Oleh :
Didik Wahyudi(1), Sutarno (2), Artini Pangastuti (2) 1.
Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta 2. Prodi Biosains Pasca Sarjana UNS Surakarta
QUORUM SENSING Suatu proses yang memungkinkan bakteri dapat berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal yang disebut autoinducer atau molekul sinyal sebagai bahasa. Proses ini memungkinkan suatu populasi bakteri dapat mengatur ekspresi gen tertentu, tingkah laku dan fenotipiknya, yang bergantung kepada jumlah populasi bakteri tersebut dan akumulasi autoinducernya.
Beberapa Peneliti Sistem Quorum Sensing Bakteri
Clay Fuqua
DENMARK UNIVERSITY
Yonsei University, Seoul, Korea Selatan.
Indiana University
Allison L Adonizio Florida International University Miami
Yaya Rukayadi
Fajar Mustika
Djordjevic
School of Life Sciences andTechnology - ITB
Massachusetts University
PLAY
SISTEM QUORUM SENSING BAKTERI MENGENDALIKAN EKSPRESI GEN
SPORULASI
BIOLUMINESCENS
PRODUKSI PIGMEN
SEKRESI VIRULENSI FACTOR PRODUKSI TOKSIN
MOTILITAS
PEMBENTUKAN BIOFILM (Taga dan Bassler, 2003).
http://www.quiestech.com/content/science/quorum-sensing_more.asp
QUORUM SENSING BLOCKING Ekstrak Alpina galanga
???
1. sistem quorum sensing, dapat dikembangkan untuk pengendalian infeksi yang dilakukan dengan mencegah pengumpulan massa bakteri atau merusak sistem komunikasinya.
2. Produksi Eksopretease dikendalikan oleh sistem quorum sensing, sehingga produksi eksoprotease bisa dijadikan indikator sistem quorum sensing
BIOFILM BAKTERI Biofilm adalah istilah yang digunakan untuk menggambarkan suatu lingkungan kehidupan yang khusus dari sekelompok mikroorganisme, yang melekat ke suatu permukaan, menjadi mikrolingkungan yang unik. Ada lima tahap perkembangan biofilm P. aeruginosa 1. 2. 3. 4. 5.
initial attachment irreversible attachment maturation I maturation II dispersion
Pseudomonas aeruginosa Phylum
Class Order Family
: Proteobacteria : GammaProteobacteria : Pseudomonadales : Pseudomonadaceae
Penyebab Nosokomial infeksi paling tinggi dibandingkan bakteri jenis lainnya (26%) (Bagian Mikrobiologi Klinik RSPM Jakarta, 1998).
Lengkuas (Alpinia galanga L) Klas Order Family
:Monocots :Zingiberales :Zingiberaceae Catherine (2002)
Khasiat: antibakteri, anti fungi, anti tumor, analgenikum, anti kembung, obat penyakit kulit. sakit perut , radang tenggorokan, diare, sariawan, herpes
Zat Kimia yang terkandung dalam Ekstrak etanol Alpinia galanga L • • • • • • •
asetokavikol asetat, p-coumaril siasetat, asam palmitat, eugenol, asetosiugenol asetat, bisabolene, farnesen,
• • • • • • • •
eskuifelandren. fenolik ester asam lemak asam lemak galanal A galanal B, galanolakton, terpen, dan lain-lain.
RUMUSAN PERMASALAHAN 1. Apakah ekstrak Alpinia galanga L mampu menghambat sistem quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa? 2. Berapakah konsentrasi ekstrak Alpinia galanga L yang paling efektif dalam menghambat sistem quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa?
3. Apakah terdapat perbedaan kemampuan penghambatan sistem quorum sensing pada Alpinia galanga L yang diperoleh dengan pelarut polar (eatanol) dan semi polar (etil asetat)?
Pseudomonas aeruginosa
Sistem Quorum sensing Acyl Homoserin lactone, Ekspresi Gen untuk Faktor Virulensi
Esktrak Alpinia galanga L
Sistem Quorum Sensing dihambat! Bakteri Tidak membentuk Faktor Virulensi dan Biofilm
Pembentukan Biofilm
Patogen
Penyakit Infeksi
Tidak Menjadi Patogen
Infeksi Dihambat.
HIPOTESIS Ekstrak Alpinia galanga L mempunyai kemampuan dalam
menghambat sistem quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa. Ada perbedaan kemampuan penghambatan sistem quorum
sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut polar (eatanol) dan semi polar (etil asetat).
Waktu dan Tempat Penelitian Laboratorium Bakteriologi dan Kimia Farmasi AAK
Nasional Surakarta pada bulan November 2009 - Juni 2010. Jl. Yos Sudarso 338 Surakarta 57155.
