacsony hőmérsékleten és normál megvilágítás mellett zajlott. A GPX alacsony fényintenzitás mellett mutatta a legnagyobb aktivitás emelkedést. A magas fényintezitás önmagában is képes volt bizonyos enzimek aktivitását megnövelni (Janda és mtsai. 2003). A fagy előtti alacsony hőmérséklet hatására számos gén aktiválódik, melyek termékei vagy a fagystressz elleni szignáltranszdukciós folymatokban vagy a direkt védekezésben játszanak szerepet. Számos hidegakklimációhoz kötődő gént már feltártak, azonban funkciójuk leírása sok esetben még megfejtésre vár. A legfontosabbak ezek közül a CBF regulon génjeinek (Winfield és mtsai. 2010), valamint a C-repeat binding factor/CRT és a dehydration-responsive element/DREB binding factor expressziója szintén növekszik, melyek szerepe a fagytolerancia kialakulásásban jelentős. Ezeknek a géneknek többsége a szárazságstressz hatására is kifejeződik, illetve ABA függést mutat. Az alacsony hőmérséklet elősegíti a másodlagos RNS struktúrák képződését is, ezáltal befolyással van a gén-, illetve fehérjeexpresszióra. A hőmérséklet kisebb mértékű változásának felismerése segít felismerni és megelőzni egy későbbi, nagyobb változás káros hatásait. A növény válasza kétféle lehet. Egyrészről a fejlődési fázisok átmenetének szabályozásában (vegetatív növekedési fázisból a virágzásba való átmenetel), másrészről megnöveli a toleranciát egy későbbi extremitás hatásainak elkerülésében, melyre az egyik legismertebb folyamat a fagytoleranciát megnövelő előzetes hidegedzés. Továbbá fontos a napi hőmérsékleti ingadozások hatásaihoz való alkalmazkodás, amelyet a cirkadián óra egyes komponenseinek eltérő intenzitású működése jelez. 5
A fenti folyamatok jó példák fény és hőmérséklet szignalizációs útjainak átfedéseire. Gabonafélékben végzett vizsgálatok alapján megállapították, hogy a megfelelő fagytolerancia kialakulása nemcsak az előzetes edzési (akklimációs) hőmérséklettől, hanem a megvilágítás erősségétől is függ (Apostol és mtsai. 2006, Janda és mtsai. 2007, Szalai és mtsai. 2009). A fagytolerancia kialakulásához elég néhány nap hideg, míg a vernalizációs folyamatok elindulásához hosszabb idő is szükséges lehet A hőmérsékleti jelátvitel molekuláris mechanizmusa kevéssé ismert. Az eddigi eredmények jelentős része a növény extremitásokra adott válaszának-, nem pedig a kis változások hatásainak megértéséről szólt. Magas hőmérsékletre a HSP/chaperon kaszkád képződik, amely elősegíti a sejtfehérjék megfelelő térszerkezet felvételét, valamint megakadályozza a denaturációjukat és a rendellenes aggregációjukat. Másrészről fontos a membrán zsírsavainak fluiditásváltozása is, amely a membránfehérjék, így a fotoszintetikus komplexek stabilitását biztosítja (Ruelland és mtsai. 2009). Hideghatásra a növény megemeli a citoszólikus Ca2+ szintjét, amely jelátviteli folyamatokat indíthat el (Franklin 2009, Knight 2002, Thomashow 2001). Kalcium érzékeny aequorin transzgént hordozó Arabidopsis (Carpaneto és mtsai. 2007) és őszi búza vonalakban hideghatásra
megemelkedett
Ca2+
szintet
figyeltek
meg,
amely
inkább
a
hőmérsékletcsökkenés gyorsaságától, mintsem annak az értékétől függött (Nagel-Volkmann 2009). Arabidopsisban és dohányban magasabb citoszólikus Ca2+ szint jelentős része a vakuólumból származott. Ismételt vagy hosszabb idejű hideghatások alkalmazásával megállapították, hogy a Ca2+ szint változásai hasonló mintázatot mutattak, melyek egyfajta memóriaként szolgálhatnak (Knight és mtsai. 1996). Ezek a megfigyelések egy Ca2+-függő jelátviteli út létére engednek következtetni. A növényekben számos élettani folyamat eredményez ROS képződést. Stresszhatásra a fotoszintézis során végbemenő vízbontásból származó oxigén gyökök és elektronok ROS felhalmozódást
okoznak
(Drążkiewicz
és
mtsai.
2003).
Ez
a
kloroplasztiszban
elekronátmeneti reakciókhoz vezet, az elektrontranszportlánc túlredukálttá válik, az elektronáramlás lelassul, amely ugyancsak fokozott ROS képződéshez vezet. További ROS képző folyamatok még a lipid peroxidációs, egyes antioxidáns reakciók és a légzési lánc oxidációs folyamatai. A PSI és PSII a legjelentősebb ROS-képzők. Az oxigén H2O2-dá redukálódása régóta ismert (Mehler 1951). Az elsődleges redukciós termék, a szuperoxid anion gyök (O2˙-), melynek diszproporciós termékei a H2O2 és az oxigén (Asada és mtsai. 1974). Másrészről, a PSII-n keletkező alapállapotú triplet oxigén (3O2) szinglet (1O2) állapotúvá alakul a PSII 6
gerjesztett állapotú triplet reakciócentruma (3P680*) által (Telfer és mtsai. 1994, Hideg és mtsai. 1998). A ROS szintje fajonként, szervenként, illetve fenofázisonként eltérő és fontos szabályozó
szereppel
rendelkezik.
A
ROS
mentesítésben
résztvevő
enzimek
sejtorganellumonként eltérőek. A víz-víz ciklusban a tilakoidokról származó O2˙- és H2O2 semlegesítése zajlik. A sztrómális ROS mentesítését a SOD és az aszkorbát-glutation ciklus (AGC) végzi, melyben a peroxiredoxin és a glutation peroxidáz is részt vesz. A fotorespirációból származó és a peroxiszómákban lévő, valamint a zsírsavoxidációból képződött ROS-t a SOD, a CAT és az APX semlegesíti. A SOD és az AGC komponensei a mitokondriumban is jelen vannak. Az alternatív oxidázok a mitokondriumban fejtik ki a hatásukat. A citoszól a sztrómáéhoz hasonló enzimkészlettel rendelkezik. Az apoplaszt és a sejtfal antioxidáns enzimei kevéssé ismertek, míg a vakuólum enzimei ezidáig ismeretlenek (Mittler és mtsai. 2004). A ROS akkumulációnak többféle káros hatása van, melyek közül a membránok degradációja az egyik legveszélyesebb, mivel az elektrolit egyensúly felbomlásához vezet. A H2O2 sokkal kevésbé reaktív, mint az oxigéngyökök, de egyrészt azért veszélyes, mert ellentétben az oxigén gyökökkel, át tud diffundálni a membránokon, és így a kialakulásától távolabbi helyeken is képes káros hatást kifejteni (Deisseroth és Dounce 1970). Könnyen átalakul hidroxil gyökké, amely az egyik legaktívabb és ezáltal az egyik legveszélyesebb gyökfajta. Stresszhatásra gyakran emelkedik a H2O2 szintje, amely a szalicilsav (SA) antioxidáns enzimekre gyakorolt hatásából is eredhet (Klessig és mtsai. 2000, Ganesan és Thomas 2001). A CuZn-SOD enzim aktivitását serkenti a SA, mely hozzájárulhat a H2O2 szint emelkedéséhez (Rao és mtsai. 1997). A H2O2 szintje kiemelkedő fontosságú a stresszellenes védekező folyamatok szignalizációja során. 2.3. Az alacsony hőmérséklet elleni védekezés növényekben 2.3.1. ROS semlegesítés – az aszkorbát-glutation ciklus (AGC) Valamely rendellenes biokémiai működés hatására (pl. akut stresszhatásra) a ROS szintje a növényben elérhet egy kritikus határértéket, amely felett a sejtekben a károsodás meghaladja a mentesítési kapacitást. A ROS többlet semlegesítésére több út is kialakult a növényekben: az enzimatikus és a nem enzimatikus út. A legfontosabb nem enzimatikus út az AGC. Ennek kulcsfontosságú vegyületei az aszkorbát (AA) és a glutation (GS), melyek 7
fontos antioxidáns védővegyületek mind önmagukban, mind pedig egyes antioxidáns enzimek kofaktoraként (Foyer és Noctor 2011). A Szent-Györgyi Albert által eredetileg hexuronsavnak (Szent-Györgyi 1931) nevezett vegyület aszkorbát néven 1933 óta ismert (Svirbely és Szent-Györgyi 1933). Az AA bioszintézisének pontos részleteire csak az utóbbi derült fény, amelyben az 1990-es évek második felében leírt AA hiányos mutánsok (vtc) vizsgálata fontos előrelépést jelentett (Smirnoff és mtsai. 2001). Növényekben a Smirnoff-Wheeler út szerint megy végbe. Ennek során a D-glükózból való szintézis GDP-L-galaktóz L-galaktóz 1-foszfáttá alakulását igényli, melyet a VTC2 gén által kódolt GDP-L-galaktóz foszforiláz (EC 2.7.7.69.) katalizál (1. ábra) (Wheeler és mtsai. 1998, Linster és mtsai. 2007, Linster és Clarke 2008).
1. ábra Az aszkorbát szintézis Smirnoff-Wheeler útja (Linster és mtsai. 2007 után).
8
A D-mannóz szintézisút inkább a levelekre-, míg a D-galakturonsav út a fejlődő gyümölcsökre jellemző (Radzio és mtsai. 2003). A GS és az AA kapcsolatát 1936-ban írták le (Hopkins és Morgan 1936). A reaktív oxigén formák semlegesítésében a legfontosabb út az AGC (2. ábra). Kiemelkedően fontos szerepe van a sejt redoxpotenciáljának szabályozásában. A ciklus reakciói révén az oxidált aszkorbát és a glutation forma visszanyeri a redukáló, azaz ROS mentesítő képességét a fotoszintézis vízbontásából származó protonokból illetve elektronokból, melyek a NADP redukált formája útján lépnek be a ciklusba (Drążkiewicz és mtsai. 2003).
2. ábra Az aszkorbát-glutation ciklus (az ábra bővebb magyarázatát ld. a szövegben) (Saruhan és mtsai. 1999 után). A reakciókban három, egymástól független redoxvegyület pár vesz részt AA/DHA, GSH/GSSG, illetve a NADPH/NADP (May és mtsai. 1998), valamint a következő enzimek: aszkorbát-peroxidáz
(APX,
EC1.11.1.11.),
monodehidroaszkorbát-reduktáz
(MDHAR,
EC1.6.5.4.), dehidroaszkorbát-reduktáz (DHAR, EC1.8.5.1.) és a glutation-reduktáz (GR, EC1.6.4.2.) (Noctor és Foyer 1998). Egy másik, a ROS semlegesítésére kialakult út a víz-víz ciklus, melynek során a fotoszintetikus elektrontranszportláncon és a PSI-en keresztül érkező elektronok egy része molekuláris oxigénre kerülhet szuperoxid aniongyököt képezve, melyet a SOD alakít át H2O2dá. A H2O2-t az APX alakítja vízzé monodehidro-AA képződése mellett. Az így keletkezett monodehidro-AA a PSI ferredoxinja (Miyake és Asada 1994) vagy a NADPH és MDHAR által katalizált reakció (Sano és mtsai. 2005) segítségével redukálódik vissza AA-tá (Asada 1999, Asada 2006).
9
2.3.2. Antioxidáns enzimek A ROS semlegesítés antioxidáns enzimek által katalizált reakciók segítségével is történhet. A ROS semlegesítő enzimek kofaktorainak jelenléte gyakran más enzimek közreműködését igényli, melyek valamilyen lépcsős vagy körfolyamat révén alakulnak a megfelelő formába. A növényekben a legfontosabb antioxidáns enzimek a következők a szuperoxid-dizmutázok (SOD), a katalázok (CAT), az aszkorbát-peroxidázok (APX) és a glutation-reduktáz (GR). A SOD (EC 1.15.1.1.) az oxidatív károsodás elleni védelem első vonalát alkotó fémtartalmú enzim, melyek a szuperoxid gyököket alakítják át H2O2-dá a következő reakció alapján: 2 O2˙¯ + 2 H+ → O2 + H2O2 Minden aerob szervezetben megtalálhatók, növényekben a fém kofaktor alapján háromféle SOD-ot különböztetünk meg. A Cu/Zn-SOD elsősorban a citoszolban, illetve a kloroplasztisz sztrómában és a peroxiszómában, a Mn-SOD a mitokondriumban és a peroxiszómában, a Fe-SOD egyes fajok kloroplasztiszaiban található meg (Bueno és mtsai. 1995). Anaerob baktériumokban vas-kén fehérjék (rubredoxin, neelaredoxin) redukálják a szuperoxid gyököket H2O2-dá (Abreués mtsai. 2001). A CAT-ok (EC 1.11.1.6.) a peroxiszómákban és a mitokondriumokban is előfordulnak. Szerepük a H2O2 közömbösítése. Bár a H2O2 nagyobb koncentrációban káros, kis koncentrációban szerepet játszhat a jelátviteli folyamatokban mind növényi, mind állati szervezetek esetében (Schreck és mtsai. 1991, Prasad és mtsai. 1994). A H2O2 koncentrációjától függően a CAT-nak kétféle működése van (Deisseroth és Dounce 1970). Alacsony H2O2 koncentráció (≤10-6 M) esetén az ún. peroxidációs működés jellemző, melynél különböző vegyületek (etanol, aszkorbát, stb.) tölthetik be a hidrogén-donor (RH2)szerepét. A H2O2 semlegesítése alábbi reakció szerint zajlik: RH2 + H2O2 → R + 2 H2O Magas H2O2 koncentráció esetén gyorsabb módon, az ún. katalatikus úton hatástalanít, ahol a H2O2 a donor, illetve egyben az akceptor is. 2 H2O2 → 2 H2O + O2 10
Az APX (EC 1.11.1.11.) vastartalmú protein, mely erősen specifikus az AA-ra, mint elektrondonorra (Miyake és Asada 1996), míg más peroxidáz enzimek, mint a guajakolperoxidázok (GPX, POD), többféle vegyületet is használhatnak elektrondonorként. Az APX a következő reakciót katalizálja: 2 AA + H2O2 → 2 DHA + 2 H2O Az enzimnek növényekben két izoenzimjét tudták kimutatni (Chen és Asada 1989, Nakano és Asada 1987, Tanaka és mtsai. 1991, Mittler és Zilinskas 1991). A citoszólon kívül a kloroplasztisz sztrómájában, illetve a tilakoid membránjában (Miyake és mtsai. 1993), a mikroszómákban
vagy
membránhoz
kötötten
helyezkednek
el,
de
kimutatták
a
mitokondriumok membránjához kötötten és a kloroplasztiszok tilakoidmembránjának lumenében is. A tilakoidkötött és sztrómális APX-et ugyanaz a gén kódolja. A két izoforma alternatív splicing eredménye (Yoshimura és mtsai. 2002). A kloroplasztikus APX labilisabb, mint a citoszólikus (Amako és mtsai. 1994). Az APX az aszkorbát-glutation ciklus résztvevője és kulcsszerepet játszik az oxidatív stressz elleni védelemben (Shigeoka és mtsai. 2002). Növényekben a GR (EC 1.6.4.2.) az aszkorbát-glutation ciklus másik fő enzime. Aktivitásának nagy része a kloroplasztiszokban mutatható ki (Bielawska és Joy 1986), de azonosították a mitokondriumban és a citoszólban is (Foyer és mtsai. 1991). Fontos szerepe van a DHA AA átalakulásban. Az enzim az alábbi egyenlet szerint végzi az oxidált glutation redukálását. GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+ A GR szinte kizárólag csak a mezofill sejtekben lokalizálódik (Doulis és mtsai. 1997). Stresszhatásra általában növekedés tapasztalható az enzim aktivitásában, melynek szerepe lehet a tolerancia kialakulásában (Foyer és mtsai. 1991, 1997b; Kocsy és mtsai. 2001). A redukált és oxidált glutation (GSH:GSSG) arányának finom szabályozásával részt vesz a sejt redox állapotának kialakításában (Foyer és mtsai.1991, Szalai és mtsai. 2009).
11
2.3.3. Fenolos vegyületek A fenolos vegyületek fontos szabályzó szereppel rendelkeznek a növekedés és a szaporodás területén, illetve a ragadozók és a patogének elleni védekezésben (Bravo 1998) az antioxidáns hatásuk alapján. Másodlagos anyagcseretermékek, melyek a pentóz-foszfát ciklus, a shikimát és a fenilpropanoid utak köztitermékeiből származnak (Randhir és mtsai. 2004). Szerkezetileg egy aromás gyűrű, illetve az ehhez tartozó hidroxil csoportokból állnak. A fenolos vegyületeknek az egy aromás gyűrűtől a több kondenzált gyűrűből álló molekuláig számos változata előfordul. Gyakran nevezik őket polifenoloknak is. Főbb
csoportjaik
a
flavonoidok,
a
tanninok,
a
hidroxibenzoesavak
és
a
hidroxifahéjsavak. A mintegy 8000 ismert polifenolos vegyületnek több, mint a felét a flavonoidok teszik ki. Az antioxidáns aktivitás a hidroxicsoportok elhelyezkedésétől és számától, illetve az aromás gyűrűk térbeli elrendeződésétől függ (Balasundram és mtsai. 2006). Egyes polifenolok a lipid alkoxil gyök semlegesítésével gátolják a lipidperoxidációt (Millic és mtsai. 1998). Patogénfertőzés után megemelkedik a polifenolok szintje (De Ascensao és Dubrey 2003, Mantern és mtsai. 1995). Egészséges növényi szövetekben a gombák ellen hatók is vannak (Lattanzio és mtsai. 2001). Csicseriborsóban (Cicer arietinum) kimutatták, hogy gombafertőzés hatására megemelkedett a polifenolok, illetve fitoalexinek szintje. Az egyes polifenolok más, gombaellenes vegyületek prekurzorai. A polifenolok általánosan gátolják az extracelluláris gomba-enzimek működését (Scalbert 1991, Chérif és mtsai. 2007). A polifenolok nehézfém stressz elleni védekezésben való szerepét szintén kimutatták (Michalak 2006). Gyógynövények vizsgálatakor azt találták, hogy számos faj kiemelkedően magas polifenoltartalommal rendelkezik. A magas polifenoltartalom erős korrelációt mutatott az össz antioxidáns kapacitással (Katalinic és mtsai. 2006). 2.3.4. Növényi hormonok 2.3.4.1. A szalicilsav (SA) hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe A
SA
(o-hidroxi-benzoesav)
legnagyobb
mennyiségben
hőtermelő
növények
virágzásakor, a biotikus stressztolerancia jelátviteli folyamatában, a hiperszenzitív reakció
12
(HR) kialakulásakor, illetve patogén fertőzés hatására mutatható ki (Raskin és mtsai. 1987, Raskin 1992). A SA jól ismert hatása, hogy a termogén növények esetében képes a növény hőmérsékletét megnövelni (Lamarck 1778, Meeuse és Raskin 1988). A hőtermelés elsősorban az illatanyagok könnyebb kibocsátását teszi lehetővé. A hőtermelés valószínűleg a cianidrezisztens, alternatív légzési lánc fokozódásából ered, továbbá a glikolízis és Szent-GyörgyiKrebs ciklus enzimeinek fokozott működése figyelhető meg (Ordentlich és mtsai. 1991). A cianid-rezisztens légzési útról kimutatták, hogy szerepe lehet hidegérzékeny növények toleranciájának kialakításában (van de Venter 1985). A SA növényekben képes a mitokondriumban működő alternatív oxidáz mennyiségét fokozni (Rhoads és McIntosh 1992), amely csökkenti a ROS kialakulásának lehetőségét (Purvis és Shewfelt 1993). Kukoricában kadmium és hidegstressz alatt a SA mennyisége össszefüggést mutatott a hidegtűrés mértékével (Szalai és mtsai. 2005). Külsőleg adagolt SA hatására dohányban (Malamy és mtsai. 1990; Yalpani és mtsai. 1991), valamint rizsben (Rakwal és mtsai. 2001) a patogenezissel kapcsolatba hozható (pathogenesis related, PR) fehérjék szintetizálódnak. Számos bizonyíték szól amellett, hogy SA szükséges a szisztemikus szerzett rezisztencia (SAR) kialakításához is. A fertőzés helyéről transzportálódó szignálmolekula a metil-SA (Me-SA). Lényeges a SA metil-transzferáz és a metil-szalicilsav-észteráz enzim aktivitásának megléte a fertőzőtt szövetekben (Park és mtsai. 2007). A növényekben normál körülmények között nem képződik Me-SA. A Me-SA-t szintetizáló
SA-karboxil-metil-transzferáz
aktivitása
fertőzés
hatására
drasztikusan
megemelkedik (Huang és mtsai. 2003). A
SA
abiotikus
stresszfolyamatokban
betöltött
szerepét
már
korábban
is
tanulmányozták. Többen vizsgálták a külsőleg adagolt (pl. táptalajba) SA hideg és fagytűrésben betöltött szerepét. Janda és mtsai. (1999) kimutatták, hogy tápoldathoz adagolt 0,5 mM SA növelte a fiatal kukorica növények hidegtűrését. A SA prekurzorai és származékai, úgymint a benzoesav, fahéjsav, acetil-SA, is hatékonynak bizonyultak a hideg elleni védelemben. A SA indukálta hideg elleni védelem fokozott GR és GPX aktivitással, illetve csökkent CAT aktivitással jár együtt (Janda és mtsai. 2000, Horváth és mtsai. 2002). Kang és Saltveit (2002) kukorica, rizs valamint az uborka esetében azt találták, hogy a tápoldathoz adagolt SA fokozta a hajtás hideggel szembeni ellenállóképességét, a gyökerekét azonban nem. GR és GPX aktivitás emelkedést itt is kimutatták. Hasonló eredményeket kaptak banánban 0,5 mM SA kezelés hatására. Kontroll hőmérsékleten SA kezelés H2O2 szint emelkedést okozott. A hidegkezelés megemelte a SOD, a CAT és a GPX aktivitását, ezáltal 13
csökkentve a H2O2 szintjét. A hatás a SA talajra locsolásával, a levekre illetve a termésre permetezésével is kimutatható volt (Kang és mtsai. 2003). Paradicsom 0,1 mM Me-SA kezelésével fokozódott a termés hidegtűrése, azonban magasabb koncentráció alkalmazásával már károsító hatású volt (Ding és mtsai. 2002). A külsőleg adott SA-nak tehát védőhatása van a hidegstressz ellen, amely általában egy szűk koncentráció tartományban érvényesül. A túl alacsony koncentrációnak nincs jelentős hatása, a magasabb pedig károsodást okozhat. Az optimális koncentráció fajonként, illetve stressztípusonként is különböző lehet. A külsőleg adagolt SA hatásairól számos tanulmány jelent meg, az endogén SA változásairól már jóval kevesebb adat áll rendelkezésünkre. Az SA akkumulációra képtelen NahG transzgenikus növények vizsgálata egy jó módszer az endogén SA hatásainak feltárására (Gaffney és mtsai.1993). Borsó növényekben, melyek magvait ültetés előtt SA oldatba áztatatták, megemelkedett endogén SA, peroxidáz, illetve oHCA szintet tapasztaltak. Az SA mennyiség emelkedése nagy valószínűséggel de novo szintézis eredménye (Szalai és mtsai. 2011). Paradicsomban sóstressz (NaCl) alatt vizsgálták a SA, az antioxidáns-, illetve a lipoxigenáz enzimek változását. A magasabb sókoncentrációhoz edződött sejtekben alacsonyabb SA szint emelkedést tapasztaltak, mint az edzetlenekben. A SOD és a lipidperoxidáz aktivitás alacsonyabb volt, ugyanakkor a GR és az APX aktivitása magasabbnak bizonyult az edzett sejtekben, mint az edzetlenekben. Sóstressz hatására az edzetlen sejtekben magasabb lett az APX és a lipid-peroxidáz, valamint ugyancsak magasabb volt a SOD aktivitás mind a só-edzetlen, mind az edzett sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy a sóstressz indukálta oxidatív stressz mérsékeltebb lehet abban az esetben, ha a sejtek egy előzetes edzésen esnek át. A tolerancia kialakulásában a SA-nak jelentős szerepe lehet (Molina és mtsai. 2002). Az adaptálódott sejtekben az alacsonyabb SA szint emelkedés magyarázata a SA meglehetősen eltérő dózis hatása lehet, amely faj- és stresszfüggést mutat. Kukoricában sóstressz hatására hasonló megfigyeléseket tettek (Szalai és Janda 2009). Arabidopsis-ban kimutatták, hogy 5 °C-on SA halmozódott fel. A növények csökkent növekedést mutattak, melyet valószínűleg a SA okozhatott, mivel a NahG növényeknél ez nem volt megfigyelhető (Scott és mtsai. 2004). A legtöbb antioxidáns enzimről kimutatták, hogy a SA befolyásolja az aktivitásukat. A SA in vivo fokozza a GPX és a GR működését, amely a hidrogén-peroxid felhalmozódás ellen hat (Dat és mtsai. 1998, Janda és mtsai. 1999). Tartós SA-kezelés hatására Arabidopsisban csökkent a CAT és az APX aktivitása megnövelve ezáltal a hidrogén-peroxid szintet, amely a hiperszenzitív reakcióhoz hasonló sejtelhaláshoz vezetett (Rao és mtsai. 1997). A SA-ról az is 14
bebizonyosodott, hogy képes a dohányból (Chen és mtsai. 1993b, Conrath és mtsai. 1995), illetve Arabidopsis-ból, paradicsomból vagy uborkából (Sánchez-Casas és Klessig 1994) izolált CAT enzimhez kötődni és annak működését meggátolni. A SA CAT gátló hatásáról feltételezik, hogy magyarázhatja a megnövekedett H2O2 szintet, és így szerepet játszik a SAR kialakulásában (Chen és mtsai. 1993a). Habár CAT gátlás jelentősége még mindig kétséges a rezisztencia kialakulásában, mivel a SA CAT kötése nem specifikus, más vastartalmú fehérjéhez is kötődik (Rüffer és mtsai. 1995), másrészt különbséget találtak a CAT izoenzimek SA iránti érzékenysége között is. A kukorica CAT1 izoenzimének aktivitásában 2 mM SA jelentős mértékű nem-kompetitív gátlást eredményezett, míg a CAT2 esetében a gátlás kompetitív volt és gyenge. A különböző CAT izoenzimek szövetenkénti eltérései különbséget eredményezhetnek a SA adott szövetben kifejtett hatásában (Horváth és mtsai. 2002). A CAT gátlás mechanizmusát illetően feltételezik, hogy a SA mint elektrondonor a CAT-t a peroxidatív útra tereli. Alacsonyabb H2O2 szint mellett ez gátlásként jelentkezik, míg káros szintű H2O2 ellen védi az enzimet (Durner és Klessig 1996). A CAT gátlás során a SA szabadgyökké alakul, amely lipidperoxidációt okozhat. Mind a CAT gátlás nyomán megemelkedett H2O2 szintről, mind a gátlás során keletkező lipidperoxidokról feltételezik, hogy részt vesznek a SA-függő rezisztencia jelátviteli folyamatában (Anderson és mtsai. 1998). Vagyis a SA hatásnak a H2O2 csak részben közvetítője. A H2O2 mellett szerepet játszhat a CAT gátlásakor keletkező SA-szabadgyök és az általa okozott lipidperoxidáció is (Klessig és mtsai. 2000). Nemcsak a SA hatására nő meg a reaktív oxigénformák mennyisége a sejtben, hanem bizonyítékok szólnak amellett is, hogy a ROS SA-felhalmozódást és ezáltal apoptózist okoz (León és mtsai. 1995, van Camp és mtsai. 1998, Enyedi 1999, Overmyer és mtsai. 2003). 2.3.4.2. Az etilén hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe Az alacsony hőmérséklet növények esetén etiléntermelést indukál. A bioszintézis fő útja a metioninból indul, amely az S-adenozil-metioninon (SAM), illetve az 1-aminociklopropán1-karboxilsavon (ACC) keresztül átalakul etilénné (Bradford 2008) (3. ábra). A stressz-indukált etilénszintézist számos növényfajban vizsgálták (Wang 1989, Field 1990). Az alacsony hőmérséklet hatására bekövetkező etiléntermelődés időbeli eloszlása fajonként különböző lehet. Körtében az ACC felhalmozódás és az etiléntermelődés már alacsony hőmérsékleten megtörténik. Más fajoknál (pl. uborka) csak az alacsony hőmérséklet utáni felmelegedés során megy végbe (Wang és Adams 1982, Wang és mtsai 1985). 15
A hideghez való alkalmazkodásban a különböző növényekben az etilénnek más-más hatása lehet. A dinnye a hideghatást megelőző etilénnel való kezelése jelentősen csökkentette a hidegkárosodási tünetek kifejlődését (Lipton és Aharoni 1979), ugyanakkor a citrom vagy az avokádó esetén fokozódtak a hideg okozta károsodások (Lee és Young 1984, McDonald 1986). Mindezek arra engednek következtetni, hogy az alacsony hőmérséklethez való alkalmazkodásban az etilén szerepe fajonként eltérő lehet.
3. ábra Az etilén bioszintézis SAM – ACC útja (Yang-ciklus) (Bradford 2008 után). További kérdés, hogy az alacsony hőmérséklet hatására termelődő etilén csak kísérő jelensége-e a stresszfolyamatnak, vagy közvetlen szerepet játszik a stresszhez való alkalmazkodásban. Két különböző hideg-érzékenységű kukoricát 5°C-on 65%-os relatív páratartalom mellett összehasonlítva azt találták, hogy a hideg-toleráns genotípusban az akklimatizáció során ez az ACC akkumuláció megszűnt, míg az érzékenyben nem. 100 %-os 16
relatív páratartalom mellett nem következett be ACC felhalmozódás, ami arra utal, hogy a levelek vízhiánya okozhatta az ACC felhalmozódást. Az ACC felhalmozódásnak alacsony hőmérsékleten több oka is lehet. Egyrészt az alacsony hőmérséklet hatására az ACC-szintáz aktivitása megemelkedhet (Janowiak és Dörffling 1995), másrészt gátlódhat az ACC-oxidáz enzim aktivitása, mely az ACC-etilén konverzióért felelős, az alacsony hőmérséklet okozta membránkárosodás miatt (Etani és Yoshida 1987). 2.3.5. A poliaminok hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe A poliaminok (PA) az élő szervezetek fontos alkotóelemei, melyek a hormonokhoz hasonlóan regulátor szerepet töltenek be a növényekben. A PA számos növekedés- és fejlődésélettani folyamathoz szükségesek, mint például a sejtosztódás, az embriogenezis vagy a virágzás (Koetje és mtsai. 1993). Mennyiségük abiotikus stresszfolyamatok során általában megnő (Evans és Malmberg 1989, Shen és mtsai. 2000, Kasukabe és mtsai. 2004). Polikationos
jellegükből
adódóan
erősen
tudnak
kötődni
negatív
töltésű
makromolekulákhoz. A PA-k csökkentik a hideg károsító hatását egyrészt azzal, hogy gátolják a lipid-peroxidációt (Tachibana 2000), másrészt a membránokhoz kötődve stabilizálják a foszfolipid-kettősréteget, valamint a tilakoidok molekuláris komplexeit (Bouchereau és mtsai. 1999). A legfontosabb PA-k a putreszcin (Put), a spemidin (Spd), illetve a spermin (Spn). Számos stresszhatásnál kimutatták, hogy megnő a Put szint. Azt is megfigyelték, hogy egyes hidegérzékeny gyümölcsök esetében a Put akkumuláció és az alacsony hőmérséklet okozta károsodások között egyenes arányosság van. Hasonló összefüggést Spd és Spn esetében nem tudtak kimutatni (McDonald és Kushad 1986). Kukoricában hideghatásra szervenkénti eltérést mutattak ki. A gyökérben a Spd, a mezokotilban a Put és a Spd, a koleoptilban a Spd és a Spn mennyisége növekedett meg (Gao és mtsai. 2009). Put-hiányos Arabidopsis mutánsokban csökkent hidegtűrést tapasztaltak, amely külsőleg adagolt Put-nel vagy ABAval helyreállíthatónak bizonyult. Azoknál a mutánsoknál, melyek nem tudtak ABA-t szintetizálni, a külsőleg adagolt Put önmagában nem védett a hideg ellen, csak az ABA jelenlétében. Ez arra utal, hogy a Put az ABA szintéziséhez szükséges egyik jelátvivő molekula lehet (Cuevas és mtsai. 2008).
17
2.3.6. Ozmotikus védővegyületek Számos stresszhatás eredményezhet alacsony vízpotenciált a sejtekben. Ennek kivédésére, a sejtszervecskék, illetve a fehérjék integritásának biztosítására a víz helyett ozmotikus hatású vegyületek keletkeznek. Az ozmotikumok szerepe szerteágazó. Egyrészről antioxidáns szereppel rendelkeznek (poliolok, taurin, hipotaurin), redox egyensúly fenntartásában játszanak szerepet (glicerol), valamint a szulfidok detoxifikációjában működnek közre (ilyen a hipotaurin). Másrészről fontos szerepük van a makromolekulák szerkezetének stabilizációjában. A trimetilamin N-oxid képes a fehérjék térszerkezet felvételének és ligandkötésének elősegítésére. A trehalóznak és a prolinnak fontos szerepe van a membránok stabilizációjában fagypont alatti alacsony hőmérsékleten. A trehalóz magas hőmérsékleten a fehérjék denaturációja ellen is hat (Hare és mtsai. 1998, Yancey 2005). A prolin egy összetett hatású vegyület, melynek fontos szerepe van többek között a hideg káros hatásainak mentesítésében. Többszörös szerepe van az ozmotikus egyensúly fenntartásában, de energiaforrásként és ROS mentesítőként is működik. Konstantinova és mtsai. (2002) fagytoleráns dohány vonalakban túltermeltették a prolinszintézis egyik kulcsenzimét, a ∆1-pirrolin-5-karboxilát-szintetázt, melynek segítségével vizsgálták a prolin direkt hatásait. 2.4. A fény biológiai szempontból fontos tulajdonságai A fény az egyik legfontosabb abiotikus környezeti tényező a növények mint fotoautotróf élőlények számára. A besugárzás mértéke, a fényintenzitás, az ún. Photosynthetical Photon Flux Density (PPFD) fontos paraméter. Egysége a µmól kvantum/m2/sec. A fotoszintézis számára fontos hullámhossztartomány (PAR) 400-700 nm-ig terjed. A fényintenzitásnak jelentős hatása van a növényekre, amely taxon- és hőmérsékletfüggést mutat. A fény spektrális összetétele ugyancsak jelentős tényező. Ennek fontossága elsősorban a fotomorfogenetikus (csírázás, árnyékelkerülés) folyamatokban nyilvánul meg. A R/FR (vörös/távoli vörös fény, R/FR= 660-670 nm fény / 725-735 nm fény) aránya fontos jelzés a fényérzékelésben résztvevő receptorok számára. Szürkületkor az R/FR lecsökken, különösen az északi szélességeken, amely a boreális fajok számára jelzés a rügybontás és a virágzás időzítésére. Az R/FR arány egyik legszembetűnőbb eltolódása a természetes vegetáció struktúráltságából, vertikális szintezettségéből adódik. A levélben ennek megfelelően 18
eltolódik a pigmentösszetétel (klorofillok (vörös elnyelő) és a karotinoidok (kék elnyelő) aránya). Az alacsony R/FR egy korai jelzés a növény számára a szomszédos vegetáció árnyékoló hatásáról, amely létfontosságú a megfelelő adaptációs válasz kialakulásában. A növény képes elkülöníteni a pillanatnyi (pl.: felhőzet) és a vegetáció okozta folyamatos árnyékot (Franklin 2008). A virágzás idejének meghatározása több környezeti tényező együttes hatásának eredménye, melyek a merisztéma identitás génekre hatnak a virágzás elősegítésére kedvező klimatikus
körülmények
között
és/vagy
kompetíciós
nyomásra.
