Diagnostika moru včelího plodu a epizootologická situace v ČR Zpracoval: MVDr. Jaroslav Bzdil, Ph.D., SVÚ Olomouc, Jakoubka ze Stříbra 1, 779 00 Olomouc Tel.: 585557223, e.mail:
[email protected]
Původce
Paenibacillus larvae (B. larvae White, 1906) je G+ fakultativně anaerobní sporulující tyčka, spory jsou vysoce rezistentní (Destrukce při 121°C po 8,6 min. v medu a až po 30 min. ve vosku) (Hansen a Brødsgaard 1999). 2
Původce Biochemické vlastnosti P. larvae : Většina kmenů je kataláza -, roste v přítomnosti 0,001% lysozymu a 2% NaCl, rozkládá želatinu a kasein, utilizuje D-glukózu, glycerol, Dmannózu, ribózu, D-trehalózu, N-acetylglukosamin, hydrolyzuje eskulin, ostatní aktivity jsou variabilní (Heyndrickx et al, 1996). Produkce pyrazinů (Bzdil, 2010). Produkce enolázy (hydrolýza proteinů – faktor patogenity (Antúnez et al, 2010). 3
Původce Genotypové vlastnosti P. larvae : Vysoká genotypová variabilita prokázaná PCR fingerprintingem. Systém ERIC 4 genotypové skupiny (I-IV). Systém BOX 4 genotypové skupiny (A-C, PLP). Systém BOX A1R a MBO REP1 prokázal 9 různých genotypových podskupin. Celkem známo 18 různých genotypů P. larvae . 4
Diagnostika moru včelího plodu
Klinická prohlídka Laboratorní vyšetření Epizootologická situace v dané zemi nebo lokalitě
5
Diagnostika moru včelího plodu Klinické vyšetření hodnotí: sílu včelstva a jeho projevy (15 – 60 tisíc dělnic, 1 matka, 300 – 600 trubců). intenzitu plodování, rovnoměrnost zakladení a kvalitu plodu. celkovou úroveň a hygienu chovu.
6
Diagnostika moru včelího plodu Odběr vzorků k laboratornímu vyšetření Včelí plásty s plodem nebo zásobami Med Měl, vosk Další materiály (pyl, mateří kaše, stěry z prostředí, propolis, dospělé včely…). Vzorky nutno dobře zabalit a opatřit žádankou / objednávkou vyšetření ! 7
Diagnostika moru včelího plodu Metody vyšetření: A) Mikroskopické 1) Nativní preparáty (fázová mikroskopie). 2) Barvené preparáty (Gram, Schaefer – Fulton acidorezistentní, Schaefer – Fulton malachitová zeleň) . 8
Diagnostika moru včelího plodu B) Kultivační metody Jsou dobře kvantifikovatelné, lze zpracovávat větší množství vzorků rutinně, porosty lze snadno konfirmovat a archivovat. Půdy bývají obohacené glukózou, thiaminem, kvasničným extraktem, tryptonem, cysteinem. Selektivity je dosaženo přídavkem kyseliny nalidixové a pipemidové, příp. Amphothericinu B. 9
Diagnostika moru včelího plodu
Z půd jsou používány například: Krevní agar se 7% ovčí krve (SBA), J-medium, MYPGP agar, , MYPGP (NALPIA A a B), MYPPN agar, BHI agar (BHIA), MYP agar, TMYGP agar, P. larvae agar (PLA)… Inkubace se provádí obvykle aerobně (mikroaerofilně) při 34-37°C po dobu 2-9 dní. 10
Kultivace medu
Smísení 15g medu s 15ml dest. vody. Inkubace při 88-92°C po dobu 5 minut. Po ochlazení kultivace 0,2ml na 1 KA a 3 MYPPN. Inkubace při 35-37,5°C po dobu 7-9 dní. Spočtení kolonií a konfirmace původce.
11
Kultivace měli
Smísení 1g měli, 8,5ml destilované vody a 0,5ml Tweenu 80 . Inkubace 0,5 hodiny při 70±2°C. Přenesení 2-5ml ze dna zkumavky do stejného objemu destilované vody. Inkubace při 90±2°C po dobu 10 minut. Ochlazení a kultivace 0,2ml na KA a MYPPN. Inkubace ploten při 37±1°C po 5-8 dní. Spočtení kolonií a konfirmace původce. 12
Diagnostika moru včelího plodu Konfirmace bakteriálních porostů Biochemické metody (Pestré řady cukrů, API systém, BIOLOG systém). Molekulárně biologické genotypové (PCR). Molekulárně biologické fenotypové. (Analýza profilu metylovaných masných kyselin plynovou chromatografií FAME, MALDI TOF). 13
Diagnostika moru včelího plodu Další metody detekce P. larvae: 1) Imunologické (ELISA, IDT, IF, Lateral Flow Device Testy) (De Graaf et al, 2006). 2) Molekulárně biologické (Fenotypové, genotypové – detekce původce přímo v materiálu) (Ryba et al, 2009), (Martinez et al, 2010). 3) Cytochemické a histochemické metody (Gregorc a Bowen, 1998). 14
Diagnostika moru včelího plodu
4) Elektronová mikroskopie (Gregorc a Bowen, 1998). 5) Kombinované metody (FISH – Fluorescence in situ hybridizace) Protilátky značené Indocarbocyaninem a Fluorescein izothiocyanátem se v histologickém preparátu váží na prokaryotní 16S rRNA a eukaryotní 18S rRNA sekvenci) (Yue et al, 2008). 6) Detekce pyrazinů (Bzdil, 2010). 15
Počty vyš. vzorků medu na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011 Počet vyš. vzorků medu na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011.