Laboratorium Mikrobiologi, Media Reagensia Balai dan
Laboratorium Kimia Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta (Lab. rujukan Nasional bidang Mikrobiologi Klinik, ISO 17025:2005). Bulan Desember 2009 – Juni 2010.
isolasi & Persiapan Bakteri Uji
Persiapan Media Biakan
Ekstraksi Alpinia galanga L
Uji Penghambatan Quorum Sensing Kurva Pertumbuhan
Uji pembentukan Biofilm: Microtiter Plate Polivinil Clorida (PVC) Analisis Data
BAKTERI UJI Bakteri strain. Pseudomonas aeruginosa diperoleh dari Pseudomonas aeruginosa yang diisolasi dari Rumah Sakit Umum Dr. Moewardi Surakarta
Lengkuas (Alpinia galanga L) Alpinia galanga L (Lengkuas) yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis Lengkuas merah besar berumur 4 – 5 bulan, yang didapatkan dari Perkebunan Tanaman Obat di Kecamatan Jatiyoso, Kabupaten Karanganyar, Provinsi Jawa Tengah
Persiapan Media Biakan Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Luria-Bertani (LB) dilengkapi dengan 0,5% glukosa dan 2 % susu skim (media AB, mengandung 2,5 mg tiamin / liter). semua strain yang diinkubasi pada 37 ° C.
Alpinia galanga L 1 kg DIPARUT & DIKERINGKAN 100 g rimpang diekstrak dalam 500ml etanol 70% selama 24 jam
DISARING, Filtrat dievavorasi dengan Rotary Evaporator 40C Vakum Setelah kering di tambah 10 ml etanol dan 20 ml heksana
Dikocok, lapisan etanol dikeringkan jadi kristal
di Larutkan dalam etanol 1% (1:100 w/v)
media LB Agar + 0,5% Glukosa + 2% susu skim inokulasi P. aeruginosa ke media agar dengan spot plate
Inkubasi pada suhu 30 C 24 jam
Ditunggu sampai dingin dan keras
Adanya zona hambatan disekitar koloni indikasi adanya enzim eksoprotease
Pengujian Kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa Tujuan untuk mengetahui aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa. Prinsip pengujian berdasarkan metode Hanlon dan Hodges (1981); kemampuan enzim protease untuk menghidrolisis Azocasein. Residu azocasein yang tidak dapat terhidrolisis oleh enzim eksoprotease akan diendapkan oleh tricloro acetic acid
Endapan dipisahkan, filtrat akan membentuk warna bila direaksikan dengan NaOH. Intensitas warna diukur dengan spektrofotometer OD 440 nm.
Pengukuran Pertumbuhan Bakteri
Kurva pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa diukur dengan spektofotometer (OD 600nm)
Kultur P.a terhambat diinkubasi dalam 10 ml TSBYE 32C, 24 jam
Analisis kuantitatif
Pewarnaan dengan kristal violet 1%, lalu dicuci
0,1 ml kultur di TSBYE dipindahkan ke 10 ml LB Broth
Di bandingkan dengan kontrol VORTEX Kekeruhan sel dipantau menggunakan microtiter pembaca pada OD 595
Ditutup dan diinkubasi pada 32C, 20 – 40 jam
100µl dipindahkan ke microtiter Plate PVC
HASIL PENELITIAN
Hasil Uji Sensitivitas antibiotik P. aeruginosa Hasil Isolasi dari RSU Dr. Moewardi Surakarta
NO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
NAMA OBAT
Amoxycillin Amoxycillin Clav.Acid Cefriaxone Ceffazidime Clindamisin Ciprofloxacine Penicillin G Sulfamethaxazole Fosfomycin Trimetrhoprim Streptomycin Meropenem Imipenem Nalidic Acid Amikacin Cloramphenicol Gentamycin Netilmycin Novobiocin Cephalothin Cefuroxime Kanamycin Cefepime Cefoxitin Coumpounds Ofloxacin Piperacillin
KODE
POTENSI OBAT (µ GRAM)
HASIL
AML AMC CRO CAZ DA CIP P SXT FOS W SXT MEM IPM NA AK C CN NET NV KF CXM KF FEP FOX CMP OFL PPR
10 30 30 2 5 5 30 100 50 5 10 30 30 30 300 30 10 15 5 20 30 15 30 30 300 30 100
Resisten Resisten Sensitif Resisten Resisten Resisten Resisten Resisten Sensitif Resisten Resisten Sensitif Sensitif Resisten Resisten Resisten Sensitif Sensitif Resisten Resisten Resisten Resisten Sensitif Resisten Sensitif Resisten Sensitif
Absorbansi
Jumlah Bakteri
Log Jumlah Bakteri
0
0.124
8,9 x 105
5.94939
2
0.119
9,8 x 105