A
fotoperiódus
szabályozásában a fény intenzitásának, spektrális eloszlásának, illetve a megvilágítás hosszának (nappalhossz) is fontos szerepe van. 2.4.1. A fényérzékelés és jelátvitel folyamata A növények a vörös és távoli vörös fényt a fitokrómok, míg a a kék fényt és az UV-A fényt a kriptokrómok és a fototropinok segítségével érzékelik. A fény elnyelődése a növényzet által a FR arányának növekedéséhez vezet, amit a fitokrómok érzékelnek. Arabidopsisban öt fitokróm ismert (phyt A, B, C, D, E). A vöröst abszorbáló inaktív Pr (red) formából fotokonverzióval keletkezik az aktív Pfr (far red) forma. A Pfr forma a távoli vörös fény hatására alakul vissza inaktív Pr formává. A Pr és a Pfr között dinamikus egyensúly áll fenn a legtöbb megvilágítás esetén. Megvilágítás hatására a fitokróm jelátvitelben fontos a fitokróm interacting faktorok (PIF) szerepe. Ezek transzkripciót szabályzó fehérjék, amelyekhez az inaktív Pfr fitokróm forma kapcsolódik. Ekkor a PIF, mint génexpressziós inhibítor lebomlik. A fitokrómok a fejlődés szabályozásában egy jelentős funkcionális megosztottságot mutatnak, amely hőmérsékletfüggő. Kísérletesen vizsgálták az egyes fitokrómoknak a csírázás elindításában való szerepét. A phyA magasabb, a phyE alacsonyabb, míg a phyB minden hőmérsékleten aktívnak bizonyult. A phyA csak hosszabb megvilágítás hatására mutatott aktivitást. 19°C-on mindhárom fitokróm közel azonos működést mutatott. Ez alapján feltételezhető, hogy létezik egy phyC és D, amelyek ezen a hőmérsékleten serkentik a csírázást, vagy ez az a hőmérséklet, amelyen nem szükséges a fitokrómok közreműködése (Franklin 2009). A PIF-ek a DELLA transzkripciós aktivátorok családjának, illetve a basic helix-loophelix (bHLH) szupercsalád tagjai. A PIF-ek közevetlenül kötődnek a fény által aktivált fitokrómokhoz. Sötétben a PIF-ek a fotomorfogenezisért felelős gének promoteréhez kötötten 19
helyezkednek el, represszálva azokat. Az aktív Pfr fitokróm forma egy ismeretlen mechanizmus révén foszforillálja PIF-eket, melyeket azután ubiquitin-ligáz ismeri fel. A PIF 1-, 3-, 4- és 5 tulajdonképpen fény hatására lebomlik (ubiquitinálódik, majd a 26S proteoszómában degradálódik). Ehhez szükséges a fitokrómokkal való közvetlen kölcsönhatás (foszforiláció). Az egyes PIF-ek biológiai funkciójának vizsgálatára monogenikus mutánsokat vizsgáltak. Az eredmények funkcionális átfedéseket mutattak. A PIF 1 sokféle folyamatban vesz részt: a fényindukálta csírázás késleltetése, a hipokotil megnyúlás gátlása, a hipokotil negatív gravitropizmusának növelése sötétben, klorofill akkumuláció gátlása fényben. A PIF1 valószínűleg a klorofillszintézis negatív regulátora. A pif1 mutánsok FR hatására az ellenkezőket mutatták. Alacsony fényintenzitáson nevelt pif1 mutánsok hajtásait fénynek kitéve fotooxidatív károsodást mutattak, etioláltak maradtak. Ennek az erőssége arányos volt az idővel. A PIF3 kontrollálja a fény hatására végbemenő morfológiai és biokémiai változásokat. A pif3 mutánsok nem reagáltak a vörös fényre, illetve egyes esetekben rövidebb hipokotil és nagyobb sziklevélméret volt megfigyelhető folyamatos vörös fény hatására, ami a PIF 3 negatív szabályozó szerepére utal a folyamatos R alatt. A PIF 1 pozitívan hat a klorofill bioszintézisre, illetve az antociánok akkumulációjára fényben (Castillon és mtsai. 2007). A PIF 4 negatív regulátora a phyB közvetítette hipokotil növekedésnek. Folyamatos vörös megvilágítás alatt a pif4/srl2 mutánsok hipokotilja rövidebb, sziklevelei hosszabbak voltak a vad típushoz képest (Huq és Quail 2002). A PIF 5-nek a PIF 4-hez hasonló szerepe van a phyB jelátvitelben. A pif 4 és 5 sem FR hatására sem sötétben nem mutatott fenotípusos változást (phyA jelátvitel). Ez is arra utal, hogy a PIF 4 és 5 fő szerepe a fotomorfogenetikus folyamatok negatív regulációja. A PIF 6 szerepe ezideig ismeretlen. Mindegyik PIF-nek hatása van a központi cirkadián óra komponensre, az APRR1 (Arabidopsis pseudo-response regulator) /TOC1 (timing of CAB expression)-re. Sőt, a cirkadián óra jelentős hatással van PIF 4 és 5 expressziójára. Kifejeződésük jelentős hatással van a ritmus-mintázatára, az éjjelnappalok váltakozásának érzékelésében és jelátvitelében (Castillon és mtsai. 2007). A PIF 7 általában alacsony mennyiségben van jelen. A phyB nem foszforillálja, ezáltal nem is degradálódik. A PIF 3-hoz hasonlóan a phyB közvetítette válasz negatív szabályozójaként a hajtás de-etiolációjában vesz részt folyamatos vörös megvilágítás alatt. A PIF 3-, 4- és 7 együttesen képes a phyB szintjét poszttranszkripciósan szabályozni (Leivar és mtsai. 2008). A PIF-ek a csírázás hormonális szignalizációjában is részt vesznek. A legismertebb kölcsönhatás a hormonképződés és a fotomorfogenetikus szignalizáció között a giberellinsav (GA) indukálta csírázás. Ebben bizonyított a PIF 1 részvétele. A PIF 1 represszálja a GA szintéziséért felelős géneket, valamint aktiválja a GA degradáló géneket. Emellett a GA 20
érzékenységet is szabályozza a GAI és az RGA gének (DELLA proteineket kódolnak) aktiválásával. Ezek génterméke a GA szignalizáció repressziójáért felelős. A PIF 1 az ABA szintézist is aktiválja, ami ugyancsak a dormancia irányába hat. Összefoglalóan a magban a phyB aktív formája a PIF 1 lebomlását okozza, melynek hatására a GA metabolizmus génjei aktiválódnak, emelkedik a GA szintje és szenzitivitása, az ABA szintje csökken. Ezek a változások együttesen aktiválják a csírázás megindulását (Castillon és mtsai. 2007). A kék fény érzékelésében a flavin-tartalmú kriptokróm növényi fotoreceptor család tagjai vesznek részt. Arabidopsisban három kriptokróm (cry 1, 2, 3) ismert. A kriptokrómok hasonlóak a DNS fotoliázokhoz. A cry 1 és 2 felelős a kék-fény mediálta hipokotil növekedés gátlásáért. Magas fényintenzitásnál a cry 1 működik, a cry 2 fotolabilis. Alacsony fényintenzitáson a cry 2 válik a meghatározóvá. A kék fény arányának kísérletes csökkentése sok fajnál gyökérmegnyúlást vagy levél hiponasztiát
okozott. Zöld fény esetén ezek a
változások nem következtek be (Franklin 2008). A harmadik receptortípusba tartoznak az ún. Zeitlupes fehérjék (ZTL). Ezek szerepe elsősorban a cirkadián óra működésének szabályozásában vesznek részt (Somers és mtsai. 2004, Somers 2005). A ZTL fehérjének kettős funkciója van. Egyrészről fénytől független módon szabályozza a cirkadián ritmusok periódushosszát és amplitúdóját, másfelől fontos szabályozó eleme a vörös fény által indukált jelátviteli folyamatoknak. Részt vesz a cirkadián óra fényérzékenységének beállításában, a hipokotilmegnyúlás regulációjában és a virágzás fotoperiódikus indukciójában. Mutánsok vizsgálatával megállapították, hogy a ZTL-eknek mind fényben, mind sötétben szerepük van a cirkadián ritmusok hosszának és amplitúdójának szabályozásában. A ztl mutánsok többsége csökkent érzékenységet mutat a vörös és a kék fénnyel szemben. Erős vörös fényben a ZTL-nek a hipokotil megnyúlásában van szerepe. A ZTL fehérje LOV/PAS (LOV: Light-Oxygen-Voltage/PAS: Per–Arnt–Sim) doménjében lévő mutációt hordozó egyedekben sem a hipokotil növekedése, sem a vörös/kék fény érzékelése nem volt alacsonyabb, mint a vad típusban. Ez azt valószínűsíti, hogy a LOV/PAS doménnek nincs szerepe a fényérzékelésben (Kevei 2006). 2.4.2. A fényintenzitás hatása alacsony hőmérsékleten A hidegstressz alatt a fényintenzitás szerepe kulcsfontosságú a fagytolerancia kialakulásában. A fagytolerancia kialakulásához elég néhány nap hideg, míg a vernalizációs folyamatok lezajlásához több hét is szükséges lehet.
21
Gabonafélékben megállapították, hogy a megfelelő fagytolerancia kialakulása nemcsak az akklimációs hőmérséklettől, hanem a megvilágítás erősségétől is függ (Gray és mtsai. 1997, Apostol és mtsai. 2006, Janda és mtsai. 2007, Szalai és mtsai. 2009). Gazdasági növények esetén a fejlődés kezdeti szakaszában nagy jelentősége van a megfelelő egyedsűrűségnek, amely fajtától függően eltérő. A megfelelő fény és hőmérsékleti viszonyoknak fontos szerepe van a termés minőségi paramétereinek kialakításában. Tavaszi búzafajták
esetén
különböző
időtartamú
hőmérsékleti
hatások
esetén
a
magok
nitrogéntartalma és az egyes aminosavak mennyisége között hőmérséklet-, illetve fotoperiódushossz függést mutattak ki (Kolderup 1975). 2.4.3. A fotoperiódus hatása és az alacsony hőmérséklet kapcsolata A fotoperiódus hossza szintén jelentős tényező a növekedés és a virágzás kezdetének időzítése szempontjából. A vegetatívból a generatív fázisba való átmenet több tényező együttes hatásának eredménye. A fény minősége (R/FR) a cirkadián óra receptorai számára jelzést biztosít, ezáltal összhangot teremt növekedésszabályozás és a fény/sötét ciklus között, megnövelve ezzel az egyed fitnesszét (Franklin 2009). Búzában és árpában végzett modellkísérletek szerint a nappal hossza, a fény intenzitása és a hőmérséklet mind fontos tényezők a fejlődés kezdetén. Az árpa érzékenyebbnek mutatkozott a nappal hosszával szemben, amely az őszi és a tavaszi fajták közötti magasabb érzékenységgel függ össze (Volk és Bugbee 1991). A búza a virágzásához alacsony hőmérsékleten (vernalizáció) hosszúnappalos (LD) megvilágítást igényel. Egyes vizsgálatok eredményei alapján úgy tűnik, hogy a búza eredetileg szélesebb fotoperiódus érzékenységgel rendelkezett, azonban a kultivációja során az erős szelekciós nyomás hatására a rövidnappalos (SD) megvilágítás melletti virágzással szemben a LD melletti került előtérbe (Cockram és mtsai. 2007). A virágzás idejének szabályozásában a fitokrómok, mint receptorok vesznek részt. A virágzás több gén (Floral Meristem Identity Genes) együttes működésének az eredménye. A génexpresszió aktivációja a fitokróm flowering time 1 (PFT1) és az FT florális integrátoron, valamint a CO transzkripciós aktivátoron keresztül megy végbe (Franklin 2009). Árpában a Ppd-H1, a VRN-H2 és a VRN-H3 gének együttes működése bizonyult a legfontosabbnak (Wang és mtsai. 2010). A Ppd géneknek fontos szerepe van a virágzás idejének szabályozásában búzában (Goncharov és Watanabe 2005), illetve árpában és rizsben is, ugyanakkor Arabidopsisban nem találtak funkcionális hasonlóságot (Dunford és mtsai. 2002). 22
A másik fontos csoportot a VRN gének alkotják. A fotoperiódusra érzékeny őszi búzafajtákban bebizonyították, hogy hathetes SD a VRN2 gén virágzásgátló termékének hatását lecsökkentette. A VRN1 merisztéma identitás gének a SD alatt nem, csak LD megvilágítás alatt aktiválódtak. Ennek magyarázata valószínűleg az, hogy egy másik VRN1 represszor is létezik. VRN1 természetes változatok vizsgálatával bebizonyították, hogy a VRN1 promoterében lévő CarG-box – amely ennek a másodlagos represszornak a kötőhelye – mutációja hozható összefüggésbe az előbbi jelenséggel. A CarG-box mutáns VRN1 változatok SD alatt más genotípusokkal összehasonlítva korábban kezdenek el virágozni (Dubcovsky és mtsai. 2006). Számos mérsékeltövi fűféléhez hasonlóan egyes Arabidopsis változatok is korábban virágoznak hosszabb idejű hideg hatására. Ez az adaptációs stratégia a tavaszi virágzást és termésképzést segíti elő szemben a késő nyár-őszivel (Colasanti és Coneva 2009, Sung és Amasino 2005). A késői virágzáshoz vernalizációs faktorok megléte szükséges. A két legfontosabb ezek közül az FLC (Flowering Locus C) és az FRI (FRIGIDA) gének. Az FLC hatása a virágzás késleltetése. A korai virágzás a VRN1 DNSkötő fehérjetermékének hatása, amely az FLC represszora (Levy és mtsai. 2002). Az FRI gének természetes változatossága nagyban befolyásolja az Arabidopsis életmenetét. Az évelő ökotípusokban az FRI az FLC expresszióját serkenti, amely a MADS box transzkripciós represszora. Káposztában két FRI allélt mutattak ki, melyek egyike az Arabidopsisban lévővel mutatott hasonlóságot (Irwin és mtsai. 2012). A korai virágzású Arabidopsis genotípusokban az FRI promoterében két deléció ismert: Col és Ler típusú. Ezek mindegyike korai virágáshoz vezet. Érdekes, hogy a késői virágzásúaknál is léteznek deléciók, azonban ezeknek nincs hatása a virágzási időre (Lízal és mtsai. 2005), mivel ezekben olyan FLC allélt találtak, melyek nem az FRI szabályozása alatt állnak (Sung és Amasino 2005). 2.4.4. Az árnyékkerülés (Shade Avoidance Syndrome, SAS) és a hőmérséklet kapcsolata A növények az árnyék elkerülésére meglehetősen hatékony megoldásokat fejlesztettek ki. Az árnyéktűrő növények vékony levelek fejlesztésével, magasabb klorofill tartalommal, valamint a lencse alakú epidermisz sejtjeik segítségével a fényt a mezofillum sejtek irányába fókuszálják.
23
A másik csoportba az árnyékot aktívan elkerülni igyekvő növények tartoznak. Ezek a fajok tartós árnyék hatására az ún. árnyékkerülési tünetegyüttest mutatják. Kétszikűek esetében a válasz a gyökér és szár elongációs növekedésének fokozódása, a levelek reorientációja (levél hiponasztia), illetve a csökkent klorofill tartalom. Ezek a folyamatok az apikális dominancia irányába vezetnek. Ha az alacsony R/FR hatás hosszabb ideig fennáll, akkor a növény korai virágzással és terméséréssel válaszol. Ez a korai vegetatív – generatív átmenet a biomassza csökkenésével jár, mert a növényben minden a reprodukcióért felelős szervek fejlődésének van alárendelve. Egyszikűnél a tartós alacsony R/FR megvilágítás szintén fokozott apikális dominanciát okoz, amely ugyancsak terméscsökkenéssel jár. Gazdasági növények esetén a megfelelő állománysűrűség kialakítása elengedhetetlen a növények optimális fejlődésének és terméshozatalának elérésére. Mint a legtöbb növény, az Arabidopsis thaliana is meglehetősen széles adaptív plaszticitással rendelkezik. Ez a fajta polimorfizmus a fényfelhasználás optimalizásáért kialakult folyamatok (Light Forage Strategy, LFS) terén is szembetűnő. Az LFS elsősorban az SAS-ban, mint a stresszre adandó morfológiai és fiziológiai tünetegyüttesben nyilvánul meg. A SAS polimorfizmusa hőmérsékletfüggést mutat. Kísérletes megfigyelések
szerint
20°C
feletti
hőmérsékleten
a
növények
fokozott
magasságnövekedéssel, megnyúlt levél-, illetve petiólumhosszal reagálnak az alacsony R/FR megvilágításra (SAS1). Ebben az esetben a növény a környező vegetáción vagy a lombkoronán való gyors áthatolásra törekszik. Alacsonyabb hőmérsékleten (16 °C) másfajta válasz alakult ki: a levélfelület és levélvastagság növelésével hatékonyabb lesz a fényfelfogás (SAS2) (Franklin 2008). Az Arabidopsis Landsberg erecta (Ler) és Cape Verde Island (Cvi) természetes változatok eltérő földrajzi elterjedésüknek megfelelően különböző hőmérsékleti és fényviszonyok mellett eltérően viselkednek (Koornneef és mtsai. 2004). A Ler 16°C-on alacsony R/FR hatására nem mutatja a SAS1 jellegeket (elsődlegesen a megnyúlt petiólumhosszt), csak 22°C-on. A Cvi mind 22°C és 16°C-on is megnyúlt petiólumhosszal válaszol az alacsony R/FR megvilágításra. A Cvi introgressziója a Ler genomban a Ler egyedekben a SAS1 komplementációját okozza, vagyis az eredetileg csak a Cvi-ban megfigyelhető jelleg a Ler-ben is megjelenik.
24
2.4.5. Fénystressz (fénygátlás) A növények életük során képesek a legkülönfélébb fényviszonyokhoz alkalmazkodni. A fényintenzitás évszakos, lassabb változásakor kevesebb kihívással kell szembenézniük, mint a hirtelen változásokra (nyilttá váló lombkoronaszint). Ha növényt több fény éri, mint amennyi a fotoszintézis működéséhez szükséges, vagy valamilyen szabályzó mechanizmus útján közömbösíteni tud, a fotoszintetizáló képesség lecsökken. A jelenséget fénygátlásnak (fotoinhibíciónak) nevezzük. Különböző egyéb stresszhatások, mint például a hidegstressz is, a fénygátlás mértékét felerősíthetik. A növények hatékony mechanizmusokat fejlesztettek ki a fénybegyűjtés, illetve a magas fény okozta károsodások elleni védelem és mentesítés terén. A túl magas fényintenzitás a fénybegyűjtő komplexek károsodása, illetve az elektrontranszport záródása miatt ROS képződéséhez vezet. Ezek közül a H2O2, a szuperoxid, a hidroxil gyökök és a szinglet oxigén a legfontosabbak (Niyogi 1999). Ezek a legtöbb sejtalkotó számára jelentős károsító tényezőnek számítanak (Foyer 1997a), beleértve a PSII és a PSI-t is. 2.4.6. A fény károsító hatása elleni védekező mechanizmusok A hideg és a magas fényintenzitás együttes hatására az oxidatív stressz okozta változások felerősödhetnek (Wingsle és mtsai. 1999), melyek kivédésére különféle mechanizmusok alakultak ki. Az erős megvilágítás hatásainak csökkentésére a nem-fotokémiai kioltás (NPQ) több útja is kialakult a növényekben, amely az elnyelt fényenergia többletet hővé alakítja. Az energia levezetés ezen mechanizmusa csökkenti a ROS képződést. Hendrickson és mtsai. (2005) megfigyelték, hogy inaktivált PSII reakciócentrumok is képesek energia átvételre a szomszédos, aktív reakciócentrumokról, amely szintén védelmet jelent a túl magas gerjesztési energia esetén (Lee és mtsai 2001, Chow és mtsai. 2005). Dunaliella salina nevű alga két – a fotoszintetikus pigmentek mennyiségében eltérő – törzsét hideg és magas fényintenzitás együttes alkalmazásával vizsgálták, melynek során csökkent klorofill és bétakarotin szintet tapasztaltak. Az aszkorbát- és glutationtartalom, illetve a szuperoxid-dizmutáz aktivitás magasabb értéket mutatott. Az aszkorbát-glutation ciklus enzimeinek aktivitása ugyanakkor nem változott meg jelentősebben (Haghjou és mtsai. 2009). Hidegedzett (12°C) és nem edzett burgonyafajtákban végeztek alacsony hőmérsékleti
25
(1°C) és magas fény 1000 mól/m2/sec) kezelést. Az edzett növények ellenállóbbnak bizonyultak (Steffen és Palta 1989). Az aszkorbátnak fontos szerepe van a magas fényintenzitás elleni védelemben. Arabidopsis vtc2 aszkorbát hiányos mutáns viselkedését vizsgálták magas fényintenzitás mellett. A növények képesek voltak a fejlődésre, de az elektrontranszport, a fotoszintetikus oxigénevolúció és a PSII kvantumhatásfokának mértéke alacsonyabb volt, mint a vad típusban. A glutationszint azonban magasabbnak bizonyult, amely valószínűleg az aszkorbát hiányát kompenzálja (Müller-Moulé és mtsai. 2004). Más vizsgálatokban a violaxantin deepoxidáz aktivitásának, és ezáltal az NPQ-nak a csökkenését is megfigyelték (Müller-Moulé és mtsai. 2002). A E vitamin a biológiai membránok egyik legfontosabb antioxidáns vegyülete. Arabidopsisban két E vitamin mutánst – vte1, amely egy tokoferol cikláz mutáns, illetve a vte2, amely fitil transzferáz mutáns – vizsgáltak erős megvilágítás és alacsony hőmérséklet együttes hatása alatt. A mutánsok kisárgultak, amely a membránok (fotokémiai) károsodására utalt. A kettős mutánsok (npqvte; az npq mutánsok a xantofill ciklus komponenseihez kötődnek) vizsgálatával arra következtettek, hogy az E vitaminnak a xantofill-ciklussal együtt kiemelkedő szerepe van PSII fénygátlásának, illetve a tilakoid membránok károsodásának megakadályozásában (Havauxa és mtsai. 2005). Magas fényintenzitás hatására megemelkedik az antociánok szintje. Az antociánok csökkentik a fotoinhibíció és a sárgulás hatását. Általában átmenetileg, a magas besugárzásnak kitett periférikus szövetekben akkumulálódnak. Az akkumuláció akkora besugárzás hatására történik, amely már fotooxidatív károsodást okoz (Steyn és mtsai. 2002). Kukoricában hideghatásra harmincszor magasabb antociánszintet is kimutattak, melynek fontos szerepe van a kloroplasztisz számára elérhető fénymennyiség szabályozásában (Pietrini és Massacci 1998). Hat Arabidopsis ökotípus összehasonlításával az aszkorbát és az antociánok mennyiségének növekedése és az erős megvilágítás között pozitív összefüggést mutattak ki. Aszkorbáthiányos mutánsokban (vtc1, vtc2, vtc3) kevesebb aszkorbátot mértek, mint a vad genotípusban. A kaempferol-glikozid mennyiségét a fény és a mutánsok alacsony aszkorbát szintje kevésbé befolyásolta. A szinapoil-malát szintje viszont csökkent a magas fényintenzitás hatására. A flavonoid bioszintézisért felelős enzimek génjeinek fokozott működését tapasztalták a vad típusban, illetve a vtc1 és vtc2 esetében. Sem az ABA-nak, sem a JA-nak nem volt kimutatható hatása az antociánok szintézisére (Page és mtsai. 2012).
26
Az antociánok akkumulációját és a szintézisükért felelős gének fokozott expresszóját az UV-A és UV-B sugárzás hatására is megfigyelték (Guo és mtsai. 2008). 2.5. A stresszfolyamatok vizsgálatának genetikai megközelítései 2.5.1. Allélpolimorfizmus Az allélváltozatosság vizsgálata fontos a minőségi és mennyiségi jellegek genetikai hátterének megismerése céljából. Léteznek homológ gének eltérő funkcióval, illetve eltérő eredetű gének azonos funkcióval az egyes fajok között. A polimorfizmusok leginkább a transzkripciós szabályzó fehérjéket érintik, illetve a kódoló a régiókat (melyek a képződő fehérjére vannak hatással). Kisebb részük pedig a génexpresszió szabályozásában résztvevő régiókra van hatással (Alonso-Blanco és mtsai. 2005b). Az allélpolimorfizmus vizsgálatával a számos olyan védekezési út komponensei is feltárhatók, melyek fontos szerepet töltenek be a hideg és a fény közvetítette jelátviteli folyamatokban. Adott stresszválasz gyakran összetett szabályozással rendelkező, többgénes, mennyiségi jelleg (QTL). Egy adott jellegért felelős gének, illetve ezek változatossága QTL térképezéssel jól vizsgálható. 2.5.2. Szegregációs populációk és a QTL térképezésben való szerepük Az Arabidopsis egy meglehetősen széles areával rendelkezik (4. ábra). Többféle genotípusa létezik, melyeket genetikai eltéréseik eredete alapján osztanak fel. A természetes változatok (másnéven: ökotípus, vad genotípus, háttér vonal, accession) a faj eltérő geográfiai régiókból származó változatai. A természetes változatok eltérő genetikai háttérrel, allélkészlettel, ezáltal eltérő morfológiai élettani jellegekkel, virágzási idővel, patogén rezisztenciával, és más életmenet stratégiákkal illetve stressztűrési képességgel rendelkeznek. Ide tartoznak a Columbia (Col), a Landsberg erecta (Ler) és a Wassilewskija (Ws). Az Arabidopsis genetikai változatossága egy alapvető és fontos eszköz a természetes változatosság, az allélpolimorfizmus, a géntérképezés és a genomvizsgálatok számára (Weigel 2012).
27
Adott jelleg genetikai vizsgálatához már jó ideje alkalmazzák a különböző heterozigóta introgressziós vonalakat. Létrehozásukhoz homozigóta szülők hibridjeit keresztezik vissza a recipiens homozigóta szülői genotípussal (Koornneef és mtsai. 2004). A mendeli domináns öröklésmenetből származó heterozigóta vonalak további keresztezéseivel az F8 generációban a rekombináció állandósul. A közel azonos genetikai állományú vonalak (Near Isogenic Lines: NIL, IL: Introgressed Lines, illetve a RIL: Recombinant Inbred Lines) széleskörűen használatosak a genetikai térképezésben. A térképezés pontossága azonban eltérő lehet. A RIL-ok már régóta használatosak genetikai térképezésre. Burr és mtsai. (1988) a kukorica genom térképezésére használtak RIL-kat. Arabidopis Ler/Col RIL-kat több jelleg térképezésére is használták (virágzási idő, mag dormancia, egyes patogénekre való ellenállóság), a Ler/Cvi RIL-ek azonban ugyanolyan hatékonynak bizonyultak a QTL térképezésre (Alonso-Blanco és mtsai. 1998). A Ler(Cvi) NIL vonalakban a homozigóta genetikai hátterű recipiens genotípusban (Ler) csak egy (vagy kis számú) Cvi introgressziós szakasz van. Hat különböző öröklődési hátterű fejlődésélettani jelleg térképezésének hatékonyságát hasonlították össze ezekben szegregációs populációkban. A NIL-ban jelentősen magasabbnak bizonyult a genetikai térképezés megbízhatósága (Keurentjes és mtsai. 2007).
4. ábra Az Arabidopsis thaliana mintegy 7000 természetes változatának elterjedése a világon. Az őshonos előfordulások sárgával, a behurcolás eredményei pirossal vannak jelölve. A térképen bemutatottakon kívül még Dél-Koreából és Afrikából is jeleztek előfordulásokat (Alonso-Blanco és Koornneef (2000) után).
28
2.5.3. A globális génexpressziós vizsgálatok szerepe stressz szignalizáció vizsgálatában Az 1990-es években transzkripciós profilok vizsgálata még kevésbé volt fejlett, így akkoriban még jóval kevesebb ismeret állt rendelkezésre a különböző metabolikus és stressz szignalizációs utakról (Hughes és Dunn 1996). Napjainkra a microarray technikák segítségével a legkülönfélébb kezelések okozta globális génexpressziós mintázat változások feltárása elérhetővé vált. Fajok, illetve a fajon belüli kategóriák, mint például a természetes változatok expressziós mintázatainak összehasonlítása lehetőséget ad számos, különféle jelleg polimorfizmusának vizsgálatára. Az Arabidopsis genom az emberénél egyébként is alkalmasabb a polimorfizmus vizsgálatra, mivel az SNP-k gyakorisága magasabb (Weigel 2012). Vizsgálták a genom metiláltságának fokát, melynek során kiderült, hogy a heterokromatin és az siRNS klaszterek metiláltsága magas, valamint a metiláció fontos szerepet tölt be a transzpozonok és az álgének lecsendesítése során (Lippman és mtsai. 2004). Az össz genom metiláltság vizsgálatával több száz, eltérő expresszióval rendelkező metilációfüggő gént, illetve nemkódoló intergenikus RNS szakaszt találtak (Zhang és mtsai. 2006). A microarray analízis a stresszválasz gének expresszió vizsgálatának jó eszköze mind Arabidopsisban, mind a haszonnövények esetén. A feltárt gének funkciója transzgenikus konstrukciók segítségével jól vizsgálható. A transzgenikus vonalak gyakran nagyobb ellenállóságot is mutatnak az adott stresszorral szemben. Shinozaki és Yamaguchi-Shinozak (2007) a szárazságstresszhez kötődő gének expressziós mintázatát, illetve funkciójának feltárását végezték el különböző fajokat összhasonlítva. A hideg és a különböző fényintenzitások hatására történő génexpressziós mintázat változásokat Arabidopsisban már többen is leírták (Fowler és Thomashow 2002, Lee és mtsai. 2005, Soitamo és mtsai. 2008). Atwell és mtsai. (2010) egy átfogó vizsgálatban 100 különböző morfológiai, élettani és molekuláris jelleget hasonlítottak össze 107 Arabidopsis természetes változat között. Egyes géneket „újra felfedeztek”, míg több más, korábbi jelölt gént sikerült pontosan azonosítani.
29
3. A kutatások céljai Munkánk során a megfelelő fagytűrés kialakulásához vezető hidegakklimáció és a fényintenzitás szerepének pontosabb megismerését tűztük ki célul. Vizsgálatainkat búzában, illetve Arabidopsis modellnövényekben végeztük. A vizsgálatokkal az alábbi kérdésekre kerestük a választ: 1. Hogyan a befolyásolja a fényerősség a búza génexpresszióját a hidegedzés alatt? Mely gének mutatnak szignifikáns aktivitásváltozást a hideg és a különböző megvilágítások hatására? 2. Mely védő vegyületek lehetnek felelősek a búza megfelelő fagytűrésének kialakításában? 3. Vannak-e fagytűrésbeli eltérések különböző aszkorbát- és szalicilsav-hiányos Arabidopsis genotípusokban? 4. Hogyan változott meg az Arabidopsis genotípusok fagy elleni védekezési stratégiája az egyes kezelési hőmérsékleteken? Mely élettani tényezők állhatnak az eltérő fagytolerancia hátterében? 5. Melyek a megfelelő fagytolerancia kialakulásáért felelős tényezők a hidegedzett Atnoa1 mutánsokban? 6. Mely gének felelősek az árnyékkerülési tünetegyüttes kialakításáért?
30
4. Anyagok és módszerek 4.1. A növénynevelés körülményei, növényi anyag 4.1.1. Búza Őszi (Triticum aestivum L. var. Mv Emese, magas fagytűrésű) és tavaszi (T. aestivum L. var. Nadro, alacsony fagytűrésű) búzanövényeket használtunk. A magokat talaj:homok=3:1 (v:v) keverékébe ültettük (Szalai és mtsai. 2009b). A növényeket Conviron PGR-15 növénynevelő kamrában (Controlled Environment Ltd, Winnipeg, Canada), 16/8 óra fény/sötét periódus mellett, 20/18 °C hőmérsékleten (nappal/éjjel), 75% relatív páratartalom mellett neveltük. A fényintenzitás a levelek magasságában PPFD=250 µmol m-2 s-1 volt (kontroll, normál fény, NL), melyet fémhalogén izzók biztosítottak (HgMI 400W/D1, Tungsram, Budapest, Magyarország). A 10. naptól (3 leveles állapot) a nevelést 5 °C-on folytattuk tovább. A hidegedzés alatt kétféle megvilágítást alkalmaztunk: a nevelési (kontroll) és egy alacsonyabb fényintenzitást (LL, PPFD=20 µmol m-2 s-1). 4.1.2. Arabidopsis mutánsok és transzgenikus vonalak A vizsgálatokhoz az Arabidopsis thaliana Col-0 ökotípusát, továbbá négy mutáns (vtc21, eds5, sid2, NOA1) és két transzgenikus (Nahg, GLO) vonalat használtunk. A Columbia (Col-0) az Arabidopsis thaliana egyik természetes változata, melyet a molekuláris genetikai kutatásokhoz gyakran használnak. A vtc mutánsok az Arabidopsis thaliana vtc aszkorbáthiányos (AA) mutánsai. A vtc2-1-ben a többihez képest jóval alacsonyabb az AA szintje (a Col-hoz viszonyítva a tized része), mivel kevésbé tudják a glükózt AA-tá alakítani (Conklin és mtsai. 2000, Conklin és mtsai. 2006). Az eds (enhanced disase susceptibility) mutánsok fokozott patogénérzékenységgel rendelkeznek. Az eds5 mutánsok patogénfertőzés után nagyon alacsony SA, illetve PR-1 (pathogenesis related) mRNS szinttel rendelkeznek, ami fokozott patogénérzékenységet okoz (Nawrath és mtsai. 2002). A sid2 mutánsokban a SA szintézis egyik útjának kulcsenzime, az izokorizmát-szintáz (ICS, EC 5.4.4.2.) szintézise károsodott (Wildermuth és mtsai 2001). Az Arabidopsis noa1 mutánsokat eredetileg nos1-ként (nos: Nitric Oxide Synthase, noa: Nitric Oxide Associated) írták le. Csökkent NO tartalommal rendelkeztek és a kettős mutánsok külsőleg adadolt NOdal regenerálódtak (Guo és mtsai. 2003). Később kiderítették, hogy az Atnoa1 mutáns nem 31
NOS deficiens, hanem egy cGTPáz mutációt hordoz. Utóbbi enzim a növény életéhez nem feltétlenül szükséges, azonban működésének hiánya törpenövést, sárgulást okoz (Moreau és mtsai. 2008). Az Arabidopsis GLOáz növények az L-gülono-1,4-lakton oxidáz (GLOáz, EC 1.1.3.8) transzgént tartalmazzák, melynek expressziója aszkorbát túltermelést okoz. Az enzim az aszkorbát bioszintézis utolsó lépésének enzime növényekben. A GLOáz gén Arabidopsis vtc mutánsokba transzformálva mutáció komplementációját okozza. A transzgenikus vad típusban azonban nem sikerült aszkorbátszint emelkedést kimutatni (Radzio és mtsai. 2003). A NahG transzgenikus változat egy szalicilsav (SA) degradáló enzim, a bakteriális eredetű szalicilát-hidroxiláz génjét hordozza. A szalicilát-hidroxiláz a SA-t katekollá alakítja. A SA szerepének vizsgálatához széleskörűen használják. A növényeket az MTA Agrártudományi Kutatóközpont, Mezőgazdasági Intézet fitotronjában neveltük Martonvásáron. A vizsgálatokhoz azonos korú növényeket használtunk, majd különböző hőmérsékleti- és fénykezeléseket alkalmaztunk. Az ültetést kereskedelmi forgalomban kapható semleges kémhatású virágföldön végeztük. Az elültetett magokat 4 napig 4 °C-on sötétben tartottuk sztratifikáció céljából, majd három hétig 23 °C-on, rövidnappalos megvilágítás (10/14 óra) mellett csíráztatószekrényben tartottuk a növényeket. A megvilágítás mértéke PPFD=50 µmol m-2 s-1 volt. A nevelés a 3. héttől Conviron PGV-36 típusú növénynevelő kamrában (Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Canada) történt 21/21°C-on, 65/75% relatív páratartalom és 14/10 órás fény-sötét periódus mellett. A megvilágítás mértéke PPFD=150 µmol m-2 s-1 volt. A hidegedzés a 8. héttől Conviron PGV-36 típusú növénynevelő kamrában (Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Canada) történt 4 °C-on 4 napig 65/75% relatív páratartalom és 14/10 órás fény-sötét periódus mellett. A megvilágítás mértéke PPFD=150 µmol m-2 s-1 volt. 4.1.3. A Ler (Cvi) NIL2-8 térképezési populáció Az Arabidopsis Landsberg erecta (Laer, Ler-0) a Col-0-hoz hasonló ökotípus, melyet főként élettani megfigyelésekhez használnak (Meyerowitz és Ma 1994). A Cape Verde Island (Cvi-0) az introgressziós vizsgálatok általánosan használt növénye. A Ler Észak-Európából, a Cvi a trópusi Cape Verde Island-ről származik. Eltérő fagytűréssel és árnyék-elkerülési stratégiával rendelkeznek (Alonso-Blanco és mtsai. 2005a).
32
Ler genetikai hátterű Cape Verde Island (Cvi) introgressziós NIL2-8 növényeket használtunk a QTL térképezési kísérletekhez (Keurentjes és mtsai. 2007). A SAS1 QTL genetikai térképezésére két generációt neveltünk és vizsgáltunk. A Lehle-táptalajra (I. táblázat) való ültetés előtt 7-8 percig 10 % (v/v)-os nátrium hipoklorit oldatban sterilizáltuk majd kétszer, sterilizált vízben mostuk a magokat a penészedés elkerülésére. A csíráztatás 4 napig 4 °C-on sötétben kezdődött, majd az 5. naptól 21 °C-on, hosszúnappalos megvilágításon (16/8 óra = N/É), 130 µmol m2 s-1 fényintenzitást alkalmazva, Microclima 1000 (Snijders Scientific BV, Tilburg, Belgium) növénynevelő kamrákban történt. A 9. naptól talajon (Levington F2+S Seed & Modular Compost + Sand (JFC Monro, Hayle, Egyesült Királyság) neveltük tovább a növényeket. Az F1 és F2 generációban a magokat az Aracon seed collector (Arasystem, Gent, Belgium) segítségével gyűjtöttük össze. I. táblázat Az Arabidopsis neveléshez használt Lehle-tápoldat összetétele. A táptalaj készítéséhez 100 ml tápoldathoz 0,75g PhytagelTM, BioReagent, Plant Cell Culture tested, Powder (Fluka/Sigma-Aldrich Aldrich Chemical Co., Dorset, Egyesült Királyság) agart használtunk. 1M
KNO3
KH2PO4 (pH: 5,8) 1 M MgSO4
1M
Ca(NO3)2
1M
Sequestrine
1,8%
H3BO3
70 mM
MnCl2
14 mM
CuSO4
0,5 mM
ZnSO4
10 mM
NaMoO4
0,2 mM
NaCl
10 mM
CoCl2
0,01 mM
33
4.2. QTL térképezés 4.2.1. DNS kivonás 96 well plate-en az F2 generációban Az F2 generáció 157 egyedéből vettünk mintát a SAS2 QTL genetikai térképezéséhez. Kontrollként 5 homozigóta Ler-Ler növényt haszáltunk. A 10 napos növényekből gyűjtöttünk mintát, a levelek mintegy tized részét levágva, DNáz mentes, steril körülmények között végig jégen tartva. A mintákhoz 450 µl DNS kivonó puffert (1M TrisHCl (pH 7,5), 4M NaCl (Fisher Scientific, Leichestershire, Egyesült Királyság), 0,5M EDTA (Fisher Scientific, Leichestershire, Egyesült Királyság), 10% SDS (Fisher Scientific, Leichestershire, Egyesült Királyság) adtunk, a csöveket (Qiagen Ltd., Crawley, Egyesült Királyság) a fedőkupakokkal (Qiagen Ltd., Crawley, Egyesült Királyság) alaposan lezártuk. A sejtfeltárás Mixer mill 8000 golyós homogenizátor (Glen Creston Ltd, Middlesex, Egyesült Királyság) segítségével történt 3 percig, 0,1 cm átmérőjű rozsdamentes acélgolyókat használva. Ezután 8 percig 20000 g-vel centrifugáltuk a mintákat. A felülúszóból 350-400 µl-t vittünk át 96 well plate-re, majd azonos mennyiségű hideg izopropanolt adtunk hozzájuk. Ezután szobahőmérsékleten 2-3 percig inkubáltunk, majd ismét 5 percig centrifugáltunk 20000 g-vel. A centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk. A csapadékot 70%-os etanollal mostuk. Ezután 37 °C-on szárítottuk a mintákat. A kinyert DNS-t 100 µl steril desztillált vízben visszaoldottuk és a vizsgálatokig -20 °C-on tároltuk. 4.2.2. DNS extrakció F3 generációban Az F3 genotipizálásához a tíz, random módon kiválasztott négyleveles állapotú növényből vettünk mintát. A levéldarabokat Eppendorf csővekbe gyűjtöttük és folyékony nitrogén jelenlétében DNS homogenizáló pálcikákkal homogenizáltunk. Ezután 600 µl DNS kivonó puffert adtunk a mintákhoz, 5 másodpercig vortexeltük, majd 5 percig 20000 g-vel centrifugáltunk. A felülúszóból mintegy 500 µl-t vittünk át egy másik Eppendorf csőbe, amelyhez 500 µl hideg izopropanolt adtunk (1:1). Az elegyet szobahőmérsékleten 2-3 percig inkubáltuk. Utána 5 percig 20000 g-vel centrifugáltunk, mely után a felülúszót eltávolítottuk. A csapadékot 70%-os etanollal mostuk, majd a mintákat 37 °C-ra tettük száradni. A kinyert DNS-t 100 µl steril desztillált vízben visszaoldottuk és a vizsgálatokig -20 °C-on tároltuk.
