Prosiding
Presentasi
llmiah
Keselamatan
Radiasi
IioteJ Kartika
Chandra.
dan
Lingkungan
:14 Vesember
X
2004
DETEKSI GEN rpoB DENGAN TEKNIK POLYN ERASE CHAIN REACTION PAD A SPUTUM BASIL T AHAN ASAM POSITIF Maria Lina Rosilawati Puslitbang Teknologi Isotop clan Radiasi -BATAN Topo Suprihadi dan Mukh Syaifudin Puslitbang Keselamatan Radiasi clan Biomedika Nuklir -BAT AN Budiman Bela
BagianMikrobiologi, FakultasKedokteran,UniversitasIndonesia
ABSTRAK DETEKSI GEN 'P°R DENGAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACllON PADA SPUTUM BASIL T AHAN ASAM POSITIF. Tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyakit yang menjadi masalah kesehatan utama di Indonesia. Permasalahan dalam pemberantasan TB menjadi lebih serius disebabkan karena timbulnya resistensi Mycobacterium tuberculosis terhadap rifampisin. Resistensi tersebut dapat dideteksi dengan menganalisis gen rpoB yang mengkode subulrit P daTi RNA polymeraseyang merupakan target rifampisin. Dalam penelitian ini diuji sebanyak 43 sampel spurum penderita TB dengan hasil uji basil tahan asam (BTA) positif. Asam deoksiribonukleat (DNA) bakteri M. tuberculosisdiekstrak daTi spurum dengan menggunakan tiga mac~ metode yakni metode Boom menggunakan guanidine isotiosianat sebagai chaolropic agent, metode proteinase-K dan metode pemanasan, kemudian keberadaan gen rpoB dideteksi dengan teknik PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 43 sampel DNA bakteri yang diekstrak dengan metode Boom, 41 sampel diantaranya positif dan 2 menunjukkan hasil negative. Sedangkan dengan metode proteinase-K, 41 sampel juga positif akan tetapi band-bandhasil elektroforesis pacta 8 sampel dari 41 sampel tersebut terlihat tipis dan 2 sampel menunjukkan hasil negatif. Unruk deteksi dengan metode pemanasan, 7 sampel menunjukkan hasil negatif. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa metode Boom relatif lebih baik daripada metode proteinase-K dan pemanasan.
ABSTRACT DETECTION OF rpoB GENE WITH POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNIQUE IN SPUTUM WITH POSITIVE ACID FAST TEST. Tuberculosis (TB) isa particular health problem in Indonesia. The problem in combating TB became more serious due to emerge of resistance of Mycobacteriumhlberculosisto rifampisin. This resistance can be detected by analyzing rpoB gene which is encoding subunit P of RNA polymeraseas a rifampisin target. In this experiment 43 sputum samples taken from TB patient with positive result of acid fast test were assayed. Deoxyribonucleic acid (DNA) of bacteria was extracted from sputum using three kind of methods including Boom's method with guanidine isothiocianate as chaotropic agent,proteinase-K and warming methods, and then the existence of rpoB gene was detected with PCR technique. The results of experiment showed that from 43 samples of DNA of bacteria extracted with Boom method, 41 samples of them were negative and 2 samples showed negative result With proteinase-K method, 41 samples were also positive but the electrophoresis bands in 8 samples of these 41 positive samples were seen thin and 2 samples showed negative Tesult. For the detection with warming method, 7 samples showed negative results. From these results, it can be known that Boom method was relatively better than proteinase-Kand warming methods.