5.98900
4
0.137
3,2 x
106
6.50515
6
0.243
7,7 x 107
7.88649
8
0.482
8,2 x 108
8.91381
10
0.752
1,8 x 1010
10.25527
12
1.066
8,7 x 1011
11.93952
14
1.123
9,8 x 1011
11.99123
16
1.162
3,3 x 1011
11.51851
18
1.104
9,8 x 1011
11.99123
20
1.178
6,2 x 1011
11.79239
22
1.089
8,4 x 109
9.92427
24
1.092
1,4 x 109
9.14612
Kurva Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa
1.4 1.2 1 0.8
Absorbansi
Jam ke
0.6 0.4 0.2 0 0
2
4
6
8
10
12
Jam ke
14
16
18
20
22
24
kontrol
2%
4%
Rata-rata Diameter Koloni (mm)
Zona Bening (mm)
Rata-rata Luas Zona Bening (mm)
0%
13.7
18.0
107.7
2%
12.3
16.3
90.1
4%
10.7
14.7
79.6
6%
8.7
10.7
30.4
8%
8.0
0.0
0.0
10%
5.0
0.0
0.0
12%
4.0
0.0
0.0
Konse ntrasi
6%
12%
10%
8%
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni Pseudomonas aeruginosa dengan pemberian ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut Etanol pada medium pertumbuhannya
kontrol
2%
4%
Rata-rata Diameter Konse ntrasi
6%
12%
Ratarata Luas Zona Bening mm
Koloni (mm)
Zona Bening (mm)
0%
13.0
17.0
94.3
2%
12.0
15.3
71.2
4%
11.3
13.3
38.8
6%
9.0
11.0
31.4
8%
7.0
0
0
10%
6.7
0
0
12%
4.7
0
0
10%
8%
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni Pseudomonas aeruginosa dengan pemberian ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etil asetat pada medium pertumbuhannya
Nilai Rata-rata produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa pada beberapa perlakuan dengan ekstrak A. galanga L. No
Perlakuan
Rata-rata
0
Kontrol
0.872a
1
kontrol + DMSO
0.737a
2
6% Ekstrak dengan pelarut etanol
0.726a
3
8% Ekstrak dengan pelarut etanol
0.655b
4
6% Ekstrak dengan pelarut Etil Asetat
0.705a
5
8% Ekstrak dengan pelarut etil asetat
0.671b
Ket : Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
Kurva produksi enzim eksoprotease Pseudomonas aeruginosa 9.00
8.00 7.00
U/ml
6.00 5.00 4.00 3.00 2.00
1.00 0.00 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Jam ke
kontrol
kontrol + DMSO
6% Ekstrak etanol
8% ekstrak etanol
6% Ekstrak Etil Asetat
8% ekstrak etil asetat
OD (600nm)
Pengukuran Pertumbuhan P. aeruginosa pada berbagai perlakuan 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 Jam Ke
kontrol
kontrol + DMSO
6% Ekstrak etanol
8% ekstrak etanol
6% Ekstrak Etil Asetat
8% ekstrak etil asetat
Rata-rata Produksi biofilm (berdasarkan Optical Density) pada P. aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi 6% dan 8%.
ekstrak 6% pelarut etanol (1)
kontrol (0)
ekstrak 6% pelarut etil asetat (2)
ekstrak 8% pelarut etanol (3)
ekstrak 8% pelarut etil asetat (4)
20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 2.548a
2.503a
1.746b
1.503b
1.722b
1.488b
1.582b
1.226b 1.606b
Ket : Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata.
1.254b
Rata-rata Produksi biofilm pada Pseudomonas aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi 6% dan 8%. 3.000
OD (595nm)
2.500
2.000 1.500 1.000 0.500
0.000 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam kontrol
Ekstrak 6% pelarut etanol
Ekstrak 6% pelarut Etil Asetat
Ekstrak 8% pelarut etanol
Ekstrak 8% pelarut Etil Asetat
Penurunan Pembentukan Biofilm P. aeruginosa 0.400 0.350 OD (595nm)
0.300 0.250 0.200 0.150
0.100 0.050 0.000 kontrol
ekstrak 6% pelarut etanol
ekstrak 6% pelarut Etil Asetat
ekstrak 8% pelarut etanol
ekstrak 8% pelarut Etil Asetat
KESIMPULAN • Ekstrak Alpinia galanga L mampu menghambat uorum sensing pada P. aeruginosa (pada konsentrasi 8% mampu menghambat produksi eksoproteasenya namun tidak menghambat pertumbuhan selnya, dan pada konsentrasi 6% mampu menghambat pembentukan biofilmnya).
• Tidak ada perbedaan kemampuan penghambatan quorum sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut polar (etanol) dan semi polar (etil asetat).
TERIMA KASIH