34
4.2.3. Genotipizálás A QTL térképezése három molekuláris marker segítségével történt. A 2. kromoszóma 12,65 és 11,61 Mb-os régiójában két allélspecifikus In/Del marker, míg a 11,16 régióját egy SNP marker segítségével genotipizáltuk a Ler(Cvi) NIL2-8 egyedeit (II. táblázat). Ezek a markerek lefedik a Cvi introgressziót a 2. kromoszómán. II. táblázat A SAS2 QTL térképezésére használt markerek és a primerszekvenciák a 2. kromoszómán. Az adatok a www.arabidopsis.org weboldalról származnak. Pozíció
11166049
Marker
SNP
Leírás
MSPI
Primer Reverse
Forward
5’-GTCATAGCGGAAGAAGACATGG-3’
5’-CCTGTTCAACCAAACTGATATTGC-
hasít a
3’
Ler-ben 11614873
In/Del
Deléció a
5’-
Cvi-ban
ATCCTGATATTGAGTTCTGGTTAATG-
5’-CTTGACCTCCGAGATTTCTTTC-3’
3’ 12658546
In/Del
Deléció a
5’-TCCTTCCTCAATGATTTCTGG-3’
5’-CCAGATCTTTGACCGCTTCT-3’
Cvi-ban
A DNS amplifikációja során a PCR reakció összetétele a következő volt: 5 µl RedTaqTM PCR Ready Mix (Fluka/Sigma-Aldrich Aldrich Chemical Co., Dorset, UK), 0,5 µl Rev és Fwd primerek, 3 µl of DNáz-mentes víz és 1 µl DNS minta. A PCR program a következő volt (III. táblázat). III. táblázat A genotipizáláshoz használt PCR program. Ciklusszám
T (°C)
Idő (perc)
1x
95 °C
03:30
35x
95 °C
00:30
55 °C
00:30
72 °C
00:30
1x
72 °C
10:00
1x
4 °C
Az SNP (11,16 Mb) marker vizsgálatához MSPI restrikciós endonukleázt (EC 3.1.21.4.) használtunk. A restrikciós reakció a következő összetételű volt: 13,8 µl DNáz mentes víz, 2 µl NE puffer4 10x koncentrációban (New England Biolab Inc., Ipswich, USA), 0,2 µl MSPI
35
(New England Biolab Inc., Ipswich, USA) valamint 4µl DNS minta. Az emésztés 37°C-on 2 óráig történt. A PCR termékeket 1%-os agaróz gélen futtatuk 100V vivőfeszültség alkalmazásával. A gélek 0,5X TAE (Tris-borát-EDTA) (Fisher Scientific UK, Leichestershire, UK) pufferben készültek. 50 ml gélhez 1,5 µl etidium-bromidot adtunk. 2 µl 1 kb Hyperladder I.-et (New England Biolab Inc., Ipswich, USA) és 4 µl amplifikált DNS-t vittünk fele a gélre. A restrikciós emésztés termékeit 1,5 %-os agaróz gélen futtattuk 100V mellett. A restrikciós reakció 20 µl-ét vittük fel a gélre. A mintákat DNS blue loading dye-jal festettük. 4.2.4. Fenotípus-vizsgálat Az F3 generációt a 4.1.3.-ben leírtakhoz hasonló körülmények között neveltük. A 3. héttől Microclima 1000 (Snijders Scientific BV, Tilburg, Belgium) növénynevelő kamrában 16 °C-os hőmérséklet mellett folyamatos, 100 µmol m2 s-1 fényintenzitású és alacsony R/FR (Red/Far red – vörös/távoli vörös) arányra beállított megvilágítást alkalmaztunk. A növényeken a fotomorfogenetikai változásokat vizuális megfigyeléseink alapján értékeltük. 4.3. Microarray vizsgálat 4.3.1. RNS izolálás és microarray vizsgálat A vizsgálathoz hidegperiódus közepén (a 6. napon), kezelésenként öt növényből két mintát vettünk, melyeket négy ismétlésben mértünk. Az RNS izolálás TRIzol reagenssel (Invitrogen Co., Carlsbad, USA) történt, melyet DNázI kezelés követett, mely után MinElute Kit-tel (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) mostuk az elegyeket. A minták RNS azonosító számát (RIN) az Agilent BioAnalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) segítségével határoztuk meg. A mintánkénti négy ismétlésből származó egyenlő mennyiségű RNS-t használtuk fel cRNS írásra. Az RNS amplifikációja és jelölése a gyártó utasításai (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) alapján lett végrehajtva. A két biológiai minta Cy3 és Cy5 festékkel jelölt cRNS-ét Agilent 4X44K Wheat Chip-re hibridizáltattuk. Ez a chip 43603 egyedi oligonukleotidot tartalmazott a pozitív és a negatív kontroll mellett. Az Mv Emese és Nadro cRNS mintái között következő összehasonlításokat végeztük el Mv Emese-normál
36
fényintenzitás (NL) vs. Mv Emese-alacsony fényintenzitás (LL), Nadro-NL vs. Nadro-LL, Mv Emese-NL vs. Nadro-NL and Mv Emese-LL vs. Nadro-LL. Az Agilent 4X44K chip szkennelése Agilent High-Resolution Microarray Scanner-rel (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) történt. A beállítások Agilent Feature Extraction Software-nek (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) megfelelők voltak. 4.3.2. Microarray adatfeldolgozás Az intenzitás adatokat az R 2.10.0-ba (R Development Core Team, 2008) importáltuk. Az adatok további feldolgozása a BIOCONDUCTOR (Gentleman és mtsai. 2004) LIMMA programcsomagjának (Smyth 2005) segítségével végeztük. A háttérzaj kivétele normexp módszerrel (Ritchie és mtsai. 2007), adott array-hez tartozó adatok normalizációja loess módszerrel (Yang és mtsai. 2002), míg az array-ek közötti normalizáció kvantilis módszerrel (Smyth és mtsai. 2003) történt. A microarray adatok elsődleges analízise a LIMMA lmFit és eBayes funkcióinak lineáris modellje szerint történt (Smyth 2004). A p-értékek Benjamini és Hochberg (1995) tesztelési módszeréhez lettek igazítva. Ezzel tartottuk a hibás pozitívok előfordulási arányát a megfelelő szint alatt. Azokat a géneket tekintettük szignifikáns aktivitásváltozást mutatónak, melyeknek fold change (FC) értéke ≥2 és a korrigált p értéke >0,5. A vizsgálat microarray adatai elérhetők a GEO adatbázisban
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/linking.html;
accession
number:
GSE29640). 4.3.3. A szekvenciák reannotációja A szignifikáns aktivitásváltozást mutató gének annotációja során az eredeti Agilent 44K chip-hez tartozó annotációs adatokat azok hiányossága miatt az UniProt plant protein collection és a Gramene rice genome annotation adataival egészítettük ki. Az arrayhez tartozó oligonukleotidok szekvenciáit az NCBI Nucleotide Archive Core és EST (Expressed Sequence Tag) szekcióiból, a TIGR Plant Transcript Assembly-ról és a DFCI Gene Indices collection-ból töltöttük le, melyek azonban nem tartalmazták az annotációs adatokat. A homológ szekvenciákat az UniProt Knowledgebase növényi részének aktuális verziójában (2011-02-02) és a Gramene rice genome assembly MSU6 verziójában kerestük.
37
Az adatbázisokban hiányos paraméterekkel nukleotid BLAST keresést hajtottunk végre (Altschul és mtsai. 1990), melyben az alacsony komplementaritású régiókra szűrést alkalmaztunk. A BLAST lefuttatása után az eredményeket tovább szűkítettük aszerint, hogy az e-értékük ≤ 1e-30 , illetve hogy az összehasonlított szekvenciák egyezése legalább 50%-os. Azoknak az oligóknak adtuk meg a leírásait és GeneOntology (GO) kiterjesztéseit, melyeknek a homológjai megtalálhatók voltak az UniProt, illetve a Gramene adatbázisban. 4.3.4. GO analízis A hideg-, illetve a fényhatásra szignifikáns expresszióváltozást mutató gének között bizonyos csoportok alul- vagy felülreprezentáltságát a GO (Gene Ontology) analízis elvégzésével vizsgáltuk. Az Agilent chip letölthető gyári annotációja csak oligonukleotid szekvenciákat tartalmaz, teljes szekvenciákat nem. Ezeket reannotációs adatokkal kiegészítve a géneket a következő GO kategóriákba soroltuk be: „biological process”, “cellular component”, “molecular function” volt. A vizsgálat szempontjából a leginformatívabbnak a ‘‘biological process’’ bizonyult. Az egyes GO kategóriák aktivációs és inhibíciós génlistákban való részvételi arányának megállapítására a GeneMerge szoftvert (Castillo-Davis és Hartl 2003) használtuk. 4.4. Fagyasztási tesztek 4.4.1. A fagyasztás körülményei A fagyasztási teszteket 1 napig sötétben -9, illetve -11°C-on az MTA Agrártudományi Kutatóközpont,
Mezőgazdasági
Intézet
fitotronjának
fagyasztókamráiban
végeztük
Martonvásáron. A program a Melléklet MI. és MII. táblázataiban látható. 4.4.2. Bonitálás A fagyasztás után a növényeket szobahőmérsékleten tartottuk. A túlélők számlálását és értékelését közvetlen a fagyasztás után-, 9-, 21- majd 33 nappal későbbi időpontokban végeztük el. Az adatokból túlélési százalékot számoltunk.
38
A fagy növényekre gyakorolt külső hatásainak osztályozására négy kategóriát (Bonitálási Osztály – BO) vezettünk be, melyekbe a következő szempontok alapján soroltuk be a növényeket: BO-0: szemmel láthatóan fonnyadt, sárga – fehér levelek, a növény kapcsolata a talajjal megszűnt, könnyen felemelhető, BO-1: A levélrózsák több, mint 50%-a károsodott, BO-2: A levélrózsák keveseb, mint 50%-a károsodott, BO-3. Gyakorlatilag ép levelű, szemmel láthatóan alig-alig vagy egyáltalán nem károsodott növény (5. ábra).
5. ábra A fagyasztási teszt utáni túlélési arányok, illetve a fagyasztás egyes mutánsokra gyakorolt hatásának leírására és osztályozására bevezetett bonitálási osztályok (BO). Az ábra minden osztályból bemutat egy-egy jellegzetes példát. A fehér nyil BO-0 baloldali képén a gyökér korai pusztulását mutatja. 4.4.3. Ionkiáramlás mérés Az Arabidopsis AtNOA1 növények leveléből 6 db 5 mm átmérőjű levélkorongot 1,5 ml szűrt vizet tartalmazó fiolába helyeztük és 1 órán át rázattuk. Ezután egy Automatic Seed Analyzer berendezéssel (ASA610, Agro Science Inc., Arm Arbor, USA) mértük az oldat vezetőképességét, majd a vizet visszapipettáztuk a fiolába a levélkorongokra és -80 °C-on fagyasztottuk egy éjszakán át, majd visszaolvasztva szobahőmérsékleten újra lemértük a konduktivitást (ez az adat jelenti a teljes membránkárosodáshoz tartozó ionkiáramlás
39
mértékét). A méréshez használt szűrt vizet desztillált vízből állítottuk elő Milli-Q 50 (Millipore, Billerica, USA) típusú berendezés segítségével. 4.5. Klorofilltartalom mérése
A relatív klorofilltartalom meghatározásához CL-01 klorofill mérő (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, England) berendezést használtunk. A mérések a harmadik teljesen kifejlett levélen történtek. 4.6. Klorofill-fluoreszcencia indukció mérése
Az Fv/Fm (ahol a Fm a maximális, az Fv pedig a változó fluoreszcenciát jelenti sötétadaptált állapotban) és a ∆F/Fm’ klorofill-fluoreszcencia indukciós paramétert (∆F/Fm’ = (Fm’–Fs)/ Fm’, ahol az Fm’ a maximális, míg az Fs a steady state klorofill-fluoreszcencia szintet jelenti fényadaptált állapotban) PAM-2000 (Walz, Effeltrich, Németország) fluorométerrel 21-, illetve az az edzési hőmérsékleten 4 °C-on a növénynevelő kamrában mértük. Az Fv/Fm mérését a levelek 30 perces sötétadaptációja előzte meg. A mérések a harmadik teljesen kifejlett levélen történtek. A nomenklatúra van Kooten és Snel (1990) munkáját követi. 4.7. Az aszkorbáttartalom meghatározása A méréshez 0,2 g friss növényi mintát folyékony nitrogénben eldörzsöltük, majd 1 ml 1,5 %-os metafoszforsavban homogenizáltuk. Ezután 10 percig 4°C-on, 10000 g-vel centrifugáltuk. A redukált aszkorbát forma mennyiségének meghatározására 380 µl felülúszóhoz 20 µl ultratiszta vizet, az össz aszkorbát tartalom méréséhez 20 µl 40 mg/ml koncentrációjú ditiotreitolt (DTT) oldatot adtunk. A mérést HPLC-vel (Waters 2690) végeztük izokratikus módon. Szolvensként 0,1%-os trifluor-ecetsavat (TFA) (pH: 2,7) használtunk. Az áramlási sebessége 1 ml/perc. Az elválasztás HyperPrep HS C18 4,6x250 mm oszlopon történt. Az aszkorbinsavat 248 nm-en detektáltuk diódasoros UV/VIS detektorral (Waters 996). Az oxidált forma mennyiségét az össz és a redukált forma mennyiségeinek különbsége adja. Az aszkorbát mennyiségét µg-ban, 1g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.
40
4.8. Antioxidáns enzimek aktivitás mérése
4.8.1. Enzimkivonás Az izolálás során 0,5 g növényi anyagot dörzsmozsárban, kvarchomok jelenlétében homogenizáltuk 2,5 ml jéghideg 0,5 mM TRIS pufferben (pH 7,4), mely 3 mM MgCl2-ot és 1 mM EDTÁ-t tartalmazott. A homogenátumot hűtött centrifugában 10 percig centrifugáltuk 10000 g-vel. A felülúszót Eppendorf csövekbe osztottuk szét. A glutation-reduktáz aktivitását a friss homogenátumból, az aszkorbát-peroxidáz, a kataláz és a gvajakol-peroxidáz aktivitását -20 °C-on tárolt felülúszóból mértük. Az enzimaktivitásokat fotometriásan határoztuk meg Shimadzu UV-VIS 160A (Kyoto, Japan) fotométert használva. Mérésig a mintákat jégen tartottuk, a méréseket szobahőmérsékleten végeztük. A monodehidro-aszkorbát-reduktáz izolálása során Krivosheeva és mtsai. (1996) módszerét alkalmaztuk, illetve ezt az általunk bevezetett módosítások alapján követtük. A 0,5 g növényi anyagot folyékony nitrogén jelenlétében dörzsmozsárban homogenizátuk. A homogenátumot annak felolvadásáig 5 percig hűtőben tároltuk. Ezután 1,75 ml extrakciós puffert adtunk a mintákhoz (2% PVP, 1 mM EDTA, 1 mM aszkorbát, 0,25% Triton-X 100, 50 mM KH2-foszfát puffer (pH 7,6)), majd az aszkorbát-peroxidáz aktivitásának megakadályozására 750 µl 50 mM KH2-foszfát puffer (pH:7,6)-ben készült telített ammónium-szulfát oldatot adtunk a mintákhoz. A homogenátumokat 4 °C-on 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk. A méréshez a felülúszót használtuk, melyet jégen tartottunk. A méréseket szobahőmérsékleten végeztük, Shimadzu UV-VIS 160A (Kyoto, Japan) fotométert használva. Az enzimaktivitásokat 1 g enzim fehérje által 1 perc alatt okozott abszorbancia változásban (nkat/g friss tömeg) adtuk meg. 4.8.2. A glutation-reduktáz (EC 1.6.4.2.) aktivitásának meghatározása
A
glutation-reduktáz
aktivitásának
meghatározásakor
a
5,5´-ditio-bis-(2-nitro-
benzoesav) (DTNB) redukcióját mértük 412 nm-en a Smith és mtsai (1988) által leírtak szerint. A reakcióelegy 1 ml össztérfogata 75 mM Na-foszfát puffert (pH 7,5), 0,15 mM dietiléntriamin-pentaecetsavat, 0,75 mM DTNB-t, 0,1 mM NADPH-t, 1 mM GSSG-t. A reakciót 50 µl minta hozzáadásával indítottuk. Az aktivitás számításához ε=14,15 /mM/cm értéket használtuk. 41
4.8.3. Az aszkorbát-peroxidáz (EC 1.11.1.11.) aktivitásának meghatározása
Az aszkorbát-peroxidáz aktivitását a következő összetételű reakcióelegyben mértük: 0,2 M TRIS puffer (pH 7,8), 5,625 mM aszkorbinsav és 0,042% H2O2. A reakcióelegy térfogata 2,25 ml volt, mely 50 µl mintát tartalmazott, és a reakciót H2O2 hozzáadásával indítottuk. Az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en követtük nyomon (Janda és mtsai. 1999). Az aktivitás számításához ε=2,8 /mM/cm értéket használtuk. 4.8.4. A mono-dehidroaszkorbát reduktáz (EC 1.6.5.4.) aktivitásának meghatározása A méréskor Krivosheeva és mtsai. (1996) módszerét, illetve ennek módosításait (Yin és mtsai 2003) követtük. A reakcióelegy összetétele a következő volt: 2100 µl KH2-foszfát puffer (pH 7,0), 300 µl 20 mM GSH oldat (50 mM KH2-foszfát puffer (pH 7,0)-ben feloldva), 300 µl 2 mM dehidroaszkorbát oldat ((KH2-foszfát puffer (pH 7,0)-ben feloldva, közvetlenül a mérés előtt frissen készítettük és végig jégen tároltuk). A vak elegyben az enzimextraktum helyett 100 µl 50 mM KH2-foszfát puffer (pH 7,0) volt. A reakciót 100 µl enzimkivonat hozzáadásával indítottuk, melynek során a dehidroaszkorbát aszkorbáttá történő átalakulását detektáltuk 265 nm-en. Az aktivitás számításához ε= 12,59 /mM/cm értéket használtuk. 4.8.5. A kataláz (EC 1.11.1.6.) aktivitásának meghatározása A kataláz aktivitását 240 nm-en mértük, a hidrogénperoxid fogyását nyomon követve. A reakcióelegy össztérfogata 3 ml volt, és 0,44 mM TRIS puffert (pH 7,4) 0,0375% H2O2-t és 50 µl növényi mintát tartalmazott (Janda és mtsai. 1999). A reakciót a H2O2 hozzáadásával indítottuk el. Az aktivitás számításához ε= 0,036 /mM/cm értéket használtuk. 4.8.6. A gvajakol-peroxidáz (EC 1.11.1.7.) aktivitásának meghatározása A gvajakol oxidációja nyomán bekövetkező abszorbancia növekedést 470 nm-en spektrofotométerrel nyomon követve mértük (Ádám és mtsai. 1995), hidrogén-peroxid oldattal indítva a reakciót. A 3 ml reakcióelegy összetétele a következő volt: 88 mM Na-acetát puffer (pH 5,5), 0,88 mM gvajakol, 0,0375% H2O2 és 50 µl növényi minta. Az aktivitás számításához ε= 26,6 /mM/cm értéket használtuk.
42
4.9. A szalicilsav mennyiségének mérése
A SA HPLC-s analízisét Meuwly és Métraux (1993) által leírt módszer szerint végeztük. Az 1,5 g növényi mintát folyékony nitrogénben, 0,75 g kvarchomok hozzáadásával dörzsmozsárban homogenizáltuk és 2 ml 70 %-os metanolt adtunk hozzá, mely 250 ng ortoanizinsavat (o-ANI: belső standard) és 25 µg para-hidroxi-benzoesavat (p-HBA: extrakciós carrier) tartalmazott. Az extraktumot 10000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, 2 ml 90%-os metanollal a csapadékot újra extraháltuk, majd utána 10000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. Az így képződött felülúszót az előzőekben félretetthez öntöttük. Az összegyűjtött felülúszókat vákuumbepárlóban vizes fázisig bepároltuk. Ezután 1 ml 5%-os (w/v) TCA-t adtunk a mintákhoz, vortexeltük, majd 10 percig 13000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszóból a szabad SA-t 3,8 ml ciklohexán:etilacetát = 1:1 (v/v) elegyével extraháltuk. A felső szerves fázist Pasteur-pipettával üvegfiolákba vittük át és a mérésig −20°C-on tároltuk. Az alsó vizes fázisból, amely a kötött formákat tartalmazta, savas hidrolízissel szabadítottuk fel a SA-t. A csövek tartalmához 25 µl 1 mg/ml p-HBA-t, 5 µl 0,05 mg/ml oANI-t és 1,3 ml 8N HCl-t adtunk és 80°C-on 60 percig inkubáltuk, majd a fentebb leírt módon extraháltuk, és a felső szerves fázisokat felhasználásig -20°C-on tároltuk. A HPLC analízis előtt a mintákat vákuumbepárlóban szárazra pároltuk, majd az „A” szolvens 900 µl-ében visszaoldottuk. A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumpa rendszer, (mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert) UV/VIS diódasoros detektor (W996) és egy W474 scanning fluoreszcens detektor. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A mintából 40 µl-t injektáltunk az 5 µm szemcseméretű, 150x4,6 mm méretű Supelcosil ABZ-Plus analitikai oszlopra. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk: A: 12,5 mM Na-acetát (pH 2,6), 15% ACN; B: 100% ACN. Az elválasztás a IV. táblázatban található gradiens programmal történt. Az oszlophőmérséklet az analízis során 40°C volt. Detektáláshoz a diódasoros UV/VIS detektorral 230 és 300 nm között teljes spektrumot vettünk fel, melynek egyik célja az, hogy minden vegyületet a maximális abszorbanciánál tudjunk kiértékelni, másrészt a jellemző UV spektrum alapján is lehet azonosítani a csúcsot a retenciós idő mellett (benzoesav, ortohidroxi-fahéjsav, SA és transz-fahéjsav). A vizsgált vegyületek közül az orto-hidroxi-fahéjsav
43
és a SA fluoreszkál is. Detektálásuk 317 nm gerjesztési és 436 nm kisugárzási (oHCA), illetve 305 nm gerjesztési és 407 nm kisugárzási hullámhosszon (SA) történt. 4.10. A poliamintartalom meghatározása A 200 mg levélmintát folyékony nitrogénben homogenizáltunk, majd 1 ml 0,2 M jéghideg perklórsavval extraháltuk és 20 percig jégen állni hagytuk. Ezt követően 20 percig centrifugáltuk 10000 g-vel. A származékképzés danzil-kloriddal Smith és Davies (1985) módszerével történt. 100 µl felülúszóhoz 200 µl telített nátrium-karbonátot és 400 µl acetonban oldott danzil-kloridot (5 mg/ml) adtunk. Összerázás után 60 °C-on sötétben 60 percig inkubáltuk, majd 100 µl 100 mg/ml töménységű prolin oldatot adtunk hozzá, és további 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten sötétben. Ez követően a danzil-származékokat 500 µl toluollal 30 másodpercig extraháltuk, és a szerves fázist vákuum alatt bepároltuk, majd 1 ml 100 % metanolban felvettük 0,2 µm pórusméretű teflon membránszűrőn átszűrtük és analizáltuk. IV . táblázat Az SA és oHCA elválasztásához használt gradiens program. Áramlási Idő (perc)
sebesség
A%
B%
(ml/perc) 1
0
1
100
0
2
1
1
100
0
3
3
1
95
5
4
5
1
95
5
5
18
1
45
55
6
20
1
0
100
7
20,1
1,4
0
100
8
25
1
0
100
9
27
1
100
0
10
31
1
100
0
A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford,
44
MA, USA) segítségével történt. A fent leírt módon származékképzett mintából 4 µl-t injektáltunk a 18 µm szemcseméretű Supelcosil C18 töltettel töltött 20x2,1 mm-es előtét kolonnára, mely után egy 100x2,1 mm analitikai oszlop volt kötve, amelyben Hypersil ODS 5 µm szemcseméretű töltet volt. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk: A: víz, B: ACN, C: MeOH. Az egyes poliaminok elválasztása gradiensprogram segítségével történt (V. táblázat). Az áramlási sebesség az analízis során 0,5 ml/perc, az oszlophőmérséklet 40 °C volt. A danzil-kloriddal származékképzett poliaminok detektálása fluoreszcens detektorral 340 nm-es gerjesztési és 515 nm-es kisugárzási hullámhosszon történt. V. táblázat Poliaminok elválasztásához használt gradiens program. Idő (perc)
A%
B%
C%
0
56
44
0
13
3
68,5
28,5
17
0
70
30
21
0
70
30
22
56
44
0
34
56
44
0
4.11. ACC- és MACC-tartalom meghatározása
Az előkészítést Tari és Nagy (1994) leírása, illetve ennek bizonyos módosításai alapján végeztük. 1 g növényi mintát 5 ml 80%-os etanolban homogenizálunk. A homogenátumot 4 °C-on 10 percig 10000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót fiolába öntöttük és ismét 5 ml 80%os etanolt adtunk hozzá, majd az előzőekben leírtak szerint centrifugáltuk. A felülúszót 55 ºCon vákuumbepárlóban szárazra pároltuk, majd 4 ml ultratiszta vízben visszaoldottuk. A visszaoldott mintákat 1 ml kloroformmal extraháltuk. A vizes-fázist 2-2-ml-re osztottuk szét. Az ACC-t annak etilénné való átalakítása után gázkromatográfiásan mértük, Lizada és Yang (1979) leírását követve. Az ACC méréséhez a reakcióelegy 0,5 ml minta, 0,2 ml 8 mM Hg2Cl2-oldat, 0,2 ml ultratiszta víz/0,2 ml 2µM ACC/0,2 ml 5 µM ACC (standard addíció), 0,5 ml 10,5M NaOH:Hypo keverék=1:3 (frissen készített)-ből állt. Az elegyeket 10 percig
45
jégen állni hagytuk. Ezek után 1 ml-t injektáltunk a gőztérbe (az ACC etilénként szabadul fel). Az extrakció utáni vizes fázisból csavaros-kupakos kémcsőbe 2 ml mintát és 2 ml 4 M HCl-t adtunk. Ezután 3 óráig 100 ºC-on hidrolizáltuk a mintákat. A mintákat lehűlésük után 2 ml 10,5 M NaOH-val átlúgosítottuk. A továbbiakban az ACC mérésnél leírtak szerint jártunk el. Az MACC-tartalmat a hidrolízis előtt és után mért ACC-tartalom különbsége adja. A gázkromatográfiás mérés paraméterei a következők voltak: Gázkromatográf típusa: Shimadzu 2010. Oszlop típusa: 300 x 0,3 cm rozsdamentes acél, töltet típusa: Alumina F-1 80/100 mesh (Supelco Inc. Bellefonte, Pennsylvania, USA) Termosztát hőmérséklete: 80 °C Injektor hőmérséklete: 100 °C Vivőgáz: He, sebessége: 35 ml/perc Detektor: lángionizációs (FID) hőmérséklete: 200 °C FID H2 sebessége: 40 ml/perc FID levegő sebessége: 300 ml/perc Make up gáz (N2) sebessége: 10 ml/perc 4.12. Az összfenol-tartalom mérése A méréshez a hidegperiódus 1., 2., 3., 4., 5., 6. és 12. napján 0,5 g növényi mintát gyűjtöttünk, melyet a felhasználásig -80 °C-on tároltunk. A mintákat dörzsmozsárban, 1 g kvarchomok és folyékony nitrogén segítségével homogenizáltuk. A homogenátumhoz két lépésben 6 ml 80%-os acetont adtunk, melynek segítségével centrifugacsövekbe vittük át a kivonatokat. A mintákat néhány percig jégen tartottuk, majd 10 percig 4 °C-on és 10000 gvel centrifugáltunk. A felülúszó 50 µl-ét használtuk fel a méréshez. A össz fenolos vegyülettartalom spektrofotometriás meghatározására az ún. gallsav (3,4,5-trihidroxi-benzoesav sav) ekvivalens módszert alkalmaztuk Salluca és mtsai. (2008) leírása alapján. A reakcióelegy a következőkből állt: 135 µl ultratiszta víz, 750 µl 10x hígított Folin-Ciocalteu reagens, 600 µl 7,5 % NaHCO3 oldat, 50 µl növényi extraktum. A vak elegy a növényi minta helyett azonos mennyiségű 80%-os acetont tartalmazott. Vortexelés után 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A reakció során megjelenő sötétkék szín alapján 765 46
nm-en mértük a minták abszorbanciáját Shimadzu UV-VIS 160A (Kyoto, Japán) fotométert használva. Standardként gallsavat (Sigma-Aldrich Kft, Budapest, Magyarország) használtunk, melynek az 1 mg/ml-es törzsoldatából a következő hígítási sorozatot készítettük: 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 mg/ml. Az összfenol-tartalmat kalibrációs egyenes alapján határoztuk meg és mg gallsav ekvivalens (GAE) mennyiségben adtuk meg 1g frisstömegre vonatkoztatva. 4.13. A prolintartalom meghatározása A méréshez a hidegedzés 3., 7. és a 12. napján 0,5 g növényi mintát gyűjtöttük, melyet a felhasználásig -80 °C-on tároltunk. A mintákat dörzsmozsárban, 1g kvarchomok segítségével 4 ml ultratiszta vízben homogenizáltuk, majd 10 percig 4°C-on és 10000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót ultratiszta vízzel 10 ml-re egészítettük ki, melyből azután 3x2,5 ml-t öntöttünk szét csavaros kémcsőbe. A mérést Bates és mtsai. (1973) módszere alapján végeztük. 2,5 ml hígított növény kivonatokhoz 1,7 ml ninhidrin reagenst (140,4 mM ninhidrin 6 M ortofoszforsav:jégecet=2:3 elegyében oldva) és a 1,7 ml jégecetet adtunk. A vak reakcióelegy 2,5 ml ultratiszta vizet, 1,7 ml ninhidrin reagenst és a 1,7 ml jégecetet tartalmazott. A vortexelés után 30 percig 100 °C hőmérsékleten inkubáltuk a mintákat, majd a lehűlésük után 5 ml toluolt adtunk hozzájuk. Az elválasztás után a felső szerves fázis tartalmazta a prolint, melyet spektrofotometriásan (Shimadzu UVVIS 160A, Kyoto, Japán) 518 nm-en mértünk. A prolint tartalmazó szerves fázishoz a maradék víz eltávolítására közvetlenül a mérés előtt egy kevés vízmentes Na2SO4ot adtunk. Standerdként 250 µg/ml prolin törzsoldatból 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 és 1,5 µg/ml hígítási sor alapján kalibrációs egyenest készítettünk. A prolintartalmat µg-ban, 1g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg. 4.14. Statisztikai elemzések
A vizsgálatok eredményeinek többsége 5 mérés átlagát tükrözi. A fluoreszcencia indukciós paraméterek és a klorofilltartalom meghatározásakor 15-20 ismétlést hajtottunk végre. Az enzimaktivitási adatok 3-5 mérés átlagából származnak. Azok az esetek, ahol a mintavétel az előbbiektől eltérő volt, az adott fejezetben külön említésre kerültek. A paraméterek genotípusok-, illetve hőmérsékleti kezelések közötti változásainak szignifikancia vizsgálatához a Student-féle kétmintás t-próbát használtunk.
47
A megfigyelésemhez használt mutáns és transzgenikus vonalak egymáshoz viszonyított hasonlóságát a mért összes élettani paraméterből (változók) kapott korrelációs mátrix alapján főkompomponens-analízissel (PCA) vizsgáltam. Egyes élettani paraméterek korreláció számítását a lineáris korrelációs index alapján végeztem el. A vizsgálatokhoz a PAST (Paleontological Statistic version 2.16) programot használtam (Hammer és mtsai. 2001). A búzán végzett microarray vizsgálatban a szignifikáns expresszióváltozást mutató gének kezelésenkénti átfedéseinek megállapítására a VENNY (Oliveros 2007) programot használtuk.
48
5. Eredmények 5.1. A fény szerepe a búza hidegedzése alatt A búzán végzett vizsgálatok fő célja a fényintenzitás hidegedzés alatti szerepének tanulmányozása volt, melynek során a génexpresszió változásaira fókuszáltunk. Vizsgálataink segítségével igyekeztünk feltárni azokat a géneket, melyek kifejeződése fényintenzitás- vagy fajtafüggést mutat. Munkák során figyelemmel kísértük két feltételezett védő vegyület – a prolin és a fenolos vegyületek – szerepét is a fagytűrés kialakulását megelőző hidegakklimáció ideje alatt. A vizsgálatokhoz őszi (Mv Emese) és tavaszi (Nadro) búzafajtákat használtunk. A növénynevelés és a kísérleti körülmények leírása a 4.1.1. fejezetben található. 5.1.1. A transzkripciós mintázat eltérései a fajták között eltérő fényintenzitás hatására A globális génexpressziós vizsgálat eredményei alapján megállapítottuk, hogy mely gének aktivitása milyen mértékben változik meg az egyes fajták esetén a hideg, illetve a fényintenzitás hatására. A két fajtának és fényintenzitásnak megfelelően négy összehasonlítást végeztünk (Mv Emese normál fényintenzitás (NL) vs Nadro NL, Mv Emese alacsony fényintenzitás (LL) vs Nadro LL, Mv Emese NL vs Mv Emese LL, Nadro NL vs Nadro LL). Az adatok elsődleges szelekciója során a kontrollhoz viszonyítva legalább kétszeres FC (fold change) értékkel és korrigált p≤0,05 értékkel rendelkező géneket válogattuk ki, mely után egy fény- és fajtafüggő, nagyszámú adathalmazt kaptunk. Az adatok további redukálása után a legmagasabb FC (fold change) értékű géneket a VI. táblázat sorolja fel összehasonlításonként. A fenti táblázat adataiból jól látszik, hogy számos – a fotoszintetikus apparátushoz vagy a növényi sejt más részeihez kötődő – gén aktivitása különböző módon (a fényintenzitás vagy az adott fajta függvényében) megváltozott. Ezek között vannak az általános stresszproteinek (CBF transzkripciós faktorok, LEA proteinek, dehydrinek, „low temperature induced proteinek”), a membránok szintézisében és integritásában szerepet játszó enzimek (foszfoetanolamin-metiltranszferáz), valamint egyes, a hidegstressz elleni védekezésben részt vevő hormonok szintézisében szerepet játszó enzimek (aldehid-oxidáz2, 1-aminociklopropán1-karboxilát-oxidáz), illetve az egyes ozmotikumok szintézisében szerepet játszó enzimek
49
(fruktán-1-fruktoziltranszferáz). Más gének termékei közvetlenül vagy közvetve a fotoszintézisre hatnak (feoforbid a oxigenáz, klorofill kötő proteinek, citokróm P450). Ha a génexpresszió legalább kétszeres változását vettük alapul, az alacsony fényintenzitás hatására az őszi fajtában, az Mv Emesében 97, míg a tavasziban, a Nadroban 106 gén mutatott aktivitásemelkedést. Hasonlóan, az alacsony fényintenzitás alapján való összehasonlítás után 387 gén mutatott csökkent aktivitást az őszi fajtában, míg a tavasziban 243 (6. ábra). A fajták eltérő fényintenzitásokon összehasonlított génexpressziós listái között kevés átfedés van. Az egyik ilyen gén az etilén szintézisben fontos enzim, az ACC oxidáz génje (TA564694565), a másik a glutation-S-transzferáz génje (TA770654565), melyek mindkét fajta esetén megvilágításfüggést mutattak. Az Mv Emesében az alacsony fényintenzitás hatására néhány gén aktivitása emelkedett (két ismeretlen funkciójú gén (TC288367 and TA595684565) és a foszfoetanolaminmetiltranszferáz (TA595794565)), más géneké csökkent (ismeretlen funkciójú gének (CN012056, TC303369), ferredoxin-NADP(H)-oxidoreduktáz gén (TA497214565), aldehid oxidáz-2 gén (TA588554565) és az ATP-áz subunit 8 (TC364427)). A Nadroban egy feltételezett glicingazdag sejtfal struktúrfehérje génje (TA531874565), az alacsony hőmérséklet indukálta fehérje génje (TC318387) és a „germin-like protein 2a” génje (TA517424565) aktiválódott, míg a fruktán:fruktán 1-fruktoziltranszferáz gének (AB088409;
AB088410),
a
kloroplasztisz
pigmentkötő
fehérje
CP24
génjének
(TA614234565) és a korai fényindukált fehérje génjének (TA937454565) csökkent az aktivitása. Azok a gének, melyek a normál és alacsony fényintenzitástól függtek az Mv Emesében, a Nadroban is hasonló expressziós mintázattal rendelkeztek alacsony fényintenzitás esetén. Ilyen volt a 3-dimetilubikinon-9 3-metiltranszferáz gén (TA837684565), az aldehid oxidáz-2 gén (TA58855 4565) és az ATPáz subunit 8 gén, melyeknek az aktivitása lecsökkent. Több, stressszhez kötődő gén (cold acclimation protein (WCS120), dehidrinek (TA643494565, TA643554565) és a CBF transzkripciós faktorok (EF028775, EF028776) génjeinek expressziója normál fényintenzitáson magasabb volt az Mv Emesében, mint a Nadroban. Az egyes kezelések génlistáinak összehasonlítása alapján úgy tűnik, hogy a normál fényintenzitásnak jelentős hatása van a génexpresszióra a hidegedzés alatt. Az Mv Emese és Nadro normál fényintenzitáson lévő expresszióváltozást mutató génjeit az Mv Emese normál és alacsony fényen lévő génjeinek listájával összehasonlítva egy alacsony fényintenzitás- és fajtafüggő (Nadro) hatás mutatható ki, amely azt jelenti, hogy egyes gének a Nadroban 50
normál fényintenzitás hatására vagy az Mv Emesében alacsony fényintenzitás hatására csökkent
aktivitást
mutatnak.