.Pllslitbang £<eselamatanRadiasi danBionledika Nuklir-Badan Tel!aga Nuklir'Nasional
237
1 'uberculosis
I. PENDAHULUAN
pasien TB dan kecil keberhasilannya jika
Di Indonesia, tuberculosis (TB) masih
isolat juga
resisten terhadap isoniazid
merupakan penyebabkematian nomor dua
(multidrug resistantM. tuberculosis(MDR-TB)
setelah penyakit jantung clan pembuluh
[3,4]. Suatu bagian gen M. tuberculosisyang
darah. Bahkan TB menduduki peringkat
mengkode subunit ~ daTi RNA polymerase
pertama penyebabkematian karena penyakit menular. Jumlah penderitanya sekitar 500.000 orang/ tahun dengan kematian sekitar 175.000orangjtahun, khususnya di
tuberculosis (rifampisin) merupakan fokus
daerah pedesaan clan perkotaan yang
program internasional penanggulangan TB
kumuh [1]. Dalam usaha memberantas
sebagai penyebab utama kematian di dunia
penyakit ini, organisasi kesehatan dunia (WHO) telah menerapkan strategi DOTS directly obseroedtreatment short-course)yang
dimana diagnosa dini clan identifikasi yang cepat sangat diperlukan
pengobatanclan mengontro.lstrain MDR [5]. Teknikdeteksi konvensional yang saat
antara lain meliputi program pengawasan keteraturan minum obat disertai jaminan agar pasien minum obat sampai tuntas. Jika
pengobatan
tidak
tuntas
akan
menyebabkan kuman kebal terhadap obat clan tentunya akanbersifat lebih ganas[2] RifampiSin atau rifampin
terbukti
efektif sebagaiobat antituberculosis (OAT) melawan strain bakteri yang :usceptible (tanggap) clan juga stram yang resisten terhadap
isoniazid
clan
streptomisin.
Rifampisin secara cepat dapat membunuh dandapat pengobatan
tanggap
(susceptible
memperpendek:1
tuberculosis
terhadap
yang
ini banyak di~nakan kelemahan
kan pengobatan yang lebih lama untuk
yakni
temyata memiliki
lambat,
prosedurnya
panjang clan kurang sensitif serta tidak dapat secara cepat digunakan untuk mendeteksi resistensi
bakteri.
Pengamatan dengan
mikroskop juga memerlukan cukup banyak patogen sehingga kurang sensitif clanatraktif. Sedangkan
teknik
membutuhkan
atau
molekuler 2
hanya
parasit dalam
sejumlah kecil sampel clan kemudian DNAnya digandakansampai sekitarl juta kalinya dengan tek11ik PCR clan dapat diperoleh hanya dalam waktu kurang lebih 1 jam [6,7]. Teknik nuklir dapat digunakan untuk
OAT.
Resistensi terhadap rifampiSin menyebab-
untuk efisiensi
melengkapi teknik cliagnosa konvensional clan
clapat
clikatakan
unikjspesifik
clan
238
infeksi
Prosiding
Presentasi
Ilmiah
Keselamatan IfoteJ Kaltika
Radiasi C~ra.
dan Lingkungan :14 Vesember
X
:J,O04
memiliki beberapa kelebihan karena lebih
akibat infeksi atau ketidaknormalan genetik
sensitif clan cepat, serta dapat digunakan
dapat didiagnosa dengan mendeteksi deret
untuk membantu memonitor penyebaran
asam nukleatnya (blok-blok penyusun gen)
penyakit infeksi, mengidentifikasi resisten-
yang spesifik untuk setiap penyakit. Metode
si organisme dengan lebih cepat dan lebih
ini sangat bennanfaat untuk alat diagnosa
murah, mengetahui aktivitas suatu obat
khususnya jika dikombinasi dengan pelabel-
dan mendeteksi organisme yang sangat
an radioaktif. Metode molekuler yang meli-
virulent
puti PCR clan hibridiSasi dot blot meng-
clan
(agresif)
menyebabkan
penyakit yang serius [6,8]. Teknik nuklir
gunakan probe (pelacak) berlabel radio-aktif
secara in vitro pada umumnya dilakukan
(biasanya P-32) merupakan metode yang
menggunakan senyawa berlabel radioaktif
cepat clan akurat untuk mengidentifikasi
untuk mendeteksi patogen clan penandaan
patogen clan bahkan dapat digunakan untuk
infeksi daTi sampel darah seperti radio-
menentukan tipe atau strain suatli'patogen.
