DETEKSI KEBERADAAN DAN KERAGAMAN BAKTERI ENDOSIMBION Wolbachia PADA BEBERAPA ORDO SERANGGA DI BOGOR
MAHARDIKA GAMA PRADANA
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2013
Mahardika Gama Pradana NIM A34090024
ABSTRAK MAHARDIKA GAMA PRADANA. Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor. Dibimbing oleh GIYANTO dan DAMAYANTI BUCHORI. Genus Wolbachia merupakan bakteri endosimbion yang diperkirakan menginfeksi 70% dari spesies serangga. Infeksi Wolbachia pada serangga dapat mempengaruhi perubahan sistem reproduksi inang. Studi mengenai keberadaan Wolbachia dilakukan dengan melakukan koleksi lapang serangga uji di sekitar Bogor. Deteksi keberadaan Wolbachia dilakukan dengan teknik PCR. Hasil deteksi menunjukkan Wolbachia supergrup A ditemukan pada sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis, Scelionidae, dan Trichogramma, sedangkan Wolbachia supergrup B ditemukan pada sampel Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Terjadi infeksi ganda oleh dua supergrup yang berbeda pada sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang diperoleh dari Drosophila merupakan supergrup A mempunyai tingkat kemiripan sekuen gen wsp sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) sedangkan isolat Wolbachia B yang diperoleh dari Sitophilus merupakan supergrup B mempunyai tingkat kemiripan sekuen gen wsp sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae (JN315982). Keywords: endosimbion, PCR, wsp.
ABSTRACT MAHARDIKA GAMA PRADANA. Detection of The Presence and Variation of Wolbachia Endosymbiont in Several Insect Orders from Bogor. Supervised by GIYANTO and DAMAYANTI BUCHORI. The genus Wolbachia is a bacterial group that infects up to 70% of insect species. Wolbachia infections are usually associated with changes in host reproduction on insect. Studies on the presence of Wolbachia was done by field collection of insect samples around Bogor. Detection of the presence of Wolbachia performed by polymerase chain reaction (PCR). This study have been detected Wolbachia supergroup A infection on Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis, Scelionidae, and Trichogramma, while Wolbachia supergrup B infection have been detected on Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, and Trichogramma. Wolbachia double infection (AB) were also found on Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, and Trichogramma. Based on sequnce analysis, obtained similiarity level of wsp gene at 100% between Drosophila sample with Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) and also between Sitophilus sample with Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae (JN315982). Keywords: endosymbiont, PCR, wsp.
©
Hak Cipta Milik IPB, tahun 2013 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipa hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DETEKSI KEBERADAAN DAN KERAGAMAN BAKTERI ENDOSIMBION Wolbachia PADA BEBERAPA ORDO SERANGGA DI BOGOR
MAHARDIKA GAMA PRADANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor Nama : Mahardika Gama Pradana NIM : A34090024
Disetujui oleh
Dr. Ir. Giyanto, MSi. Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Damayanti Buchori, MSc. Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, MSi. Ketua Departemen Proteksi Tanaman
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor”, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Banyak pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan tugas akhir ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada: Dr. Ir. Giyanto, MSi. Dan Prof. Dr. Ir. Damayanti Buchori, MSc. selaku dosen pembimbing tugas akhir yang telah banyak memberikan berbagai macam bantuan kepada penulis baik berupa pikiran, materi, waktu, dan hal lainnya. Dra. Endang Sri Ratna, Ph.D selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan kritik dan saran untuk penyempurnaan penulisan skripsi. Seluruh Dosen dan Staff Departemen Proteksi Tanaman IPB, keluarga tercinta Papa, Mama, Ibuk, Kakak, Adik untuk kasih sayang, dukungan serta doa yang selalu diberikan. Teman-teman Laboratorium Bakteri Tumbuhan (Kak Tatit, Kak Syaiful, Auzan, Nadzir, Arfi, Elok, Eka) dan Laboratorium Pengendalian Hayati (Mbak Laras, Mbak Nita, Bayu, Winda) atas bantuan dan motivasi yang telah diberikan selama penelitian. Teman-teman Iyoeh House (Yan, Arifin, Kautsar) atas pertemanan selama kuliah di IPB dan segala macam dukungan yang selalu diberikan kepada penulis. Suci Regita dan Ihsan Nurkomar atas bantuan dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis ketika menempuh studi maupun selama penelitian. Teman-teman seperjuangan di Departemen Proteksi Tanaman, serta pihak lain yang turut membantu dalam pelaksanaan tugas akhir ini. Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, November 2013 Mahardika Gama Pradana
DAFTAR ISI PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Metode Penelitian Pengambilan Serangga Uji Deteksi Wolbachia Ekstraksi DNA Amplifikasi DNA Elektroforesis dan Visualisasi Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia Analisis Sekuen Nukleotida dan Filogenetika Analisis Sekuen Nukleotida Analisis Filogenetika HASIL DAN PEMBAHASAN Jenis-Jenis Serangga Uji Deteksi Keberadaan Wolbachia Hasil Ekstraksi DNA Amplifikasi Gen wsp Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida Analisis Filogenetika SMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
1 1 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 7 7 8 9 10 10 11 12 12 12 13 15
DAFTAR TABEL 1 Jenis serangga yang digunakan dalam penelitian 2 Hasil deteksi keberadaan Wolbachia dan keragaman supergrup Wolbachia yang menginfeksi beberapa inang 3 Tingkat kemiripan sekuen nukleotida isolat Wolbachia supergrup A dan Wolbachia supergrup B dengan spesies homolog yang telah dideposit di GeneBank
6 9
10
DAFTAR GAMBAR 1 Visualisasi ekstraksi DNA total serangga yang diuji 2 Visualisasi hasil amplifikasi gen wsp sebagai deteksi keberadaan Wolbachia 3 Visualisasi amplifikasi gen wsp Wolbachia supergrup A dan supergrup B 4 Pohon filogenetik isolat-isolat Wolbachia yang dibangun berdasarkan sekuen nukleotida sebagian gen wsp dengan Cardinium sebagai outgroup
7 8 9 11
DAFTAR LAMPIRAN 1 Jenis serangga yang diuji dan jumlah setiap jenis yang diekstraksi 2 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup A isolat Bogor dengan isolat di Genbank 3 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup B isolat Bogor dengan isolat di Genbank