A következő
gének
mutatták
az
előbbi
alacsony
fényintenzitástól vagy fajtától való függést: két ismeretlen funkciójú gén (CN012056; TC303369), az aldehid oxidáz-2 enzim génje (TA588554565) és az ATP-áz subunit 8 génje (TC364427). VI. táblázat A szignifikáns aktivitásváltozást mutató (p≤0,05) és a legmagasabb FC értékkel rendelkező-, illetve egyes, a hidegstressz elleni védekezésben szerepet játszó gének listája. A feltűntetett
logFC
értékek
az
összehasonlítások
második
tagjára
vonatkoztatott
génexpresszióváltozás mértékét fejezik ki az első taghoz képest (+: aktiváció, -: gátlás). FC: fold change érték, NL: normál fényintenzitás, LL: alacsony fényintenzitás. A microarray vizsgálathoz a minták a 12 napos hidegedzés 6. napján lettek begyűjtve. A gén neve
Szisztematikus
logFC
Funkció
név Mv Emese NL vs Nadro NL
WCS120
M93342
-4,541
cold acclimation protein
TA64355 4565
TA64355 4565
-3,039
dehydrin
CN012056
CN012056
-2,863
putative protein
TC303369
TC303369
-2,838
putative protein
TC364427
TC364427
-2,723
ATPase subunit 8
TA58855 4565
TA58855 4565
-2,586
aldehyde oxidase-2
TA64355 4565
TA64355 4565
-2,562
late embryogenesis abundant protein
TA83768 4565
TA83768 4565
-2,435
3-demethylubiquinone-9 3-methyltransferase
LOC100037627
EF028775
-2,239
CBF transcription factors
tacr7
CK217957
-1,993
Triticum aestivumFGAS: Library6 CAP GATE1
LOC100037628
EF028776
-1,814
CBF transcription factors
CK162617
CK162617
2,360
putative lipoxygenase
gstf4
BT009505
3,207
glutathione S-transferase
TA83882 4565
TA83882 4565
3,617
cytochrome P450
TA81377 4565
TA81377 4565
4,578
pheophorbide a oxygenase
TC339039
TC339039
4,609
putative protein
TA50701 4565
TA50701 4565
4,617
putative protein
TA73313 4565
TA73313 4565
4,661
pathogen-related protein
TA59083 4565
TA59083 4565
4,734
putative protein
TA82864 4565
TA82864 4565
4,786
putative protein
51
CK213823
CK213823
4,892
putative glycosyltransferase
mads#11
DY761369
5,055
MADS-box transcription factor
TA64540 4565
TA64540 4565
5,096
acyl-CoA-binding protein
CV776192
CV776192
6,134
putative glycosyltransferase
Mv Emese LL vs Nadro LL
TA70405 4565
TA70405 4565
-5,455
putative protein
TC311080
TC311080
-5,288
putative protein
TC278589
TC278589
-5,046
class III peroxidase 62 precursor
TA64349 4565
TA64349 4565
-4,504
dehydrin
TA64355 4565
TA64355 4565
-3,974
dehydrin
WCS120
M93342
-3,809
cold acclimation protein
TA64355 4565
TA64355 4565
-3,790
late embryogenesis abundant protein
TA93745 4565
TA93745 4565
-3,226
early light-inducible protein
TA77065 4565
TA77065 4565
-2,426
glutathione S-transferase
LOC100037627
EF028775
-2,252
CBF transcription factors
LOC100037628
EF028776
-2,005
CBF transcription factors
CK162617
CK162617
-1,994
putative lipoxygenase
TA51742 4565
TA51742 4565
2,064
germin-like protein 2a
TA63299 4565
TA63299 4565
4,496
60S ribosomal protein L9
CV776192
CV776192
4,523
putative glycosyltransferase
TA77096 4565
TA77096 4565
4,606
LEM3-like protein
TA63312 4565
TA63312 4565
4,638
60S ribosomal protein L9
mads#11
DY761369
4,693
MADS-box transcription factor
CD879657
CD879657
8,117
putative protein
Mv Emese NL vs Mv Emese LL
CN012056
CN012056
-3,487
putative protein
TC303369
TC303369
-3,117
putative protein
TA58855 4565
TA58855 4565
-3,006
aldehyde oxidase-2
TC364427
TC364427
-2,998
ATPase subunit 8
TA49721 4565
TA49721 4565
-2,784
ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase
TA83768 4565
TA83768 4565
-2,526
3-demethylubiquinone-9 3-methyltransferase
TA77065 4565
TA77065 4565
1,084
glutathione S-transferase
TA56469 4565
TA56469 4566
1,244
1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase
TA59544 4565
TA59544 4565
2,136
phosphoethanolamine methyltransferase putative phosphoethanolamine N-
TA59568 4565
TA59568 4565
2,170
52
methyltransferase
TA59579 4565
TA59579 4565
2,239
phosphoethanolamine methyltransferase
WPEAMT
AY065971
2,249
phosphoethanolamine methyltransferase
TA72415 4565
TA72415 4565
2,330
chitinase
LOC542888
CK161662
2,511
dehydrin WZY 1-1
TA64681 4565
TA64681 4565
2,737
putative senescence associated protein
TC288367
TC288367
3,047
putative protein
Nadro NL vs Nadro LL
1-FFT-A
AB088409
-4,410
beta-fructofuranosidase
TC283914
TC283914
-4,376
fructan 1-fructosyltransferase
1-FFT-B
AB088410
-4,30
beta-fructofuranosidase
TA69793 4565
TA69793 4565
-3,954
lipoxygenase 2.1. chloroplast precursor
CK162617
CK162617
-3,831
putative lipoxygenase
TA62733 4565
TA62733 4565
-3,149
chlorophyll a-b binding protein
gstf4
BT009505
-2,951
glutathione S-transferase
TA61423 4565
TA61423 4565
-2,949
chloroplast pigment-binding protein CP24
TA93745 4565
TA93745 4565
-2,701
early light-inducible protein
TA83882 4565
TA83882 4565
-2,659
cytochrome P450
TA77065 4565
TA77065 4565
-1,837
glutathione S-transferase
TA56469 4565
TA56469 4566
1,288
1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase
TA51742 4565
TA51742 4565
2,232
germin-like protein 2a
TA93556 4565
TA93556 4565
3,259
coiled-coil domain-containing protein
TC318387
TC318387
3,676
low temperature induced protein
TA53187 4565
TA53187 4565
3,698
putative glycine-rich cell wall structural protein
TA64649 4565
TA64649 4565
5,075
putative rhodanese-like domain containing protein
Amikor a génexpressziós listák között a Nadro normál vs. alacsony fényintenzitás és a normál fényintenzitás esetén az Mv Emese vs. Nadro összehasonlítást elvégeztük, egy fajta és fényintenzitásfüggő expressziószabályozást figyeltünk meg. Normál fényintenzitáson a glutation-S-transzferáz génje (BT009505), a citokróm P450 génje (TA83882 4565) és egy lipoxigenáz gén (CK162617) aktivitása magasabb volt a Nadroban, mint az Mv Emesében, alacsony fényintenzitáson azonban szupresszálva voltak.
53
6. ábra Az egyes fényintenzitás- és fajtakombinációk szignifikáns expresszióváltozást mutató gének száma és a listák közötti átfedések. A számok a legalább 2x FC értékű és a korrigált P≤0,05 hibavalószínűség mellett szignifikáns aktivitásváltozással rendelkező géneket jelentik. (A) A Venn-diagram négy részhalmaza, illetve annak a metszetei az aktivitásemelkedést mutató gének közötti átfedéseket mutatja. (B) A Venn-diagram négy részhalmaza, illetve annak a metszetei a csökkent aktivitást mutató gének közötti átfedéseket mutatja (E: Mv Emese; N: Nadro; NL (L): normál fényintenzitás (250 µmol m−2 s−1); LL (D): alacsony fényintenzitás (20 µmol m−2 s−1). 5.1.2. Stresszhez kötődő anyagcseretermékek változásai a hidegedzés hatására a megvilágítás függvényében 5.1.2.1. Ozmoprotektánsok: prolin A prolin más egyéb élettani szerepe mellett fontos ozmoprotektáns, amely több – szövetek dehidratációjával járó – stresszhatás során is hatást fejt ki. Kísérletünkben a prolinszint hidegedzés alatti változásait vizsgáltuk a két eltérő erősségű megvilágítás függvényében. A prolin mennyiségében a hidegedzés 3. napján normál fényintenzitáson egy átmeneti csúcs volt megfigyelhető mindkét fajta esetén (7. ábra). A 7. és az utolsó, 12. napon a 3. napi
54
csúcshoz viszonyítva alacsonyabb volt a prolin szintje, de a kontrollszinthez képest ezek az értékek is szignifikánsan magasabbak voltak. Az alacsony fényintenzitáson egyik fajta esetén sem volt kimutatható szignifikáns változás a prolinszint változásaiban.
250
250
Alacsony fényintenzitás Normál fényintenzitás
Nadro
200
Mv Emese
150
PPr orolin l i n ( µ gµg/g ) / g F WFW
PPr rolin o l i n ( µ gµg ) / /gg FFW W
200
**
150
**
100
100
50
50
0 0
2
4
6
8
10
0
12
0
Hidegedzés ideje (nap) (nap) A hidegedzés ideje
2
4
6 8 10 Hidegedzés ideje (nap) A hidegedzés ideje (nap)
12
7. ábra A prolin mennyiségének változásai a Nadro tavaszi és az Mv Emese őszi búzafajtákban. Az ábrán feltűntetett szignifikanciaszintek a hidegedzés alatti mintavételi időpontokban és a kontroll hőmérsékleten mért prolinértékek közötti különbséget jelentik a két megvilágításon **: p≤0.01, illetve ***: p≤0.001 hibavalószínűség mellett (NL: normál fényintenzitás (250 µmol m−2 s−1); LL: alacsony fényintenzitás (20 µmol m−2 s−1); n=5, SD). 5.1.2.2. Antioxidáns vegyületek: összfenol-tartalom A hidegedzés első hat napján naponta mértük az összes fenolosvegyület-tartalmat. Az összes fenolos vegyület szintjében mindkét búzafajta esetén, alacsony és normál fényintenzitáson egyaránt egy átmeneti csökkenést figyeltünk meg a hidegedzés 3. napján. Az 5. napon emelkedés, a 6. napon lassú csökkenés volt látható. Ez a tendencia mindegyik esetben közel hasonló volt. A kontrollhoz képest (a hidegedzés előtti nevelési hőmérséklet) az utolsó, 12. napon szignifikánsan magasabb össz fenolosvegyület-szint volt kimutatható a Nadro esetén mindkét fényintenzitás alatt (8. ábra), míg az őszi fajtában, az Mv Emesében csak a normál megvilágítás esetén (8. ábra).
55
Alacsony fényintenzitás
60
***
Normál fényintenzitás
Nadro
50
***
40 30 20 10 0 0
1
2
3
4
5
6
A hidegedzés ideje (nap) Mv Emese
12
A hidegedzés ideje (nap)
70
***
zesfenolosvegyület (m gG A E)/ gFW PolifenolÖsstartalom (mgGAE/FW)
Összesfenolosvegyület (mgGAE) / gFW
Polifenol tartalom (mgGAE/FW)
70
60 50 40 30 20 10 0 0
1
2
3
4
5
6
12
A hidegedzés ideje (nap)
A hidegedzés ideje (nap)
8. ábra Az összes fenolos vegyület mennyiségének változásai a Nadro tavaszi és az Mv Emese őszi búzafajtákban. Az ábrán feltűntetett szignifikanciaszintek a kontroll hőmérséklet és a hidegedzés utolsó napján mért két érték közötti különbséget jelentik az adott fajtánál és megvilágításon ***: p≤0.001 hibavalószínűség mellett (Normál fényintenzitás (250 µmol m−2 s−1); Alacsony fényintenzitás (20 µmol m−2 s−1); n=5, SD). 5.2. A hideg- és fagytűrés élettani vizsgálata eltérő fagytűrésű Arabidopsis mutánsokban és transzgenikus vonalakban A
búzában
végzett
vizsgálatokkal
párhuzamosan
Arabidopsis-ban,
mint
modellnövényben is folytattunk vizsgálatokat. A kísérletekhez olyan genotípusokat választottunk, melyek az általunk vizsgált anyagcsereutak komponenseihez kapcsolódnak. Aszkorbáthoz,
illetve
szalicilsavhoz
kötődő
mutánsok
és
transzgenikus
vonalak
hidegtűrésbeli különbségeinek feltárására hidegedzést és fagyasztási teszteket hajtottunk végre. A kísérletek során több stresszhez kötődő vegyület és élettani változó eltéréseit vizsgáltuk. Eredményeink az Arabidopsis hidegtűrés elleni stratégiáját tükrözik, más fajokra
56
való általánosíthatóságuk további vizsgálatokat igényel. A növényi anyag és a nevelési körülmények leírása a 4.1.2. fejezetben található. 5.2.1. Fagyasztási tesztek Az első, a fagyasztási teszt befejezése utáni időpont, amikor a növényeken már elkülöníthető hatások látszódtak, a 12. nap volt. Az ekkori osztályozás és a számlálás alapján a -11°C-on fagyasztott növények esetén még aránylag magas túlélést állapítottunk meg. A Col-0 és a sid2 60% körül éltek túl. A vtc2-1, az eds5 és a NahG jóval fagyérzékenyebbnek bizonyultak, túlélésük 10%-os volt. A GLOáz esetén már ebben az időpontban sem volt túlélő -11°C-on. A többi genotípus esetén -9°C-on 90-100%-os, kivéve az eds5 – amelynél 70% körüli volt – túlélési arányt kaptunk (az adatok nincsenek bemutatva). A növényeket 21 nappal a fagyasztás után tekintettük túlélőnek (9. ábra). A hidegedzést követő fagyasztási tesztek alapján kapott eredmények a VII. táblázatban találhatók. VII. táblázat A mutáns és transzgenikus vonalak fagyasztási tesztek utáni túlélési arányai (%). Az adatok 21 nappal a fagyasztás után voltak felvételezve. Col-0: vad genotípus, vtc2-1: aszkorbát-hiányos mutáns, GLOáz: aszkorbáttúltermelő-transzgenikus vonal, eds5: enhanced disase susceptibility – fokozott patogénérzékenységgel rendelkező mutáns, sid2: izokorizmátszintáz mutáns, NahG: szalicilsav degradáló transzgenikus vonal. A fagyasztás 24 óráig tartott, a túlélő egyedek végleges számlálását a fagyasztás után 21 nappal végeztük (M ± SD).
-9°C
-11°C
Col-0
66 ± 34
9 ± 27
vtc2-1
55 ± 14
2±3
GLOase
49 ± 27
0
eds5
64 ± 9
1±3
sid2
69 ± 0
20 ± 33
NahG
66 ± 24
0
A -9°C-on fagykezelt 21 napos növényeknél a megfigyelt túlélők aránya 40-50%-ra csökkent mindegyik genotípus esetén. A legalacsonyabb számú a GLOáz egyedei esetén-, míg a legmagasabb számú túlélő pedig a sid2 növényeknél volt. -11°C jóval alacsonyabb számban
57
voltak megfigyelhetők a túlélő növények. A GLOáz, az eds5 és a NahG esetén egyáltalán nem-, míg a Col-0, a sid2 esetén is csak 20% alatti túlélés volt megfigyelhető. A vtc2-1 növények között csak egy-egy túlélő egyed volt látható. Az utolsó értékelést fagyasztás után 33 nappal végeztük. Ebben az időpontban -11°C-on hasonló volt a túlélők aránya, mint a 21. napon számláltak esetén. -9°C-on tovább csökkenést állapítottunk meg a Col-0, a vtc2-1, valamint a GLOáz esetén (20% körüli túlélésiszázalék), a SA-hoz kötődő genotípusok esetén azonban a 21. napon tapasztalt túléléshez képest csak kisebb csökkenés volt megfigyelhető. Az utolsó napi megfigyelés alapján tehát az eds5, a sid2, illetve a NahG genotípusok bizonyultak a legkevésbé érzékenynek a faggyal szemben. Bebizonyosodott az is, hogy a -9°C az a hőmérséklet, melyen megállapítható volt a genotípusok közötti eltérés a faggyal szembeni ellenállóságban. A fagyasztási tesztekből kapott túlélésbeli különbségek bizonyítják, hogy a különböző élettani jellegekre mutáns és transzgenikus változatok fagytűrése eltérő, amely már megfigyelhető volt a fagyteszt előtti hidegedzés alatt mért paraméterek némelyikénél is. A következőkben ezen eltérések okainak felderítésére végzett vizsgálataink eredményei következnek. 5.2.2.
A fotoszintetikus apparátus szerepe
5.2.2.1. A klorofilltartalom változásai Az eltérő fagytűréssel rendelkező Arabidopsis mutánsok és transzgenikus növények esetén mértük a levél klorofilltartalmát kontroll-, hidegedzési-, valamint a fagyteszt utáni hőmérsékleten. A kapott eredmények az egységnyi levélfelületre vonatkoztatott relatív klorofill tartalmat jelentik. Az eredmények a 10. ábrán láthatók. A vad genotípusban (Col-0) és sid2 mutánsban az edzési hőmérsékleten és az alacsonyabb fagypont alatti (-11 °C) hőmérsékleten is alacsonyabb volt a klorofilltartalom mint kontroll körülmények között. Érdekes módon a magasabb fagypont alatti hőmérsékleten (-9 °C) a klorofillszint a kontroll értékkel közel azonos volt. A vizsgálathoz használt mutánsok, transzgenikus vonalak, illetve vad genotípus klorofill tartalmát adott hőmérsékleten összehasonlítva azt kaptuk, hogy 21 °C-on a NahG klorofill szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a Col-0 -hoz hasonlítva. Hidegedzés hatására, 4 °Con az eds5-ben szignifikánsan magasabb, míg a NahG-ben alacsonyabb volt a klorofillszint.
58
-9 °C-on a vtc2-1-ben és a NahG-ben szignifikánsan kevesebb klorofill volt kimutatható, mint a vad genotípusban. -11°C-on csak a NahG-ben volt szignifikáns a klorofill csökkenése, ugyanakkor a vtc2-1-ben is alacsonyabb szintet mértünk, de ez a változás nem volt szignifikáns.
9. ábra A vizsgált Arabidopsis mutánsok és transzgenikus vonalak állapota 21 nappal az 1 napos -9, illetve -11°C-os fagyasztási tesztek után. Az ábra fotói egy-egy jellegezetes képet mutatnak mindegyik genotípusból.
A csökkenő hőmérséklettel csökkenő klorofilltartalom volt megfigyelhető a vtc2-1 aszkorbáthiányos mutáns, illetve kevésbé kifejezett módon a NahG transzgenikus vonal esetén. A GLOáz hasonló tendenciát mutatott, mint a Col-0 és a sid2, de -11 °C-on alacsonyabb volt a klorofilltartalma, mint kontroll hőmérsékleten. Az eds5 mutánsban csak 11 °C hatására csökkent a klorofillszint. A fagypont alatti hőmérséklet utáni mérések a fagyteszt után 4 nappal készültek.
59
21°C 4°C -9°C -11°C
20 18
10
***
**
**
12
***
14
**
Relatív klorofill tartalom
16
*
8 6 4 2 0 Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
10. ábra A klorofill tartalom változásai a hőmérséklet függvényében a vizsgált Arabidopsis mutáns és transzgenikus vonalakban. A mérések a nevelési periódus (21 °C) és a 4 napig tartó 4°C-os hidegedzés utolsó napján, illetve a -9 és -11°C-os fagyasztások után 4 nappal készültek. A feltűntetett szignifikanciaszintek a kezelt növények klorofilltartalom értékei és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01; *** : p≤0,001) (n=15; SD). Hideg (4 °C) hatására a klorofilltartalom hasonlóan változott tehát egyrészről a Col-0, a sid2 és a GLOáz esetén, melyeknél érdekes volt, hogy az edzési hőmérsékleten csökkent a klorofillszint, viszont a -9 °C-os fagyasztás után a kontrollhoz hasonló szint volt mérhető. Ezekben a genotípusokban valószínűleg hamarabb regenerálódott a klorofillszintézis. A vtc2-1 és a NahG szintén hasonló tendenciát mutattak. Ezekben a klorofilltartalom a hőmérséklettel párhuzamosan csökkent. 5.2.2.2. A PSII kvantumhasznosítási paraméterei (Fv/Fm és ∆F/Fm’) A PSII működésének hidegstressz alatti változását klorofill fluoreszcencia indukció segítségével vizsgáltuk. A kapott eredmények közül az aktuális (∆F/Fm’) és a maximális (Fv/Fm) kvantumhatásfokot hasonlítottuk össze a négy különböző kezelési hőmérsékleten. Az egyes genotípusok Fv/Fm értékeit adott hőmérsékleten összehasonlítva meglehetősen kis változásokat tapasztaltunk (11. ábra). Kontroll körülmények között az összes genotípus Fv/Fm értéke közel hasonló volt a Col-0-hoz. A hidegedzés hatására a maximális kvantumhatásfok
értékek
kissé
magasabbnak
60
bizonyultak
a
vad
genotípushoz
képest. Ezek a különbségek azonban egyik esetben sem voltak szignifikánsak. A fagyasztási hőmérsékleteken csak egy-egy esetben tapasztaltunk szignifikáns különbséget. -9 °C-on a vtc2-1, míg -11°C-on a sid2 esetén volt alacsonyabb az Fv/Fm értéke a Col-hoz viszonyítva. Ezek a kismértékű változások arra utalnak, hogy a mutánsok és transzgenikus vonalak között
** *
*** * **
** **
** *
* *
0.9
* * *
azonos hőmérsékleten nincs jelentős különbség.
21 °C 4 °C -9 °C -11 °C
0.8 0.7
Fv/Fm
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
11. ábra A PSII maximális kvantumhatékonyágának (Fv/Fm) változása a hidegedzés időtartama alatt kontroll, edzési és a két fagyasztási hőmérsékleten. A feltüntetett szignifikanciaszintek a kezelési hőmérsékleteken mért Fv/Fm értékek és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01; *** : p≤0,001) (n=15; SD). Az Fv/Fm változása a hőmérséklet csökkenésével általában alacsonyabb értéket mutatott amikor az egyes kezelési hőmérsékletek Fv/Fm értékei a kontroll hőmérsékleten mérttel voltak összehasonlítva. A 4 °C-os hidegedzés hatására szignifikánsan alacsonyabbak voltak az értékek. A -9 °C-on fagyasztott növények az edzési hőmérséklethez képest ismét magasabb Fv/Fm értéket mutattak, amely megközelítette a kontroll hőmérsékleten mért értékét. A 21 °Con mért értékhez képest a csökkenés ezen a hőmérsékleten csak a GLOáz, az eds5, a sid2 és a NahG esetén volt szignifikáns. Érdekes, hogy a klorofilltartalom változása során közel azonos tendenciát tapasztaltunk. A -11 °C-os növények Fv/Fm értékei voltak a legalacsonyabbak az előző három hőmérsékleten mértekhez viszonyítva. A -11 °C-on mért értékeket a kontroll hőmérsékleti értékekkel összehasonlítva a csökkenés minden esetben szignifikáns volt. Az utóbbi
értékek
jól
tükrözik
a
PSII 61
károsodását
-11
°C-on.
A
GLOáz
transzgenikus növények bizonyultak a legérzékenyebbnek a fagyhatással szemben, mivel ezen a hőmérsékleten minden egyed elpusztult, így az Fv/Fm sem volt mérhető. Az egyes genotípusok aktuális kvantumhatásfok értékeit (∆F/Fm’) az egyes hőmérsékleteken összehasonlítva a következő változásokat tapasztaltunk (12. ábra). Kontroll hőmérsékleten a GLOáz, az eds5 aktuális kvantumhasznosítása a vad genotípuséhoz közeli értéket mutatott. Alacsonyabb értéket mértünk a vtc2-1, sid2 és a NahG esetén, melyek közül a legkifejezettebb csökkenés a sid2-ben volt. Az edzési hőmérsékleten, 4 °C-on az egyes genotípusok ∆F/Fm’ értékei között lecsökkent a különbség, kivéve a sid2-ban, amely itt is szignifikánsan alacsonyabb volt, de kevésbé kifejezetten, mint 21 °C-on.
**
***
***
***
***
0.8
***
0.9
21°C 4°C
0.7
∆F/Fm'
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
12. ábra A PSII aktuális kvantumhatásfokának (∆F/Fm’) változása a hidegedzés időtartama alatt kontroll és edzési hőmérsékleten (4 nap 4 °C). A mérések a két hőmérsékleti periódus utolsó napjain készültek. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési hőmérsékleten mért ∆F/Fm’ értékek és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (** : p≤0,01; *** :p≤0,001) (n=15; SD). A kontroll és az edzési hőmérsékleten mért aktuális kvantumhatásfok értékeket összehasonlítva mindegyik genotípus esetén szignifikáns csökkenést tapasztaltunk a ∆F/Fm’ értékeiben. A vizsgálat eredményei alapján a ∆F/Fm’ érzékenyebb paraméternek bizonyult a hideg hatására, mint az Fv/Fm.
62
5.2.2.3. A fotoszintézishez kötődő paraméterek változásainak egymással való kapcsolata A különböző genotípusok egyes kezelési hőmérsékletekhez tartozó klorofilltartalom, Fv/Fm és dF/Fm’ adatainak egymáshoz viszonyított hasonlóságát a korrelációs indexeik alapján hasonlítottuk össze. Ennek során a három vizsgált paraméter adott hőmérsékleten való korrelációjának
mértékére
voltunk
kíváncsiak
az
összes
genotípus
adatainak
figyelembevételével. A korrelációs vizsgálat eredménye a VIII. táblázatban látható. VIII. táblázat A különböző kísérleti hőmérsékleteken mért fotoszintetikus működéshez kötődő paraméterek korrelációja. CHLF: klorofill tartalom, Fv/Fm: a PSII maximális kvantumhatásfoka, ∆F/Fm’: a PSII aktuális kvantumhatásfoka. A paraméterek rövidítése utáni a számok (21, 4, -9 és -11) a hőmérsékletet jelentik °C-ban kifejezve. A táblázatban félkövérrel a korrelációs értékek (az átló alatti baloldali háromszög), kiemelés nélkül a p értékek (az átló feletti jobb oldali háromszög) láthatók. Kék színnel azok a korrelációs értékek vannak kiemelve, ahol az összehasonlított paraméterek korrelációja adott hőmérsékleten, p≤0,05 mellett a legmagasabb volt. CHLF21
CHLF21
CHLF4
CHLF-9
CHLF-11
Fv/Fm21
Fv/Fm4
Fv/Fm-9
Fv/Fm-11
∆/Fm'21
∆F/Fm'4
0
0,85599
0,11295
0,30698
0,86752
0,50101
0,32356
0,74658
0,32057
0,5372
CHLF4
-0,0346
0
0,78809
0,81028
0,5426
0,83993
0,41647
0,64767
0,35519
0,20241
CHLF-9
0,29544
-0,0512
0
0,23185
0,60772
0,56294
0,94653
0,004997
0,26063
0,48241
CHLF-11
0,19295
0,04575
0,22503
0
0,8565
0,06725
0,9432
0,49629
0,90749
0,88047
Fv/Fm21
-0,0318
-0,1157
-0,0976
0,03447
0
0,81449
0,66697
0,89439
0,38177
0,20388
Fv/Fm4
0,12778
0,0385
-0,11
0,33855
-0,04472
0
0,31617
0,13463
0,14609
0,11962
Fv/Fm-9
-0,1866
-0,154
0,01279
-0,01359
-0,08191
-0,1894
0
0,28465
0,64182
0,67152
Fv/Fm-11
-0,0616
0,08698
-0,499
0,12918
0,02531
0,27954
0,2019
0
0,93404
0,1736
∆F/Fm'21
-0,1877
-0,1749
0,21204
0,02216
-0,16562
0,27189 -0,08852
0,015781
0
0,005872
∆F/Fm'4
-0,1173
-0,2395
-0,1333
0,02867
-0,23875
0,29033 -0,08073
0,25514
0,49096
0
A táblázat adataiból a három vizsgált paraméter adott hőmérsékleten mért adatai között egyértelmű összefüggéseket nem sikerült találnunk. A grafikonok alapján azonban úgy látszik, hogy a kontroll hőmérséklet utáni hidegedzés hatására megváltozott klorofilltartalom hatással lehet a kvantumhasznosítási paraméterekre (10., 11., 12. ábrák). A kvantumhasznosítás paraméterek csökkenése – amely a ∆F/Fm’ esetén volt a legkifejezettebb – nagy valószínűséggel az alacsonyabb klorofillszinttel (is) magyarázható.
63
5.2.3. Az antioxidáns védekezőrendszer aktivitása – az aszkorbát-glutation ciklus vizsgálata
5.2.3.1. Glutation-reduktáz (GR) A vizsgálatokban használt növényekben szignifikánsan alacsonyabb volt a GR aktivitása 21°C-on a sid2-ban, az eds5-ben, a GLOáz-ban és a NahG-ben, mint a Col-0 -ban. A hidegedzés után a genotípusok közötti különbségek lecsökkentek. A kontroll és az edzési hőmérsékleten mért adatokat összehasonlítva azt tapasztaltuk,
400
*** *
*
***
450
4 °C
***
21 °C
500
**
hogy a GR aktivitása mindegyik genotípus esetén szignifikánsan megemelkedett (13. ábra).
nkat / g FW
350 300 250 200 150 100 50 0
Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
13. ábra A glutation reduktáz (GR) aktivitásának változása a hidegedzés hatására. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési hőmérsékleten mért GR aktivitás értékek és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01; *** :p≤0,001). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD).
64
5.2.3.2. Mono-dehidroaszkorbát reduktáz (MDHAR) Vizsgálatainkban a kontroll hőmérsékleten csak a sid2 esetén volt szignifikánsan magasabb a MDHAR működése. A hidegedzés hatására a vtc2-1 mutánsok kivételével mindegyik genotípusban megemelkedett az aktivitás, ami azonban csak a NahG-ben volt szignifikáns (14. ábra). A vtc2-1 növényekben gyenge csökkenés volt megfigyelhető. Edzési hőmérsékleten a
nkat / g FW
genotípusok között nem volt jelentős különbség az enzim aktivitásában. 21 °C
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
4 °C
*
Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
14. ábra A mono-dehidroaszkorbát reduktáz (MDHAR) aktivitásváltozása a hidegedzés hatására. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési hőmérsékleten mért MDHAR aktivitás értékek és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). 5.2.3.3. Aszkorbát-peroxidáz (APX) Az APX a növényekben a stressz során keletkezett H2O2 bontását végzi az aszkorbát redukált formájának segítségével. Vizsgálatunkban a hidegstressz alatt az enzimaktivitás minden genotípus esetén magasabb volt, mint a hidegedzés előtt, azonban szignifikáns változás csak az eds5 és a sid2 esetén volt megfigyelhető (15. ábra). Az egyes mutánsok, valamint a transzgenikus vonalak között egyik hőmérsékleten sem volt jelentősebb eltérés.
65
nkat / g FW
4 °C
**
21 °C
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
*
Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
15. ábra Az aszkorbát-peroxidáz (APX) aktivitásváltozása a hidegedzés hatására. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési hőmérsékleten mért APX aktivitás értékek és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). 5.2.3.4. Az aszkorbát (AA) szint változásai A kontroll, 21°C-os hőmérsékleten a vtc2-1 növények totál és redukált AA tartalma szignifikánsan alacsonyabb (p≤0,01, p≤0,001), a GLOáz redukált AA tartalma magasabb (p≤0,05) volt a vad genotípushoz hasonlítva (16. ábra). Az oxidált forma szintje csak a sid2 esetében volt magasabb, mint a Col-0-é (p≤0,05) (16. ábra). A hidegedzés után (2°C) a genotípusok közötti összhasonlítás eredménye a vtc2-1-ben mind a totál és a redukált AA tartalom kisebb (p≤0,001), a GLOáz-ban pedig magasabb (p≤0,05) volt, mint a Col-0-ban. Az eds5 szintje szintén magasabb volt, mind a totál (p≤0,01), mind a redukált (p≤0,05) forma esetén. Az
egyes
genotípusok
két
kezelési
hőmérsékleten
történő
AA
szintjének
összehasonlítása során a következőket tapasztaltuk. A vad genotípus esetén a redukált AA forma (p≤0,05) (16. B ábra), valamint a sid2-ben az oxidált AA forma csökkenése bizonyult szignifikánsnak (p≤0,05) (16. C ábra). A Col-0, illetve a vtc2-1 genotípusokban általában csökkent az AA formák mennyisége. Az SA-hiányos mutánsokban, illetve transzgenikus NahG vonalban kevéssé változott vagy kismértékű csökkenés volt megfigyelhető.
66
µg/g FW
Totál AA
21°C
2°C
3 2 1 0 Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
µg/g FW
Redukált AA
3 2 1 0
* Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
µg/g FW
Oxidált AA
3 2
*
1 0 Col-0
vtc2-1
GLOase
eds5
sid2
NahG
16. ábra Az aszkorbáttartalom (AA) genotípusok közötti különbségei és mennyiségi változásai a hidegedzés hatására. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési hőmérsékleten mért AA értékek és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (*: p≤0,05). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=3, SD).
67
5.2.4. A szalicilsav (SA) és a hidegtűrés kapcsolata 5.2.4.1. Az orto-hidroxi-fahéjsav (oHCA) mint a SA előanyaga A szabad oHCA szintjében szignifikáns eltéréseket tapasztaltunk mind az egyes genotípusok között adott hőmérsékleten, mind a genotípusonként a hidegedzés hatására. Kontroll hőmérsékleten (21°C) szignifikánsan alacsonyabb oHCA szintet mértünk a mutánsok (vtc2-1, eds5, sid2) esetén a Col-0-hoz viszonyítva. A transzgenikus vonalakban is lecsökkent az oHCA szintje, de kevéssé kifejezett mértékben. Az edzési hőmérsékleten (4°C) a mutánsokban jóval magasabb volt a szabad oHCA szintje, mint a vad genotípusban, amely arra enged következtetni, hogy a hideg hatására nagyobb mennyiségű oHCA képződik. A hidegedzés hatására a NahG kivételével mindenhol csökkent a szabad oHCA szintje, amely a Col-0-ban volt a legkifejezettebb (17. A ábra). Szignifikáns csökkenés volt még megfigyelhető a GLOáz és a sid2 esetében. A kötött forma esetén (17. B ábra) kontroll hőmérsékleten az egyes genotípusok között nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést, bár a Col-0 és a vtc2-1 esetén magasabb magasabb volt az oHCA szintje. Az edzési hőmérsékleten az aszkorbáthiányos mutánsban, a vtc2-1-ben, az aszkorbátot túltermelő GLOáz transzgenikus fajtában és a sid2 csökkent SA szintézissel jellemezhető mutánsban szignifikánsan alacsonyabb volt az oHCA kötött formájának mennyisége, mint vad genotípusban. A hidegedzés hatására a vad genotípusban, a vtc2-1 és a GLOáz esetén csökkent, míg a SA szintézisében károsodott vagy az azt degradáló transzgenikus növény, a NahG esetében kissé emelkedett a kötött oHCA szintje. A változás egyedül a GLOáz esetén volt szignifikáns. 5.2.4.2. Az endogén SA mennyiségének változása Az oHCA mérése után vizsgáltuk az endogén SA változásait is. A szabad SA szintje kontroll hőmérsékleten csak a vtc2-1 és a NahG esetén tért el a vad genotípustól. A vtc2-1 ben szignifikánsan magasabb, a NahG-ben alacsonyabb szintet mértünk. A hidegedzés hatására a NahG-ben a Col-0-hoz képest megszűnt a különbség. A vtc2-1 -ben a Col-0-hoz képest 4 °C-on szignifikánsan alacsonyabb szabad SA szintet mértünk.