300
250
247
200
165 Počet vyš. vzorků
150 130 100 73
70 60
63
65
66
50
0
0 Rok 2002 Rok 2003 Rok 2004 Rok 2005 Rok 2006 Rok 2007 Rok 2008 Rok 2009 Rok 2010 Rok 2011
16
Počty vyšetřených vzorků vosku a měli na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011 Počet vyš. vzorků vosku a měli na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011.
3500 3292 3000 2862 2641
2862
2675
2500 2245 2000 Počet vyš. vzorků 1500
1000
500
0
150 0 0 0 Rok 2002 Rok 2003 Rok 2004 Rok 2005 Rok 2006 Rok 2007 Rok 2008 Rok 2009 Rok 2010 Rok 2011
17
Prevalence P. larvae ve vzorcích medu vyšetřených na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011 Prevalence P. larvae ve vzorcích medu vyšetřených na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011.
14
12 11,43 10
8,46 8 7,2
Prevalence
6,06
6
4,62 4
2 1,52
1,37 0
0 Rok 2002
Rok 2003
0 Rok 2004
0 Rok 2005
Rok 2006
Rok 2007
Rok 2008
Rok 2009
Rok 2010
Rok 2011
18
Prevalence P. larvae ve vzorcích vosku a měli vyšetřených na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011. Prevalence P. larvae ve vzorcích vosku a měli vyšetřených na SVÚ Olomouc v letech 2002-2011.
20 18,66 18 16 14 12,99 12 10
Prevalence
9,71
8
7,44 6,13
6
4,59
4,82
4 2 0
0 Rok 2002
0 Rok 2003
0 Rok 2004
Rok 2005
Rok 2006
Rok 2007
Rok 2008
Rok 2009
Rok 2010
Rok 2011
19
Porovnání prevalencí P. larvae v českém medu s literárními údaji. Porovnání prevalence výskytu P. larvae v medu vyšetřeném v SVÚ Olomouc v letech 2003-2009 s literárními údaji
60 51,5 50
38,6
Prevalence v %
40
Řada1
30 23 20 12,48
11 10
8,5 5,8
0 ČR
BEL
POL
USA Země
ARG
URU
AUS
20
Počty nových a zdolaných ohnisek MVP v pohraničních oblastech ČR v letech 2008-2011 2008
Okres
2009
2010
2011
Nová
Zdolaná
Nová
Zdolaná
Nová
Zdolaná
Nová
Zdolaná
Frýdek - Místek
5
6
2
2
3
3
1
1
Vsetín
-
-
-
-
5
5
3
3
Zlín
3
3
7
7
-
-
5
5
Uherské Hradiště
-
-
-
-
-
-
1
1
Hodonín
1
1
-
-
1
1
-
-
Břeclav
5
4
13
14
6
6
-
-
21
Počty aktivních ohnisek MVP v ČR v letech 2005-2010 Počty aktivních ohnisek MVP v ČR v letech 2005-2010.
30
28
25 21 20
15
9
10 7
5 5
3
0 Rok 2005
Rok 2006
Rok 2007
Rok 2008
Rok 2009
Rok 2010 22
Mor včelího plodu (ohniska nově vzniklá v období 1. 1. – 30. 6. 2011)
23
P. larvae jako zoonotické agens ?
5 pozitivních hemokultur na P.larvae u humánních pacientů (Rieg et al, 2010). Všichni pacienti i.v. narkomani, věk 20-35 let. Paralelně probíhající hepatitis B (1x) a hepatitis C (5x). Sympt.: Horečky 37,8°C – 39,8°C, únava, somnolence, malátnost, 1x peritonitis, 1x anemie, 1x tachypnoe, plicní šelest, 1x krvácení ze sliznic. Infekce pravděpodobně z inj. Methadonu s příměsí medu. 24
Klinické symptomy moru včelího plodu
25
Klinické symptomy moru včelího plodu.
26
Klinické symptomy moru včelího plodu.
27
P. larvae Schaefer- Fulton
28
P. larvae Gram
29
P. larvae vegetativní buňka
30
Spora P. larvae
31
Měl homogenizovaná Tweenem
32
Kultivace včelí měli
33
Morfologická variabilita P. larvae
34
P. larvae na MYP agaru
35
Morfologická variabilita P. larvae na MYPPN agaru
36
Systém BIOLOG
37
Molekulární fenotypová diagnostika MALDI
38
Molekulární fenotypová diagnostika MALDI
39
Hmotnostní spektrum P. larvae CCM 5680 (MALDI)
40
Hmotnostní spektrum P. larvae CCM 38 (MALDI)
41
PCR snímek
42
Rozklad indigokarmínu
43
Pyraziny v chromatogramu Abundance TIC: Z17.D 420 400 380 360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 10.00
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
16.00
17.00
18.00
19.00
Time-->
44
Děkuji za pozornost