15 15 16
PENDAHULUAN Latar Belakang Wolbachia merupakan bakteri endosimbion yang berasal dari ordo Rickettsiales, famili Anaplasmataceae. Wolbachia merupakan bakteri intraseluler yang ditemukan di arthropoda dan nematoda. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa infeksi Wolbachia pada serangga dan sebagian besar arthropoda lainnya serta nematoda filarial diperkirakan mencapai 70% (Werren et al. 1995). Wolbachia memperbanyak diri dengan pembelahan biner dalam vakuola sel inang dan dikelilingi oleh membran asal inang. Pada arthropoda, sebagian besar bakteri berada di dalam sitoplasma sel yang terdapat di sistem organ reproduksi, selain itu juga terdapat di dalam jaringan lain, termasuk jaringan saraf dan hemosit (Louis dan Nigro 1989). Baik pada arthropoda maupun nematoda, Wolbachia ditransmisikan secara transovarial kepada keturunannya (Werren 1997). Wolbachia pipientis saat ini dianggap sebagai satu-satunya spesies dari genus Wolbachia (Dumler et al. 2001). Studi berdasarkan karakter molekuler telah menerangkan bahwa terdapat bermacam-macam strain dari W. pipientis secara filogenetik (Lo et al. 2007). Berdasarkan variasi di dalam 16S rRNA yang diperoleh dari berbagai arthropoda dan nematoda filarial, spesies W. pipientis dapat dibagi menjadi delapan supergrup yaitu supergrup A sampai dengan H. Supergrup A dan B paling umum ditemukan pada arthropoda, supergrup C dan D secara khas ditemukan pada nematoda filarial, supergrup E ditemukan pada ordo Collembola, supergrup F dan H ditemukan pada rayap (ordo Isoptera), dan supergrup G ditemukan pada beberapa laba-laba Australia (Babec 2012). Pada arthropoda, infeksi Wolbachia berhubungan dengan perubahan dalam sistem reproduksi inang, yang meliputi: a) kematian keturunan jantan selama proses embriogenesis pada bakteri betina yang terinfeksi, b) induksi partenogenesis, menghasilkan keturunan diploid akibat ketiadaan reproduksi seksual, c) feminisasi genetik jantan, perubahan genetik jantan menjadi betina, dan d) inkompatibilitas sitoplasma-cytoplasmic incompatibility, ketidakmampuan jantan terinfeksi untuk melakukan fertilisasi sel telur dari betina yang tidak terinfeksi maupun betina terinfeksi dengan tipe Wolbachia yang berbeda (Stouthamer et al. 1999). Masingmasing fenotipe ini meningkatkan proporsi betina yang terinfeksi dalam populasi inang dan sebagai bentuk adaptasi bakteri untuk meningkatkan transmisi mikroorganisme. Efek parasit seperti pada inang ini umumnya disebut sebagai reproductive parasitism (Bandi et al. 2001). Keberadaan Wolbachia pada beberapa spesies serangga sangat diperlukan untuk reproduksi inang (Hurst dan Jiggins 2000). Dampak dari Wolbachia terhadap sistem reproduksi serangga berpotensi sebagai salah satu strategi pengendalian hama dan vektor penyakit tanaman. Distribusi Wolbachia yang luas sekaligus peran sebagai manipulator sistem reproduksi inang menjadikan bakteri ini berpeluang sebagai agen hayati yang ramah lingkungan. Beberapa strategi pengendalian memanfaatkan induksi inkompatibilitas sitoplasma di dalam pengendalian hama. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa Wolbachia dapat ditransfer dan dapat bertahan di dalam inang yang berbeda jenis (introduksi) serta di dalam inang tersebut Wolbachia dapat mengekspresikan fenotip reproduksi seperti yang diharapkan (Xie et al. 2005).
2 Salah satu contoh aplikasi yang berhasil di bidang pertanian yang pernah dilaporkan yaitu strain Wolbachia dari inang Rhagoletis cerasi (Diptera: Tephritidae) telah digunakan untuk menginfeksi lalat buah Mediterania melalui injeksi embrionik. Persilangan di antara betina tidak terinfeksi dengan jantan terinfeksi menghasilkan kematian telur sebesar 100%. Persilangan di antara lalat buah yang terinfeksi strain Wolbachia berbeda menghasilkan inkompatibilitas sebesar 100% (Bourtzis dan Robinson 2006). Umur merupakan faktor penting yang mempengaruhi kemampuan suatu vektor untuk mentransmisikan patogen manusia. Hal ini berdasarkan fakta bahwa hampir semua patogen membutuhkan periode inkubasi ekstrinsik di dalam serangga inang sebelum transmisi patogen terjadi. Transmisi ini hanya dilakukan sebagian kecil dari populasi serangg inang yaitu serangga inang yang sudah tua atau mendekati akhir siklus dewasa, sehingga muncul sebuah pemikiran mengenai strategi untuk mempersingkat siklus hidup (umur) serangga inang yang berperan sebagi vektor tersebut. McMeniman et al. (2009) melaporkan telah berhasil mentransfer wMelpop yaitu strain Wolbachia dengan fenotip mempersingkat siklus hidup inang. Wolbachia tersebut ditransfer ke dalam nyamuk Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) yang merupakan vektor utama penyakit demam berdarah. Strategi dengan mempersingkat siklus hidup merupakan sebuah strategi baru untuk mengendalikan penyakit terbawa vektor. Indonesia dengan kekayaan mega biodiversitas hayati khususnya serangga, memungkinkan penggunaan Wolbachia sebagai salah satu strategi pengendalian hama penyakit khususnya pada bidang pertanian. Perlu dilakukan sebuah penelitian mengenai penyebaran atau distribusi Wolbachia di seluruh Indonesia sehingga data mengenai distribusi inang maupun fenotip tersedia. Di Indonesia, studi mengenai keberadaan Wolbachia masih jarang dilakukan. Tercatat pada tahun 2008 penelitian mengenai hubungan kepadatan spesies Drosophila melanogaster dan penularan secara horizontal Wolbachia (Kusmintarsih 2008). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan sehingga potensi Wolbachia sebagai agen hayati dalam pengendalian hama penyakit dapat diaplikasikan. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mempelajari keberadaan Wolbachia pada beberapa serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera serta keragaman supergrup Wolbachia yang menginfeksi serangga tersebut serta identifikasi dengan teknik molekuler. Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah mengetahui keberadaan dan keragaman bakteri endosimbon Wolbachia pada beberapa serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera di Bogor. Informasi mengenai keberadaan Wolbachia menjadikan bakteri endosimbion ini sebagai agens dalam mengendalikan hama atau penyakit berdasarkan kemampuannya dalam memanipulasi sistem reproduksi inang.