68
17. ábra A szabad (A) és kötött (B) orto-hidroxi fahéjsav (oHCA) szintjének genotípusok közötti különbségei és mennyiségi változásai a hidegedzés hatására. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési és a kontroll hőmérsékleten mért oHCA értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01; ***: p≤0,001). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). Hidegedzés hatására a vtc2-1–ben és a GLOáz–ban szignifikánsan csökkent, míg a NahG–ben emelkedett a szabad forma mennyisége a kontroll hőmérsékleten mérthez viszonyítva (18. A ábra). Az SA kötött formájának genotípusok közötti aránya mindkét hőmérsékleten jelentős eltéréseket mutatott. Szignifikánsan alacsonyabb volt a kötött SA szintje az SA hiányos mutánsok esetén 21 és 4 °C-on is a vad genotípushoz viszonyítva. A NahG szintje is alacsonyabb volt, de szignifikánsan csak a kontroll hőmérsékleten. Az egyes hőmérsékleteken való összehasonlításban a vtc2-1 és az eds5 esetén szignifikánsan lecsökkent a kötött forma szintje a hidegedzés hatására. A Col-0 szintén csökkenést, a GLOáz, a sid2 és a NahG kisebb emelkedést mutatott (18. B ábra).
69
18. ábra A szabad (A) és a kötött (B) SA szintjének genotípusok közötti különbségei és mennyiségi változásai a hidegedzés hatására. A feltűntetett szignifikanciaszintek az edzési és a kontroll hőmérsékleten mért SA értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). 5.2.4.3. Az oHCA és az SA változásának összefüggései A
vizsgálatokból
kapott
oHCA
és
SA
formák
adott
hőmérsékleten
való
összefüggéseinek felderítésére korrelációs analízist végeztünk. A vizsgálat eredménye a IX. táblázatban található. A táblázat összehasonlításai alapján a szabad oHCA 21°C-on mért mennyisége és a szabad SA 21°C-on mért mennyisége egymással pozitív összefüggést mutatott. Utóbbi tendencia a 4 °C-on mért értékek esetén is igaznak bizonyult. Pozitív korreláció volt kimutatható a 21 °C-on mért kötött oHCA és a szabad SA értékei között is.
70
IX. táblázat A különböző hőmérsékleteken mért oHCA és SA értékek korrelációja. A paraméterek rövidítése utáni a számok (21, 4) a hőmérsékletet jelentik °C-ban kifejezve. Az f: free (szabad), b: bound (kötött) a vegyületek formáját jelenti. A táblázatban félkövérrel a korrelációs értékek (az átló alatti baloldali háromszög), kiemelés nélkül a p értékek (az átló feletti jobb oldali háromszög) láthatók. Kék színnel azok a pozitív korrelációs értékek vannak kiemelve, ahol az összehasonlított paraméterek korrelációja adott hőmérsékleten, p≤0,05 mellett a legmagasabb volt. oHCAf21 oHCAf4 oHCAf21 oHCAf4 oHCAb21 oHCAb4 SAf21 SAf4 SAb21 SAb4
0 0,67905 -0,07877 0 0,054044 -0,2523 -0,03302 0,1801 0,49199 -0,30105 -0,10272 0,44547 0,034647 -0,39907 0,23901 -0,15308
oHCAb21 oHCAb4 SAf21
SAf4
SAb21
SAb4
0,77669 0,86249 0,005754 0,5891 0,85577 0,20338 0,17861 0,34092 0,10596 0,013626 0,028917 0,41932 0 0,68959 0,028693 0,42447 0,43245 0,10391 -0,07605 0 0,64185 0,071648 0,57562 0,097665 0,39959 -0,08851 0 0,59839 0,14009 0,75537 -0,15141 0,33356 -0,10018 0 0,49518 0,41791 -0,14885 -0,10644 -0,27584 -0,12951 0 0,064994 0,30275 0,30808 0,059355 -0,15354 0,34121 0
5.2.5. Poliaminok (PA) Az poliaminok koncentrációjának változásait a 19. ábrán láthatjuk. Az agmatin szintje a genotípusok közötti különbségeket tekintve 21°C-on a GLOáz, 4 °C-on az eds5 tért el a Col0-tól. A hideg hatására csak a sid2 -ban emelkedett meg szignifikánsan ennek a poliaminnak a szintje. A putreszcin szintjében az egyes genotípusok között jelentősebb eltéréseket nem tapasztaltunk. Csak az eds5 putreszcin szintje volt magasabb a Col-0-énál. A hidegedzés hatására azonban nagyobb mértékű változások következtek be. Mindegyik genotípusban szignifikánsan megemelkedett a putreszcin mennyisége. A spermidin mennyiségi változásai az agmatinhoz hasonlóan kevéssé voltak eltérőek. A két kezelési hőmérsékleten egyik mutáns vagy transzgenikus fajta spermidin mennyisége sem tért el a vad genotípusétól. A spermin a másik olyan PA, melynek a szintjében a hideg jelentősebb változásokat okozott. Az egyes genotípusok közötti különbségeket összehasonlítva sem a kontroll, sem az edzési hőmérsékleten nem volt jelentős különbség. A hidegedzés hatására a putreszcinhez hasonlóan itt is jelentős változásokat tapasztaltunk, bár az előzőhöz képest ellentétes tendenciával. Szignifikáns csökkenés történt a Col-0, a vtc2-1, a sid2 és a NahG esetén, valamint kevésbé kifejezett módon az eds5 és a GLOáz spermin szintjében is.
71
19. ábra Az agmatin, a putreszcin, a spermidin és a spermin szintjének genotípusok közötti különbségei
és
mennyiségi
változásai
a
hidegedzés
hatására.
A
feltűntetett
szignifikanciaszintek az edzési és a kontroll hőmérsékleten mért értékek egymástól való különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p≤0,05; ** : p≤0,01; *** : p≤0,001). A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). 5.2.6. Az etilénszintézis előanyagának vizsgálata (ACC és MACC) Vizsgálataink során mértük a növények ACC, illetve inaktivációs termékének, az MACC (malonil-ACC) tartalmát. Az eredmények a X. táblázatban láthatók. A táblázat adataiból látható, hogy kontroll hőmérsékleten sem az ACC, sem az MACC szintjében nem volt szignifikáns eltérés a genotípusok között, bár a GLOáz, illetve vtc2-1 ACC szintje 21 °C-on a többihez képest kissé magasabbnak bizonyult. 21 °C-on valamivel magasabbak voltak a másik transzgenikus vonal, a SA-t bontó NahG ezen értékei is.
72
X. táblázat Az ACC és MACC értékek a kontroll (21°C) és az edzési (4°C) hőmérsékleten. A feltüntetett szignifikanciaszintek a két hőmérsékleten mért értékek közötti különbséget jelentik adott genotípus esetén, * : p≤0,05 hibavalószínűség mellett. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD).
ACC (nmól/g friss tömeg)
MACC (nmól/g friss tömeg)
21°C
4°C
21°C
Col-0
0,5 ± 0,4
3,8 ± 5,1
8,4
± 7,6
6,4
± 4,0
vtc2-1
0,6 ± 0,4
2,5 ± 1,8
30
± 27
4,4
± 2,7
GLOáz 6,0 ± 8,4
4,9 ± 7,2
5,4
± 4,1
30,1 ± 41,2
eds5
0,8 ± 0,7
0,7 ± 0,6
11,9 ± 12,6
15,3 ± 10,7
sid2
0,7 ± 0,6
1,8 ± 1,2
18,5 ± 10,0
3,9
NahG
1,1 ± 1,0
1,6 ± 0,9
29,2 ± 47,7
7,01 ± 4,3
4°C
± 3,1 *
Az edzési hőmérsékleten a fenti értékek között szintén nem volt kimutatható fajtabeli különbség. A három SA-hoz kötődő genotípusban (eds5, sid2, NahG) kissé alacsonyabb, míg a GLOáz-ban magasabb volt az ACC szintje a Col-0-hoz képest. Az MACC a GLOáz és az eds5-ben volt a legmagasabb és a sid2-ben a legalacsonyabb 4°C-on a vad típussal összehasonlítva. A kontroll és a hidegedzésen mért ACC értékeket összehasonlítva szignifikáns eltérés szintén nem volt kimutatható. Kisebb mértékben, de a Col-0-ban és a vtc2-1-ben emelkedett, míg a GLOáz-ban csökkent az ACC mennyisége. Az MACC a hidegedzés hatására kismértékű csökkenést a Col-0-ban, a vtc2-1 -ben, a NahG-ben és emelkedett a GLOáz-ban. Egyedül a sid2 MACC szintjében volt szignifikáns a csökkenés (* : p≤0,05). 5.2.7. A hasonlóság vizsgálat eredménye A hidegedzés és fagyasztási tesztek során kapott adatok alapján előzetesen megvizsgáltuk az egyes genotípusok egymáshoz viszonyított hasonlóságát a kontroll és az edzési hőmérsékleten. Ehhez 21 metrikus változó adatait használtuk fel. A főkomponens analízisből kapott szórásdiagram az 20. ábrán látható.
73
20. ábra Az eltérő fagytűréssel rendelkező Arabidopsis mutánsok és transzgenikus vonalak egymáshoz viszonyított hasonlósága. Az ábrán feltüntetett két tengely azt a két hipotetikus változót jelenti, amely a legnagyobb különbséget okozza a növények hidegtűrési stratégiája között. A genotípusok neve után: K= kontroll hőmérséklet (21°C); C= edzési hőmérséklet (4°C). A 21 komponensből kettő bizonyult szignifikánsnak. Kontroll hőmérsékleten az aszkorbáthiányos mutáns, a vtc2-1, a Col-0 és a NahG bizonyult a legeltérőbbnek a többi genotípustól. A mért élettani jellegek változásai alapján egymáshoz hasonló volt az eds5, a sid2 és a GLO-áz. A hidegedzés hatására a genotípusok egymástól eltérőbbnek bizonyultak, mint a kontroll hőmérsékleten. Csökkent a SA-hiányos mutánsok egymáshoz viszonyított hasonlósága is. A legnagyobb különbséget okozó hipotetikus változók a putreszcin, a spermin, a szabad oHCA, valamint a glutation-reduktáz és az aszkorbát-peroxidáz aktivitásváltozásai voltak. A PCA alapján azt az eredményt kaptuk, hogy a hidegedzés hatással volt a vizsgált élettani paraméterekre, melyek változásai a vizsgált Arabidopsis genotípusok egymástól való elkülönülését okozták a hidegstressz ellen adott válasz során.
74
5.3. A hidegedzés hatása az Arabidopsis thaliana noa1 (Atnoa1) mutánsok esetén A mutánst eredetileg az aszkorbát és SA hiányos mutánsok és transzgenikus vonalakkal együtt, hasonló kísérleti rendszerben szerettük volna vizsgálni, de a nagyon eltérő viselkedése miatt külön fejezetben tárgyaljuk. Az eredetileg nos-ként leírt mutánsokat a NOS alulműködésének tulajdonították. Az utóbbi néhány évben kiderült, hogy a mutáció valójában egy mitokondriális cGTPázzal kapcsolatos. Az noa1 (Atnoa1) mutáció molekuláris háttere, a mutánsok stresszellenes viselkedése azonban kevéssé ismert. Vizsgálataink során az előzőekhez hasonlóan a hidegedzés szerepét igyekeztünk megismerni megfelelő fagytűrés kialakulásában. A növénynevelés paraméterei a 4.1.2. fejezetben olvashatók. 5.3.1. A fagyasztási teszt és a membránkárosodás mértéke Vizsgáltuk a membránkárosodás mértékét a fagyasztott levelek ionkiáramlása utáni vezetőképesség mérésével. Az egyes kezelési hőmérsékleteken egyik genotípus esetén sem találtunk szignifikáns különbséget. A hidegedzés hatására azonban szignifikáns eltérések voltak a membránkárosodás mértékében (21. ábra). Edzetlen Edzett
Membránkárosodás (%)
70.0 60.0 50.0 40.0 30.0
***
20.0
**
10.0 0.0 -10.0
Col-0
Atnoa1
21. ábra A fagyasztás okozta sejtmembrán-károsodás különbségei hidegedzett és edzetlen növények ionkiáramlás mérése alapján. A hidegedzés 5°C-on 5 napig, a fagyasztás -9°C-on történt. A szignifikancia szintek az edzett és az edzetlen növények közötti különbséget jelentik genotípusonként ** : p≤0,01; *** :p≤0,001 hibavalószínűség mellett. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD).
75
Az edzetlen (21 °C-os) növények jóval érzékenyebbek voltak a fagyra, a sejthártya jobban károsodott, ami az ionegyensúly felbomlásához vezet. A levéldarabokat tartalmazó oldat ionkoncentrációja nőtt, ezáltal az elektromos vezetőképessége emelkedett. Az edzett növényekben (5 °C) ez az érték alacsonyabb volt, amely kisebb károsodásra utal. 5.3.2. A fotoszintetikus apparátus 5.3.2.1. A klorofilltartalom változása Mivel az Atnoa1 egy kisebb, törpenövésű, lassabb gyökér- és hajtásnövekedéssel rendelkező mutáns, az azonos fejlettségi állapot elérése végett a vizsgálatokhoz egy héttel hamarabb lett ültetve, mint az összehasonlítások alapját képező vad genotípus, a Col-0. Az Atnoa1 egy kissé kevesebb klorofillt tartalmazott, mint a Col-0 (22. ábra). Ez jól kifejeződik a sárgás levelek, mint a mutáció egyik fenotípusos bélyege alapján is. 5.3.2.2. Fluoreszcencia indukciós paraméterek Az Atnoa1 mutánsok fotoszintetikus apparátusának vizsgálatára kontroll hőmérsékleten (21 °C) nevelt növényeken klorofill-a fluoreszcencia indukciós vizsgálatot végeztünk. Az Fv/Fm paraméter szignifikánsan alacsonyabb volt az Atnoa1 növények esetén, mint a vad genotípusban. Az Fv/Fm paraméterhez hasonlóan, a PSII aktuális kvantumhatásfokát megadó paraméter (dF/Fm’) is alacsonyabb volt az Atnoa1-ben, mint a Col-0-ban (23. ábra).
76
35
*
30
SPAD érték
25 20 15 10 5 0 Col-0
Atnoa1
22. ábra A Col-0 és az Atnoa1 klorofilltartalmának összehasonlítása kontroll hőmérsékleten * : p≤0,05 hibavalószínűség mellett. A mérések a nevelési periódus utolsó napján történtek (n=20, SD). Col-0 1 0.9
***
Atnoa1 AtNOA1
**
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 ∆F/Fm’
Fv/Fm
23. ábra Az Arabidopsis thaliana Col-0 és Atnoa1 mutáns kvantumhatékonysága 21°C-on. A ** és *** a vad genotípustól való eltérés szignifikancia szintjét jelenti p≤0,01 és p≤0,001 hibavalószínűség mellett. A mérések a nevelési periódus utolsó napján történtek (n=5, SD).
77
5.3.3. Antioxidáns enzimek Vizsgálataink során négy antioxidáns enzim aktivitását mértük kontroll (21°C) és edzési hőmérsékleten (4°C). Az aszkorbát-glutation ciklus egyik kulcsenzime a glutation-reduktáz (GR). Az enzim aktivitását megmérve kontroll hőmérsékleten nem találtunk enzimaktivitásbeli eltérést a vad és a mutáns között. Edzési hőmérsékleten azonban szignifikánsan magasabb (p≤0,05) volt a mutáns aktivitása, mint a Col-0 esetén (24. ábra).
GR
1200
4°C
***
1000 nkat / g FW
20°C
800 600 400 200 0
Col-0
Atnoa1
24. ábra A glutation reduktáz (GR) aktivitás különbsége a Col-0 és az Atnoa1 növényekben. A szignifikancia szintjét ***-gal jelöltük p≤0,001 hibavalószínűség mellett. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD).
Az aszkorbát-peroxidáz (APX) az aszkorbát-glutation ciklus másik, fontos enzime. A genotípusok között aktivitásbeli különbséget egyik hőmérsékleten sem tapasztaltunk. A hideg hatására mindkét fajta esetén lecsökkent az aktivitás, ez azonban csak a Col-0-ban volt szignifikáns (25. ábra).
78
APX 160
20°C
4°C
***
140
nkat / g FW
120 100 80 60 40 20 0
Col-0
Atnoa1
25. ábra Az aszkorbát peroxidáz (APX) aktivitás különbsége a Col-0 és az Atnoa1 növényekben. A szignifikancia szintjét ***-gal jelöltük p≤0,001 hibavalószínűség mellett. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). Méréseink alapján a kataláz aktivitásában nem találtunk szignifikáns eltérést sem a genotípusok azonos hőmérsékleten való, sem pedig adott genotípus különböző hőmérsékleten mért aktivitásában (26. ábra).
20°C
CAT
4°C
nkat / g FW
15 10 5 0
Col-0
Atnoa1
26. ábra A kataláz (CAT) aktivitás különbsége a Col-0 és az Atnoa1 növényekben. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD).
Mértük a gvajakol-peroxidázok (GPX) együttes aktivitását. Jelentősebb aktivitásbeli különbségeket ennél az enzimnél nem tudtunk kimutatni (27. ábra).
79
GPX
20°C
4°C
60 50
nkat / g FW
40 30 20 10 0
Col-0
-10
Atnoa1
27. ábra A gvajakol-peroxidáz (GPX) aktivitás különbsége a Col-0 és az Atnoa1 növényekben. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). 5.3.4. Szalicilsav Vizsgálatunk során összehasonlítottuk a szabad és a kötött SA szintjét a kontroll (21 °C) és az edzési (4 °C) hőmérsékleten nevelt Col-0 és Atnoa1 növényekben. A hidegedzés csak a Col-0 esetén okozott szignifikáns (p≤0,001) emelkedést a kötött forma szintjében. A mutánsokban magasabb volt a szabad és a kötött SA, amely a kontroll és a hidegedzett növényekben is szignifikáns volt (28. A, 28. B ábra). 350
7000
**
250 200
**
150 100
4000 3000 2000 1000
0
0
Atnoa1 21°C
Col-0
Atnoa1
**
5000
50
Col-0
*
6000 K ötött SA (ng/g FW)
Szabad SA (ng/g FW)
300
Col-0
4°C
Atnoa1 21°C
Col-0
Atnoa1 4°C
28. ábra A szabad (A) és kötött (B) szalicilsav (SA) szintjének eltérései a Col-0 és az Atnoa1 mutánsban a két kezelési hőmérsékleten. Az ábrán feltüntetett szignifikanciaszintek a két genotípus közötti különbséget jelentik adott hőmérsékleten **: p≤0,01 és *: p≤0,05 hibavalószínűség. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD).
80
5.3.5. Poliaminok A poliaminok mérésének eredményei a XI. táblázatban láthatók. Az agmatin szintjében a vad és a mutáns genotípus között nem volt szignifikáns eltérés sem a kontroll, sem az edzési hőmérsékleten. Hidegedzés hatására kismértékű, de nem szignifikáns csökkenés látszódott mindkét esetben. XI. táblázat Az agmatin (Agm), a pureszcin (Put), a spermidin (Spd) és a spermin (Spn) szintjének különbségei a vad (Col-0) és a mutáns (Atnoa1) genotípus között a két kezelési hőmérsékleten. Az ábrán feltüntetett szignifikanciaszintek a két hőmérsékleten mért értékek közötti különbséget jelentik adott genotípus esetén ***: p≤0,001 hibavalószínűség mellett. A mintavétel a két hőmérsékleti periódus utolsó napján történt (n=5, SD). Poliaminok (nmól / g friss tömeg) Agm Col-0
Put
Spd
21°C 21,3 ± 13,7 15,8 ± 9,6 4°C
146,8 ± 82,2 26,2 ± 15,0
22,3 ± 10,2 77,1 ± 27,8 *** 183,5 ± 29,8 14,9 ± 3,6 ***
Atnoa1 21°C 17,5 ± 3,5 22,2 ± 3,6 4°C
Spn
206,6 ± 1,6
40,0 ± 2,7
20,1 ± 7,0 109,6 ± 17,2 *** 213,2 ± 14,7 20,6 ± 5,8 ***
A putreszcin szintjében sem a kontroll sem az edzési hőmérsékleten nem volt eltérés a két genotípus között. A hidegedzés azonban mindkét fajtában szignifikáns emelkedést okozott. A spermidin szignifikáns eltérést mutatott a két fajta között mindkét hőmérsékleten. A Col-0-hoz viszonyítva az Atnoa1-ben magasabb volt a spermidin mennyisége 21 °C-on (***: p≤,001) és 4°C-on (*: p≤0,05). A hidegedzés hatására szignifikáns eltérést egyik genotípus esetén sem tapasztaltunk. A spermin a másik PA, melynek a putreszcin mellett jelentősen megváltozott – szignifikánsan lecsökkent – a mennyisége a hideg hatására mindkét genotípus esetén. Fajták közötti eltérés csak a kontroll hőmérsékleten volt, ahol az Atnoa1-ben szignifikánsan magasabb volt a spermin szintje (**: p≤0,01).
81
5.4. Az árnyékkerülés (Shade Avoidance Syndrome, SAS) és hőmérséklet: az alacsony hőmérséklet hatása a SAS-ra Nemcsak a fényintenzitásnak, hanem a fényminőségnek is fontos szerepe van a növények megfelelő fejlődése szempontjából. A SAS polimorfizmust mutató jelleg, amely a megfelelő fagytűrés kialakulásához hasonlóan hőmérsékletfüggést mutat. Tartós árnyék hatására az Arabidopsis Ler ökotípus 16°C-on nem mutatja a SAS1 jellegeket, csak 22°C-on. A Cvi azonban 22°C és 16°C-on is megnyúlt petiólumhosszal válaszol, amely a hatékonyabb fényfelfogásért alakult ki. A Cvi introgressziója a Ler genomban a SAS1 komplementációját okozza, vagyis az eredetileg csak a Cvi-ban megfigyelhető jelleg a Ler-ben is megjelenik. Vizsgálataink
során
QTL
térképezéssel
az
árnyékelkerülés
természetes
genetikai
változatosságáért felelős gén(eke)t kerestük. A növénynevelés és a kezelések leírása a 4.1.3. fejezetben olvasható. 5.4.1. A SAS1 QTL térképezése Előzetes vizsgálatok alapján ismert, hogy a SAS1 QTL a 2. kromoszómán helyezkedik el. A QTL analízis kapcsán SAS1-ért felelős géneket és ezek lókuszait kerestük. Arabidopsis természetes változatok közel azonos genetikai állományú vonalait (Near Isogenic Lines) Ler(Cvi) NIL2-8-kat használtuk, mint térképezési populációt. A Cvi introgressziót három molekuláris marker használatával térképeztük, amely a kromoszóma azon szakaszát fedték le, melyen a Cvi introgresszió megtalálható volt. A 157 F2 vonalból 96-ot sikerült genotipizálni mindhárom markerrel. Olyan genotípusokat kerestünk, melyekben a három markerből kettő heterozigóta genotípust mutatott. 7 olyan heterozigóta vonalat kaptunk, melyeknek megegyező volt a genotípusa a vizsgálatok alapján. Ezekből neveltük az F3 generációt. 5.4.2. Bulk szegregációs analízis Az F2 generáció térképezése után hét heterozigóta (introgressziós) vonalat választottunk ki, amelyekből az F3 generációt neveltük. A két vonal kevés magot hozott, valamint gombásodás miatt a növényeket korábban át kellett ültetni a talajra, mint ahogyan azt terveztük. Ennek ellenére az F3-ban a túlélés közel 100%-os volt. A genotípusok nem voltak olyan tisztán elkülöníthetőek, mint az F2-ben való térképezéskor, mert a mintavétel sajátosságaiból adódóan a DNS extraktum egy keverék volt. 82
A növények kis mérete miatt (szikleveles állapot) egy mintához 10 csíranövényből random módon gyűjtöttünk levélmintákat. Az F3 csíranövényeinek genotípusai között kis különbségek lehetnek az F2 gametogenezisekor bekövetkezett szegregációs események miatt. Emiatt a gélen foltintenzitásbeli eltérések voltak megfigyelhetők az In/Del markerek produktumai esetén. Ezek a foltintenzitás eltérések a Ler vagy a Cvi allélek DNS extraktumban való relatív mennyiségeivel korreláltathatók. A vonalak genotípusának végleges megállapítására három ismétlés volt. A hét F3 vonal genotipizálása négy esetben megerősítette, míg három vonal esetén nem az F2 térképezésének eredményét. Ennek megfelelően négy vonalat választottunk ki a SAS1 okozta morfogenetikai fenotípusos változások kísérletes ellenőrzéséhez. A 18, 36, 37 és a 40-es (a számok technikai kódok) vonalakban a SAS1 QTL térképezhető volt, amely után azt az eredményt kaptuk, hogy a QTL a 11,2 MB régióban helyezkedik el a 2. kromoszómán (29. ábra). Ebben a régióban az Erecta (ER), illetve az Erecta-szerű gének (ERL1, ERL2) találhatók, melyek általános, szerteágazó szerepet töltenek be a fotomorfogenetikus folyamatokban.
29. ábra A SAS1 QTL térképezése. Az ábra jobb oldalán az a négy Ler(Cvi) NIL2-8 van feltűntetve, melyeket sikerült genotipizálni mindhárom markerrel az F2 és az F3 generációban is. A QTL pozíciója a Cvi introgresszión belül a 11,2 MB-os régióra tehető.
83
5.4.3. SAS1 jellegek fenotípusos vizsgálata Az F3 populáció genotipizálása és a heterozigóta egyedek szelektálása után felneveltük az F3 generációt a 18, 36, 37 és 40-es számú NIL 2-8 vonalból. Alacsony hőmérsékleten (16°C) és alacsony R/FR megvilágítás alatt neveltük a növényeket a SAS1 fenotípusos jellegeinek megfigyelésére.
30. ábra Az F3 generáció Ler(Cvi) NIL2-8 négy vonala, amelyben a SAS1 kezdeti morfogenetikai jellegei láthatóak voltak. A kép 11 nappal az alacsony R/FR megvilágítás kezdete után készült. A hőmérséklet 16 °C volt. A képen a megnyúló petiólumok, mint a SAS1 elsődleges jellegei figyelhetők meg (a 18 vonal esetén ez a jelenség kevésbé volt megfigyelhető). A SAS polimorfizmusa hőmérsékletfüggést mutat. Korábbi megfigyelések szerint 20°C feletti hőmérsékleten a növények fokozott magasságnövekedéssel, megnyúlt levél-, illetve petiólumhosszal reagálnak az alacsony R/FR megvilágításra (SAS1). Egy héttel az alacsony R/FR megvilágítás kezdete után 16 °C-on még nem volt megfigyelhető a SAS1 (megnyúlt petiólum,
fokozottabb
hosszanti
növekedés).
A
kezdeti
különbségek
a
petiólumhosszabbodásában voltak megfigyelhetők a 10. naptól. A 25 és a 90-es vonal kettős rekombináns Ler genotípusnak bizonyult. A legkifejezettebben a 36, a 37 és a 40-es vonalakban voltak megfigyelhetők a fotomorfogenetikus változások. A 18-as vonal esetén a SAS1 jegyei kevéssé voltak kifejezettek (30. ábra).
84
Az F2 és F3 genotipizálásának és az élettani vizsgálatok megfigyelésének eredményei jól korreláltak (XII. táblázat). XII. táblázat A SAS1 QTL térképezés és a fenotípus vizsgálat eredményének összehasonlítása a Ler(Cvi) NIL2-8 F2 és F3 generációban. A QTL pozíciója a Cvi introgresszión belül a 11,2 MB-os régióra tehető (Het: heterozigóta, ?: ismeretlen genotípus). Ler(Cvi) NIL 2-8 Markerek (Mb) F2
36
18
37
40
12.65 Het
Ler
Ler
Ler
11.61 Het
Het
Het
Het
11.16 Ler
Het
Het
?