immunoassay(RIA) dan teknik molekuler
Hibridisasi DNA dengan Southern blotting
dengan menggunakan teknik PCR. RIA
tersebutmerupakan metode baku emas (gold
dapat digunakan untuk mengidentifikasi
standard) dimana diperlukan
patogen yang bertanggung jawab terhadap
banyak (105-108 kopi)
infeksi dengan menggunakan antibodi
menggandakan DNA atau RNA sampai 1 juta
berlabel radioisotope [8]. Sedangkanteknik
kali atau lebih clan dapat deng~
nukfu secara in vivo dilakukan dengan
diukur menggunakan pelacak asa~ nukIeat
memberi
pasien
zat radioaktif
atau
".-
DNA yang
[6]. PCR mampu
mudah
berlabel radioaktif untuk mengirl'
radiofarmaka (biasanya intravena) yang
fragmerttVNA:Tekriik
terakumuIasik di organjjaringan sasaran
spesifik serta akurat
kemudian
atau
sejumlah kecil patogen seperti TBC clan jauh
mengukur radiofarmaka yang diberikan
lebih cepat daripada teknik konvensional
kepada pasien (biasanya rngesti) seperti
serta dapat mencegah keganasan serta fisiko
hembusan
kematian pasien karena dapat ditangal1i
dideteksi
L
naJ.as
dati
Iuar
seperti Facia
deteksi
Helicobacter P:t/lori .[8, 9]
Metode molekuler radioaktif secara
ihi sangafsensitif clan untuk
mencleteksi
secara dini 18]. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwameskipun relatif mahal,
in zntro dapat digunakan unttik mendeteksi
metode radioaktif
secara dini infeksi. Suatu penyakit baik
daripada metode non radioaktif
Puslitbang Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir-'Badan
ternyata lebih sensitif
Tenaga Nuklir Nasional
Oalam
239
&straksi freezer
Prosiding
Presentasi
llmiah
Keselamatan IfoteJ
makalah ini disajikan hasil peneli-tian
satu
dengan teknik biologi molekuler untuk
pemanasan.
mendeteksi
keberadaan
gen
rpoB
Radiasi
KaJtika
bagian
dan
Chandra,
Lingkungan
.14 Vesember
untuk
lainnya
X .2t:Ji)4
metode
yang
merupakan bagian bakteri M. tuberculosis
11.2.Ekstraksi DNA daD deteksi gen rpoB.
pada sputum pasien TB.
DNA
daTi
sputum
dengan
metode Boom dilakukan dengan menggunakan buffer lisis yang terdiri dari Tris-HO,
II. TATA KERJA 11.1.Pengumpulan dan preparasi sampel. Empat puluh enam sampel klinis sputum pasien TB (43 positif dan 2 negatif (kontrol) berdasarkan uji menggunakan
diatom, etanol 70% dingin, aseton kemudian
teknik konvensional BTA (basil tahan
dipanaskan pada 56°C selama 10 menit.
asam)) diperoleh daTi Pusat Tuberkulosis
Setelah kering, pellet ditambah dengan 60 1-11
Indonesia (PPTI) Kebayoran Baru Jakarta
larutan
Selatan dan
kecepatan tinggi. Supematan diambil untuk
dilengkapi
data dulling
meliputi umur, jells kelamin, pekerjaan, kebiasaan merokok, riwayat pengobatan
TE
IX
dan
disentrifugasi
pada
dipergunakan pada prosesPCR. Ekstraksi
DNA
dengan
metode
dan hasil diagnosa. Umur pasien berkisar
protemse-K dilakukan sebagai berikut.
antara 15 dan 70 tahun terdiri dari 20 laki-
dalam hasil homogenisasisputum, ditambah-
laki d31126 perempuan. Sputumditempat-
karl 100 III
kan dalam botol steril dan disimpan dalam
selanjutnya diinkubasi pada SOoCselarna 6
sampai ekstraksi DNA dilakukan.
jam atau overnight. Setelah itu kemudian
Sputum dihomogenisasi clan didekontami-
dididihkan selama 10 menit, disentrifugasi
nasi dengan larutan asetil-L-sistein, NaOH
pada 12.000 rpm selama 10 menit, super-
Tris-EDTA (TE).
natannya digunakan sebagai template DNA.
clan
Na~sitrat
clan
Kp
proteinase-K (100 Ilgjml),
Selanjutnya dibagi menjadi tiga bagian
Dan metode
yang
ketiga
adalah metode
dengan volume sarna, satu bagian unhtk
pernanasan
yang
ekstraksi menggunakan metode yang
rnenarnbahkan 500 1.11 NaOH 2% ke dalarn
dikembangkan oleh Boom dkk. [10], satu
hasil homogenisasi sputum clan dididihkan
bagian untuk metode proteinase-K clan
selama 2 menit, disentrifusgasi pada 15.000
dilakukan
dengan
rpm selama3 menit dan supernatan dibuang.
