Leona Leišová
Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Metodika pro praxi
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2007
Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem řešení projektu: MZE0002700602 - Studium a využití biodiverzity, genetických mechanismů a nových metod pro zlepšování biologického potenciálu odrůd a setrvalý rozvoj zemědělství
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN 978-80-87011-27-0
Leona Leišová
Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene
METODIKA PRO PRAXI
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2007
Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Předmětem metodiky je zavedení nové metody pro druhově specifickou detekci a stanovení fytopatogenní houby Pyrenophora teres, která je původcem hnědé listové skvrnitosti a způsobuje značné ekonomické ztráty na porostech ječmene. Metoda je založena na detekci Pyrenophora teres pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery. Aplikace metodiky předpokládá základní vybavení laboratoře molekulární biologie. Specifická a včasná detekce původce listové skvrnitosti umožní účinnou aplikaci příslušných fungicidů a tím pozitivně ovlivní výnos ječmene. Detekce a stanovení P. teres rovněž umožní lepší hodnocení odrůd ječmene v odrůdových zkouškách a při šlechtění ječmene na rezistenci k původcům listových skvrnitostí.
Detection and quantification of Pyrenophora teres in barley leave tissue The aim of this methodology is to establish a new method of species specific detection and quantification of Pyrenophora teres causing leave spot disease of barley. It brings about high economic losses in barley. The methodology is based on polymerase chain reaction (PCR) with specific primers. The application of the method assumes moderately equipped laboratory of molecular biology. The specific and timely detection of P. teres allows the effective application of fungicides and also the better evaluation of barley varieties in variety trials and in barley breeding for resistance to pathogens causing leave spot diseases.
Oponenti: Ing. S. Kozelská, CSc.
Metodika je určena orgánům státní správy, šlechtitelským organizacím a zemědělské praxi. Metodika byla schválena odborem výzkumu MZe pod č.j. 001449/2008. Ministerstvo zemědělství doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.
Obsah: Úvod
1
Podstata metody
..5
Potřebné technické vybavení
..7
Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat
10
Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti
15
Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití
16
Přednosti metody, možnosti rozšíření
16
Další doporučená literatura
16
Úvod Listové skvrnitosti na listech ječmene (Hordeum vulgare L.) patří mezi nejdůležitější choroby ve všech oblastech, kde je ječmen dominantní zemědělskou plodinou. Jsou způsobovány komplexem houbových patogenů, z nichž každý vytváří odlišné typy symptomů. Nejčastější z nich jsou síťovitá, hnědá a pruhovitá skvrnitost (net blotch, spot blotch a leaf stripe). Hnědá skvrnitost je způsobována houbami: Pyrenophora teres f. sp. maculata (anamorph. Drechslera teres f. sp. maculata) a Helminthosporium sativum (anamorph. Drechslera sorokiana syn. Bipolaris sorokiana). Původcem klasické síťovité skvrnitosti listů ječmene je houba Pyrenophora teres f. sp. teres (anamorph. Drechslera teres f. sp. teres). Za pruhovitou skvrnitost je zodpovědná houba Pyrenophora graminea (anamorph. Drechslera graminea) (Minaříková, 2002). Pyrenophora teres na