F3 18
36
37
40
12.65 Het
Ler
Ler
Ler
11.61 Het
Het
Het
Het
11.16 Ler
Het
Het
Het
Kifejezett
Kifejezett
Kifejezett
Hipokotil megnyúlás
Gyenge
85
6. Az eredmények megvitatása 6.1. A fény hatása a búza hidegedzése alatt 6.1.1. A hideg indukálta génexpresszió változásai A fénynek jelentős szerepe van a hideg-indukálta fagytűrés kialakulásában az évelő és a kétnyári fajok esetén (Lewitt és mtsai. 1980), így a gabonafélékben is (Gray és mtsai. 1997, Apostol és mtsai. 2006, Janda és mtsai. 2007, Szalai és mtsai. 2009). Arabidopsis-ban megfigyelték, hogy a hideg és a fény hatása különálló faktorként mutatkozott meg, mert több különböző hőmérsékleten is kialakult a faggyal szembeni tolerancia 12 órás vagy hosszabb idejű megvilágítás alatt (Wanner és Juntilla 1999). Arabidopsis Col-0 ökotípus és az ice (a fagytolerancia kialakulásához szükséges transzkripciós faktor hiányos) mutáns transzkripciós profiljának összehasonlításával megállapították, hogy sok hidegfüggő gén aktivitása már a hideghatás előtt is eltérő volt (Lee és mtsai. 2005). A fagytűrés kialakulásához szükséges gének feltárására két búzafajta – egy őszi: az Mv Emese, illetve egy tavaszi: Nadro – esetén vizsgáltuk az teljes génexpressziós mintázat változását alacsony hőmérsékleti edzés (5 °C) során két eltérő erősségű megvilágítás mellett (normál fényintenzitás, NL, PPFD=250 µmol m-2 s-1; alacsony fényintenzitás, LL, PPFD=20 µmol m-2 s-1). A micorarray vizsgálatból kapott adatok feldolgozása során négy összhasonlítást végeztünk: Mv Emese NL vs Nadro NL, Mv Emese LL vs Nadro LL, Mv Emese NL vs Mv Emese LL, Nadro NL vs Nadro LL. Az aktivitásváltozás adatok elsődleges redukálása és a stresszanyagcserében szerepet vagy feltételezett szerepet betöltő gének keresésével közelebb kerülhetünk a hidegstressz alatti szignalizáció és a metabolikus működések megértéséhez. Lee és mtsai. (2005) Arabidopsisban 939 hidegindukált génexpresszió változását figyelték meg, melyből 655 aktivitásemelkedést, 284 pedig aktivitáscsökkenést mutatott. Mv Emesében 97 míg Nadroban 106 gén aktivitásemelkedését mutattuk ki, aktivitáscsökkenést Emesében 387 míg Nadroban 243 gén esetében tapasztaltunk. A magas FC (fold change) értékű, szignifikáns aktivitásváltozást mutató gének egy része a fotoszintetikus apparátushoz vagy a növényi sejt más részeihez kötődik, mások általános stresszproteinek (CBF transzkripciós faktorok, LEA proteinek, dehydrinek, alacsony hőmérséklet indukálta proteinek), a membránok szintézisében és integritásában szerepet játszó enzimek (foszfoetanolamin N-metiltranszferáz). A LEA proteinek a magasabbrendű növényekben főleg a szárazságstressz okozta dehidratáció ellen nyújtanak védelmet (Amara és mtsai. 2012, 86
Hong-Bo és mtsai. 2005). Vizsgálatunkban kimutattuk a LEA proteinek fokozott expresszióját, amely a hidegstressz indukálta fagytűrésre való felkészülés egyik része lehet. Más gének aktivitásváltozása a hidegstressz elleni védekezésben szerepet játszó egyes hormonok
(ABA,
etilén) szintézisének
enzimjeit
kódolják
(aldehid
oxidáz-2,
1-
aminociklopropán-1-karboxilát oxidáz). Arabidopsis-ban Lee és mtsai. (2005) szintén több, növényi növekedésszabályzó vegyület szintéziséért felelős gén expresszióját figyelték meg a hideg hatására (auxinok, giberellinsav, ABA). Egyes
ozmotikumok
szintézisében
szerepet
játszó
enzimek
(fruktán
1-
fruktoziltranszferáz), valamint közvetlenül vagy közvetve a fotoszintézisre ható vegyületek génjeinek (feoforbid-a oxigenáz, klorofill kötő proteinek, citokróm P450) aktivitásváltozása ugyancsak kimutatható volt. A visszafordíthatatlan fagykárosodást többek között a membránok szétesése, ez által a klorofill-protein komplexek károsodása és a fotoszintézis aktivitásának csökkenése okozza, melyek megakadályozásában fontos az ozmotikumok szerepe, egyes cukroké, illetve a proliné (Wanner és Juntilla 1999). A fruktánokról szintén bebizonyították, hogy az áttelelő növényekben, mint a búzában is, fontos szerepük van a stressz elleni védekezésben (Kawakami és Yoshida 2005). Vizsgálatunkban több olyan gént is kimutattunk,
melyek
terméke
a
membránok
stabilizálásában
és
a
membránlipid
anyagcserében, illetve ozmotikumok szintézisében (foszfoetanolamin N-metiltranszferáz, fruktán 1-fruktoziltranszferáz) vesz részt. A feoforbid a oxigenáz aktivitás valószínűleg a fotoszintetikus apparátus károsodása okozta klorofillszint megváltozásának hatására mutatott magasabb értéket (Chung és mtsai. 2006). A citokóm P450 tartalmú enzimeknek fontos szerepük van a lipid, a fenolos vegyületek, a terpenoid vagy az alkaloidák metabolizmusában (Schuler 1996). A citokróm P450 gén hideg hatására történő aktivitásváltozását Arabidopsisban Bilodeau és mtsai. (2002) szintén leírták. A foszfoetanolamin N-metiltranszferáz a glicinbetain (betain) szintézisének egyik kulcsenzime. A betain szintézisének kulcsenzimei a kolin-monooxigenáz, a foszfoetanolamin N-metiltranszferáz, melyhez az S-adenozil-L-metionin szolgáltatja a metilcsoportot. A foszfoetanolamin N-metiltranszferáz mellett az S-adenozil-L-metionin szintjét szabályozó egyik enzim, a 3-demetilubikinon-9 3-metiltranszferáz génjének aktivitásváltozását is sikerült kimutatnunk. Vizsgálataink, illetve mások eredményei alapján (Mato és mtsai. 1997) úgy tűnik, hogy az S-adenozil-L-metionin szintje, amely többek között a betainszintézishez is szükséges, az Sadenozil-L-metionin szintáz, a foszfoetanolamin N-metiltranszferáz, illetve a kolinmonooxigenáz által szabályozott. A betainnak a szárazságstressz elleni védekezésben való 87
szerepét leírták kukoricában és cirokban (Agboma és mtsai. 1997), illetve gyapotban (Gorham és Jokinen 1998). Egy sótűrő laboda fajban (Atriplex nummularia) kimutatták, hogy a betainnek jelentős szerepe van az ozmotikus stressz károsító hatásai ellen (Tabuchi és mtsai. 2005). Búzában is megfigyelték betain, valamint a glutamin, prolin, 4-aminovajsav, illetve más aminosavak akkumulációját 4 °C-os hidegakklimáció hatására (Naidu és mtsai. 1991). A kezelések között csak két gén mutatott átfedést. Az egyik az ACC-oxidáz, mely az etilén bioszintézisében játszik kulcsszerepet. Rozsban 5 °C-os hidegkezelés hatására megemelkedett etilénszintet, valamint antifreeze protein expressziót mutattak ki (Yu és mtsai. 2001). Az alma termésében 4 °C-os hidegkezelés hatására Leliévre és mtsai. (1995) megemelkedett ACC-oxidáz aktivitást találtak. A másik a GST enzim génje. Fagyérzékeny növényekben bebizonyították, hogy a GST-nek fontos szerepe van a fagytűrés kialakulásában. Burgonyában Seppänen és mtsai. (2000) alacsony hőmérséklet és magas fényintenzitás mellett a GST transzgén megemelkedett expresszióját mutatták ki. GST transzgént hordozó Arabidopsis esetén Huang és mtsai. (2009) a hideg hatására magas GST aktivitást, valamint prolin és klorofillszintet tapasztaltak. Transzgenikus rizsnövényekben szintén kimutatták GST hidegtűrésfokozó hatását (Takesawa és mtsai. 2002). Ezen tényezők mindegyike a fagytűrés megemelkedéséhez vezet. Az Mv Emesében LL hatására megemelkedett a foszfoetanolamin metiltranszferáz gén aktivitása és többek között lecsökkent a ferredoxin-NADP(H) oxidoreduktáz, aldehid oxidáz2 és az ATPáz subunit 8 génjeinek aktivitása. A Nadroban emelkedett aktivitást mutatott a low-temperature-induced protein és a germin-like protein 2a génje, míg csökkent a kloroplasztisz pigmentkötő fehérje CP24, a korai fény indukálta fehérje és a fruktán:fruktán 1fruktoziltranszferáz génjének az aktivitása. A tavaszi fajtában a fruktán:fruktán 1fruktoziltranszferáz
aktivitásának
csökkenése
valószínűleg
az
ozmotikumképződés
csökkenését is jelentheti. A fény közvetlen szerepe a fagytűrés kialakulása során valószínűleg a fotoszintézis intenzitásának növelésében van, amely befolyással van az ozmotikumok képződéséhez szükséges CO2 megkötésére, és ezáltal a szénhidrátok szintézisére (Wanner és Juntilla 1999). Azok a gének, melyek NL és LL függőek voltak az Mv Emesében, a Nadroban is hasonló expressziós mintázattal rendelkeztek LL esetén. Ilyen volt a 3-dimetilubikinon-9,3metiltranszferáz és az aldehid-oxidáz-2 génje, melyek aktivitása csökkenést mutatott. A 3dimetilubikinon-9,3-metiltranszferáz az S-adenozil-L-metionin S-adenozin-L-homociszteinné alakulását katalizálja. Az S-adenozil-L-metionin anyagcseréje hatással van számos, transzmetilációt igénylő biokémiai reakcióra. Mindemellett két poliamin, a spermidin és a 88
spermin bioszintézis előanyaga (Roje és
mtsai. 2006). A 3-dimetilubikinon-9,3-
metiltranszferáz vizsgálataink során tapasztalt expresszióváltozása a poliamin-anyagcsere hideg általi befolyásoltságára utalhat. Az aldehid-oxidáz-2 gén aktivitás változása az ABA anyagcseréjének változásaira utal. Arabidopsisban négy aldehid oxidáz enzim van. Ezek szervspecifikus kifejeződésűek, az ABA szintézis utolsó lépését katalizálják. Az ABA fejlődésélettani szabályzó szerepe mellett a különböző stresszek elleni védekezésben is részt vesz (Xiong és Zhu 2003, Seo és mtsai. 2000). Több, a stressszhez kötődő gén (dehidrinek, CBF transzkripciós faktorok) aktivitása NL esetén magasabb volt az Mv Emesében, mint a Nadroban, amely ezen géntermékek magasabb szintjére utal az őszi fajtában. A dehidrinek szintén fontos, membránvédő szereppel rendelkeznek (Rorat 2006). A CBF génekről bebizonyosodott, hogy fontos a szerepük a hideg indukálta fagytűrés kialakításában (Zhou és mtsai. 2010, Thomashow 2001, Thomashow 1999). Winfield és mtsai. (2010) a chilling folyamata során többek között a CBF regulon génjeinek fokozott expresszióját mutatták ki. A CBF expresszió az edzési hőmérséklettől és a fénytől való függést mutat (Campoli és mtsai. 2009). Búzában végzett globális génexpressziós vizsgálataink alapján a hidegperiódus alatt a fényintenzitás fontos befolyásoló tényezőnek bizonyult. A szignifikáns expresszióváltozást mutató gének FC értékeinek varianciája alapján végzett főkomponens analízis (PCA) eredmény megmutatta, hogy a gének aktivitásváltozása elsősorban fényintenzitástól és az adott fajtától függ. A génexpressziós vizsgálat és a transzkriptum abundancia mérésének eredményei között pozitív korreláció volt kimutatható (Majláth és mtsai. 2012). 6.1.2. Ozmotikumok, antioxidánsok A prolin egy összetett hatású vegyület, melynek fontos szerepe van többek között a hideg káros hatásainak mentesítésében, egyrészről az ozmotikus és citoszólikus pH egyensúly fenntartásában, másfelől ROS-mentesítőként és chaperonként is működik. Fagypont alatti hőmérsékleten membránok stabilizációjában is szerepet játszik (Hare és mtsai. 1998, Yancey 2005). Őszi (Mv Emese) és tavaszi (Nadro) búzafajták hidegedzése után azt tapasztaltuk, hogy az edzés végére NL mellett a kontrollhoz képest szignifikánsan magasabbak voltak a prolin értékek. LL esetén egyik fajta esetén sem volt kimutatható változás. Konstantinova és mtsai. (2002) a prolinszintézis kulcsenzimét túltermelő transzgenikus dohány vonalakban kimutatták a prolin fagystressz elleni kiemelkedő szerepét. Vizsgálatunk eredményei megegyeznek 89
azokkal a megfigyelésekkel, melyek szerint sóstressz indukálta prolinszint emelkedés kifejezetebb volt a magasabb fényintenzitásokon, mint az alacsonyabb megvilágítási viszonyok mellett (Ábrahám és mtsai. 2003, Arora és Saradhi 2002, Fedina 2002). Arabidopsis Col-0 növényekben a prolin akkumulációja szintén a fényintenzitásfüggést mutatott. Koncentrációjának emelkedése a fagyhatás kezdete után egy nappal jelentkezett. A növényekben ekkorra már kialakult a fagytolerancia, ami arra utal, hogy prolin nem az elsődleges fagyhatások ellen, hanem inkább az alacsony hőmérséklet okozta, hosszabb távú szárazságstressz elleni védekezésben vesz részt (Wanner és Juntilla 1999). Eredményeink alapján az előzőhöz hasonló megállapítást tehetünk. A prolin szintje a hidegedzés 3. napján érte el a legmagasabb szintet, majd kissé lecsökkent, de mindvégig magasabb maradt, mint az edzés előtt, melynek a vizsgált búzafajtákban való jelentős szerepére utalhat a hideg okozta kedvezőtlen ozmotikus viszonyok elleni védelem terén. Az Mv Emesében és a Nadroban a hidegedzés alatt hasonló tendenciákat tapasztaltunk mindkét fajta és megvilágítás esetén az összes fenolos vegyület tartalom változásaiban. Nadro esetén mindkét fényintenzitás alatt, míg az Mv Emesében csak a NL esetén volt magasabb a fenolos vegyületek szintje a hidegedzés utolsó napjára. Kimutatták, hogy egyes polifenolok gátolják a lipidperoxidációt (Millic és mtsai. 1998), amely egyik, a hidegstressz hatására bekövetkező kedvezőtlen változás. Több növényfaj vizsgálatával kimutatták, hogy a magas polifenoltartalom erős korrelációt mutat a összantioxidáns kapacitással (Katalinic és mtsai. 2006). Vizsgálataink során nem találtunk egyértelmű kapcsolatot a fenolos vegyületek és a búza hidegakklimációja között. Az a megfigyelés, hogy az őszi fajtában csak a NL mellett volt szignifikánsan magasabb a fenolos vegyületek szintje valószínűleg azzal magyarázható, hogy a megfelelő fagytűrés kialakulásához a NL a legmegfelelőbb, amelyet gabonafélékben már számos tanulmányban leírtak (Gray és mtsai. 1997, Apostol és mtsai. 2006, Janda és mtsai. 2007, Szalai és mtsai. 2009). 6.2. Az alacsony hőmérséklet élettani hatásai Arabidopsis-ban 6.2.1. Fagytűrésbeli különbségek A búzában kapott eredmények mellett a hideg- és fagytűrés tanulmányozása Arabidopsis-ban is új eredményekkel szolgálhat. A hőmérsékleti jelátvitel molekuláris mechanizmusa meglehetősen kevéssé ismert. A mutáns és transzgenikus élőlények jó alapot 90
nyújtanak a hidegtűrési folyamatok jelátviteli mechanizmusának tanulmányozására. Számos olyan Arabidopsis természetes változat létezik, melyek a fagytűrésben egymástól eltérőek a CBF és COR gének expressziójának eltérései miatt (McKhann és mtsai. 2008). Arabidopsis hos10-1 (high expression of osmotically responsive genes) mutánsokat nyolc napig 4 °C-on akklimatizálták. A fagyasztás közben a 30 percenkénti 2 °C-os hőmérsékletcsökkenés bizonyult a legmegfelelőbbnek. Hét nappal a fagyasztás után a nem edzett egyedek -6 °C alatt elpusztultak. A hidegedzett egyedek némelyike -8 °C-on is túlélt, azonban -10 °C-on nem találtak túlélő egyedet (Zhu és mtsai. 2005). Vizsgálatunkban a -9 °C-os fagyasztás után 21 nappal mindegyik genotípus esetén hasonló volt a túlélők aránya. A legalacsonyabb számú a GLOáz esetén, míg a legmagasabb számú túlélő pedig a sid2 növényeknél volt. Újabb irodalmi adatok szerint a GLOáz transzgenikus növények AA szintje önmagában nem is jelentősen magasabb, mint a vad genotípusé. Az AA-hiányos mutánsokban (vtc) azonban a GLOáz transzgén expressziója az AA szint helyreállását okozta (Radzio és mtsai. 2003). Az AA mérésünk eredményei is ezt támasztották alá. Megjegyzendő azonban, hogy más fajokban (burgonya) a GLOáz transzgén az AA-szint 141%-os emelkedését okozta. A transzgenikus növények ellenállóképessége magasabb volt különböző abiotikus stresszekkel (metil-viologén, NaCl, mannitol) szemben (Hemavathi és mtsai. 2010). GDP-D-mannóz-foszforiláz transzformáns és kontroll paradicsom növényekben megnőtt az AA és a DHA szint, amely kapcsolatba hozható volt azok megemelkedett hidegtűrésével (Li és mtsai. 2011). A GLOáz vonalak fokozott pusztulása – hipotézis szintjén – kapcsolatban állhat a kontroll hőmérsékleten magas AA szint okozta ROS csökkenéssel, amely más, a fagy káros hatásai ellen védő folyamatok szignalizációjára befolyással lehet. -11°C-on csak a Col-0, a sid2 esetén voltak túlélő egyedek. A Col-0 egy fagytűrő ökotípus (Gilmour és mtsai. 1988, Thomashow 1994, 1999, Warren és mtsai. 1996, Knight és mtsai. 1999). Egy napig tartó 1 °C-os, 16 órás megvilágítás melletti hidegedzés után képes túlélni a -8 °C-on történő fagyasztást. Két vagy három napig tartó hidegedzés után a -12 °C túlélésére is képesek (Wanner és Juntilla 1999). Ez utóbbi megfigyelés összhangban van azokkal az eredményeinkkel, mely szerint négy napos hidegakklimáció után mind -9 °C-on, mind -11°C-on a vad, illetve az AA és a SA hiányos mutánsok között is voltak túlélő egyedek. Megfigyelésünk szerint a hidegakklimációhoz a négy napig tartó 4 °C-os körülmények is elegendők. A fagyasztási tesztekből kapott túlélési különbségek bizonyítják, hogy a különböző élettani jellegekre és stresszellenes jelátviteli utakra mutáns és transzgenikus Arabidopsis változatok fagytűrése meglehetősen eltérő. 91
6.2.2. A hideg hatása a fotoszintézis működésére: klorofillszint és kvantumhatékonyság A fagytűrésbeli eltérések hátterének feltárására a fotoszintézis működésének vizsgálata elsőrendű, mivel ez a folyamat a növény energiatermelésének alapja. A kloroplasztiszban PSI és PSII a legjelentősebb ROS-képzők. Ha töltésszétválasztás és az elektrontranszport nem működik rendesen, az ROS képződéshez vezet, melynek káros hatásairól számos tanulmány született (Gill és Tuteja 2010, Mittler és mtsai. 2004, Drążkiewicz és mtsai. 2003). A fotoszintézis hatékonyságát nagyban befolyásolhatja a klorofill molekulák mennyisége. A klorofill-a és b fontos fotoszintetikus pigmentek, melyek mennyisége stresszhatásra megváltozhat. Vizsgálatunkban a klorofilltartalom mérése után a GLOáz hasonló tendenciát mutatott, mint a Col-0 és a sid2. A -9°C-os fagyasztás után mért klorofillszint a kontroll értékekkel általában közel azonos volt. Ennek egyik lehetséges magyarázata a hidegedzés klorofillanyagcserére való adaptációs hatása lehet. Búzában hidegedzés utáni génexpressziós vizsgálattal
kimutatták a feoforbid-a oxigenáz aktivitás
változását (Majláth és mtsai. 2012), amely a klorofill degradáció egyik enzime (Chung és mtsai. 2006). A hidegedzés azonban a -11 °C-os fagyasztás hatásával szemben kevésbé bizonyult hatékonynak. A
csökkenő
hőmérséklettel
csökkenő
klorofilltartalom
volt
megfigyelhető,
különösképpen a vtc2-1 mutáns és a NahG transzgenikus fajta esetén. Ezeknél a fajtáknál a klorofilltartalom -9 °C-on is alacsonyabb volt, mint a kontroll, illetve az edzési hőmérsékleten. Ennek a két fajtának az esetében a hidegedzés hatékonysága alacsonyabb lehetett, mint a többi genotípus esetén. Az eds5 az összes többitől különbözött, ennél sem az edzési hőmérsékleten, sem pedig a -9°C-on nem volt csökkenés, csak -11°C-on. DemmigAdams (1990) hideg hatására a klorofill- és karotinoidtartalom jelentős megváltozását tapasztalta. A kartinoidoknak fotoprotektív szerepük van. Az Fv/Fm a fotoszintetikus apparátus működésének, de általában a növény általános állapotának jó indikátora lehet (Demmig-Adams és mtsai. 1992), melynek értéke „stresszmentes” állapotban (az egyed ökológia igényeihez közeli, optimális állapotban) 0,8 körüli (Krause és Weis 1991, Larcher 2003). Az egyes genotípusok Fv/Fm értékeit adott hőmérsékleten
összehasonlítva
0,8
körüli
meglehetősen
kismértékű
változásokat
tapasztaltunk, melyek arra utalnak, hogy a mutánsok és transzgenikus vonalak között azonos hőmérsékleten nincs jelentős különbség. A 4 °C-os hidegedzés hatására szignifikánsan alacsonyabb Fv/Fm értékeket mértünk. Négy nappal a -9 °C-os fagyasztás után a növények az edzési hőmérséklethez képest ismét 92
magasabb, kontroll közeli Fv/Fm értéket mutattak. A -11 °C-os növények Fv/Fm értékei voltak a legalacsonyabbak az összes többi kezelési hőmérsékleten mértekhez viszonyítva. Egy vizsgálatban eltérő földrajzi szélességekről származó, különböző fagytűrési hátterű Arabidopsis változatokat hasonlóan 4 °C-os hidegedzésnek, majd fagytesztnek vetettek alá. A hőmérséklet csökkenésével lecsökkent az Fv/Fm és az Fs értéke, melyek az F0-hoz hasonlóan összefüggést mutattak a hidegtűréssel (Mishra és mtsai. 2011). A -11 °C-on mért Fv/Fm értékeket a kontroll hőmérsékleti értékekkel összehasonlítva a csökkenés minden esetben szignifikáns volt, mely jól tükrözi a PSII károsodását ezen a hőmérsékleten. A GLOáz transzgenikus növények bizonyultak a legérzékenyebbnek a fagyhatással szemben, mivel ezen a hőmérsékleten minden egyed elpusztult, így az Fv/Fm sem volt mérhető. Az Fv/Fm-mel összehasonlítva a hideg hatására a ∆F/Fm’ azonban érzékenyebb paraméternek bizonyult, amely PSII klorofill komplexeinek aktuális (fényadaptált állapotban lévő) kvantumhatékonyságát jelzi. Ennél a hidegedzés hatására mindegyik genotípus esetén szignifikáns csökkenést tapasztaltunk. A kvantumhatékonysági paraméterek csökkenése – amely a ∆F/Fm’ esetén volt a legkifejezettebb – az alacsonyabb klorofillszinttel, illetve az emiatt mérhető alacsonyabb fluoreszcenciával is magyarázható. A kvatumhatékonyság csökkenésének azonban a klorofilltartalom csökkenésén kívül más okai is lehetnek. Az egyik lehetséges ok a klorofill-protein molekulakomplexek, a reakciócentrumok elrendeződésének megváltozása. A másik a hideg hatására lelassult elektrontranszport és az emiatt megnövekvő ROS koncentráció. Ha a levezető mechanizmusok nem megfelelően működnek (pl. LHCIIPSI kapcsolat (Amunts és mtsai. 2010), akkor a PSII fluoreszcencia hozama növekszik és a kvantumhatékonyság csökken. Az edzési hőmérséklet csökkenti a CO2 megkötését, ezáltal csökken az elektrontranszport ráta (Demmig-Adams és mtsai. 1992). A töltésszétválasztásból származó többlet energia miatt a fluoreszcencia intenzitás megemelkedése, illetve a PSII aktivitás csökkenése léphet fel (Hüner és mtsai. 1993). A megnövekedett gerjesztési nyomás kivédésére a gerjesztési energia levezető mechanizmusai mellett a növények a szénhidrátanyagcsere szabályozása révén is képesek válaszolni (Huner és mtsai. 1998). Az általunk kapott eredmények alapján hasonló megállapítást tehetünk, azzal a különbséggel, hogy ha nem közvetlenül a fagyasztás után, hanem néhány nap regenerációs idő elteltével mértük a kvantumhatékonyságot, akkor úgy tűnik, hogy egy bizonyos kritikus minimum hőmérsékletig a növény képes a regenerációra, melyet a fotoszintézis helyreállása jelez. Col-0 és Ler ökotípusok, illetve mutánsaik esk-1 (eskimo-1) és frs-1 (freezing sensitive1) vizsgálatával a fagytűrés, illetve az elkerülés közötti különbségeket tárták fel. Az Fv/Fm és a
93
klorofilltartalom változásai alapján fotoszintetikus apparátusban nem tapasztaltak jelentős károsodást (Reyes-Díaz és mtsai. 2006). A vizsgálatainkhoz felhasznált genotípusok fagytoleranciája alapján úgy tűnik, a kritikus hőmérséklet a -10 °C lehet. Hasonló vizsgálatban, de más változatok használatával a hidegedzett egyedek némelyike -8 °C-on is túlélt, azonban -10 °C-on nem találtak túlélő egyedet (Zhu és mtsai. 2005). 6.2.3. Az aszkorbáttartalom és az enzimatikus ROS-mentesítés Hideg hatására csökken az antioxidáns enzimek aktivitása, amely a mitokondriumban, illetve
a
kloroplasztiszban
elekronátmeneti
reakciókhoz
vezet,
a
kloroplasztikus
elektrontranszportlánc túlredukálttá válik, az elektronáramlás lelassul, amely a reaktív oxigén fajták fokozott (ROS) képződéshez és a sejtekben való felhalmozódásához vezet (Ruelland és mtsai. 2009). A ROS akkumulációnak többféle káros hatása van, melyek közül a membránok degradációja (lipidperoxidáció), a fehérjék és a DNS oxidációja a legfontosabb (Gill és Tuteja 2010). A ROS semlegesítésében az egyik legfontosabb folyamat az aszkorbát-glutation ciklus (AGC). A ciklus enzimreakciói révén az oxidált aszkorbát (AA) és a glutation forma visszanyeri a redukáló képességét a fotoszintézis vízbontásából származó protonokból illetve elektronokból (Noctor és Foyer 1998, Drążkiewicz és mtsai. 2003, Foyer és Noctor 2011). Az AA az AGC és a ROS semlegesítés fontos résztvevője (Müller-Moulé és mtsai. 2002). A redukált AA szintje kontroll és edzési hőmérsékleten a vtc2-1-ben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a Col-0-ban. Irodalmi adatok szerint a vtc2-1-ben a többihez képest jóval alacsonyabb az AA szintet mértek (a Col-hoz viszonyítva annak mintegy tized része) (Mukherjee és mtsai. 2010, Conklin és mtsai. 1996), amely a mért adatainkkal szintén hasonlóságot mutatott. A GLOáz transzgenikus vonal redukált AA tartalma sem a kontroll, sem az edzési hőmérsékleten nem bizonyult egyértelműen magasabbnak a vad genotípussal összehasonlítva. Saláta és dohány GLOáz transzgenikus növényekben hétszer magasabb AA szintet mutattak ki (Jain és Nessler 2000). Radzio és mtsai. (2003) vizsgálatai szerint az Arabidopsis Col-0 genotípus GLOáz transzgént hordozó vonalaiban az AA tartalom hasonló értéket mutatott, mint a transzgént nem hordozó genotípusban. Ugyanakkor a vtc mutánsokban a GLOáz transzgén a mutáció helyreállását okozta. Vizsgálatunkban a SA hiányos genotípusok AA szintje szignifikánsan nem tért el a Col-0-tól, kivéve az oxidált formát a sid2 esetében, amely kissé magasabb volt. Edzési hőmérsékleten magasabb volt az 94
eds5 totál és redukált AA szintje, mint a Col-0 esetén. Mukherjee és mtsai. (2010) vtc, eds5 és vtceds mutánsok Pseudomonas syringae fertőzése után szintén magasabb aszkorbát szintet mutattak ki. Wang és mtsai. (2011) SA hiányos Arabidopsis mutánsokban ugyancsak a magasabb AA szint hatásának tulajdonítják a vírusfertőzés elleni sikeres védekezést. A hidegedzés hatására a kontroll hőmérsékleten mértekhez képest szignifikánsan lecsökkent a Col-0 redukált, illetve a sid2 oxidált AA formája. A Col-0, illetve a vtc2-1 genotípusban kisebb mértékben, de szintén csökkent AA formák mennyisége. Az SA hiányos mutánsokban, illetve transzgenikus NahG vonalban kevéssé változott vagy kismértékű csökkenés figyelhető meg. Ezen eredmények alapján úgy tűnik, hogy a hideg kevéssé befolyásolja az AA tartalmat, amely más védekezési utak meglétét is feltételezheti. A ROS mentesítéshez elérhető redukált AA tartalmat az AGC nagyban befolyásolja. Búzafajták vizsgálatakor hidegedzés hatására kimutatták a GR, a MDHAR és az APX gének expressziójának emelkedését (Baek és Skinner 2003). A ciklus enzimei közül az egyik legfontosabb a glutation-reduktáz (GR). Vizsgálatainkban az aktivitása a hideg hatására mindegyik genotípus esetén szignifikánsan megemelkedett. Az aszkorbát-peroxidáz (APX) enzimaktivitás minden genotípus esetén magasabb volt, mint a hidegedzés előtt, azonban szignifikáns változás csak az eds5 és a sid2 esetén volt megfigyelhető. Ez a megfigyelés összefügghet Wang és mtsai. (2011) megfigyelésével, miszerint a SA hiányos Arabidopsis mutánsokban vírusfertőzés hatására megemelkedett AA szintet tapasztaltak, melynek a SA hiányával szemben szerepe lehet a sikeres védekezésben. Annak ellenére, hogy a SA hiányos mutánsokban a hideg nem okozott különösebb változást az AA szintjében, mégis feltételezhető, hogy ezekben a genotípusokban az AA-nak fontos szerepe lehet a védekezésben. Az APX és a GR aktivitásának megemelkedése biztosíthatja a hidrogén-peroxid bontását és szabályozhatja a redukált glutation mennyiségét (Molina és mtsai. 2002). APX3 transzgenikus Arabidopsis növények a több, más stressz mellett a hideggel szemben is ellenállóbbnak bizonyultak (Zhang és mtsai. 1997). Rizsben hideghatásra a levelekben megemelkedett APX, a gyökérben megemelkedett APX és GR aktivitást mutattak ki (Kuk és mtsai. 2003). Mások rizsben öt napig tartó 8 °C-os hidegedzés után magasabb AA szintet és APX aktivitást mértek, melyek a toleráns fajtákban a hideghatás után tovább megmaradtak, szemben az érzékeny fajtákkal (Guo és mtsai. 2006).
95
6.2.4. A szalicilsav és hidegstressz A szalicilsavról (SA) és rokon vegyületeiről újabban bebizonyosodott, hogy fontos szerepük van az abiotikus stressz folyamatok szignalizációjában. Alacsony koncentrációban átmeneti oxidatív stresszt okoznak a növényben, amely megnöveli az antioxidatív kapacitást, és ezáltal stresszvédő anyagok szintézisét indukálja. A magasabb SA koncentráció a hiperszenzitív reakcióhoz hasonló sejtelhaláshoz vezethet. A SA-as kezelés és a hideg akklimatizációs folyamatok közös tulajdonsága, hogy átmenetileg megemelik a hidrogénperoxid szintet (Okuda és mtsai. 1991, Chen és mtsai. 1993a, Luo és mtsai. 2001). Kísérletesen bebizonyították, hogy a tápoldathoz adagolt, alacsonyabb koncentrációjú (0,5 mM) SA-előkezelés hatására kukoricában kisebb mértékű volt a hidegkárosodás (Janda és mtsai. 1999). Vizsgálatunkban az edzési hőmérsékleten a mutánsokban jóval magasabb volt a szabad oHCA tartalom, mint a Col-0-ban, amely a mutánsokban végbemenő oHCA közvetítette védekezési folyamatok fokozottabb működésére is utalhat. A hidegedzés hatására a NahG kivételével minden esetben csökkent a szabad oHCA szintje, amely a szabad forma védekezésben való kisebb jelentőségére utalhat. A kötött oHCA forma vad genotípushoz viszonyított mennyiségi arányai, illetve az akklimáció hatására bekövetkező változások hideg elleni védekezésben való csökkent szerepére utalhatnak. Őszi búza hidegedzése során szintén oHCA felhalmozódást tapasztaltak (Janda és mtsai. 2007). Az oHCA valószínűsíthető, hogy nemcsak a SA előanyagaként funkcionál. Irodalmi adatok szerint más benzoesav származékokhoz hasonlóan képes védelmet nyújtani kukoricában a hideg ellen (Janda és mtsai. 2000, Horváth és mtsai. 2002), valamint kimutatták, hogy képes közömbösíteni a szinglet oxigént (Foley és mtsai. 1999), így valószínűleg a SA bioszintézistől függetlenül az antioxidáns válaszban is szerepe lehet. Az oHCA más, SA rokon vegyületekhez hasonlóan csökkenti a katalázaktivitást. A SA katalázgátló hatását először dohányban mutatták ki (Chen és mtsai. 1993a), majd számos más növény esetében (Arabidopsis, paradicsom, uborka) is igazolták. A kataláz aktivitás csökkenésének hatására átmenetileg megemelkedik a H2O2 mennyisége, amely képes más védekező rendszereket aktiválni (Janda és mtsai. 1999, Janda és mtsai. 2000, Horváth és mtsai. 2002). Méréseink alapján a hidegedzés hatására a vtc2-1-ben és a GLOáz-ban szignifikánsan csökkent, míg a NahG-ben emelkedett a szabad forma mennyisége. Az SA kötött formájának az SA hiányos genotípusokban alacsonyabb volt a vadhoz viszonyítva. Hidegedzés hatására a vtc2-1-ben és az eds5-ben szignifikáns csökkenést tapasztaltunk. 96
Az Arabidopsis Col-0 és NahG növények növekedése alacsony hőmérsékleten eltérést mutat. A két hónapos NahG növények mérete a vad növényekének két-háromszorosa is lehet. Scott és mtsai. (2004) méréseinkhez hasonlóan a SA szint emelkedését tapasztalták mindkét genotípusban a hideghatás alatt, melynek a növekedésbeli különbségekkel való kapcsolatát azonban nem tudták egyértelműen kimutatni. Őszi búzafajtákban hideg hatására a szabad SA mennyisége a levélben megnőtt, a kötött SA-szint nem változott meg jelentősen (Janda és mtsai. 2007). Chen és mtsai. (1993b) az SA növekedés hatására megemelkedett H2O2 szintet mértek a sejtekben. Kukoricában H2O2 adagolással bizonyos antioxidáns enzimek aktivitása megemelkedik, és ezzel párhuzamosan hidegtűrésük is fokozható volt (Prasad és mtsai. 1994). Durner és Klessig (1996) szerint a SA jelenlétében a kataláz peroxidatív működése fokozódik. A SA mint elektrondonor szerepel, és az enzimet lassabb peroxidatív reakcióba vonja. A kataláz enzim gátlása során a SA elektront ad le, és így szabadgyökké alakul. A SA-gyök lipidperoxidációt okozhat, és a keletkező lipidperoxidok részt vehetnek jelátviteli folyamatokban, például a SA-függő rezisztencia kialakulásának folyamatában (Anderson és mtsai. 1998). Az Arabidopsisban kapott eredményeink a szabad és a kötött SA csökkenését jelezték a hideg hatására, melyek az előző megfigyelésekkel szemben más jellegű szignalizáció meglétét feltételezik. Az aszkorbát (AA) tartalomban nem voltak jelentős változások kimutathatók a hideg hatására. A vizsgált antioxidáns enzimek közül jelentősen csak a glutation-reduktáz (GR), illetve csekélyebb mértékben az aszkorbát-peroxidáz (APX) esetén volt kimutatható aktivitásemelkedés. Az aszkorbát-peroxidáz a H2O2 szint csökkentésével akadályozhatja a H2O2 által indukált védekezési folyamatok kialakulását. Aktivitása csak az eds5-ben és a sid2-ban volt magasabb, bár a kofaktorának (AA) szintjét befolyásoló enzimnek, a mono-dehidroaszkorbátreduktáznak (MDHAR) nem volt kimutatható aktivitásváltozása ebben a két mutánsban. Ugyanakkor, az APX aktivitás fokozott GR működésével együtt biztosíthatja a H2O2 bontását valamint szabályozhatja a redukált glutation mennyiségét (Molina és mtsai. 2002). A glutationnak fontos szerepe van a ROS csökkentésében (Noctor és Foyer 1998, Foyer és Noctor 2011), melynek megfelelő szintje fontos a szignalizáció és a károsító hatások közötti egyensúly kialakulásához (Suzuki és Mittler 2006). 6.2.5. A poliaminok szerepe a hideg elleni védekezésben Ismert, hogy a poliaminoknak (PA) szerepe van a különféle stresszhatások elleni védelemben (Kasukabe és mtsai. 2004, Shen és mtsai. 2000, Bouchereau és mtsai. 1999, 97
Evans és Malmberg 1989). Az antioxidáns enzimek, a SA hatásának vizsgálata után a PA-ok hidegstressz elleni védelemben betöltött szerepét igyekeztünk tisztázni. Irodalmi adatok szerint a PA-ok hideg elleni védő szerepe abból áll, hogy egyrészt gátolják a lipidperoxidációt (Tachibana 2000), másrészt stabilizálják a membránok molekulakomplexeit (Bouchereau és mtsai. 1999, Besford és mtsai. 1993). Méréseink alapján úgy látszik, hogy a hidegedzés az agmatin és a spermidin szintjére nincs vagy csak kevés befolyással van. Más megfigyelések szerint kukoricában a spermidin szintje nem változott meg sem három napig tartó 5 °C-os hőmérséklet, sem SA-as előkezelés hatására (Németh és mtsai. 2002). A hidegedzés hatására a putreszcin és a spermin szintjében szignifikáns mennyiségi eltéréseket tapasztaltunk. A putreszcin esetén megemelkedett, a spermin esetén lecsökkent a mennyiségük a 4 °C-os edzés hatására. Irodalmi adatok szerint a putreszcin akkumulációja és az alacsony hőmérséklet okozta károsodások mértéke között egyenes arányosságot találtak hidegérzékeny zöldségekben és gyümölcsökben, melyet a spermidin és a spermin esetében nem tudták kimutatni (Kramer és Wang 1989, McDonald és Kushad 1986). Kukoricában háromnapos alacsony hőmérsékleti kezelés hatására a putreszcin szint megemelkedett, míg az SA előkezelt növényekben már normál hőmérsékleten nagyobb mértékű növekedést tapasztaltak, mely a hideg hatására később nem változott (Németh és mtsai. 2002). Ennek egyik oka a fotoinhibíció növekedése lehetett (Szalai és mtsai. 1997). A putreszcin szintje kukoricában szövetenként és szervenként eltérő lehet (Gao és mtsai. 2009).
Putreszcin
hiányos Arabidopsis mutánsokban csökkent a hidegtűrést tapasztaltak, melyeket külsőleg adagolt putreszcinnel sikeresen regeneráltattak (Cuevas és mtsai. 2008). A putreszcin egyik hatásmechanizmusa, hogy hidegstressz során képes antioxidáns enzimekhez kötődni, vagy antioxidáns molekulákhoz kapcsolódni, mellyel meggyorsítja az intracelluláris migrációjukat az oxidatív stressz helyére (Bouchereau és mtsai. 1999). Az általunk vizsgált Arabidopsis fajtákban szignifikánsan lecsökkent a spermin koncentrációja.
Más
növényekben
is
kimutattak
csökkenést.
SA
előkezelt
kukoricanövényekben a hideg hatására lecsökkent a spermin szintje (Németh és mtsai. 2002). Cukkiniben kimutatták, hogy alacsony hőmérséklet hatására megemelkedett mind a spermidin, mind a spermin mennyisége (Kramer és Wang 1989). A spermidin és a spermin szerepe abban állhat, hogy védelmet nyújtanak lipidperoxidáció membránkárosító hatása ellen azáltal, hogy egyrészt meggátolják a foszfolipidek lipid kettősrétegen keresztüli mozgását, valamint stabilizálják a tilakoid membránok molekula komplexeit (Besford és mtsai. 1993, Popovic és mtsai. 1979). 98
A PA-ok előzőekben bemutatott mennyiségi változásai arra engednek következtetni, hogy a putreszcin és a spermin szintje a hideg által erősen befolyásolt. A putreszcin nagymértékű emelkedését annak átmeneti felhalmozódása is okozhatta. A spermin képződése lassabb folyamat lehet. Erre utalhat az is, hogy putreszcin és a spermin szintjét összehasonlítva az edzési periódus végére a putreszcin mintegy 4–7szerese volt a sperminnek. Ez a feltételezett, a szintézis idejének eltolódása továbbiakban magyarázat lehet a spermin edzés után mért szintjének a kontroll hőmérséklethez viszonyított csökkenésére is. Egy másik lehetséges ok a spermin gyors metabolizmusa lehet. Ez azonban még pontosan nem tisztázott. Az eredményeink alapján úgy tűnik, hogy bizonyos antioxidáns enzimek mellett a poliaminoknak fontos szerepük lehet a hideg káros hatásaival szemben. 6.2.6. Etilén-anyagcsere és hidegstressz Hidegérzékeny növények esetében a hideg etiléntermelést indukálhat (Tong és Yang 1987). Az etilén stressz fiziológiai jelentősége pontosan még nem ismert, sem védő, sem szabályozó funkcióját nem mutatták ki. Rozsban a hideg és szárazságstressz alatt külsőleg adagolt
ACC(1-aminociklopropán-1-karboxilsav)-val
sikerült
az
antifreeze
proteinek
expresszióját kiváltani 20 °C-on. 5 °C-os hidegkezelés hatására pedig megemelkedett etiléntermelést és az antifreeze proteinek expresszióját sikerült kimutatni (Yu és mtsai. 2001). Az etilén bioszintézis prekurzorának, az ACC-nak a meghatározásával következtethetünk az etilén hidegedzés alatti változásaira. Az
Arabidopsis
mutánsok
és
transzgenikus
vonalak
vizsgálatával
kontroll
hőmérsékleten sem az ACC, sem az MACC szintjében nem volt szignifikáns eltérés a genotípusok között. A hidegedzés alatt sem volt kimutatható különbség. A kontroll és a hidegedzésen mért ACC értékeket összehasonlítva csak kisebb változások voltak kimutathatók, de a Col-0-ban és a vtc2-1-ben emelkedett, míg a GLOáz-ban csökkent a mennyisége. Az MACC a hidegedzés hatására kis mértékben csökkent a Col-0-ban, a vtc2-1ben, a NahG-ben és emelkedett a GLOáz-ban. Egyedül a sid2 MACC szintjében volt szignifikáns a csökkenés. Az mutánsokban a MACC mennyiségének csökkenése az ACC mennyiségének emelkedésével párhuzamosan az etiléntermelés növekedését jelentheti (Liu és mtsai. 1985). Kukoricában és búzában alacsony hőmérsékleten megváltozott MACC szintet mértek, az ACC-val ellentétben az MACC tartalom nem korrelált a hidegtűréssel (Janowiak és Dörffling 1996, Machácková és mtsai. 1992). Fiatal kukoricanövényekben a magasabb ACC-tartalom 99
nagyobb hidegkárosodással járt együtt (Janowiak és Dörffling 1995). A magasabb ACC tartalom oka a megnövekedett ACC-szintáz aktivitás mellett az ACC-oxidáz inaktiválása lehet, mely a membránkárosodás következménye (Etani és Yoshida 1987). Az Arabidopsisban végzett méréseink eredményei alapján úgy tűnik, hogy a növények négy napos 4 °C-on történő hidegedzése az ACC és MACC szintjére nincs jelentős hatással. 6.3. A hideg hatása az Arabidopsis noa1 mutánsokra Az Arabidopsis thaliana noa1 (Nitric Oxide Associated) mutánsok korábban nos (Nitric Oxide Synthase) néven voltak ismertek. Csökkent NO tartalommal rendelkeztek és a kettős mutánsok külsőleg adagolt NO-dal képesek regenerálódni (Guo és mtsai. 2003). Moreau és mtsai. (2008) szerint az Atnoa1 mutáns nem NOS deficiens, hanem egy cGTPáz mutációt hordoz, amely néhány, fenotípusosan jól látható jelleg változását okozza. Az Atnoa1 mutáció pontos molekuláris háttere és stresszellenes védekezési mechanizmusai kevéssé ismertek. Vizsgálataink során a hidegedzés hatásait tanulmányoztuk a noa1 mutáción. A növények négy napig 4 °C-on voltak hidegedzve, majd egy napig -12 °C-os fagyasztáson estek át. A fagytűrés élettani hátterének megismerésére az ionkiáramlás mérés mellett vizsgáltuk a fotoszintetikus apparátus károsodását, az antioxidáns enzimek, a SA és a PA szerepét. Az Atnoa1 kontroll hőmérsékleten kevesebb klorofillt tartalmazott, mint a Col-0. Az F0 és az Fm magasabbnak bizonyult, mint a vad típusban, amely a PSII közvetlen vagy közvetett károsodására utal. Az előzőeknek megfelelően az Fv/Fm, illetve a ∆F/Fm’paraméter alacsonyabb volt az Atnoa1 esetén 21 °C-on, mint a vad genotípusban. A felesleges energia disszipáció egyik mechanizmusa a klorofill fluoreszcencia nem-fotokémiai kioltása (NPQ). Más vizsgálatban megállapítottuk, hogy a Col-0 esetén az NPQ lefutása lassabb volt, mint az Atnoa1 esetén, amely kompenzációs folyamatként szolgálhat (Majláth és mtsai. 2011). A mutáns GR aktivitása az edzési hőmérsékleten, valamint a hidegedzés hatására szignifikánsan magasabb volt, mint a Col-0 esetében. Az APX esetén hideg hatására mindkét fajta esetén lecsökkent az aktivitás, amely csak a Col-0 esetén volt szignifikáns. A gvajakol peroxidázok (GPX) és kataláz (CAT) aktivitásában nem voltak kimutatható különbségek. Az antioxidáns enzimaktivitás változások arra engednek következtetni, hogy a noa1 mutációnak nincs közvetlen hatása az antioxidáns védekező rendszer enzimeinek működésére. Az Atnoa1 alacsony NO szinttel rendelkezik (Guo és mtsai. 2003, Zhao és mtsai. 2007a, 2007b, Wang és mtsai. 2010). A NO termelődésében fontos szerepe van az SA-nak. Méréseink eredménye alapján a mutánsban magasabb volt a szabad és a kötött SA 100
mennyisége, amely a kontroll és a hidegedzett növényekben is szignifikáns volt. A hidegedzés csak a Col-0 esetén okozott szignifikáns emelkedést a kötött forma szintjében. A SA mutánsokban való magas szintjének egyik lehetséges magyarázata, hogy a magas SA koncentráció negatív visszacsatolásos módon csökkenti a NO termelődését, bár ez a feltevés még nem egészen bizonyított. A másik lehetőség, hogy a vad genotípusénál magasabb SA szintnek
az
általános
stresszadaptációban
lehet
szerepe
(pl.
a
törpenövés,
kvantumhatékonyság). A poliaminok közül a spermidin Arabidopsis-ban, de általában növényekben egy kimondottan a stresszhez kötődő vegyület, szemben a putreszcinnel és a sperminnel (Bouchereau és mtsai. 1999, Kasukabe és mtsai. 2004). A Col-0-hoz viszonyítva az Atnoa1ben magasabb volt a spermidin mennyisége 21 °C-on. A putreszcin a hidegedzés hatására a Col-0-ban és az Atnoa1-ben is jelentős emelkedést mutatott. A spermin a hideg hatására mindkét genotípusban jelentős csökkenést mutatott. Más fajokban, mint az őszi búza esetén (Szalai és mtsai. 2009), hidegérzékeny kukoricában magas fényintenzitás melletti hidegedzés után hasonló eredményeket kaptak (Szalai és mtsai. 1997, Németh és mtsai. 2002). A poliaminok valószínűleg nem közvetlenül a hidegstresszhez kötődnek, szerepük inkább az általános védekezési folyamatok során lehet. Az eddigi eredmények alapján megállapítható, hogy az Atnoa1 mutánsok képesek a hideg káros hatásainak kompenzációjára, amely a fotoprotektív folyamatokkal, valamint az SA és a PA-ok hatásával függ össze. 6.4. Az árnyék-kerülésért felelős gének térképezése A fény és a hőmérséklet kapcsolatát már számos ponton leírták, de az eddigi ismeretek még több helyen is hiányosak. Az előzőekben a búza esetén vizsgáltuk a fényintenzitás szerepét a hidegedzés alatt. A fényintenzitás mellett a fény minősége is számos folyamatra befolyással van. A fénybegyűjtés optimalizálásáért folytatott alkalmazkodási folyamatok (Light Foraging Strategy, LFS) a Shade Avoidance Syndrome-ban (SAS) nyilvánulnak meg, amely egy hőmérsékletfüggő, polimorfizmust mutató jelleg. A gazdasági növények – mint a kalászos gabonafélék – esetén az LFS sikeressége kulcsfontosságú a fejlődés kezdeti szakasza alatt és a későbbi termésmennyiség szempontjából (Goins és mtsai. 1997, Kasajima és mtsai. 2007). Kimutatták, hogy a búzában az alacsony R/FR megvilágítás (árnyék) késlelteti a gyökér és a hajtás növekedését (Ugarte és mtsai. 2010).