240
Prosiding
Presentasi
/lmiah
Keselamatan Ifotel
Radiasi
Kartika
Chandra,
dan Lingkungan .14 Vesember
X
2,004
Ditambahkan 1 mililiter Tris HO 0,1 M
sasi dengan UV transilluminator dan difoto
(pH 6,8) clan
disentrifugasi kembali. Setelah supernatant dibuang, ditambahkan
dengan kamela install Polaroid.
100 ~l deionizedwater steril clan dididihkan
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
selama 5 menit clan selanjutnya disentri-
Hasil-hasil
~ gen pendeteksian
rpoB
fugasi. Supernatannya digunakan untuk
dengan ketiga jenis metode disajikan dalam
prosesPCR.
Tabel 1 clan band-bandyang menunjukkan
Amplifikasi
DNA basil ekstraksi
keberadaan gen tersebut dari hasil elektro-
isolat klinis dan strain standard (H37Rv)
foresis disajikan dalam Gambar 1 untuk
dilakukan dengan metode PCR mengguna-
ketiga metode. Dan Tabel 1 terlihat bahwa
kan 1 pasang primer oligonukleotida (TR8
daTi 43 sampel DNA bakteri yang diekstrak
clan 9) yang didesain dari gen rpofJ M.
dengan
tuberculosis.Proses PCR dilakukan dengan
menunjukkan basil positif keberadaanbagian
mencampur isolate DNA 10 111dengan
gen rpoB dengan band-bandPCR yang cukup
pereaksi PCR yang terdiri dari akuabides
tebal clan 2 sampel diantaranya menunjukkan
stern, 1arutan Buffer lOX, MgO2 25 roM,
hasil negatif. Untuk metode proteinase-K, 41
dNTP 100 11M, primer atas-bawah masing-
sampel Juga menunjukkan basil
masing 0,1 11Mclan enzim Taq polymerase
keberadaan bagian gen rpoB dengan band-
2,5 U sehirigga diperoleh volume akhir 50
band produk PCR 158 base-pairakan tetapi
~l. Sebagai kontrol positif adalah DNA
band-bandhasil elektroforesis pada.8 dan 41
isolate dari H37Rv. Amplifikasi dilakukan
sampel
metode
positif
Boom,
tersebut
41
sampel
terlihat
dengan denaturasi awal pada 95 oC selama
tipis, sedangkan 2 sampel menunjukkan hasil
15 menit
negatif. Untuk deteksi dengan metode ketiga
diikuti
35
siklus meliputi
denaturasi pada 94°C, annealing pada 58oC
(pemanasan), 35 sampel menunjukkan basil
clan elongasi raJa 72oC masing-masing
positif clan 8 sampel negatif. Facia sampel
selama 55 detik. Setelah selesai 35 siklus,
nomor 4 terlihat bahwa gen rpoB terdeteksi
diteruskan dengan elongasi pada 72°C
dalam DNA yang diekstraksi dengan metode
selama 7 menit. Setelah proses amplifikasi,
Boom sedangkan dengan dua metode yang
DNA
dideteksi dengan teknik elektro-
lain menunjukkan positif tetapi pita DNA
foresis pada gel agarose 1,5%clan divisuali-
terlihat sangat tipis.Untuk sampel nomor 42, hasil positif terlihat hanya pada metode
Puslitbang Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir Nasional
241
Prosiding
Presentasi
Ilmiah
Keselamatan Ifotel
Kartika
Radiasi
dan
Chandra,
Lingkungan
.#4 Vesember
X 2004
Boom daD proteinase-K saja, sedangkan
metode yang sensitif, dapat diulang (repro-
untuk sampel nomOI 43, dengan metode
ducible),cepat, sederhana, murah, clan tidak
Boom
positif
memerlukan perlatan ~usus clan pengeta-
sedangkan dengan dua metode yang lain
huan biokimia yang mendalam serta resiko
hasilnya negatif. Facia dua sampel BTA
ke personil yang rendah.