rozdíl od např. Pyrenophora triticirepentis patří mezi monofágní organismy, je vázána na úzký okruh hostitelů. Jsou jimi různé druhy rodu Hordeum: Hordeum vulgare, Hordeum spontaneum, Hordeum murinum, Hordeum bulbosum a Hordeum marinum. Pouze u Pyrenophora teres f. sp. maculata byla jak ve skleníkových, tak i v polních podmínkách prokázána schopnost přechodu na pšenici (Triticum aestivum). Na listech pšenice vytváří nekrotické skvrny a dokonce sporuluje (Minaříková, 2002). Pyrenophora teres f. sp. maculata se vyskytuje častěji na ozimém šestiřadém ječmeni (Hordeum vulgare) než na jarním dvouřadém (Minaříková and Polišenská, 1999). Má větší konkurenční schopnost, je agresivnější a zřejmě potlačuje i rozvoj net typu (Pyrenophora teres f. sp. teres) (Scott, 1991; Ondřej, 2000). Klasický net typ, Pyrenophora teres f. sp. teres dominuje na jarních dvouřadých odrůdách ječmene (Hordeum vulgare) (Minaříková and Polišenská, 1999). Každý druh/ forma hub rodu Pyrenophora se projevuje typickými symptomy na listech hostitele. Pyrenophora teres f. sp. teres se projevuje protáhlými světle hnědými lézemi s tmavě hnědým síťováním. Nekrotické léze jsou vždy doprovázeny 1
chlorotickou zónou. S časem symptomy mění barvu až do tmavě šedo-hnědé nikoliv však tvar. Pyrenophora teres f. sp. maculata způsobuje na listech tmavě hnědé nekrotické skvrny oválného tvaru bez síťování obklopené různě širokou chlorotickou zónou (Shipton et al., 1973). Zatímco se Pyrenophora graminea šíří výhradně osivem, Pyrenophora teres se rozšiřuje jak osivem, tak i inokulací listů během vegetace. Přenos osivem má význam jen v dosud nezamořených oblastech. Je-li však přítomen jiný zdroj primárního inokula, nemá přenos osivem patrně velký význam (Shipton et al., 1973). Primárním zdrojem inokula jsou zejména posklizňové zbytky rostlin není však jisté, zda primárním inokulem jsou konidiospory nebo askospory. Askospory se tvoří během saprofytní fáze života patogena na posklizňových zbytcích, které zůstávají na povrchu půdy (Barrault, 1989). Doba zrání perithécií je 3 až 5 měsíců v závislosti na teplotě (Barrault, 1989). Askospory představují velké nebezpečí z hlediska hostitele hlavně jako potencionální zdroj nových genotypů patogena spíš, než že by byly primárním inokulem. Nejčastějším primárním inokulem jsou konidie vytvářející se na infikovaných posklizňových zbytcích (Barrault, 1989). Konidie, které se tvoří na povrchu nekrotických lézí na listech infikovaných rostlin, a to i rezistentních, způsobují sekundární infekce dalších listů téže rostliny nebo dalších rostlin v okolí. Konidie se šíří větrem, dešťovými kapkami a větrným deštěm. Za příznivých podmínek může toto onemocnění vážně ohrozit výnos a sladovnickou kvalitu ječmene. Uvádí se výnosové ztráty 10-40% (Porta-Puglia et al., 1986; Steffenson and Webster, 1992). Vážné epidemie postihly mnoho oblastí České republiky v letech 1996 a 1997 (Minaříková and Polišenská, 1999). Ztráty mohou být redukovány kontrolou zdravotního stavu osiva, rotací plodin, zaoráváním posklizňových zbytků, aplikací listových fungicidů a pěstováním rezistentních odrůd ječmene (Shipton et al., 1973; Tekauz, 1990; Minaříková, 2002). Vzhledem k ekonomickému tlaku na co nejnižší vstupní náklady 2