101
Növényekben a SAS-nak a hőmérséklettől függően kétféle morfogenetikus útja van (Franklin és Whitelam 2005). Kísérletes megfigyelések szerint 20 °C feletti hőmérsékleten a növények
fokozott
magasságnövekedéssel,
megnyúlt
levél,
illetve
petiólumhosszal
válaszolnak az alacsony R/FR megvilágításra (SAS1). Alacsonyabb hőmérsékleten (16 °C) másfajta válasz alakult ki: a levélfelület és levélvastagság növelésével hatékonyabb lesz a fényfelfogás (SAS2) (Franklin 2008, 2009). Eltérő fagytűrésű Arabidopsis természetes változatok esetén felismerték, hogy a morfogenetikus választ a fény befolyásolja (AlonsoBlanco és mtsai. 2005a). Alacsony hőmérsékleten és R/FR megvilágításon a trópusi származású Cvi egyik morfológiai változása a megnyúlt petiólum, melyet alacsonyabb és magasabb hőmérsékleti viszonyok mellett is megjelenít. Vizsgálataink során a Ler(Cvi) 2-8 NIL-ak alacsony R/FR megvilágításának kezdete utáni 11. naptól azonban már szembetűnőek voltak a megnyúló petiólumok, melyek megmutatták, hogy a Cvi introgresszión belül megtalálható a jellegért felelős SAS1QTL. A NIL-ak genetikai vizsgálatával meghatározható a SAS1 QTL pozíciója. A SAS poligénes jelleg, melynek térképezése során már több gént is feltártak. Az egyik ilyen az ELF3, amely a hipokotil növekedés szabályozásáért felelős (Coluccio és mtsai. 2010). A fitokrómok közvetítette jelátvitelben Roig-Villanova és mtsai. (2006) hat gént vizsgáltak, melyek a SAS és a deetioláció alatti változásokért is felelősnek bizonyultak. Az egyik legfontosabb ezek közül phytochrome-interacting factor 3-like-1 (PIL1) gén, melynek terméke a rövid és a hosszabb idejű árnyék alatt is fontos szerepet tölt be a fitokrómok (PhyB) közvetítette jelátvitelben. Vizsgálataink során a SAS1 három molekuláris marker használatával elvégzett térképezése után azt az eredményt kaptuk, hogy a SAS1 QTL a 2. kromoszóma a 11,2 MB régiójában helyezkedik el. Ebben a régióban az Erecta (ER), illetve az Erecta-szerű gének (ERL1, ERL2) találhatók, melyek általános, szerteágazó szerepet töltenek be a fotomorfogenetikus folyamatokban (Torii és mtsai. 1996, Zanten és mtsai. 2009, Tisné és mtsai. 2011). Vizsgálatunk eredményei az előbbi gének árnyék-kerülési tünetegyüttesben való részvételét látszanak igazolni. 6.5. További tervezett vizsgálatok Arabidopsis-ban I. Az Arabidopsis pif3 és npq4 mutánsok fagytűrése eltérést mutat Az előzőekben az Arabidopsis thaliana aszkorbát és szalicilsav (SA) hiányos mutánsait és transzgenikus vonalait felhasználva vizsgáltuk a hideg- és fagytűrés élettani hátterét. A 102
mutánsok stressz alatti vizsgálatával igyekeztünk az aszkorbát és a SA hidegstressz alatti szerepére következtetni. A fényminőség érzékelésének jelátviteli folyamataiban fontos a fitokróm interacting faktorok (pif) szerepe (Castillon és mtsai. 2007, Huq és Quail 2002). A pif3 mutánsok chilling alatti viselkedése eltérő fényintenzitási viszonyok alatt kevéssé ismert. A másik, az npq4 mutánsokra az NPQ (nem-fotokémiai kioltás) qE szakaszának alacsony intenzitása jellemező, mert hiányzik a belőlük a PSII PsbS proteinje. A qE egy hődisszipációs folyamat, amely a klorofillok triplet formáinak képződése ellen hat, valamint megakadályozza a PSII elektronakceptorainak telítődését. Ennek alulműködése protongrádiens kialakulásáshoz vezet (Müller-Moulé és mtsai. 2004). További céljaink közé tartozik a két mutáns különböző fényintenzitási viszonyok melletti hidegedzésének vizsgálata a megfelelő fagytolerancia kialakulásában. Előkísérleteink eredményei alapján úgy tűnik, hogy a mutánsok fagytűrésében eltérések figyelhetők meg (31. ábra). A következő lépésekben az eltérő fagytűrés az élettani hátterének tanulmányozását tűztük ki célul.
II. A hideg- és fagytűrés kialakulásáért felelős tényezők további vizsgálata a microarray vizsgálat eredményei alapján A búzában 5 °C-on különböző megvilágítási viszonyok mellett kivitelezett globális génexpressziós vizsgálat eredményei alapján a hideg- és fagytűrés kialakulásáért felelős tényezők részletesebb feltárására újabb vizsgálatokat tervezünk. A szignifikáns aktivitásváltozást mutató gének közül kíváncsiak vagyunk a dehidrinek változására, melyek membránvédő szereppel rendelkeznek (Rorat 2006). Az aldehid-oxidázok aktivitás változásának meghatározásával az ABA szintézis változásaira következtethetünk. Továbbá tervezzük a fruktánok, mint fontos ozmoprotektánsok (Kawakami és Yoshida 2005), illetve szintézisük egyik kulcsenzimének, a fruktán:fruktán 1-fruktoziltranszferáz változásainak vizsgálatát alacsony hőmérséklet hatására.
103
31. ábra Az Arabidopsis pif3 és npq4 mutánsok eltérő fagytűrése 12, illetve 11 nappal a fagyasztás után (DAF) (normál fényintenzitás, NL, fényintenzitás, LL, PPFD=20 µmol m-2 s-1).
104
PPFD=100 µmol m-2 s-1; alacsony
7. Összefoglalás
A búzában végzett globális génexpressziós vizsgálat eredményei alapján a fényintenzitás fontos befolyásoló tényezőnek bizonyult a hidegperiódus alatt. A fagytolerancia kialakításában résztvevő újabb komponenseket sikerült azonosítanunk, melyek egyrészről a fotoszintetikus folyamatokhoz (feoforbid-a oxigenáz, klorofill kötő proteinek, citokróm P450, ferredoxin-NADP(H) oxidoreduktáz), a fagy elleni védelem kialakulásához (3-demetilubikinon-9 3-metiltranszferáz, fruktán 1-fruktoziltranszferáz, dehidrinek, CBF transzkripciós faktorok, LEA fehérjék, foszfoetanolamin N-metiltranszferáz), a glutation (GST)-, illetve a hormonanyagcseréhez (aldehid oxidáz-2, ACC-oxidáz) kapcsolódnak.
Őszi és tavaszi búzában a prolin szintje normál megvilágítás mellett a hidegedzés 3. napján volt a legmagasabb, majd lecsökkent, azonban végig magasabb maradt, mint az edzés előtt volt. Alacsony fényintenzitáson egyik fajta esetén sem tapasztaltunk jelentős eltéréseket.
Az Arabidopsis aszkorbát- és szalicilsav-hiányos mutánsok és transzgenikus vonalak fagytűrése
meglehetősen
eltérőnek
bizonyult.
Egy
kritikus
fagypont
alatti
hőmérsékletig a növények képesek a regenerációra, amely vizsgálataink alapján -10 °C-nak bizonyult.
Arabidopsis-ban megállapítottuk, hogy az antioxidáns enzimeknek, az aszkorbátnak és a szalicilsavnak kisebb, míg a poliaminoknak jelentősebb szerepük van a hideg káros hatásai elleni védelemben, illetve a megfelelő fagytolerancia kialakításában.
Az Atnoa1 mutánsok hideggel szembeni ellenállóképességének tanulmányozása során a fotoprotektív folyamatok jelentőségét, valamint a szalicilsav és a poliaminok szerepét sikerült kimutatnunk.
Arabidopsis-ban az alacsony hőmérsékleti viszonyok alatti árnyék kerülésért felelős (SAS1) QTL-t a 2. kromoszóma 11,2 MB régiójára térképeztük. A jelölt génként az Erecta (ER), illetve az Erecta-szerű géneket (ERL1, ERL2) azonosítottuk.
105
8. Summary
Alterations in the gene expression profiles were studied in a microarray experiment of winter and spring wheat varieties under cold stress. A number of genes showed both cold and light intensity dependence. Most of these related to photosynthesis, the development of antifreeze processes or the glutathione and hormone metabolism.
Proline which is an important osmolyte, was also studied in wheat subjected to cold stress at various light intensities. The level of this compound was only significantly higher under normal light, but not at low light intensity.
Besides wheat, ascorbate (AA)- and salicylic acid (SA)-deficient mutants and transgenic lines of Arabidopsis thaliana were also used to further investigate the background of frost tolerance development. The frost tolerance of the Arabidopsis genotypes differed. The chlorophyll content and Fv/Fm quantum efficiency parameter showed a slight temperature dependence. The recovery of these parameters is possible after freezing at -10 °C. The roles of AA and certain antioxidant enzymes were not significant. The genotypes had different levels of SA but no direct correlation was found between the SA level and frost tolerance.
The levels of two polyamines (PA) (putrescine, spermine) suggested a general role against cold stress, since similar tendencies were observed in all of the genotypes.
The results proved that cold hardening was an important process before frost, not only in cereals but also in Arabidopsis. However, the results derived from Arabidopsis can only be used to a limited extent.
The mechanism of cold tolerance in a newly desribed Arabidopsis mutant (noa1: Nitric Oxide Associated) was also studied. The results showed that the role of SA, PAs and photoprotective processes is of primary importance during cold stress.
Not only light intensity but also light quality (wavelength) has a multiple impact on the physiological, developmental and stress signalling processes in plants. The polymorphism of the Shade Avoidance Syndrome (SAS) showed both temperature and light quality dependence. The SAS QTL was mapped to the 11.2 MB region on Arabidopsis chromosome II. The Erecta and Erecta-like genes were identified as possible candidate genes.
106
9. Felhasznált irodalom Abreu IA, Saraiva LM, Soares CM, Teixeira M, Cabelli DE (2001) The mechanism of superoxide scavenging by Archaeoglobus fulgidus neelarredoxin. J Biol Chem 276: 38995–39001. Agboma M, Jones MGK, Peltonen-Sainio P, Rita H, Pehu E (1997) Exogenous glycinebetaine enhances grain yield of maize, sorghum and wheat grown under two supplementary watering regimes. J. Agron. and Crop Sci. 178: 29–37. Alexandre CM, Hennig L (2008) FLC or not FLC: The other side of vernalization. Journal of Experimental Botany 59: 1127–1135. Alonso-Blanco C, Peeters AJM, Koornneef M, Lister C, Dean C, van den Bosch N, Pot J, Kuiper MTR (1998) Development of an AFLP based linkage map of Ler, Col and Cvi Arabidopsis thaliana ecotypes and construction of a Ler/Cvi recombinant inbred line population. Plant J. 14/2: 259–271. Alonso-Blanco C, Gomez-Mena C, Francisco L, Koornneef M, Salinas J, Martínez-Zapater JM (2005a) Genetic and Molecular Analyses of Natural Variation Indicate CBF2 as a Candidate Gene for Underlying a Freezing Tolerance Quantitative Trait Locus in Arabidopsis. Pl.Phys.139: 1304–1312. Alonso-Blanco C, Mendez-Vigo B, Koornneef M (2005b) From phenotypic to molecular polymorphisms involved in naturally occurring variation of plant development. Int. J. Dev. Biol. 49: 717–732. Alonso-Blanco C, Koornneef M (2000) Naturally occurring variation in Arabidopsis: an underexploited resource for plant genetics. Trends Plant Sci 5: 22–29. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic Local Alignment Search Tool J Mol Biol 215: 403–410. Amako K, Chen GX, AsadaK (1994) Separate assays specific for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and for chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidase in plants. Plant Cell Physiol 35: 497–504. Amara I, Odena A, Oliveira E, Moreno A, Masmoudi K, Pagès M, Goday A (2012) Insights into Maize LEA Proteins: From Proteomics to Functional Approaches. Plant Cell Physiol 53/2: 312–329. Amunts A, Toporik H, Borovikova A, Nelson N (2010) Structure determination and improved model of plant photosystem I. J. Biol. Chem. 285: 3478–3486.
107
Anderson MD, Chen Z, Klessig DF (1998) Possible involvement of lipid peroxidation in salicylic acid-mediated induction of PR-1 gene expression. Phytochem. 47: 555–566. Anderson MD, Chen Z, Klessig DF (1998): Possible involvement of lipid peroxidation in salicylic acid-mediated induction of PR-1 gene expression. Phytochem 47: 555–566. Apostol S, Szalai G, Sujbert L, Popova LP, Janda T (2006) Non-invasive monitoring of the light-induced cyclic photosynthetic electron flow during cold hardening in wheat leaves. Z. Naturforsch. 61c: 734–740. Arora S, Saradhi PP (2002) Light induced enhancement in proline levels under stress is regulated by non-photosynthetic events. Biol Plant 45: 629–632. Asada K, Kiso K, Yoshikawa K (1974) Univalent reduction of molecular oxygen by spinach chloroplasts on illumination. J Biol Chem 249: 2175–2181. Asada K (1999) The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 601–639. Asada K (2006) Production and Scavenging of Reactive Oxygen Species in Chloroplasts and Their Functions. Plant Physiology 141/2: 391–396. Atwell S, Huang YS, Vilhjálmsson BJ, Willems G, Horton M, Li Y, Meng D, Platt A, Tarone AM, Hu TT, Jiang R, Muliyati NW, Zhang X, Amer MA, Baxter I, Brachi B, Chory J, Dean C, Debieu M, de Meaux J, Ecker JR, Faure N, Kniskern JM, Jones JDG, Michael T, Nemri A, Roux F, Salt DE, Tang C, Todesco M, Traw MB, Weigel D, Marjoram P, Borevitz JO, Bergelson J, Nordborg M (2010) Genome-wide association study of 107 phenotypes in Arabidopsis thaliana inbred lines. Nature 465: 627–631. Ábrahám E, Rigó G, Székely G, Nagy R, Koncz C, Szabados L (2003) Light-dependent induction of proline biosynthesis by abscisic acid and salt stress is inhibited by brassinosteroid in Arabidopsis. Plant Mol Biol 51: 363–372. Ádám A, Bestwick CS, Barna B, Mansfield JW (1995) Enzymes regulating the accumulation of active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringae pv. phaseolica. Planta 197: 240–249. Baek KH, Skinner DZ (2003) Alteration of antioxidant enzyme gene expression during cold acclimation of near-isogenic wheat lines. Plant Science 165/6: 1221–1227. Balasundram N, Sundram K, Sammana S (2006) Phenolic compounds in plants and agriindustrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food Chemistry 99/1: 191–203. Bates LS, Waldren RP, Teare ID (1973) Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil. 39/1: 205–207. 108
Benjamini Y, Hochberg Y (1995) Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J Roy Stat Soc 57: 289–300. Besford RT, Richardson CM, Campos JL, Tiburcio AF (1993) Effect of polyamines on stabilization of molecular complexes of thylakoid membranes of osmotically stressed oat leaves. Planta 189: 201–206. Bielawski W, Joy KW (1986) Properties of glutathione reductase from chloroplasts and roots of pea. Phytochem 25: 2261–2265. Bilodeau P, Udvardi MK, Peacock WJ, Dennis ES (1999) A prolonged cold treatmentinduced cytochrome P450 gene from Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment 22: 791–800. Bouchereau A, Aziz A, Lahrer F, Martin-Tanguy J (1999) Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Sci 140: 103–125. Bradford KJ (2008) Shang Fa Yang: Pioneer in plant ethylene biochemistry. Plant Science 175: 2–7. Bravo L (1998) Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutrition Reviews 56: 317–333. Bueno P, Varela J, Gimenez-Gallego G, del Río LA (1995) Peroxisomal copper, zinc superoxide dismutase. Plant Physiol. 108: 1151–1160. Burr B, Burr FA, Thompson KH, Albertson MC, Stube CW (1988) Gene Mapping with Recombinant Inbreds in Maize. Genetics 118: 519–526. Campoli C, Matus-Cádiz MA, Pozniak CJ, Cattivelli L, Fowler DB (2009) Comparative expression of Cbf genes in the Triticeae under different acclimation induction temperatures. Mol Genet Genomics (2009) 282: 141–152. Castillon A, Shen H, Huq E (2007) Phytochrome Interacting Factors: central players in phytochromemediated light signaling networks. Trends in Plant Science 12/11: 514– 521. Carpaneto A, Ivashikina N, Levchenko V, Krol E, Jeworutzki E, Zhu JK, Hedrich R (2007) Cold Transiently Activates Calcium-Permeable Channels in Arabidopsis Mesophyll Cells. Plant Physiology 143/1: 487–494. Castillo-Davis CI, Hartl DL (2003) GeneMerge–post-genomic analysis, data mining, and hypothesis testing. Bioinformatics 19: 891–892. Castillon A, Shen H, Huq E (2007) Phytochrome Interacting Factors: central players in phytochromemediated light signaling networks. Trends in Plant Science 12/11: 514 – 521. 109
Cassol D, De Silva FSP, Falqueto AR, Bacarin MA (2008) An evaluation of non-destructive methods to estimate total chlorophyll content. Photosynthetica 46/4: 634–636. Chapman DJ, Millner PA, Barber J (1983) The influence of plant growth temperature on the lipid/protein ratio of chloroplast thylakoid membranes. Biochem Soc Trans 11: 387– 388. Chen GX, Asada K (1989): Ascorbate peroxidase in tea leaves: occurence of two isozymes and the differences in their enzymatic and molecular properties. Plant Cell Physiol 30: 987–993. Chen Z, Ricigliano JR, Klessig DF (1993a) Purification and characterization of a soluble salicylic acid binding protein from tobacco. Proc Natl Acad Sci USA 90: 9533–9537. Chen Z, Silva H, Klessig DF (1993b) Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science 262: 1883–1886. Chérif M, Arfaoui A, Rhaiem A (2007) Phenolic compounds and their role in bio-control and resistance of chickpea to fungal pathogenic attacks. Tunisian Journal of Plant Protection 2: 7–21. Chow WS, Lee HY, He J, Hendrickson L, Hong YN, Matsubara S (2005) Photoinactivation of photosystem II in leaves. Photosynth Res. 84/1-3: 35–41. Chung DW, Pružinská A, Hörtensteiner S, Ort DR (2006) The Role of Pheophorbide a Oxygenase Expression and Activity in the Canola Green Seed Problem. Plant Physiol. 142/1: 88–97. Cockram J, Jones H, Leigh FJ, O’Sullivan D, Powell W, Laurie DA, Greenland AJ (2007) Control of flowering time in temperate cereals: genes, domestication, and sustainable productivity. J Exp Bot 58: 1231–1244. Colasanti J, Coneva V (2009) Mechanisms of Floral Induction in Grasses: Something Borrowed, Something New. Plant Physiology 149: 56–62. Coluccio PM, Sanchez SE, Kasulin L, Yanovsky MJ, Botto JF (2010) Genetic mapping of natural variation in a shade avoidance response: ELF3 is the candidate gene for a QTL in hypocotyl growth regulation. Journal of Experimental Botany 62/1:167–176. Conklin PL, Gatzek S, Wheeler GL, Dowdle J, Raymond MJ, Rolinski S, Isupov M, Littlechild JA, Smirnoff N (2006) Arabidopsis thaliana VTC4 Encodes L-Galactose-1-P Phosphatase, a Plant Ascorbic Acid Biosynthetic Enzyme. The Journal of Biological Chemistry 281/23: 15662–15670.
110
Conklin PL, Saracco SA, Norris SR, Last RL (2000) Identification of ascorbic acid-deficient Arabidopsis thaliana mutants. Genetics 154: 847–856. Conklin PL, Williams EH, Last RL (1996) Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficient Arabidopsis mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9970–9974. Conrath U, Chen Z, Ricigliano JR, Klessig DF (1995) Two inducers of plant defense responses, 2,6-dichloroisonicotinic acid and salicylic acid, inhibit catalase activity in tobacco. Proc Natl Acad Sci USA 92: 7143–7147. Cuevas JC, Lopez-Cobollo R, Alcazar R, Zarza X, Koncz C, Altabella T, Salinas J, Tiburcio AF, Ferrando A (2008) Putrescine is involved in Arabidopsis freezing tolerance and cold acclimation by regulating abscisic acid levels in response to low temperature. Plant Physiol 148: 1094–1105. Dat JF, Foyer CH, Scott IM (1998) Changes in salicylic acid and antioxidants during induced thermotolerance in mustard seedlings. Plant Physiol 118: 1455–1461. De Ascensao AFRDC, Dubrey IA (2003) Soluble and wall-bound phenolic polymers in Musa acuminata roots exposed to elicitors from Fusarium oxysporum f.sp. cubens. Phytochemistry 63: 679–686. Demmig-Adams B, Adams WW (1992) Photoprotection and other responses of plants to light stress. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43: 5996–6026. Demmig-Adams B (1990) Carotenoids and photoprotection in plants: a role for the xanthophylls zeaxanthin. Reviews on bioenergetics. Biochimica et Biophysica Acta 1020: 1–24. Deisseroth A, Dounce A (1970) Catalase: physical and chemical properties, mechanism of catalysis and physiological role. Physiol Rev 50: 319–326. Ding CK, Wang CY, Gross KC, Smith DL (2002) Jasmonate and salicylate induce the expression of pathogenesis-related-protein genes and increase resistance to chilling injury in tomato fruit. Planta 214: 895–901. Doulis AG, Debian N, Kingston-Smith AH, Foyer CH (1997) Differential localization of antioxidants in maize leaves. Plant Physiol 114: 1031–1037. Dowgert, M. F. and Steponkus, P. L. (1984). Behavior of the plasma membrane of isolated protoplasts during a freez-thaw cycle. Plant Physiology 75: 1139–1151. Drążkiewicz M, Skórzyńska-Polit E, Krupa Z (2003) Response of the ascorbate–glutathione cycle to excess copper in Arabidopsis thaliana (L.). 164/2: 195–202.
111
Dubcovsky J, Loukoianov A, Fu D, Valarik M, Sanchez A, Yan L (2006) Effect of photoperiod on the regulation of wheat vernalization genes VRN1 and VRN2. Plant Molecular Biology 60: 469–480. Dunford RP, Masahiro Yano, Nori Kurata, Takuji Sasaki, Gordon Huestis, Torbert Rocheford, David A. Laurie (2002) Comparative Mapping of the Barley Ppd-H1 Photoperiod Response Gene Region, Which Lies Close to a Junction Between Two Rice Linkage Segments. Genetics 161: 825–834. Durner J, Klessig DF (1996) Salicylic acid is a modulator of tobacco and mammalian catalases. J Biol Chem 271: 28492–28501. Enyedi AJ (1999) Induction of salicylic acid biosynthesis and systemic acquired resistance using the active oxygen species generator rose bengal. J Plant Physiol 154: 106–112. Etani S, Yoshida S (1987) Reversible and irreversible reduction of ACC-dependent ethylene formation in mung bean (Vigna radiata L. Wilczek) hypocotyls caused by chilling. Plant Cell Physiol 28: 83–91. Evans PT, Malmberg RL (1989) Do polyamines have roles in plant development? Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 40: 235–269. Fedina IS, Georgieva K, Grigorova I (2002) Light-dark changes in proline content of barley leaves under salt stress. Biol Plant 45: 59–63. Field RJ (1990) Influence of chilling stress on ethylene production. – In Wang CY.(ed.): Chilling injury of horticultural crops. CRC Press, Boca Raton, Fla., Chap. 15. Finch-Savage WE, Leubner-Metzger G (2006) Seed dormancy and the control of germination. New Phytologist 171: 501–523. Foley S, Navaratnam S, McGarvey DJ, Land EJ, Truscott G, Rice-Evans CA (1999) Singlet oxygen quenching nad the redox properties of hydroxycinnamic acids. Free Radical Bio Med 26: 1202–1208. Foyer CH, Noctor G (2011) Ascorbate and Glutathione: The Heart of the Redox Hub. Plant Physiology 155/1: 2–18. Foyer CH (1997a) Oxygen metabolism and electron transport in photosynthesis. In JG Scandalios, ed, Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY: 587–621. Foyer CH, Lopez-Delgado H, Dat JF, Scott IM (1997b): Hydrogen peroxide- and glutathioneassociated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signalling. Physiol Plant 100: 241–254.
112
Foyer CH, Lelandais M, Galap C, Kunert KJ (1991) Effects of elevated cytosolic glutathione reductase activity on the cellular glutathione pool and photosynthesis in leaves under normal and stress conditions. Plant Physiol 97: 863–872. Fowler S, Thomashow MF (2002) Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in. 16 Physiol. Plant. 0, 2012 addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell 14: 1675–1690. Franklin KA 2008. Shade avoidance. New Phytologist 179: 930–944. Franklin KA 2009. Light and temperature signal crosstalk in plant development. Current Opinion in Plant Biology 12: 63–68. Franklin KA, Whitelam GC (2005) Phytochromes and shade-avoidance responses in plants. Annals of Botany 96: 169–175. Gaffney T, Friedrich L, Vernooij B, Negrotto D, Nye G, Uknes S, Ward E, Kessmann H, Ryals J (1993) Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science 261: 754–756. Ganesan V, Thomas G (2001) Salicylic acid response in rice: influence of salicylic acid on H2O2 accumulation and oxidative stress. Plant Sci 160: 1095–1106. Gao C, Hu J, Zhang S, Zheng Y, Knapp A (2009) Association of polyamines in governing the chilling sensitivity of maize genotypes. Plant Growth Regul 57: 31–38. Gentleman RC, Carey VJ, Bates DM, Bolstad B, Dettling M, Dudoit D, Ellis B, Gautier L, Ge Y, Gentry J (2004) Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 5: R80 Gill SS, Tuteja N (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 48: 909–930. Gilmour SJ, Hajela RK, Thomashow MF (1998) Cold acclimation in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology 87: 745–750. Goins GD, Yorio NC, Sanwo MM, Brown CS (1997) Photomorphogenesis, photosynthesis, and seed yield of wheat plants grown under red light-emitting diodes (LEDs) with and without supplemental blue lighting. Journal of Experimental Botany 48/312: 1407– 1413. Goncharov NP, Watanabe N (2005) Physical Mapping and Chromosomal Location of the Photoperiod Response Gene Ppd2 in Common Wheat. Breeding Science 55/1: 81–86. Gorham J, Jokinen K (1998) Glycinebetaine treatment improves cotton yields in field trials in Pakistan. Abstracts. World Cotton Research Conference II, Athens, Greece. p. 329.
113
Gray GR, Chauvin LP, Sarhan F, Huner NPA (1997) Cold acclimation and freezing tolerance (a complex interaction of light and temperature). Plant Physiol 114: 467–474. Griffith M, Antikainen M, Hon WC, Pihakaski MK, Yu W, Chun JU, Yang DSC (1997) Antifreeze proteins in winter rye. Physiol Plant 100: 327–332. Guo FQ, Okamoto M, Crawford NM (2003) Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling. Science. 302 (5642): 100–103. Guo J, Han W, Wang MH (2008) Ultraviolet and environmental stresses involved in the induction and regulation of anthocyanin biosynthesis. African Journal of Biotechnology 7/25: 4966–4972. Guo Z, Ou W, Lu S, Zhong Q (2006) Differential responses of antioxidative system to chilling and drought in four rice cultivars differing in sensitivity. Plant Physiology and Biochemistry 44: 828–836. Gusta L, Wisniewski M, Nesbitt NT, Gusta ML (2004) The effect of water, sugars, and proteins on the pattern of ice nucleation and propagation in acclimated and nonacclimated canola leaves. PlantPhysiology 135, 1642–1653. Haghjou MM, Shariati M, Smirnoff N (2009) The effect of acute high light and low temperature stresses on the ascorbate-glutathione cycle and superoxide dismutase activity in two Dunaliella salina strains. Physiol Plant. 135/3: 272–280. Hammer Ш, Harper DAT, Ryan PD (2001) PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica 4/1: 9pp. http://palaeo-electronica.org/2001_1/past/issue1_01.htm Hare PD, Cress WA, Standen JV (1998) Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant, Cell and Environment 21: 535–553. Havauxa M, Eymerya F, Porfirovab S, Reya P, Dörmann P (2005) Vitamin E Protects against Photoinhibition and Photooxidative Stress in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell 17: 3451–3469. Hemavathi KG, Upadhyaya CP, Akula N, Young KE, Chun SC, Kim DH, Park SW (2010) Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses. Biotechnol Lett. 32/2: 321–330. Hendrickson L, Förster B, Pogson BJ, Chow WS (2005) A simple chlorophyll fluorescence parameter that correlates with the rate coefficient of photoinactivation of photosystem II. Photosynth Res. 84/1-3: 43–49.
114
Hideg E, Kalai T, Hideg K, Vass I (1998) Photoinhibition of photosynthesis in vivo results in singlet oxygen production detection via nitroxide-induced fluorescence quenching in broad bean leaves. Biochemistry 237: 11405–11411. Holmes MG, Smith H (1977) The function of phytochrome in the natural environment - II. The influence of vegetation canopies on the spectral energy distribution of natural daylight. Photochemistry and Photobiology 25: 539–545. Hong-Bo S, Zong-Suo L, Ming-Ana S (2005) LEA proteins in higher plants: Structure, function, gene expression and regulation. 45/3-4: 131–135. Hopkins FG, Morgan EJ (1936) Some relations between ascorbic acid and glutathione. Biochem J 30: 1446–1462. Horváth E, Janda T, Szalai G, Páldi E (2002) In vitro salicylic acid inhibition of catalase activity in maize: differences between the isozymes and a possible role in the induction of chilling tolerance. Plant Sci 163: 1129–1135. Huang C, Guo T, Zheng SC, Feng QL, Liang LH, Li L (2009) Increased cold tolerance in Arabidopsis thaliana transformed with Choristoneura fumiferana glutathione Stransferase gene. Biologia Plantarum 53/1: 183–187. Huang J, Cardoza YJ, Schmelz EA, Raina R, Engelberth J, Tumlinson JH (2003) Differential volatile emissions and salicylic acid levels from tobacco plants in response to different strains of Pseudomonas syringae. Planta 217: 767–775. Hughes MA, Dunn MA (1996) The molecular biology of plant acclimation to low temperature. J. Exp. Bot. 47/296: 291–305. Huner NPA, Öquist G, Hurry VM, Krol M, Falk S, Griffith M (1993) Photosynthesis, photoinhibition and low temperature acclimation in cold tolerant plants. Photosynth. Res. 37: 19–39. Huner NPA, Öquist G, Sarhan F (1998) Energy balance and acclimation to light and cold. Trends Plant Sci. 3: 224–230. Huq E, Quail PH (2002) PIF4, a phytochrome-interacting bHLH factor, functions as a negative regulator of phytochrome B signaling in Arabidopsis. The EMBO Journal 21/10: 2441–2450. Hüner NPA, Öquist G, Hurry VM, Kroll M, Falk S, Griffith M (1993) Photosynthesis, photoinhibition and low temperature acclimation in cold tolerant plants. Photosynthesis Research 37:19–39.
115
Irwin JA, Lister C, Soumpourou E, Zhang Y, Howell EC, Teakle G, Dean C (2012) Functional alleles of the flowering time regulator FRIGIDA in the Brassica oleracea genome. BMC Plant Biology 12: 21. Jain AK, Nessler CL (2000) Metabolic engineering of an alternative pathway for ascorbic acid biosynthesis in plants. Molecular Breeding 6: 73–78. Janda T, Szalai G, Kissimon J, Páldi E, Marton C, Szigeti Z (1994a) Role of light intensity in the chilling injury of young maize plants studied by chlorophyll fluorescence induction measurements. Photosynthetica 30: 293–299. Janda T, Kissimon J, Szigeti Z, Veisz O, Páldi E (1994b) Characterization of cold hardening in wheat using fluorescence induction parameters. J. Plant Physiol. 143: 385–388. Janda T, Szalai G, Tari I, Páldi E (1999) Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effect of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta 208: 175–180. Janda T, Szalai G, Antunovics Zs, Horváth E, Páldi E (2000) Effect of benzoic acid and aspirin on chilling tolerance and photosynthesis in young maize plants. Maydica 45: 29– 33. Janda T, Szalai G, Rios-Gonzalez K, Veisz O, Páldi E (2003) Comparative study of frost tolerance and antioxidant activity in cereals. Plant Sci. 164: 301–306. Janda T, Szalai G, Leskó K, Yordanova R, Apostol S, Popova L (2007) Factors contributing to the enhanced freezing tolerance in wheat during frost hardening in the light. Phytochemistry 68: 1674–1682. Janowiak F, Dörrfling K (1996) Chilling of maize seedlings: Changes in water status and abscisic acid content in ten genotypes differring in chilling tolerance. J Plant Physiol 147: 582–588. Janowiak F, Dörrfling K (1995) Chilling-induced changes in the contents of 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) and its N-malonyl conjugate (MACC) in seedlings of two maize inbreds differing in chilling tolerance. J Plant Physiol 147: 257– 262. Kang HM, Saltveit ME (2002) Chilling tolerance of maize, cucumber and rice seedling leaves and roots are differentially affected by salicylic acid. Physiol Plant 115: 571–576. Kang GZ, Wang CH, Sun GC, Wang ZX (2003) Salicylic acid changes activities of H2O2metabolizing enzymes and increases the chilling tolerance of banana seedlings. Environ Exp Bot 50: 9–15.
116
Kasajima S, Inoue N, Mahmud R, Fujita K, Kato M (2007) Effect of the Light Quality on Developmental Rate of Wheat under Continuous Light at a Constant Temperature. Plant Prod. Sci. 10/3: 286–291. Kasukabe Y, He L, Nada K, Misawa S, Ihara I, Tachibana S (2004) Overexpression of spermidine synthase enhances tolerance to multiple environmental stresses and upregulates the expression of various stress-regulated genes in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 45: 712–722. Katalinic V, Milos M, Kulisic T, Jukic M (2006) Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols. Food Chemistry 94: 550–557. Kawakami A, Yoshida M (2005) Fructan:fructan 1-fructosyltransferase, a key enzyme for biosynthesis of graminan oligomers in hardened wheat. Planta 223: 90–104. Keurentjes JJB, Bentsink L, Alonso-Blanco C, Hamhart CJ, Blankenstijn-De Vries H, Effgen S, Vreugdenhil D, Koornneef M (2007) Development of a Near-Isogenic Line Population of Arabidopsis thaliana and Comparison of Mapping Power With a Recombinant Inbred Line Population. Genetics 175: 891–905. Kevei É (2006) A Zeitlupe fehérje szerepének vizsgálata a növényi cirkadián óra működésében és a fényszabályozott folyamatokban. Doktori Értekezés, Molekuláris és Sejtbiológia Doktori Program, Szegedi Tudományegyetem, Szeged, 132 pp. (with an English Summary) Klessig DF, Durner J, Noad R, Navarre DA, Wendehenne D, Kumar D, Zhou JM, Shah J, Zhang S, Kachroo P, Trifa Y, Pontier D, Lam E, Silva H (2000) Nitric oxid and salicylic acid signalling in plant defense. Proc Natl Acad Sci USA 97: 8849–8855. Knight H, Veale EL, Warren GJ, Knight MR (1999) The sfr6 mutation in Arabidopsis suppreses low temperature induction of genes dependent on the CRT/DRE sequence motif. The Plant Cell 11: 875–886. Knight H, Trewavas AJ, Knight MR (1996) Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8/3: 489–503. Knight MR (2002) Signal transduction leading to low-temperature tolerance in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 357: 871–875. Kocsy G, von Ballmoos P, Rüegsegger A, Szalai G, Galiba G, Brunold C (2001) Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using safeners increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiol 127: 1147–1156.