menunjukkan
basil
negatif sebagai kontrol,
salah satunya
Metode pertama dalam penelitian ini
menunjukkan basil positif pada ketiga jenis
adalah metode yang dikembangkan oleh
metode meskipun band-bandPCR-nyatipis.
Boomdkk. [10] yang telclh banyak digunakan
Hasil BTA positif secara konvensional
untuk
(mikroskopis) menunjukkan kemungkinan
macam sampel klinis seperti urin, darah daD
jumlah
sputum.
bakteri M.
tuberculosis yang
mengisolasi
Metode
DNA
ini
dari
berbagai
didasarkan
pada
mempunyai gen rpoB yang menjadi target
pengikatan DNA dengan adanya chaotropic
rifampisin,
tidak
agent seperti guanidin isotiosianat (GuSCN)
terdeteksi dengan metode konvensionalj
pada partikel silika atau gelas dan telah
mikroskopis. Hal ini menunjukkan bahwa
diketahui dengan baik kelebihannya. GuSCN
teknik PCR lebih sensitif daripada metode
merupakan agensia
konvensional.
memumikan clan mendeteksi DNA clan RNA
sedikit
sehingga
Dalam penelitian ini, dibandingkan
yang kuat
untuk
k.arena potensinya dalam melisis sel
ada tidaknya band-band basil PCR dan
menonaktifkan nuklease. Agensia GuSCN
DNA yang diekstraksi dengan mengguna-
juga terbukti lebih efektif daripada chaotropic
kan tiga macam metode yakni metode
agent yang lain seperti GuHCI karena tidak
Boom, proteinase-K clan pemanasan,yang
adanya
nantinya akan digunak~
adanya GuSCN, konsentrasi tinggi asam
secara rutin
penghambatan
RNase.
Dengan
untuk mendeteksi secara dini keberadaan
nukleat akan terikat kuat pada diatom
M. tuberculosisdalam sampelklinis sputum
(partikelsilika).
dan sensitifitas atau resistensinya terhadap obat. Dengan demikian dibutuhkan .sual:u
Puslitbang Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir
Nasional
242
~;;
Prosiding
Presentasi
llmiah
Keselatnatan JioteJ Kartika
Tabel1
1. 3. 4-
5. 6.
7. 8. 9. 10. 11. 1213.
14. 15.
L 341
16.
P -) L30 L 31 P 32
17. 18. 19. 20. 21.
L(50 P(24 P(60
22-
23. 24. 25.
!@
L 70 P 17 P 33 L42 P 50 L 45 P22 L -) L 19
26. 27. 28. 29. 30. 31. 32-
33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41.
P34
42-
43.
44.~~
45. (K)
dan Lingkungan
L 19 P 52 P 29 P 19 L 50 L 27 L 61 P 21 P25 P25 P 17
+ + +
+
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
+
++
+ + +
++ ++ ++ ++ ++
+ + + + +
+ + +
+ + + + + +
+ + + +
+ + +
+ + +
~
+ +
it-
+ --r;:--
++
t. +
L
+ +
~~
++
++ ++ + (ips)
++
++ ++ ++
++ ++
+'tn~\I S
+(tps).
'."'-'i
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + (tps)
I
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
++ ,
+ (ips) + (ips)
I
++ ++
++
++ ++ ++
-
+
~++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
~~ ++ ++ ttn~\ + ,trs,
,-
:
++ + (tps)
!
++ ++ + + itn,,\ "..S,
:i
i
+ (tps)
~ ~ ~
+ (t.,S)
+ (tps) ++ ++ ++
++
+ (tps)
i..-+(~S)
L (60)
*) Catatan : tps adalah tipis dan K adalah BTA negatif (kontrol)
Puslitbang Keselamatan Radiasi ann Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir Nasional
X
21)04
Hasil deteksi gen rpoBdengan PCR dan ketiga jenis metode (Boom, Protenase-Kclan pemanasan)pada sputum BTA positif.