je zvýšený zájem o vyšlechtění odrůd s rezistencí k listovým skvrnitostem. Šlechtění na rezistenci k tomuto patogenu je však značně obtížné pro jeho velkou intraspecifickou variabilitu. Klasická metodika detekce houbových patogenů zahrnuje pěstování na umělých živných médiích, imunologické testy (ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) a patologické testy na diferenciačních odrůdách hostitele (Afanasenko et al., 1995). Tyto metody selhávají tam, kde se jedná o vysoce variabilní populaci patogena a tam, kde existují druhy či formy geneticky si velmi blízké. To je případ houby Pyrenophora teres, jejíž populace vykazují vysokou míru variability, a která se vyskytuje ve dvou formách: Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata. Obě formy produkují podobné kultury na umělých živných půdách, mají takřka identickou morfologii; liší se pouze typem symptomu na listech hostitele. Vzhledem k tomu, že se rezistence k oběma formám dědí nezávisle je důležité, aby byl patogen korektně identifikován. Nové možnosti detekce patogenů se otevřely s objevením polymerázové řetězové reakce. Avšak žádná z dosud publikovaných metod nedokázala spolehlivě rozlišit a tedy detekovat obě formy Pyrenophora teres vyskytující se v České republice. Byla tedy vyvinuta a optimalizována vlastní metodika pro detekci a stanovení obou forem Pyrenophora teres v listových pletivech rostlin založená na diagnostických AFLP markerech (Leisova et al., 2006). Kvantitativní stanovení vychází ze základní metody Real-time PCR se specifickými TaqMan sondami. Vývoj této metodiky byl publikován (Leišová et al., 2005; Leišová et al., 2006) a zde je kompletní protokol předkládán pro využití v rostlinolékařské, šlechtitelské a obecně zemědělské praxi. Literatura: AFANASENKO O.S., HARTLEB H., GUSEVA N.N., MINARIKOVA V., JANOSHEVA M. (1995): A set of differentials to characterize populations of Pyrenophora teres Drechs. for international use. Journal of Phytopathology 143: 501-507. 3
BARRAULT G. (1989): L´Helminthosporiose de l´orge causée par Drechslera teres. Thèse de doctorat d´État, L´Institut National Polytechnique, Toulouse, 1989. LEIŠOVÁ L, MINAŘÍKOVÁ V., KUČERA L., OVESNÁ J. (2005): Genetic diversity of Pyrenophora teres isolates as detected by AFLP analysis. Journal of Phytopathology 153: 569-578. LEISOVA L., MINARIKOVA V., KUCERA L., OVESNA J. (2006): The quantification of Pyrenophora teres in infected barley leaves using real-time PCR. Journal of Microbiological Methods 67: 446-455. MINAŘÍKOVÁ V., LEIŠOVÁ L. (2005): Reakce odrůd jarního ječmene vůči síťovité skvrnitosti v lokalitě Kroměříž (2003-2004) a detekce tohoto patogena pomocí specifických markerů. Obilnářské listy 2: 7-9. MINAŘÍKOVÁ V., POLIŠENSKÁ I. (1999): ANALYsis of populations of Pyrenophora teres on barley in the Czech Republic. Plant Protection Science 35: 115-120. MINAŘÍKOVÁ V. (2002): Aktuálně k výskytu houbových chorob ječmene. Úroda 4: 10-12. ONDŘEJ M. (2000): Problematika hub rodu Drechslera na ječmeni (Hordeum). Agro 5: 11-14. PORTA-PUGLIA A., DELOGU G., VANNACCI G. (1986): Pyrenophora graminea on winter barley seed: effect on disease incidence and yield losses. Journal of Phytopathology 117: 26-33. SCOTT D.B. (1991): Identity of Pyrenophora isolates causing nettype and spot-type lesions on barley. Mycopathologia 116: 29-35. SHIPTON W.A., KAHN T.N., BOYD W.J.R. (1973): Net blotch of barley. Reviews in Plant Pathology 52: 269-290. STEFFENSON B.J., WEBSTER R.K. (1992): Pathotype diversity of Pyrenophora teres f. teres on barley. Phytopathology 82: 170-177. TEKAUZ A. (1990): Characterization and distribution of pathogenic variation in Pyrenophora teres f. teres and P. teres f. maculata from western Canada. Canadian Journal of Plant Pathology 12: 141-148. 4