117
Koetje DS, Kononowicz H, Hodges TK (1993) Polyamines metabolism associated with growth and embryogenic potential of rice. J Plant Physiol 141: 215–221. Kolderup F (1975) Effects of temperature, photoperiod, and light quantity on protein production in wheat grains. Journal of the Science of Food and Agriculture. 26/5: 583– 592. Konstantinova T, Parvanova D, Atanassov A, Djilianov D (2002) Freezing tolerant tobacco, transformed to accumulate osmoprotectants. Plant Sci 163: 157–164. Kramer FG, Wang CY (1989) Correlation of reduced chilling injury with increased spermine and spermidine levels in zucchini squash. Physiol Plant 76: 479–484. Kratsch HA, Wise RR (2000) The ultrastructure of chilling stress. Plant Cell Environ. 23: 337–350. Krause GH, Weis E (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42 :313–349. Krivosheeva A, Tao DL, Ottander C, Wingsle G, Dube SL, Öquist G (1996) Cold acclimation and photoinhibition of photosynthesis in Scots pine. Planta 200/3: 296–305. Kuk YI, Shin JS, Burgos NR, Hwang TE, Han O, Cho BH, Jung S, Guh JO (2003) Antioxidative Enzymes Offer Protection from Chilling Damage in Rice Plants. Crop Sci. 43: 2109–2117. Lamarck JB (1778) In: Flore Francaise 3. L'Emprimerie Royale, Paris, pp. 537–539. Larcher W (2003) Physiological plant ecology. ecophysiology and stress of functional groups. 4th edn. Berlin, Heidelberg: Springer; 2003. Plants under stress: 345–450. Larcher W (1987) Stress bei Pflanzen. Naturwiss. 74: 158–167. Lattanzio V, Di Venere D, Linsalata V, Bertolini P, Ippolito A, Salerno M (2001) Low temperature metabolism of apple phenolics and quiescence of Phlyctaena vagabunda. Journal of Agriculture and Food Chemistry 49: 5817–5821. Lee B, Henderson DA, Zhu JK (2005) The Arabidopsis Cold-Responsive Transcriptome and Its Regulation by ICE1. Cell 17: 3155–3175. Lee HY, Hong YN, Chow WS (2001) Photoinactivation of photosystem II complexes and photoprotection by non-functional neighbours in Capsicum annuum L. leaves. Planta 212/3: 332–342. Lee SK, Young RE (1984) Temperature sensitivity of avocado fruit in relation to C2H4 treatment. J Am Soc Hort Sci 109: 689–692. Leivar P, Monte E, Al-Sady B, Carle C, Storer A, Alonso JM, Ecker JR, Quail PH (2008) The Arabidopsis Phytochrome-Interacting Factor PIF7, Together with PIF3 and PIF4, 118
Regulates Responses to Prolonged Red Light by Modulating phyB Levels. The Plant Cell 20: 337–352. Lelièvre JM, Tichit L, Fillion L, Larrigaudière C, Vendrell M, Pech JC (1995) Cold-induced accumulation of 1-aminocyclopropane 1-carboxylate oxidase protein in Granny Smith apples. Postharvest Biology and Technology 5/1–2: 11–17. León J, Lawton MA, Raskin I (1995) Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco. Plant Physiol 108: 1673–1678. Levy YY, Mesnage S, Mylne JS, Gendall AR, Dean C (2002) Multiple Roles of Arabidopsis VRN1 in Vernalization and Flowering Time Control. Science 297/5579: 243–246. Levitt J (1980) Responses of Plants to Environmental Stresses, Ed2. Academic Press, New York Li C, Zhang L, Shi Q, Li Q, Guo X, Li X, Yu X (2011) Effects of GMPase Overexpression on Ascorbic Acid Content and Relative Index to Low-temperature Tolerance in Tomato Plants. ACTA HORTICULTURAE SINICA 38 /4: 692–700. Lichtenthaler HK (1998) The stress concept in plants: an introduction. Ann N Y Acad Sci. 851: 187–198. Linster CL, Clarke SG (2008) L-Ascorbate biosynthesis in higher plants: the role of VTC2. Trends in Plant Science 13: 567–573. Linster CL, Gomez TA, Christensen KC, Adler LN, Young BD, Brenner C, Clarke SG (2007) Arabidopsis VTC2 Encodes a GDP-l-Galactose Phosphorylase, the Last Unknown Enzyme in the Smirnoff-Wheeler Pathway to Ascorbic Acid in Plants. J Biol Chem. 282/26: 18879–18885. Lippman Z, Gendrel AV, Black M, Vaughn MW, Dedhia N, McCombie WR, Lavine K, Mittal V, May B, Kasschau KD, Carrington JC, Doerge RW, Colot V, Martienssen R (2004) Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature 430: 471–476. Lipton WJ, Aharoni Y (1979) Chilling injury and ripening of 'honey dew' muskmelons stored at 2,5 ° and 5 °C after ethylene treatment at 20 °C. J Am Soc Hort Sci 104: 327–330. Liu Y, Hoffman NE, Yang SF (1985) Ethylene-promoted malonylation of 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid participates in autoinhibition of ethylene synthesis in grapefruit flavedo discs. Planta 164/4: 565–568. Lizada MCC, Yang SF (1979) A simple and sensitive assay for 1-amino-cyclopropane-1carboxylic acid. Anal Biochem 100: 140–146.
119
Lízal P, Dadejová M, Cetkovská K, Řepková J, Relichová J (2005) Molecular analysis of FRI (FRIGIDA) gene in early and late-flowering ecotypes and late-flowering mutants in Arabidopsis thaliana. From laboratory to business. ISBN 80-86778-16-9: 51. Luo JP, Jiang ST, Pan LJ (2001) Enhanced somatic embryogenesis by salicylic acid of Astragalus adsurgens Pall.: relationship with H2O2 production and H2O2-metabolizing enzyme activities. Plant Sci. 161: 125–132. Lyons JM, Raison JK (1970) Oxidative activity of mitochondria isolated from plant tissues sensitive and resistant to chilling injury. Plant Physiol. 45: 386–389. Lyons, JM (1973) Chilling injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 24: 445–466. Lyons JM, Raison JK, Steponkus PL (1979) The plant membrane in response to low temperature: An overview. In: Lyons JM, Graham D, Raison JK (eds.): Low Temperature Stress in Crop Plants: the Role of the Membrane. New York, Academic Press, pp. 1–24. Machácková I, Hanisová A, Krekule J. (1992) Changes in the level of MACC during cold hardening and dehardening in winter wheat. Physiol Plant 84: 399–402. Mahajan S, Tuteja N (2005) Cold, salinity and drought stresses: an overview. Arch Biochem Biophys 444: 139–158. Majláth I, Szalai G, Soós V, Sebestyén E, Balázs E, Vanková R, Dobrev PI, Tandori J, Janda T (2012) Effect of light on the gene expression and hormonal status of winter and spring wheat plants during cold hardening. Phys. Plant. 145/2: 296–314. Majláth I, Szalai G, Papp I, Vanková R, Janda T (2011) Atnoa1 mutant Arabidopsis plants induce compensation mechanisms to reduce the negative effects of the mutation. J Plant Physiol. 168/11: 1184–1190. Malamy J, Carr JP, Klessig DF, Raskin I (1990): Salicylic acid: A likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection. Science 250: 1002–1004. Mandre M (2002) Stress concepts and plants. Forestry Studies / Metsanduslikud uurimused 36: 9–16. Matern U, Grimmig B, Kneusel RE (1995) Plant cell wall reinforcement in the diseaseresistance response: molecular composition and regulation. Canandian Journal of Botany 73: S511–S517. Mato JM, Alvarez L, Ortiz P, Pajares MA (1997) S-adenosylmethionine synthesis: Molecular mechanisms and clinical implications. Pharmacology& Therapeutics 73/3: 265–280.
120
Martin B (1987) Arrhenius plots and the involvement of thermotropic phase transitions of the thylakoid membrane in chilling impairment of photosynthesis in thermophylic higher plants. Plant Cell Environ. 9: 323–331. May MJ, Vernoux T, Van Montagu M, Inzé D (1998) Glutathione homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant development. J. Exp. Bot. 49: 649– 667. McDonald RE (1986) Effects of vegetable oils, CO2, and film wrapping on chilling injury and decay of lemons. Hortscience 21: 476–477. McDonald RE, Kushad MM (1986) Accumulation of putrescine during chilling injury of fruits. Plant Physiol 82: 324–326.n Access McKhann HI, Gery C, Bérard A, Lévêque S, Zuther E, Hincha DK, Mita SD, Brunel D, Téoulé E (2008) Natural variation in CBF gene sequence, gene expression and freezing tolerance in the Versailles core collection of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology 8:105. Meeuse BJD, Raskin I (1988) Sexual reproduction in the arum lily family with emphasis on thermogenicity. Sex Plant Reprod 1: 3–15. Mehler AH (1951) Studies on reactivities of illuminated chloroplasts. I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Arch Biochem Biophys 33: 65–77. Meuwly P, Métraux JP (1993) Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous quantitation of salicylic acid and its putative biosynthetic precursors in cucumber leaves. Anal Biochem 214: 500–505. Meyerowitz EM, Ma H (1994) Genetic variations of Arabidopsis thaliana. In The Arabidopsis book (ed. Meyerowitz EM and Somerville CR): 1161–1268. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Michalak A (2006) Phenolic Compounds and Their Antioxidant Activity in Plants Growing under Heavy Metal Stress. Polish J. of Environ. 15,/4: 523-530. Millic BL, Djilas SM, Canadanovic-Brunet JM (1998) Antioxidative activity of phenolic compounds on the metal-ion breakdown of lipid peroxidation system. Food Chem. 61: 443. Minami A, Furuto A, Uemura M (2010) Dynamic compositional changes of detergentresistant plasma membrane microdomains during plant cold acclimation. Plant Signal Behav. 5/9: 1115–1118.
121
Mishra A, Mishra KB, Höermiller II, Heyer AG, Nedba L (2011) Chlorophyll fluorescence emission as a reporter on cold tolerance in Arabidopsis thaliana accessions. Plant Signal Behav. 6/2: 301–310. Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Van Breusegem F (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends Plant Sci 9/10: 490–508. Mittler R, Zilinskas BA (1991) Purification and characterisation of pea cytosolic ascorbate peroxidase. Plant Physiol 97: 962. Miyake C, Asada K (1996) Inactivation of mechanism of ascorbate peroxidase at low concentrations of ascorbate: hydrogen peroxide decomposes compound I of ascorbate peroxidase. Plant Cell Physiol 37: 423–430. Miyake C, Asada K (1994) Ferredoxin-dependent photoreduction of monodehydroascorbate radicals in spinach thylakoids. Plant Cell Physiol 35: 539–549. Miyake C, Cao WH, Asada K (1993) Purification and molecular properties of thylakoidbound ascorbate peroxidase from spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol 343: 881–889. Molina A, Bueno P, Carmen Marín, M, Rodríguez-Rosales MP, Belver A, Venema K, Donaire JP (2002) Involvement of endogenous salicylic acid content, lipoxygenase and antioxidant enzyme activities in the response of tomato cell suspension cultures to NaCl. 156/3: 409–415. Moreau M, Lee GI, Wang Y, Crane BR, Klessig DF (2008) AtNOS/AtNOA1 Is a Functional Arabidopsis thaliana cGTPase and Not a Nitric-oxide Synthase. J Biol Chem. 283/47: 32957–32967. Mukherjee M, Larrimore KE, Ahmed NJ, Bedick TS, Barghouthi NT, Traw MB, Barth C (2010) Ascorbic Acid Deficiency in Arabidopsis Induces Constitutive Priming That is Dependent on Hydrogen Peroxide, Salicylic Acid, and the NPR1 Gene. MPMI 23/3: 340–351. Murata N, Takahashi MA, Hamazaki Y (1982) Compositions and positionaldistributions of fatty acids in phospholipids from leaves of chilling-sensitive and chilling-resistant plants. Plant Cell Physiol 23: 1071–1079. Müller-Moulé P, Golan T, Niyogi KK (2004) Ascorbate-Deficient Mutants of Arabidopsis Grow in High Light Despite Chronic Photooxidative Stress. Plant Physiology 134: 1163–1172. Müller-Moulé P, Conklin PL, Niyogi KK (2002) Ascorbate Deficiency Can Limit Violaxanthin De-Epoxidase Activity in Vivo. Plant Physiology 128/3: 970–977.
122
Nagel-Volkmann J, Plieth C, Becker D, Luthen H, Dorffling K (2009) Cold-induced cytosolic free calcium ion concentration changes in wheat. Journal of Plant Physiology 166/17: 1955–1960. Naidu BP, Palega LG, Aspinall D, Jennings AC, Jones GP (1991) Amino acid and glycine betaine accumulation in cold-stressed wheat seedlings. Phytochemistry 30/2: 407–409. Nakano Y, Asada Y (1987) Purification of ascorbate peroxidase from spinach chloroplasts: its inactivation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant Cell Physiol 28: 371. Nawrath C, Heck S, Parinthawong N, Métraux JP (2002) EDS5, an Essential Component of Salicylic Acid–Dependent Signaling for Disease Resistance in Arabidopsis, Is a Member of the MATE Transporter Family. The Plant Cell 14: 275–286. Németh M, Janda T, Horváth E, Páldi E, Szalai G (2002) Exogenous salicylic acid increases polyamine content but may decrease drought tolerance in maize. Plant Sci 162: 569– 574. Nishida I, Murata N (1996) Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: the crucial contribution of membrane lipids. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47: 541–568. Niyogi KK (1999) Photoprotection revisited: genetic and molecular approaches. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 333–359. Noctor G, Foyer C (1998) Ascorbate and Glutatione: Keeping Active Oxygen Under Control. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. 49:249–79 Okuda T, Matsuda Y, Yamanaka A, Sagisaka S (1991) Abrupt increase in the level of hydrogen-peroxide in leaves of winter-wheat is caused by cold treatment. Plant Physiol. 97: 1265–1267. Oliveros JC (2007) VENNY. An interactive tool for comparing lists with Venn Diagrams. http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html. Ordentlich A, Linzer RA, Raskin I (1991) Alternative respiration and heat evolution in plants. Plant Physiol 97: 1545–1550. Overmyer K, Brosché M, Kangasjarvi J (2003) Reactive oxygen species and hormonal control of cell death. Trends Plant Sci 8: 335–342. Page M, Sultana N, Paszkiewitz K, Florance H, Smirnoff
N (2012) The influence of
ascorbate on anthocyanin accumulation during high light acclimation in Arabidopsis thaliana: further evidence for redox control of anthocyanin synthesis. Plant, Cell & Environment Special Issue: Special Issue on Redox Signaling 35/2: 388–404.
123
Park SW, Kaimoyo E, Kumar D, Mosher S, Klessig DF (2007) Methyl salicylate is a critical mobile signal for plant systemic acquired resistance. Science 318: 113–116. Pietrini F, Massacci A (1998) Leaf anthocyanin content changes in Zea mays L. grown at low temperature: Significance for the relationship between the quantum yield of PS II and the apparent quantum yield of CO2 assimilation. Photosynthesis Research 58/3: 213– 219. Popovic RK, Kyle DJ, Cohen AS, Zalik S (1979) Stabilization of thylakoid membranes by spermine during stress-induced senescence of barley leaf discs. Plant Physiol 64: 721– 726. Prasad TK, Anderson MD, Martin BA, Stewart CR (1994) Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide. Plant Cell 6: 65–74. Purvis AC, Shewfelt RL (1993) Does the alternative pathway ameliorate chilling injury in sensitive plant tissues? Physiol Plant 88: 712–718. Quinn PJ (1988) Effects of temperature on cell membranes In: Long SP, Woodward FI (eds.) Plants and Temperature. Symp. Soc. Exp. Biol. 42, Cambridge, The Company of Biologists Limited, pp. 237–258. Radzio JA, Lorence A, Chevone BI, Nessler CL (2003) L-Gulono-1,4-lactone oxidase expression rescues vitamin C-deficient Arabidopsis (vtc) mutants. Plant Molecular Biology 53: 837–844. Roje S (2006) S-Adenosyl-l-methionine: Beyond the universal methyl group donor. 67/15: 1686–1698. Rakwal R, Agraval GK, Agraval VP (2001) Jasmonate, salicylate, protein phophatase 2A inhibitors and kinetin up-regulate OsPR5 expression in cut-responsive rice (Oryza sativa). J Plant Physiol 158: 1357–1362. Randhir R, Lin YT, Shetty K (2004) Phenolics, their antioxidant and antimicrobial activity in dark germinated fenugreek sprouts in response to peptide and phytochemical elicitors. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 13: 295–307. Rao MV, Paliyath G, Ormrod DP, Murr DP, Watkins CB (1997) Influence of salicylic acid on H2O2 production, oxidative stress, and H2O2–metabolizing enzymes. Plant Physiol 115: 137–149. Raskin I (1992) Role of salicylic acid in plants. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43: 439–463.
124
Raskin I, Ehmann A, Melander WR, Meeuse BJD (1987) Salicylic acid: a natural inducer of heat production in Arum lilies. Science 237: 1601–1602. Reyes-Díaz M, Ulloa N, Zuñiga-Feest A, Gutiérrez A, Gidekel M, Alberdi M, Corcuera LJ, Bravo LA (2006) Arabidopsis thaliana avoids freezing by supercooling. Journal of Experimental Botany 57/14: 3687–3696. R Development Core Team R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 2008. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL: http://www.R-project.org. Ritchie ME, Silver J, Oshlack A, Holmes M, Diyagama D, Holloway A, Smyth GK (2007) A comparison
of
background
correction
methods
for
two-colour
microarrays.
Bioinformatics 23: 2700–2707. Rhoads DM, McIntosh L (1992) Salicylic acid regulation of respiration in higher plants: alternative oxidase expression. Plant Cell 4: 1131–1139. Rorat T (2006) Plant dehydrins – tissue location, structure and function. Cellular & Molecular Biology Letters 11: 536–556. Ruelland E, Vaultier MN, Zachowski A, Hurry V (2009) Cold signalling and cold acclimation in plants. Advances in Botanical Research 49: 36–150. Rüffer M, Steipe B, Zenk MH (1995) Evidence against specific binding of salicylic acid to plant catalase. FEBS Letters 377: 175–180. Salisbury FB, Ross CW (1992) Plant Physiology. Belmont, CA: Wadsworth. pp. 357–407, 531–548. Salluca TG, Peñarrieta JM, Alvarado JA, Bergenstähl B (2008) Determination of total phenolic compounds content and the antioxidant capacity of andean tubers and roots. Revista Boliviana de Química 25/1: 58–61. Sano S, Tao S, Endo Y, Inaba T, Hossain MA, Miyake C, Matsuo M, Aoki H, Asada K, Saito K (2005) Purification and cDNA cloning of chloroplastic monodehydroascorbate reductase from spinach. Biosci Biotechnol Biochem 69: 762–772. Sánchez-Casas P, Klessig DF (1994) A salicylic acid-binding activity and a salicylic acidinhibitable catalase activity are present in a variety of plant species. Plant Physiol 106: 1675–1679. Saruhan N, Terzi R, Saglam A, Kadioglu A (1999) The relationship between leaf rolling and ascorbate-glutathione cycle enzymes in apoplastic and symplastic areas of Ctenanthe setosa subjected to drought stress. Biol Res. 42/3: 315–326. 125
Scalbert A (1991) Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry 30: 3875–3883. Schreck R, Rieber P, Bauerle PA (1991) Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kB transcription factor and HIV-1. EMBO J. 10: 2247–2258. Scott IM, Clarke SM, Wood JE, Mur LAJ (2004) Salicylate accumulation inhibits growth at chilling temperature in Arabidopsis. Plant Physiol 135: 1040–1049. Selye H (1973) The evolution of the stress concept. Am. Sci. 61: 692–699. Seo M, Peeters AJM, Koiwai H, Oritani T, Marion-Poll A, Zeevaart JAD, Koornneef M, Kamiya Y, Koshiba T (2000) The Arabidopsis aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product catalyzes the final step in abscisic acid biosynthesis in leaves. PNAS 97/23: 12908–12913. Seppänen MM, Cardi T, Borg Hyökki M, Pehu E (2000) Characterization and expression of cold-induced glutathione S-transferase in freezing tolerant Solanum commersonii, sensitive S. tuberosum and their interspecific somatic hybrids. Plant Sci. 153/2:125–133. Schuler MA (1996) Plant cytochrome P450 monooxygenases. Critical Reviews in Plant Sciences 15: 235–284. Schmitz RJ, AmasinoRM (2007) Vernalization: A model for investigating epigenetics and eukaryotic gene regulation in plants. Biochimica Biophysica Acta 1769: 269–275. Shen W, Nada K, Tachibana S (2000) Involvement of polyamines in the chilling tolerance of cucumber cultivars. Plant Physiol 124: 431–440. Shigeoka S, Ishikawa T, Tamoi M, Miyagawa Y, Takeda T, Yabuta Y, Yoshimura K (2002) Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. J. Exp. Bot. 53: 1305– 1319. Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozak K (2007) Gene networks involved in drought stress response and tolerance. Journal of Experimental Botany 58/2: 221–227. Siddiqui, KS, Cavicchioli, R (2006). Cold-adapted enzymes. Annual review of Biochemistry 75: 403–433. Smirnoff N, Conklin PL, Loewus FA (2001) Biosynthesis of ascorbic acid in plants: A Renaissance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52: 437–467. Smyth GK, Speed TP (2003) Normalization of cDNA microarray data. Methods 31: 265–273. Smyth GK (2004) Linear models and empirical Bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol 31: 1–25.
126
Smyth GK (2005) LIMMA: Linear models for microarray data. In: Gentleman R, Carey VJ, Huber W, Irizarry RA, Dudoit S (eds): Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor, Springer, New York, pp 397 – 420. Smith IK, Vierheller TL, Thorne CA (1988) Assay of glutathione reductase in crude tissue homogenates using 5,5’-dithiobis (2-nirtobenzoic acid). Anal. Biochem 175: 408–413. Smith H, Whitelam GC (1997) The shade avoidance syndrome: multiple responses mediated by multiple phytochromes. Plant Cell Environ 20: 840–844. Smith MA, Davies PJ (1985) Separation and quantitation of polyamines in plant tissue by high performance liquid chromatography of their dansyl derivatives. Plant Physiol 78: 89– 91. Soitamo AJ, Piippo M, Allahverdiyeva Y, Battchikova N, Aro EM (2008) Light has a specific role in modulating Arabidopsis gene expression at low temperature. BMC Plant Biol 8: 13. Somers DE (2005) ZEITLUPE and the control of circadian timing. In: Wada M, Shimazaki K, Iino M, eds, Light Sensing in Plants. Springer, Tokyo: 347–354. Somers DE, Kim WY, Geng R (2004) The F-box protein ZEITLUPE confers dosage dependent control on the circadian clock, photomorphogenesis, and flowering time. Plant Cell 16: 769–782. Steffen KL, Palta JP (1989) Growth and Development Temperature Influences Level of Tolerance to High Light Stress. Plant Physiol. 91/4: 1558–1561. Steyn WJ, Wand SJE, Holcroft DM, Jacobs G (2002) Anthocyanins in Vegetative Tissues: A Proposed Unified Function in Photoprotection. New Phytologist 155/3: 349–361. Sung S, Amasino RM (2005) Remembering winter: toward a molecular understanding of vernalization. Annu Rev Plant Biol 56: 491–508. Suzuki N, Mittler R (2006) Reactive oxygen species and temperature stresses: A delicate balance between signaling and destruction. Physiologia Plantarum 126: 45–51. Svirbely J, Szent-Györgyi A (1933) The Chemical Nature of Vitamin C. The Biochemical Journal 27/1: 279–285. Szalai Sz, Horgosi Sz, Soós V, Majláth I, Balázs E, Janda T (2011) Salicylic acid treatment of pea seeds induces its de novo synthesis. J Plant Physiol 168: 213–219. Szalai G, Pap M, Janda T (2009) Light-induced frost tolerance differs in winter and spring wheat plants. J Plant Physiol 166: 1826–1831.
127
Szalai G, Janda T (2009) Effect of salt stress on the salicylic acid synthesis in young maize (Zea mays L.) plants. J Agron. Crop Sci. 195/3: 165–171. Szalai G, Pál M, Horváth E, Janda T, Páldi E (2005) Investigations on the adaptability of maize lines and hybrids to low temperature and cadmium. Acta Agron Hung 53: 183– 196. Szalai G, Janda T, Páldi E, Dubacq JP (2001) Changes in the fatty acid unsaturation after hardening in wheat chromosome substitution lines with different cold tolerance. J Plant Physiol 158: 663–666. Szalai G, Janda T, Bartók T, Páldi E (1997) Role of light in changes in free amino acid and polyamine contents at chilling temperature in maize (Zea mays L.). Physiol Plant 101: 434–438. Szent-Györgyi A (1931) On the function of hexuronic acid in the respiration of the cabbage leaf. J Biol Chem 90: 385–393. Tabuchi T, Kawaguchi Y, Azuma T, Nanmori T, Yasuda T (2005) Similar Regulation Patterns of Choline Monooxygenase, Phosphoethanolamine N-Methyltransferase and SAdenosyl-l-Methionine Synthetase in Leaves of the Halophyte Atriplex nummularia L. Plant and Cell Physiology 46/3: 505–513. Tachibana S (2000) Physiology of polyamines and their involvement in abiotic stress tolerance of plants. Regul Plant Growth Dev 35: 56–66. Takesawa T, Ito M, Kanzaki H, Kameya N, Nakamura I (2002) Over-expression of γglutathione S-transferase in transgenic rice enhances germination and growth at low temperature. Molecular Breeding 9: 93–101. Tanaka K, Takeuchi E, Kubo A, Sakaki T, Haraguch K, Kawamura Y (1991) Two immunologically different isozymes of ascorbate peroxidase from spinach leaves. Arch Biochem. Biophys 286: 371. Tari I, Nagy M (1994) Enhancement of extractable ethylene at light/dark transition in primary leaves of paclobutrazol-treated Phaseolus vulgaris seedlings. Physiol Plant 90: 353–357. Telfer A, Bishop SM, Phillips D, Barber J (1994) Isolated photosynthetic reaction center of photosystem II as a sensitizer for the formation of singlet oxygen. J Biol Chem 269: 13244–13253. Tisné S, Barbier F, Granier C (2011) The ERECTA gene controls spatial and temporal patterns of epidermal cell number and size in successive developing leaves of Arabidopsis thaliana. Annals of Botany. 108/1: 159–168.
128
Thomashow MF (2001) So what's new in the field of plant cold acclimation? Lots! Plant Physiol 125: 89–93. Thomashow MF (1999) Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 571–599. Thomashow MF (1994) Arabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance. In: Meyerowitz E, Somerville C, editors. Arabidopsis. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press: 807–834. Tong CBS, Yang SF (1987) Chilling-induced ethylene production by beans and peas. J Plant Growth Regul 6: 201–208. Torii KU, Mitsukawa N, Oosumi T, Matsuura T, Yokoyama R, Whittier RF, Komeda Y. (1996) The Arabidopsis ERECTA Gene Encodes a Putative Receptor Protein Kinase with Extracellular Leucine-Rich Repeats. The Plant Cell Vol. 8:735–746. Traw MB, Kim J, Enright S, Cippolini DF, Bergelson J (2003) Negative cross-talk between salicilate- and jasmonatemediated pathways in the Wasslewskija ecotype of Arabidopsis thaliana. Molecular Ecology 12: 1125–1135. Blackwell Publishing Ltd.
Ugarte CC, Trupkin SA, Ghiglione H, Slafer G, Casal JJ (2010) Low red/far-red ratios delay spike and stem growth in wheat. Journal of Experimental Botany 61/11: 3151–3162. van Camp W, Van Montagu M, Inzé D (1998) H2O2 and NO: redox signals in disease resistance. Trends Plant Sci 3: 330–334. van de Venter HA (1985) Cyanide-resistant respiration and cold resistance in seedlings of maize (Zea mays L.) Annals of Bot. 56: 561–563. van Kooten O, Snel JFH (1990) The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25: 147–150. Veisz O (1989) A megvilágítás hosszának és spektrális összetételének hatása az őszi búza fagyállóságára. Növénytermelés 38: 105-110. Verlues, N, Agarwal M, Katiyar-Agarwal S, Zhu S, Zhu JK (2006) Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing abiotic stresses that affect plant water status. The Plant Journal 45: 523–539. Volk T, Bugbee B. (1991) Modeling light and temperature effects on leaf emergence in wheat and barley. Crop Sci. 31/5: 1218–1224.
129
Wang SD, Zhu F, Yuan S, Yang H, Xu F, Shang J, Xu MJ, Jia SD, Zhang ZV, Wang JH, Xi DH, Lin HH (2011) The roles of ascorbic acid and glutathione in symptom alleviation to SA-deficient plants infected with RNA viruses. Planta 234/1: 171–181. Wang CY (1989) Relation of chilling stress to ethylene production. – In Low temperature stress physiology in crops (Li PH ed.) pp. 177–189. CRC press, Boca Raton. Wang CY, Sams CE, Gross KC (1985) Ethylene, ACC, soluble polyuronide, and cell wall noncellulosic neutral sugar content in 'Eldorado' pears during cold storage and ripening. J Am Hort Sci 110: 687–691. Wang CY, Adams DO (1982) Chilling-induced ethylene production in cucumbers (Cucumis sativus). Plant Physiol 69: 424–427. Wang G, Schmalenbach I, von Korff M, Léon J, Kilian B, Rode J, Pillen K (2010) Association of barley photoperiod and vernalization genes with QTLs for flowering time and agronomic traits in a BC2DH population and a set of wild barley introgression lines. Theor Appl Genet. 120/8: 1559–1574. Wang X, Li J, Liu J, He W, Bi Y (2010) Nitric oxide increases mitochondrial respiration in a cGMP-dependent manner in the callus from Arabidopsis thaliana. Nitric Oxide 23: 242– 250. Wanner LA, Junttila O (1999) Cold-Induced Freezing Tolerance in Arabidopsis. Plant Physiology 120/2: 391–400. Warren GJ, McKown R, Marin A, Teutonico R (1996) Isolation of mutants affecting the development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Physiology 111: 1011–1019. Wheeler GL, Jones MA, Smirnoff N (1998) The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants. Nature 393/6683: 365–369. Weigel D (2012) Natural Variation in Arabidopsis: From Molecular Genetics to Ecological Genomics. Plant Physiology 158/1: 2–22. Welti R, Li Weigi, Li M, Sang Y, Biesiada H, Zhou HE, Rajashekar CB, Williams TD, Wang X (2002) Role of phospholipase D in freezing-induced lipid changes in Arabidopsis.The Journal of Biological Chemistry 277: 31994–32002. Wildermuth MC, Dewdney J, Wu G, Ausubel FM (2001) Arabidopsis defence againts pathogens requires salicylic acid synthesized isichorismate synthase. Nature 414: 562– 565. Winfield MO, Lu C, Wilson ID, Coghill JA, Edwards KJ (2010) Plant responses to cold: transcriptome analysis of wheat. Plant Biotechnology Journal 8: 749–771. 130
Wingsle G, Karpinski S, Hällgren JE (1999) Low temperature, high light stress and antioxidant defence mechanisms in higher plants. Phyton 39/4: 253–268. Zanten M, Snoek LB, Proveniers MCG, Peeters AJM (2009) The many functions of ERECTA. Trends in Plant Science 14/4: 214–218. Zhang C, Fei SZ, Warnke S, Li L, Hannapel D (2010) Ice recrystallization inhibition proteins of perennial ryegrass enhance freezing tolerance. Planta 232: 155–164. Zhang H, Wang J, Nickel U, Allen RD, Goodman HM (1997) Cloning and expression of an Arabidopsis gene encoding a putative peroxisomal ascorbate peroxidase. Plant Molecular Biology 34/6: 967–971. Zhang X, Yazaki J, Sundaresan A, Cokus S, Chan SW, Chen H, Henderson IR, Shinn P, Pellegrini M, Jacobsen SE, Ecker JR (2006) Genome-wide high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in Arabidopsis. Cell. 126/6: 1189–1201. Zhao MG, Tian QY, Zhang WH (2007a) Nitric oxide synthase-dependent nitric oxide production is associated with salt tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol 144: 206–217. Zhao MG, Zhao X, Wu Y, Zhang L (2007b) Enhanced sensitivity to oxidative stress in an Arabidopsis nitric oxide synthase mutant. J Plant Physiol 164: 737–745. Zhou MQ, Shen C, Wu LH, Tang KX, Lin J (2010) CBF-dependent signaling pathway: A key responder to low temperature stress in plants. Critical Reviews in Biotechnology 31/2: 186–192. Zhu J, Verslus PE, Zheng X, Lee BH, Zhan X, Manabe Y, Sokolchik I, Zhu Y, Dong CH, Zhu JK, Hasegawa PM, Bressan RA (2005) HOS10 encodes an R2R3-type MYB transcription factor essential for cold acclimation in plants. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 102: 9966–9971. Yalpani N, Silverman P, Wilson TMA, Kleier DA, Raskin I (1991) Salicylic acid is a systemic signal and an inducer of pathogenesis-related proteins in virus-infected tobacco. Plant Cell 3: 809–818. Yancey PH (2005) Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses. The Journal of Experimental Biology 208: 2819–2830. Yang YH, Dudoits S, Luu P, Lin DM, Peng V, Ngai J, Speed TP (2002) Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucl Acids Res 30: e15. Yin YH, Tao DL, Hao ZQ, Ye J, Du, Yj, Liu HL, Zhou YB (2003) Environmental stresses and redox status of ascorbate. Acta Botanica Sinica 45/7: 795–801. 131
Yoshimura K, Yabuta Y, Ishikawa T, Shigeoka S (2002) Identification of a ciselement for tissue-specific alternative splicing of chloroplast ascorbate peroxidase pre-mRNA in higher plants. J Biol Chem 277: 40623–40632. Yu XM, Griffith M, Wiseman SB (2001) Ethylene induces antifreeze activity in winter rye leaves. Plant Physiol. 126/3: 1232–1240. Xiong L, Zhu JK (2003) Regulation of Abscisic Acid Biosynthesis. Plant Physiology 133/1: 29–36.
132
10. Melléklet MI. táblázat Az Arabidopsis kísérletekhez használt fagyasztási program. Min T: -11 °C – 24h
Kamraprogram Időpont Hőmérséklet Időpont 2011.11.15. 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00 2011.11.16. 0:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00 6:00 7:00 8:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00
4°C 2°C 0°C -1°C -2°C -3°C -4°C -5°C -6°C -7°C -8°C -9°C -10°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C -11°C
21:00 22:00 23:00 2011.11.17. 0:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00 6:00 7:00 8:00 9:00 10:00 11:00 12:00
133
Hőmérséklet -11°C -11°C -11°C -11°C -9°C -7°C -3°C -1°C 1°C 3°C 5°C 8°C 10°C
MII. táblázat Az Arabidopsis kísérletekhez használt fagyasztási program. Min T: -9 °C – 24h
Kamraprogram Időpont Hőmérséklet Időpont 2011.11.15. 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00 2011.11.16. 0:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00 6:00 7:00 8:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00
4°C 2°C 0°C -1°C -2°C -3°C -4°C -5°C -6°C -7°C -8°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C -9°C
21:00 22:00 23:00 2011.11.17. 0:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00 6:00 7:00 8:00 9:00 10:00 11:00 12:00
134
Hőmérséklet -9°C -9°C -7°C -5°C -3°C -1°C 1°C 3°C 5°C 8°C 10°C
Köszönetnyilvánítás Köszönetem szeretném kifejezni a MTA ATK Mezőgazdasági Intézet vezetőségének, hogy lehetővé tették a munka elvégzését. Külön köszönettel tartozom Dr. Szalai Gabriellának, aki elvállalta a témavezetésemet és mindvégig számíthattam hasznos tanácsaira és türelmére. Köszönök minden segítséget, tanácsot és biztatást, valamint az értekezés alapos átnézését osztályvezetőmnek, Dr. Janda Tibornak. Mindkettejüknek hálával tartozom, hogy szünbiológus végzettséggel lehetőséget kaptam, hogy megkezdhessem a munkámat a növényélettan területén. Köszönöm Dr. Pál Magda, Dr. Tandori Júlia és Dr. Gáspár László, valamint Kovács Viktória és Gondor Orsolya Kinga segítségét, akik a kísérletes munkák kezdeti, illetve egyes későbbi szakaszaiban segítettek. A genomikai vizsgálatokban köszönöm Dr. Soós Vilmos és Dr. Sebestyén Endre segítségét. Köszönettel tartozom asszisztenseinknek, Kövesdi Ferencnének és Kóti Gyulánénak (†) a kísérletek kivitelezésében nyújtott segítségükért. Ők voltak azok, akik bevezettek a laboratórium „életébe”. Az angliában végzett molekuláris genetikai munka elvégzésének biztosításáért, illetve a publikálatlan eredményeik egy részének a dolgozatban való közlési jogáért köszönettel tartozom Dr. Keara A. Franklin-nek. A kísérletes munkában való segítségért Dr. Dhaval V. Patel-nek és Dr. Gordon Brown-nak. Köszönetemet fejezem ki mindazon magyar és külföldi kollégáknak, akiket bár név szerint nem említek, de bármilyen formában segítették a munkámat.
A munkák anyagi hátterét az OTKA-K75584, illetve az AGRISAFE FP7-203288, WP1, Task 1.7. pályázat fedezte.
135