L 39 P 43 L25 P22 L23 P22 P -) P25 P 24 L66 P 24 L 55 P28 L38
2-
Radiasi
Chandra. .14 Vesember
243
Prosiding
Presentasi
Ilmiah
Keselamatan I/Ote} Kartika
M
K+ 4
4
4
43
43
Radiasi Chandra.
datI Lingkungan :14 Vesember
X
!J;OiJ4
K-
(I) (II) (III) (I) (II)
Gambar1. Band-bandbasil elektro£oresis produk PCRpada L5% agarose untuk ketiga jenis metode. Lajur daTi kiri ke kanan adalah marker (M), kontrol positif (K +), sampel nomor 4 (metode Boom), 4 (metode proteinase-K,4 (metode pemanasan),sarnpel nomor 43 (metode Boom), 43 (metode proteinase-K)clan kontrol negative (K-).
Metode yang kedua untuk ekstraksi
kan beberapa DNA mengalami degradasi.
DNA adalah dengan metode proteinse-K
Dan Tabel 1 terlihat bahwa metode ini
yang relatif lebih pendek (sederhana)dari-
harnpir sarna kualitasnya dengan metode
pada metode Boom. Proteinase-K adalah suatu enzim yang berfungsi untuk melisis protein
menggunakan
buffer
yang
mengandung sodium dodesil sulfat. Efekti-
demikiail metode kedua ini menjadi suatu
vitasnya tergantung pada suhu (optimum
alternative kedua. Metode iI}i telah banyak
55-57oC)clan lamanya inkubasi (2-3 jam
digunakan untuk ekstraksi DNA dari sampel
atau semaIam) yang merupakan penentu
darah dan cairan tubuh yang lain.
potensi proteinase-K.
Pemumian asam nukleat sebagai
Inaktivasi yang
cukup panjang pada 95oCdapat menyebab--
pelacak keberadaan suatu bakteri patogen
-Puslitbang Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir
Nasional
244
Prosiding
Presentasi
Ilmiah
Keselamatan Ifotel
Kartika
Radiasi
dan Lingkungan
Chandra.
14 Vesembe-
X
~O04
dalam spesimen kIinis merupakan prose-
8% selama prosedur dan 30% diantaranya
dur
itu
tidak dapat dielusi. DNA yang diperoleh pun
banyaknya tahapan pada prosedur klasik
tergantung pada jumlah DNA awal yang ada
(seperti lisis, proteinase, ekstraksi dengan
dalam sampel mula-mula.
pelarut organik dan pengendapan dengan
ikatan yang baik antara molekul
etanol) masih ditemui adanya resiko yang
dengan partikel
besar akan transmisi antar sampel (konta-
pencuci untuk mendispersi asam nukleat clan
minasi). Namun ketika teknik biologi
untuk mendisrupsi asam nukleat dengan
molekuler seperti PCR yang sangat sensitif
diatom juga menentukan jumlah hasil DNA.
diperkenalkan untuk
Adanya RNA untai tunggal yang mungkin
yang
panjang.
nukleat daTi suatu transmisi ini
Di
samping
mendeteksi asam mikroba
patogen,
dapat terdeteksi dengan
silika,
TerbenhIknya
vorteks
DNA dengan
terikut dengan DNA juga merupakan suatu faktor tersendm,
mudah yang mengarah ke basil positif-
Oi negara-negara berke~bang seperti
salah. Teknik PCR yang sangat sensitif ini
Indonesia, permasalahan dala~ pe~beran-
memungkinkan
tasan TB
terdeteksinya
transmisi
~enjadi
lebih
berat karena
sehingga hams dilakukan dengan ekstra
kurangnya informasi kerentanan (suscepti.
hati-hati [10].