Metodika detekce a stanovení Pyrenophora teres v pletivech hostitele Podstata metody Metodika se skládá ze tří částí: první z nich je odběr vzorků a extrakce DNA; druhou částí je detekce Pyrenophora teres a třetí částí je kvantitativní stanovení Pyrenophora teres v pletivech hostitele. I. Odběr vzorků a izolace DNA Podstatou první části je jednak odběr vzorků listových pletiv se symptomy nebo i bez symptomů podle zásad správného vzorkování tak, by výpověď o míře výskytu Pyrenophora teres v porostech byla statisticky významná. Vzorky – jednotlivé listy – mohou být uchovávány buď v papírových sáčcích za běžných teplot, budou-li dále zpracovávány podle metodiky detekce nebo v uzavřených igelitových sáčcích při teplotách -20°C a nižších budou-li dále zpracovávány podle metodiky kvantitativního stanovení Pyrenophora teres v pletivech hostitele. Postatou extrakce DNA je uvolnění DNA z buněk mechanickým rozdrcením a oddělení DNA od ostatních sloučenin, zejména proteinů, polysacharidů a barviv. Přidáním detergentu CTAB dochází za přítomnosti soli NaCl k vytvoření ve vodě rozpustného komplexu [CTAB-DNA], který je následně směsí chloroformu a izoamylalkoholu (24:1) extrahován do vodné fáze a oddělen takto od proteinů a polysacharidů, které jsou spolu s chloroformovou fází odstraněny. DNA je pak srážena absolutním etanolem a zbytky soli a detergentu jsou odstraněny pomocí 75% roztoku etanolu. DNA je rozpuštěna v pufru TE, který je velmi zředěným vodným roztokem Tris a EDTA, které stabilizují DNA v roztoku. Tris upravuje pH a EDTA vyvazuje Mg2+ ionty a tím inhibuje činnost enzymů rozkládajících DNA. II. Detekce Pyrenophora teres Druhou částí je specifická detekce Pyrenophora teres ve vzorcích. Principem této metody je aplikace polymerázové 5
řetězové reakce (PCR) s páry primerů navrženými na základě specifických DNA sekvencí obou forem druhu Pyrenophora teres. Výsledkem je buď přítomnost nebo nepřítomnost PCR produktu podle toho, zda primery „najdou“ svoji komplementární sekvenci ve vzorku DNA či „nenajdou“. Pokud tuto sekvenci „najdou“ dochází k tak mnohonásobnému zmnožení úseku DNA uvozeného daným párem primerů, že je možné přítomnost tohoto úseku DNA a tedy i přítomnost dané formy Pyrenohora teres detekovat pomocí běžná analýzy produktů PCR, kterou je gelová elektroforéza. Produkty PCR jsou vizualizovány pomocí barviva EthidiumBromidu, které interkaluje do dvouřetězcové DNA produktů PCR. Pod UV světlem je pak možno přímo detekovat přítomnost či nepřítomnost produktů jednotlivých PCR reakcí. III. Stanovení Pyrenophora teres Principem třetí části, kterou je kvantitativní stanovení Pyrenophora teres je rovněž aplikace PCR reakce avšak v uspořádání v tzv. reálném čase. Základem je rovněž PCR se specifickými primery, ale pro stanovení PCR produktů jsou použity tzv. TaqMan sondy, což jsou oligonukleotidy, které se specificky hybridizují od oblasti mezi primery a tím zvyšují specifičnost reakce. Na 5´ konci jsou značeny fluorescenční značkou (FAM, VIC, apod.) a na 3´ konci je kovalentně navázán zhášeč fluorescence, kterým může být buď fluorescenční značka TAMRA nebo nefluorescenční kovalentně navázaný MGB (Minor Groove Binder) zhášeč. 5´-3´ exonukleázová aktivita Taq polymerázy v elongačních fázích PCR způsobuje degradaci sondy a tím dochází ke vzrůstu intenzity fluorescence, která je v každém cyklu PCR reakce detekována pomocí CCD kamery. Porovnáním odečtených hodnot Ct (Cycle treshold) s kalibrací lze stanovit kvantitativní zastoupení PCR produktu v reakční směsi.