3
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Pelaksanaan Kegiatan penelitian dimulai dari bulan Februari 2013 sampai Juni 2013. Kegiatan identifikasi serangga dilakukan di Laboratorium Pengendalian Hayati, Departemen Proteksi Tanaman, IPB sedangkan deteksi molekuler Wolbachia dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Metode Penelitian Pengambilan Serangga Uji Serangga uji yang digunakan merupakan serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera. Lokasi pengambilan serangga ordo Diptera dan Hymenoptera dilakukan di sekitar Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat sedangkan serangga uji Hymenoptera diperoleh dari SEAMEO BIOTROP, Bogor. Pengambilan serangga uji dari ordo Hymenoptera yang termasuk parasitoid dilakukan dengan mengambil inang terparasit dan dipelihara di laboratorium. Serangga yang telah diperoleh kemudian dilakukan identifikasi sampai tingkat famili dan genus. Serangga yang telah diperoleh kemudian disimpan di dalam lemari pendingin (freezer) pada suhu -20 ⁰C dengan tujuan untuk mematikan serangga dan menghentikan proses metabolisme bakteri endosimbion yang berada di dalam tubuh serangga. Jumlah serangga yang diuji setiap genus atau famili tidak dibatasi, ditentukan sesuai ukuran serangga (Lampiran 1). Berdasarkan protokol yang ditulis oleh Babec (2012), ukuran serangga yang dipakai pada penelitian ini kurang dari batas 0.1 ml pada tabung Eppendorf ukuran 1.5 ml. Deteksi Wolbachia Ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA serangga dilakukan menurut metode Babec (2012) dengan modifikasi. Untuk mendapatkan DNA Wolbachia dari genom serangga diperoleh dengan cara menghancurkan secara fisik serangga pada bagian alat reproduksi, abdomen, atau seluruh tubuh serangga sesuai dengan ukurannya. Serangga betina lebih baik digunakan dalam ekstraksi apabila tersedia (Kikuchi dan Fukatsu 2003). Seluruh serangga uji dihancurkan sampai halus menggunakan micropestle di dalam tabung eppendorf kurang lebih selama 1 menit dengan terlebih dahulu ditambah bufer CTAB sebanyak 200 μl kemudian diinkubasi pada suhu 65 ⁰C selama 15 menit. Sebanyak 200 μL klorofom isoamil alkohol (24:1) ditambahkan kemudian tabung dibolak-balik selama 30 menit. Tabung kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10 000 rpm sehingga dihasilkan supernatan. Supernatan yang telah diperoleh dipindah ke tabung Eppendorf baru sebanyak 150 μL. RNAse ditambahkan sebanyak 2 μL kemudian diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama satu jam. Sebanyak 15.2 μL NaCl ditambahkan diikuti dengan penambahan 480 μL etanol absolut kemudian diinkubasi di lemari pendingin pada suhu -20 ⁰C selama 3 jam. Tabung kemudian disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan tersisa pelet yang mengandung DNA total. Pelet kemudian dicuci dengan
4 penambahan etanol 70% dan disntrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang, pelet kemudian disuspensikan dengan larutan TE sebanyak 50 μL. Amplifikasi DNA. Deteksi keberadaan Wolbachia menggunakan primer spesifik 81F (5’TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 3’) dan 691R (5’AAA AAT TAA ACG CA 3’). Pasangan primer tersebut akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 632 pb (Zhou et al. 1998). Sebanyak 1 μL DNA hasil isolasi ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf baru, dicampur dengan 12.5 μL Master Mix, 1.5 μL Primer Mix, dan ddH2O 7.5 μL. Amplifikasi ini dilakukan pada mesin PCR (Gene Amp PCR system 9700, PE Applied Biosystems, USA). Amplifikasi tersebut didahului dengan denaturasi awal selama 7 menit pada suhu 94 ⁰C. Kemudian dilanjutkan dengan siklus amplifikasi yang dalam satu siklus amplifikasi adalah denaturasi satu menit pada 94 ⁰C, penempelan primer (annealing) selama setengah menit pada 50.7 ⁰C, sintesis selama 1 menit pada 72 ⁰C dan diulang sebanyak 30 kali, diakhiri untuk tahapan penyempurnaan sintesis selama 10 menit pada 72 ⁰C (Pourali et al. 2009). Elektroforesis dan Visualisasi. Visualisasi DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan gel agarosa 1% dalam TAE 2X. Gel agarosa dibuat dengan mencampurkan 0.4 g gel agarosa dengan 40 mL bufer Tris-asetat EDTA (TAE) 2X (0.045 M Trisasetat, 0.01 M EDTA) dan dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer 100 mL. Campuran dipanaskan dalam microwave hingga agarosa larut sempurna dan ditambahkan 2.5 μL larutan ethidium bromida pada konsentrasi 10 mg/mL. Sebelumnya aparatus pencetak gel dibersihkan, dikeringkan, kemudian diletakkan pada permukaan yang datar. “Sisir” gel kemudian diletakkan di bagian atas aparatus pencetak gel (± 0.5-1.0 mm dari atas). Selanjutnya larutan agarosa dimasukkan ke dalam cetakan gel hingga keras kemudian dipindahkan ke bak elektroforesis (Bio-Rad Power PAC 300, USA) dan ditambahkan 1X TAE bufer elektroforesis hingga gel agarosa terendam. Sebanyak 5 µl DNA hasil amplifikasi bersama 1 µl bufer loading dihomogenkan kemudian dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan pipet mikro. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 75 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis tersebut divisualisasikan dengan Transilluminator ultra violet (Sambrook et al. 1989). Pita DNA yang terbentuk pada hasil elektroforesis tersebut diamati dan dipotret dengan menggunakan kamera digital. Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia Serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia diuji lebih lanjut untuk mengetahui kelompok Wolbachia supergrup A dan B. Zhou et al. (1998) menyebutkan bahwa untuk membedakan keragaman supergrup Wolbachia menggunakan pasangan primer 136F (5’ TG AAA TTT TAC CTC TTT TC 3’) dan 691R (5’AAA AAT TAA ACG CA 3’) yang akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 556 pb sebagai Wolbachia dari supergrup A, sedangkan pasangan primer 81F (5’TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 3’) dan 522R (5’ ACC AGC TTT TGC TTG ATA 3’) akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 442 pb sebagai Wolbachia dari supergrup B. Visualisasi hasil amplifikasi dilakukan dengan metode elektroforesis seperti metode yang sudah dijelaskan sebelumnya.