biliiy) isolat M. tuberculosisdisebabkankarena
Inti
dalam
terbatasnya dana dan kemampuan teknik
adalah pemutnian asam
untuk mendeteksi. Pengobatan TB tanpa
nukleat dimana asam nukleat dapat di-
informasi tersebutakan mempertinggi resiko
murnikan langsung atau tidak tergantung
kegagalan pengobatan clan penyebaran strain
pada sifat organisme. Prosedur awal
yang resisten
prosedur yang diuji
penelitian ini
dimaksudkan
untuk
melisis sel dan
serta resiko
merebaknya
resistensi terhadap obat yang lain. Beberapa
melepaskan asam nukleat yang kemudian
metode pun telah dikembangkan oleh para
akan berikatan dengan silika. Kedapat
peneliti seperti cytometricdan alamarbluetests
ulangan (recovery)DNA tergantung pada
clan metode proporsional untuk menguji
deret nukleotidanya clan ada kemungkinan
susceptibility.~. tuberculosisterhadap rifampin
DNA
and isoniazid [11].
hilang
dalam beberapa langkah
prosedur sehingga kalau perlu ditambahkan DNA
carrier. Beberapa penelitian
mengidentifikasi hilangnya DNA sebesar
PuslitbangKeselamatan
Telah diketahui bahwa resistensi terhadap rifampisin dan isoniazid merupakan faktor paling penting dalam menentukan
Radiasi dan Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir
Nasional
245
Prasiding
Presentasi
Ilmiah
Keselamatan JIOteJ Kaltika
efektivitas petunjuk pengobatan standard
tersebut telah menyebabkan ke keperluan akan metode diagnostik yang cepat, murah terutama di negara-negara berkembang seperti Indonesia. Deteksi cepat resistensi rifampisin karena
(RMP) pun sangat penting
merupakan
petunjuk
penting
resistensi MDR yang menjadi kendala utama terapi TB. Secarakolektif basil-basil
dan Lingkungan 14 Vesember
X
~O04
IV. SIMPULAN
yang direkomendasikan oleh WHO saat ini. Pengungkapan mekanisme aksi obat
Radiasi Chandra,
Dari basil penelitian ini dapat diketahui bahwa dari 43 sampel DNA bakteri yang diekstrak dengan metode Boom, 41 sampel diantaranya menunjukkan basil positif dan 2 sampeI negatif, sedangkan dengan metode proteinase-K, 41 sampel juga positif akan tetapi band-bandbasil elektroforesis pada 8 dari 41 sampel positif tersebut terlihat tipis, dan dua sampel lainnya menunjukkan basil negatif.
Untuk
deteksi dengan metode
pemanasan, 8 sampel menunjukkan hasil negatif. Dan hasil tersebut dapat ditarik 95% strain M. tuberculosisyang resisten RMP memiliki mutasi dalam daerah hot-
kesimpulan bahwa meskipun prosedurnya lebih panjang, metode Boom relatif lebih baik
spot 81 pasang basa (kodon 507-533) sub unit J3RNA polymerase dari gen rpoB[6]. Oleh karena jtulah maka dalam penelitian
daripada
metbde
proteinase-K clan
pemanasan.
ini dikembangkan daD dikaji tiga jenis metode ekstraksi DNA
bakteri untuk
bersifat sensitif atau resisten terhadap rifampisin dan isoniazid. Analisis tersebut dapat dilakukan dengan metode single strand conformation palyrrlorphism (SSCP) bail
radioaktif maupun non radioaktif
diikuti dengan direct sequendng.Metode lain adalah hibridisasi dot blot dengan pelacakradioaktif atau fluoresensi.
DAFfAR PUSTAKA 1. ADITAMA, T.Y., Tuberkulosis kini, masa datang & penanggulangannya, Seminar Nasional "Quality assuranceprogramme for molecular-based diagnosis of Hepatitis C and tuberculosis", Jakarta, 2003. 2. CARMELIA, B., Program nasional pemberantasan tuberculosis, Seminar Nasional"Quality assurance programme for molecular-based diagnosis of Hepatitis C and tuber~osis", Jakarta, 2003. 3. MITCHISON, D.A. and NUNO, A.J., Influence of initial drug resistanceon the responseto short-course chemotherapy of pulmonary tuberculosis. Am. Rev. Respir. Dis. 133, 423-430,1986.