5
Analisis Sekuen Nukleotida dan Filogenetika Analisis Sekuen Nukleotida. Produk PCR yang menunjukkan hasil positif dari masing-masing supergrup (A dan B) diambil satu sampel sebanyak 40 µl dikirim ke PT. Genetika Sains (First-Base Asia, Malaysia) untuk dilakukan sekuen nukleotida. Analisis Filogenetika. Hasil sekuen gen wsp dianalisis untuk mengetahui tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen wsp dari Wolbachia yang telah didepositkan pada GenBank dengan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yang tersedia pada alamat http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sebelum dilakukan pensejajaran dengan program BLAST, hasil sekuen diedit dengan program Chromaspro. Data sekuen nukleotida dianalisis menggunakan program ClustalW multiple alignment dengan perangkat lunak BioEdit V7.2.5 kemudian dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan perangkat lunak Mega 5.2.2.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jenis-Jenis Serangga Uji Serangga yang diuji untuk keperluan penelitian ini terdiri dari tiga ordo yaitu Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera (Tabel 1). Latar belakang pengambilan tiga ordo ini yaitu sebagian besar literatur mengenai studi tentang Wolbachia menggunakan serangga uji yang sama dengan penelitian ini. Serangga uji Trichogramma yang diperoleh dari lapang selanjutnya dilakukan perbanyakan (rearing) di Laboratorium Pengendalian Hayati, Departemen Proteksi Tanaman, IPB untuk mendapatkan jumLah yang cukup untuk ekstraksi. Sementara itu serangga uji yang lainnya tidak dilakukan rearing karena jumLah yang diperoleh dari lapang sudah cukup untuk ekstraksi. Tabel 1 Jenis serangga yang digunakan dalam penelitian Ordo Coleoptera Diptera
Hymenoptera
Famili Bruchidae Curculionidae Tephritidae Tephritidae Culicidae Drosophilidae Braconidae Chalcididae Formicidae Scelionidae Trichogrammatidae
Genus Callosobruchus Sitophilus Bactrocera 1 Bactrocera 2 Armigeres Drosophila Apanteles Brachymeria Anoplolepis Scelionidae Trichogramma
Beberapa literatur menunjukkan bahwa kajian bio-assessment Wolbachia pada famili Drosophilidae menjadi model dasar dalam perkembangan penelitian ini. Drosophila simulans merupakan salah satu sistem permodelan yang sangat baik untuk meneliti populasi genetik inang dan simbionnya. D. simulans merupakan spesies kosmopolitan yang mengandung lima strain Wolbachia (wHa, wNo, wRi, wAu, dan wMa). Strain keenam diketahui berasal dari Tanzania (James et al. 2002). Lalat buah dari genus Bactrocera merupakan hama penting pada beberapa komoditas pertanaman khususnya di Indonesia. Salah satu pendekatan pengendalian yang cukup populer dan ramah lingkungan yaitu dengan menggunakan perangkap feromon atraktan seperti metil eugenol. Penggunaan dari Wolbachia dapat dijadikan sebagai sarana pengendalian di masa depan baik melalui transfer horizontal Wolbachia dari jenis inang yang lain atau dari jenis ini sendiri seperti yang telah berhasil diaplikasikan pada nyamuk Aedes aegepty. Pada penelitian ini diambil sampel nyamuk dari genus Armigeres yang biasa disebut dengan nyamuk hutan.
7 Dua genus dari ordo Coleoptera yaitu Callosobruchus dan Sitophilus merupakan kelompok hama gudang yang kosmpolitan, menjadi masalah utama di dalam gudang penyimpanan khususnya yang menyimpan bahan makanan. Di Jepang, deteksi dan karakterisasi strain Wolbachia pada hama gudang dan parasitoidnya telah dilakukan sebagai informasi dasar atas potensi Wolbachia sebagai strategi pengendalian hama di masa depan (Kageyama et al. 2009). Hubungan parasitoid dengan inang mengenai kejadian penularan horizontal Wolbachia dari parasitoid ke inang atau sebaliknya merupakan penelitian yang menarik dan sedang dikembangkan. Informasi mengenai keberadaan Wolbachia pada parasiotid (khususnya ordo Hymenoptera) sangat penting untuk mengetahui interaksi antara Wolbachia dengan parasitoid maupun dengan inang parasitoid. Deteksi Keberadaan Wolbachia Hasil Ekstraksi DNA Hasil ekstraksi yang didapat berupa pelet DNA yang disuspensikan di dalam larutan bufer TE. Hasil ekstraksi kemudian dielektroforesis untuk mengetahui secara visual kualitas DNA yang diperoleh. Hasil ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukan dengan hasil visualisasi pada gel agarosa yaitu terbentuk satu pita DNA pada bagian atas gel seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Hasil ektraksi DNA yang diperoleh belum menunjukkan kualitas yang sempurna, karena masih terdapat materi ikutan lain yang masih terbawa. Hasil elektroforesis menunjukkan smear pada pita DNA nomor 8, hal ini menunjukkan bahwa DNA tidak utuh yang disebabkan oleh faktor fisik maupun kimiawi pada saat proses ekstraksi. Sampel nomor 5 dan 9 tampak tidak terbentuk pita DNA total yang terdapat pada bagian ujung atas gel. Hal ini tidak berarti pada sampel nomor 5 dan 9 DNA total tidak terekstraksi namun DNA total yang berhasil terekstraksi jumLahnya sangat sedikit sehingga pada saat proses pewarnaa di dalam elektroforesis DNA total tidak tervisualisasi dengan jelas.
Gambar 1 Visualisasi ekstraksi DNA total serangga yang diuji. Anak panah menunjukkan pita DNA total yang terbentuk. Keterangan: 1. Callosobruchus, 2. Sitophilus, 3. Bactrocera 1, 4. Bactrocera 2, 5. Armigeres, 6. Drosophila, 7. Apanteles, 8. Brachymeria, 9. Anoplolepis, 10. Scelionidae, 11. Trichogramma
8 Pita DNA yang smear menunjukkan bahwa DNA tidak utuh. Hal ini disebabkan oleh faktor fisik dan faktor kimiawi yang terjadi saat ekstraksi. Faktor fisik yang mempengaruhi hasil DNA total antara lain proses penggerusan serangga uji tidak merata yang menyebabkan hasil gerusan kurang halus sehingga hasil lisis kurang sempurna. Kurang teliti dalam menggunakan pipet mikro sehingga volume larutan ekstraksi yang diambil tidak sesuai takaran juga dapat mempengaruhi hasil ekstraksi. Faktor kimiawi yang mempengaruhi hasil ekstraksi antara lain terjadi kontaminasi bahan kimia yang digunakan selama ekstraksi DNA. Namun demikian, DNA yang terdapat smear (mempunyai kualitas kurang baik) masih dapat digunakan untuk deteksi Wolbachia. Amplifikasi Gen wsp Berdasarkan hasil amplifikasi diketahui bahwa dari 11 jenis serangga yang diuji, 10 di antaranya positif terinfeksi Wolbachia. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pita DNA yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 632 pb (Gambar 2). Zhou et al. (1998) menyebutkan bahwa pasangan primer spesifik akan mengamplifikasi gen wsp yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 590 sampai 632 pb tergantung dari strain Wolbachia yang dideteksi. Serangga yang negatif terinfeksi Wolbachia yaitu Bactrocera 1 yang telah diidentifikasi lanjut mempunyai jenis Bactrocera dorsalis complex (Laras, komunikasi pribadi). M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
750 pb 500 pb
Gambar 2
Visualisasi hasil amplifikasi gen wsp sebagai deteksi keberadaan Wolbachia. Sumuran M: DNA marker ladder 1-kpb, 1: Drosophila, 2: Bactrocera 1, 3: Bactrocera 2, 4: Callosobruchus, 5: Sitophilus, 6: Apanteles, 7: Anoplolepis, 8: Armigeres, 9: Brachymeria, 10: Scelionidae, 11: Trichogramma
Protein permukaan membran merupakan protein yang diekspresikan oleh gen pengkode utama protein permukaan membran Wolbachia (wsp). Protein permukaan membran Wolbachia berpartisipasi dalam respon kekebalan inang, proliferasi sel, patogenesitas, dan pengendali kematian sel (Uday dan Puttaraju 2012). Protein ini menunjukkan kesamaan urutan yang erat dengan protein permukaan membran pada famili Alphaprobacteria. Protein ini juga homolog dengan protein permukaan membran yang telah terbukti memiliki fungsi antigenik dalam bakteri patogen penting seperti Ehrlichia dan Neisseria (Werren et al. 2008). Wsp merupakan gen yang paling bervariasi di antara gen lain yang umum digunakan untuk deteksi Wolbachia, misalnya 16S rRNA atau ftsZ. Variasi yang terdapat pada gen wsp
9 menunjukkan perbedaan genetik relatif tinggi di antara strain Wolbachia (Baldo et al. 2005). Gen ini menunjukkan karakter yang informatif untuk menentukan hubungan evolusioner di dalam strain (Zhou et al. 1998). Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia Tiap-tiap serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia kemudian dilakukan amplifikasi untuk pengelompokan supergrup Wolbachia (A dan B) dengan menggunakan pasangan primer 136F dan 691R untuk Wolbachia supergrup A sedangkan pasangan primer 81F dan 522R untuk Wolbachia supergrup B (Zhou et al. 1998). Hasil visualisasi pada gel agarosa menunjukkan bahwa isolat yang positif terinfeksi Wolbachia supergrup A akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 556 pb, sedangkan isolat yang positif terinfeksi Wolbachia supergrup B akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 442 pb (Gambar 3). Berdasarkan hasil amplifikasi tercatat sebanyak 9 sampel serangga yang diuji terinfeksi Wolbachia supergrup A dan 6 sampel serangga terinfeksi Wolbachia supergrup B. Hasil amplifikasi juga menunjukkan adanya infeksi ganda oleh Wolbachia, dimana terdapat dua supergrup Wolbachia (A dan B) yang menginfeksi satu jenis inang yang sama yaitu pada sampel Calosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Pada penelitian ini, tampak jelas bahwa Wolbachia dari supergrup A mempunyai tingkat infeksi yang lebih tinggi daripada Wolbachia supergrup B (Tabel 2). Werren et al. (1995) menemukan bahwa di antara spesies serangga neotropical infeksi ganda lebih sering terjadi dan lebih mudah dibentuk atau dipertahankan. Werren dan Windsor (2000) melaporkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata di antara ordo serangga terhadap frekuensi infeksi dari supergrup A dan B, dimana tingkat infeksi supergrup A lebih tinggi dibandingkan supergrup B.