Puslitbang Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir
Nasional
246
Prasiding
Presentasi
Ilmiah
Keselamatan I.JoteJ Kaltika
4. MILLER, L.P., CRAWFORD, J.T. and SHINNICK, T.M., The rpoB gene of Mycobactrium tuberculosis,Antimicrobial Agentsand Chemotherapy 38 (4), 805-811, 1994. 5. SAJDUDA, A., BRZOSTEK, A., POPLAWSKA, M., AUGUSTYNOWICZ-KOPEC, E., ZWOLSKA, Z., NIEMANN,S., DZIADEK, J. and HILLEMANN, D., Molecular characterizeation of rifampisin- and isoniazidresistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Poland, ].Clin. Microbiol.Vol. 42 (6), 2425-31,2004. 6. TELENTI, A., IMBODEN, P., MARCHEST, F., LOWRIE, D., COLE, 5., COLSTON, M.J., MATTER, L., SCHOPFER, K., and BODMER, T., Detection of rifampisin-resistance mutation in Mycobacteriumtubercu-Iosis, Lancet341,647-650,1993. 7. BAUER, H.M. and MANOS, M., PCR detection of genital human papillomavirus, In: D.H. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover, and T.J. White (eds.) Diagnostic molecular microbiology, Principles and applications. American Society of Microbiology, Washington DC., p 407-413. 8. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY, Combating infection in developing countries, Vienna Austria,
2000. 9. LOGAN, R.P.H., The IJC urea breath test, In : Helicobacter pylori techniques for clinical diagnosis & basic research: Diedit oleh Adrias Lee and Francis Magraud, WB Sanders Company Ltd., London, 1996,1-16. 10. BOOM, R., SOL, C.J.A., SALIMANS, M.M.M., JANSEN, C.L., WERTHEIMVAN DILLEN, P.M.E., and VAN DER NOORDAA, J., Rapid and simple method for purification of nucleic acids, ]. Clin. Microbiol. 28(3),495-503,1990. 11. REIS, R.S., NEVES, I., LOURENCO, S.L.S., FONSECA, L.S. and
Radiasi
dan Lingkungan
Chandra,
.14 Vesember
X
~Ol)4
LOURENCO, M.C.S., Comparison of flow cytometric and alamar blue tests with the proportional method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to rifampin and isoniazid, J. Clin. Microb. 42, 2247-2248,2004.
DISKUSI
Susyati (P3KRBiN-BATAN) Pada hasil penelitian disebutkan bahwa daTi 43 sampel yang diperiksa temyata 40 sampel positif dengan metode Boom, apakah ini berarti DNA terekstraksi dengan baik (dengan metode Boom). Apakah hal ini jika rpoB-nya positif berarti pula bakteri sudah resisten ?.Apakah hasil ini sudah di-
bandingkan dengan pemeriksaanresistensi konvensional (teknik kultur) ?
Jawab: Metode Boom adalah metode untuk mengekstraksi DNAjRNA. Hasil PCR dengan menggunakan primer rpoB positif apabila DNA hasil ekstraksi mempunyai gen yang mengkode rpoB. Bakteri M. Tuberculosis resisten terhadap rifampisin apabila terjadi mutasi pada gen rpoB. Oleh karenanya untuk mendeteksi mutasi masih diperlukan teknik lanjutan yakni hibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radioaktif maupun non radioaktif, atau SSCP daD sequencing. Hasil ini tidak atau belum dibandingkan dengan teknik kultur untuk pemeriksaan resistensi. Himawan Anwar (PT. Pindo Deli Pulp Mill) Apakah efek metode "Boom pada penderita TB ? lawab:
"
Tidak ada efek langsung pada penderita TB. Metode Boom adalah metode untuk mengekstraksi DNA clan jika dilanjutkan dengan teknik untuk mendeteksi adanya M. tuberculosisdengan teknik PCR clan hasilnya positif berarti pasien terinfeksi bakteri TB.
Puslitbang Keselamatan Radiasi ann Biomedika Nuklir-Badan
Tenaga Nuklir Nasional
247