750 pb 500 pb
Gambar 3 Visualisasi amplifikasi gen wsp Wolbachia supergrup A dan supergrup B. Keterangan A: amplifikasi dengan pasangan primer 136F dan 691R, B: amplifikasi dengan pasangan primer 81F dan 522R, 1: Drosophila, 2: Calosobruchus, 3: Bactrocera 1, 4: Sithopilus, 5: Apanteles, 6: Anoplolepis, 7: Armigeres, 8: Brachymeria, 9: Scelionide, 10: Trichogramma Perrot-Minnot et al. (1996) menjelaskan bahwa kejadian infeksi ganda berpengaruh terhadap kompatibilitas sitoplasma pada inang. Telur yang terinfeksi
10 ganda akan kompatibel dengan sperma yang terinfeksi ganda maupun tunggal, sedangkan telur yang terinfeksi tunggal tidak kompatibel dengan sperma yang terinfeksi ganda. Penelitian yang telah dilakukan pada spesies Nasonia vitripennis menunjukkan jantan yang terinfeksi ganda tidak kompatibel dengan betina yang terinfeksi tunggal maupun ganda. Dengan demikian, infeksi ganda akan meningkatkan infeksi tunggal pada populasi yang tidak terinfeksi. Tabel 2 Hasil deteksi keberadaan Wolbachia dan keragaman supergrup Wolbachia yang menginfeksi inang Infeksi Ordo Famili Genus Supergrup Wolbachia Coleoptera Bruchidae Callosobruchus + B Curculionidae Sitophilus + A,B Diptera Tephritidae Bactrocera 1 Tephritidae Bactrocera 2 + A,B Culicidae Armigeres + A,B Drosophilidae Drosophila + A Hymenoptera Braconidae Apanteles + A Chalcididae Brachymeria + A,B Formicidae Anoplolepis + A Scelionidae Scelionidae + A Trichogrammatidae Trichogramma + A,B Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida Sepuluh serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia, diambil masingmasing satu sampel tiap supergrup untuk dilakukan sekuen nukleotida. Sampel yang digunakan yaitu DNA Wolbachia yang berasal dari Drosophila untuk mewakili sekuen supergrup A sedangkan DNA Wolbachia yang berasal dari Sitophilus mewakili sekuen dari supergrup B. Hasil sekuen nukleotida kemudian dianalisis menggunakan program BLAST untuk mengetahui spesies yang homolog dengan isolat yang telah didepositkan di dalam GeneBank. Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang merupakan supergrup A dari Indonesia mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum yang mempunyai nomor aksesi di GeneBank GQ924887 (Tabel 3). Isolat ini diketahui berasal dari Austria (Miller et al. 2010). Isolat uji Wolbachia yang berasal dari genus Drosophila ini tidak secara jelas merujuk pada strain Wolbachia yang spesifik pada hasil BLAST di GeneBank. Hasil BLAST menunjukkan beberapa strain yang muncul seperti wPol1 (AY596785), wWal1 (AY596783), dan wWal2 (AY596784). Dengan demikian, hasil penelitian ini belum dapat menunjukkan strain Wolbachia dari isolat yang diperoleh. Isolat Wolbachia B yang merupakan supergrup B dari Indonesia mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae yang mempunyai nomor aksesi di GeneBank JN315982. Isolat ini diketahui berasal dari Prancis (Henri dan Mouton 2011). Berdasarkan hasil BLAST
11 menunjukkan bahwa isolat uji Wolbachia yang berasal dari genus Sitophilus secara jelas merujuk pada Wolbachia strain wSito. Tabel 3 Tingkat kemiripan sekuen nukleotida isolat Wolbachia supergrup A dan Wolbachia supergrup B dengan spesies homolog yang telah dideposit di GeneBank Kemiripan Isolat Inang Spesies yang homolog No. Aksesi (%) Wolbachia A Drosophila Wolbachia GQ924887 100 endosymbiont of Drosophila paulistorum Wolbachia B Sitophilus Wolbachia JN315982 100 endosymbiont of Sitophilus oryzae strain wSito Analisis Filogenetika Hubungan kekerabatan antara isolat Wolbachia dapat dilihat dengan analisis pohon filogenetika. Pohon filogenetika yang dibangun berdasarkan sekuen nukleotida gen wsp dari isolat-isolat Wolbachia yang berasal dari berbagai negara serta berasal dari genus inang yang sama, yaitu genus Drosophila untuk supergrup A dan genus Sitophilus untuk supergrup B. Hasil analisis filogenetika mengindikasikan dua kelompok besar yang terpisah cukup jelas (Gambar 4). Kelompok pertama dan kedua memiliki perbedaan pada tingkat taksonomi yaitu supergrup. Kelompok pertama merupakan kelompok Wolbachia supergrup A dan kelompok kedua merupakan kelompok Wolbachia supergrup B. Hal ini membuktikan bahwa Wolbachia yang telah dideteksi mempunyai keragaman supergrup A dan B. Pohon filogenetik menunjukkan kekerabatan yang jauh antara isolat Wolbachia dengan Cardinium yang juga merupakan bakteri endosimbion pada serangga yang digunakan sebai outgroup.
Supergrup A
Supergrup B
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat-isolat Wolbachia yang dibangun berdasarkan sekuen nukleotida sebagian gen wsp dengan Cardinium sebagai outgrup
12
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan deteksi molekuler telah ditemukan bakteri endosimbion Wolbachia pada serangga yang diuji dan terdapat keragaman supergrup Wolbachia, yaitu supergrup A dan B yang menginfeksi serangga tersebut. Hasil deteksi menunjukkan telah ditemukan Wolbachia supergrup A pada sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis, Scelionidae, dan Trichogramma, sedangkan Wolbachia supergrup B ditemukan pada sampel Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Terjadi infeksi ganda oleh dua supergrup yang berbeda pada sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang diperoleh dari Drosophila merupakan supergrup A mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) sedangkan isolat Wolbachia B yang diperoleh dari Sitophilus merupakan supergrup B mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae (JN315982). Saran Perlu dilakukan penelitian serupa dengan mengambil contoh serangga dari ordo yang lebih luas. Identifikasi serangga inang yang diuji diharapkan dapat sampai pada level spesies, sehingga diperoleh informasi tentang distribusi Wolbachia. Perlu dilakukan identifikasi tingkat strain dan analisis dampak dari keberadaan Wolbachia sehingga informasi yang tersedia dapat digunakan dalam penerapannya sebagai agens hayati untuk mengendalikan hama dan penyakit di bidang pertanian pada khususnya.
13
DAFTAR PUSTAKA [Babec] Bay Area Biotechnology Education Consortium. 2012. Wolbachia PCR: Student Guide. San Mateo (US): Babec. Baldo L, Lo N, Werren JH. 2005. Mosaic nature of the Wolbachia surface protein. Journal of Bacteriology. 187:5406-5418. Bandi C, Dunn AM, Hurst GD, Rigaud T. 2001. Inherited microorganisms, sexspecific virulence and reproductive parasitism. Trends Parasitology. 17:8894. Bourtzis K, Robinson AS. 2006. Insect pest control using Wolbachia and/or radiation. Insect Symbiosis. 2:225-246. Braig HR, Weiguo Z, Stephen LD, Scott O. 1998. Cloning and characterization of a gene encoding the major surface protein of bacterial endosymbiont Wolbachia pipientis. Journal of Bacteriology. 180(9):2373-2378. Dumler JS, Anthony FB, Cornelis PJB, Gregory AD, Guy HP, Stuart CR, Yasuko R, Fred RR. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and ‘HGE agent’ as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 51:2145-2165. Henri H, Mouton L. 2011. High-resolution melting technology: a new tool for studying the Wolbachia endosymbiont diversity in the field. Molecular Ecology Resources. 12(1):75-81. DOI:10.1111/j.1755-0998.2011.03064. Hurst GDD, Jiggins FM. 2000. Male-killing bacteria in insects: mechanisms, incidence, and implication. Emerging Infectious Diseases. 6(4):329-336. James AC, Dean MD, McMahon ME, Ballard JWO. 2002. Dynamics of double and single Wolbachia infections in Drosophila simulans from New Caledonia. Heredity. 88:182-189. Kageyama D, Satoko N, Taro I, Akihiro M. 2009. Detection and identification of Wolbachia endosymbionts from laboratory stocks of stored-product insect pests and their parasitoids. Journal of Stored Products Research. 46:13-19. Kikuchi Y, Fukatsu T. 2003. Diversity of Wolbachia endosymbionts in heteropteran bugs. Applied and Environmental Microbiology. 69(10):6082–6090. Kusmintarsih ES. 2008. Population density of Wolbachia bacteria and the induction of the popcorn-effect in Drosophila melanogaster. Microbiology Indonesia. 2(2):89-94. Lo N, Paraskevopoulos C, Bourtzis K, O’Neill L, Werren JH, Bordenstein SR, Bandi C. 2007. Taxonomic status of the intracellular bacterium Wolbachia pipientis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 57:654-657. Louis C, Nigro L. 1989. Ultrastructural evidence of Wolbachia Rickettsiales in Drosophila simulans and their relationships with unidirectional cross incompatibility. Journal of Invertebrate Pathology. 54:39–44.
14 McMeniman CJ, Lane RV, Cass BN, Fong AW, Sidhu M, Wang YF, O'Neill SL. 2009. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323:141-144. Miller WJ, Lee H, Daniela S. 2010. Infectious speciation revisited: impact of symbiont depletion on female fitness and mating behavior of Drosophila paulistorum. PLOS Pathogens. 6(12):1-17. DOI:10.1371/j.ppat.1001214. Perrot-Minnot MJ, Guo LR, Werren JH. 1996. Single and double infections with Wolbachia in the parasitic Nasonia vitripennis: effects on compatibility. Genetics Society of America. 143:961-972. Pourali P, Roayaei AM, Jolodar A, Razi JMH. 2009. PCR screening of the Wolbachia in some arthropods and nematodes in Khuzestan province. Iranian Journal of Veterinary Research. 10(3):216-222. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. New York (US): Cold Spring Harbour Laboratory Press. Saridaki A, Bourtzis K. 2009. Wolbachia-induced reproductive parasitism and applications. Entomologia Hellenica. 18(2009):3-16. Stouthamer, R, Breeuwer JAJ, Hurst GDD. 1999.Wolbachia pipientis: Microbial manipulator of arthropod reproduction. Annual Review of Microbiology. 53:71–102. Uday J, Puttaraju HP. 2012. Comparative analysis of Wolbachia surface protein in D. melanogaster, A. tabida, and B. malayi. Biomedical Informatics. 8(15)711715. Werren JH. 1997. Biology of Wolbachia. Annual Review of Entomology. 42:587609. Werren JH, Baldo L, Clark ME. 2008. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. Nature Review Microbiology. 6:741-751. Werren JH, Windsor D. 2000. Wolbachia infection frequency in insects: evidence of a global equilibrium? Proceedings of the Royal Society of London B. 267:1277-1285. Werren JH, Windsor D, Guo L. 1995. Distribution of Wolbachia among neotropical arthropods. Proceedings of the Royal Society of London B. 262:197–204. Xie Z, Khoo CC, Dobson SL. 2005. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310:326–328. Zhou W, Rousset F, O’Neill S. 1998. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proceedings of the Royal Society of London B. 265:509-515.
15
LAMPIRAN Lampiran 1 Jenis serangga yang diuji, jumLah setiap jenis yang diekstraksi, dan bagian tubuh yang diekstraksi Ordo Coleoptera
Diptera
Hymenoptera
Famili
Genus
JumLah individu yang diekstraksi
Bruchidae
Callosobruchus
5
Curculionidae
Sitophilus
5
Tephritidae Tephritidae
Bactrocera 1 Bactrocera 2
3 3
Culicidae
Armigeres
3
Drosophilidae
Drosophila
7
Braconidae
Apanteles
36
Chalcididae
Brachymeria
3
Formicidae
Anoplolepis
6
Scelionidae
Scelionidae
20
Trichogrammatidae
Trichogramma
3 000
Bagian yang diekstraksi Seluruh tubuh Seluruh tubuh Abdomen Abdomen Seluruh tubuh Seluruh tubuh Seluruh tubuh Abdomen Seluruh tubuh Seluruh tubuh Seluruh tubuh
Lampiran 2 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup A isolat Bogor dengan isolat di Genbank Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp
---------------------------------------------------------AAA GGTCCAATAAGTGATGAAGAAACTAGCTACTACGTTCGTTTGCAATACAACGGTGAAATT * TTACCTCTTTTCACAAAAATTGAAGGTATTGAATATAAAAAGGCCACAGACATTCATAAT TTACCTCTTTTCACAAAAATTGAAGGTATTGAATATAAAAAGGCCACAGACATTCATAAT ************************************************************ CCATTAAAAGCATCTTTTATAGCTGGTGGTGGTGCATTTGGTTACAAAATGGACGACATC CCATTAAAAGCATCTTTTATAGCTGGTGGTGGTGCATTTGGTTACAAAATGGACGACATC ************************************************************ AGGGTTGATGTTGAAGGGCTTTATTCACAGCTAAACAAAAATGATGTTACAGGTGCAGCA AGGGTTGATGTTGAAGGGCTTTATTCACAGCTAAACAAAAATGATGTTACAGGTGCAGCA ************************************************************ TTTAACCCAGATACTGTTGCAGACAGTTTAACAGCAATTTCAGGGCTAGTTAACGTTTAT TTTAACCCAGATACTGTTGCAGACAGTTTAACAGCAATTTCAGGGCTAGTTAACGTTTAT ************************************************************ TACGATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCA TACGATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCA ************************************************************ GCGTATATTAGCACTCCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATCAAAAAAGTAAATTTGGTTTT GCGTATATTAGCACTCCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATCAAAAAAGTAAATTTGGTTTT ************************************************************ GCTGGTCAAGTAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAGTCAAACTTTATGCT GCTGGTCAAGTAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAGTCAAACTTTATGCT
3 60 63 120 123 180 183 240 243 300 303 360 363 420 423 480
16 Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp Wo_A_Bogor_wsp Wo_GQ924887_wsp
************************************************************ GGAGCTCGTTATTTCGGTTCTTTTGGTGCTCATTTTGATAAAGATACTGCTGCAGCAAGC GGAGCTCGTTATTTCGGTTCTTTTGGTGCTCATTTTGATAAAGATACTGCTGCAGCAAGC ************************************************************ AAAGACAAGGGGGAACTCAAAGTTCTTTACAGCACTGTTGGTGCAGAAGCTGGAGTAGCG AAAGACAAGGGGGAACTCAAAGTTCTTTACAGCACTGTTGGTGCAGAAGCTGGAGTAGCG ************************************************************ TTTAATTTTTA 554 TTTAATTTTT- 610 **********
483 540 543 600
Lampiran 3 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup B isolat Bogor dengan isolat di Genbank Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp Wo_B_Bogor_wsp Wo_JN315982_wsp
TTGGTCCAATAAGTGATGAAGAAACTAGCTACTATGTTCGTTTGCAATATAATGGTGAAG ----------------TGAAGAAACTAGCTACTATGTTCGTTTGCAATATAATGGTGAAG ******************************************** TTTTACCTTTTAAAACAAGGATTGATGGTGTTACATATAAATCAGGTAAGGACAGCAATA TTTTACCTTTTAAAACAAGGATTGATGGTGTTACATATAAATCAGGTAAGGACAGCAATA ************************************************************ GTCCCTTAAAAGCATCTTTTCTAGCTGGAGGTGGTGCATTTGGTTATAAAATGGATGATA GTCCCTTAAAAGCATCTTTTCTAGCTGGAGGTGGTGCATTTGGTTATAAAATGGATGATA ************************************************************ TCAGGGTTGATGTTGAAGGACTTTACTCACAATTGAGTAAAGATGCAGATGTAGTAGATA TCAGGGTTGATGTTGAAGGACTTTACTCACAATTGAGTAAAGATGCAGATGTAGTAGATA ************************************************************ CTTCTCCAGCAGTTGTAGAAAGTTTAACAGCATTTTCAGGACTAGTTAATGTTTATTACG CTTCTCCAGCAGTTGTAGAAAGTTTAACAGCATTTTCAGGACTAGTTAATGTTTATTACG ************************************************************ ATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCAGCGT ATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCAGCGT ************************************************************ ATGTAAGCAATCCTTTAGTAACAGAGGTTACTGGTGATAAAAAATCTGGATTTGGTTTTG ATGTAAGCAATCCTTTAGTAACAGAGGTTACTGGTGATAAAAAATCTGGATTTGGTTTTG ************************************************************ CTTATCAAGCAAAAGCTGGTA--------------------------------------CTTATCAAGCAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAATCAAGCTTTATGCTG ******************** -----------------------------------------------------------GTGCTCGTTATTTTGGTTCTTATGGTGCTAATTTTGGTAAGACAGCTAAAGATGATGGCG ----------------------------------------GAATCAAAGTTCTTTACAGCACTGTCGGTGCAGAAGCTGGA 565
60 44 120 104 180 164 240 224 300 284 360 344 420 404 441 464 524
17
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 14 Maret 1991, sebagai putra kedua dari empat bersaudara dari pasangan Tri Warsono dan Sri Wahyuningsih. Penulis memiliki seorang kakak laki-laki dan dua orang adik perempuan bernama Septian Ady Nugraha, Malinda Wahyu Rahmawati, dan Malinda Wahyu Utami. Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas Negeri 1 Sragen, Jawa Tengah pada tahun 2009 dan pada tahun yang sama setelah lulus diterima di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Mandiri IPB (USMI). Selama menjadi mahasiswa penulis aktif mengikuti berbagai lembaga kemahasiswaan seperti Klub Cybertron Asrama TPB sebgai staff tahun 2010, Uni Konservasi Fauna sebagai staff Divisi Konservasi Serangga tahun 2011. Wakil Ketua Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman tahun kepengurusan 2011/2012 dan sebagai Kepala Divisi Keprofesian tahun kepengurusan 2012/2013. Anggota Entomologi Club pada tahun 2012, anggota Organic Farming Club tahun 2012, dan Ketua Paguyuban Mahasiswa Sragen di Bogor tahun kepengurusan 2011/2012. Prestasi yang sempat diraih penulis selama masa studi yaitu menjadi wakil Departemen Proteksi Tanaman pada acara Syngenta Conection Program bersama mahasiswa Australia di Malang pada tahun 2011, penerima besiswa Tanoto National Champion Scholarship pada tahun 2011, ketua Program Kreatifitas mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat didanai Dikti tahun 2012, juara I lomba cerdas cermat Entomologi tingkat nasional pada tahun 2012, berkesempatan mengikuti Training in Biological Control di Universitas Tsukuba Jepang dan Training in Rapid Biodiversity Assessment bersama Universitas Vienna di Kepulauan Kraktau pada tahun 2013. Penulis juga aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Biologi Patogen pada semester genap tahun ajaran 2010/2011, Entomolgi Umum pada semester ganjil tahun ajaran 2011/2012, dan Dasar-Dasar Proteksi Tanaman pada semester genap tahun ajaran 2011/2012.