6
Potřebné technické vybavení I. Odběr vzorků a izolace DNA Pro uchovávání vzorků a izolaci DNA je třeba následující zařízení: mrazák na teplotu -20°C a nižší homogenizátor QIAGEN centrifuga s otáčkami min. 11000 otáčet/min. s rotorem na zkumavky z umělé hmoty (Ependorfky) o objemu 2 ml vodní lázeň nebo teplotní blok vortex zařízení na horizontální elektroforézu spektrofotometr (pouze v případě následné aplikace metodiky kvantitativního stanovení Pyrenophora teres) Automatické pipety Zkumavky na izolaci DNA – 2ml Špičky na automatické pipety Pro izolaci DNA jsou potřebné následují roztoky a chemikálie: tekutý dusík 2 x CTAB PUFR: 2 M NaCl (SERVA) 40 ml 5 M roztoku 0,2 M Tris (SERVA) 20 ml 1 M rozt. o pH 8,0 50 mM EDTA (SERVA) 10 ml 0,5 M rozt. o pH 8,0 2 % CTAB (Sigma Aldrich) 2 g CTAB s do 100 ml H2O up TE PUFR: 10 mM Tris (SERVA) 2,5 ml 1 M roztoku o pH 8,0 1 mM EDTA (SERVA) 0,5 ml 0,5 M rozt. o pH 8,0 do 250 ml H2O up PVP = polyvinylpyrrolidon (Sigma Aldrich) Směs chloroform (SERVA): isoamylalkohol (Lachema Brno) ( (24:1) Absolutní tj. min. 96% roztok etanolu (SERVA) – vymražený (-20°C) 70 % roztok etanolu (SERVA) 7
1 x TAE PUFR TRIS báze (s) (SERVA) 4,8 g 0,48% roztoku ledová CH3COOH (Sigma-Aldrich) 1,5 ml 0,5M EDTA (pH = 8,0) 2,0 ml 1mM roztok do 1000ml H2O up Velikostní standard λ HindIII (Fermentas), vč. loading buffer
II. Detekce Pyrenophora teres Pro detekci P. teres jsou potřebné následující chemikálie a zařízení: primery (syntéza firmou Applera) Primer PTM494d PTT429g PTT471h PT194m PT139m PTM379d7
Primery: PTM494d PTT429g PTT471h PT194m PT139m PTM379d7
Primer forward Primer revers 5´-TATTCTGCTAAGAGCTAGCATCCTA-3´ 5´-ACTGCGTACCAATTCTCTACAACTA-3´ 5´-CTTTTTGCAAGGGTCGTGC-3´ 5´-GCTGATGACATAAGTCGCTGC-3´ 5´-CCTGAGTAACTTGCCCCACC-3´ 5´-GAAAAGAGATGATGCGGACAC-3´ 5´-CATCGATGCGGCGTAAATTG-3´ 5´-ACAACGCGACAAAGGGCAG-3´ 5´-CATCGATGCGGCGTAAATTG-3´ 5´-TACAGCAGAAGGCAGTCGGC-3´ 5´-TTTACCTCCTACACAGCCACACC-3´ 5´-AACATATTTCTTCGCCTACACATCG-3´
TM 55°C 62°C 62°C 62°C 62°C 62°C
Velikost amplikonu 161 bp 93 bp 91 bp 194 bp 139 bp 379 bp
dNTP (Invitrogen) Tth polymeráza vč. pufru a MgCl2 (Biotools) H2O up (Sigma Aldrich) 8
Agaróza (SERVA) Ethidium-bromid (Sigma-Aldrich) 1 x TAE PUFR TRIS báze (s) (SERVA) 4,8 g ... 0,48% roztoku ledová CH3COOH (Sigma-Aldrich) 1,5 ml ... 0,5M EDTA (pH = 8,0) 2,0 ml ...1mM roztok do 1000ml ... H2O up Velikostní standard 100bp DNA Ladder (Fermentas), vč. loading buffer PCR destičky vč. víček či folie (AB gene), lze použít jednotlivé PCR zkumavky od různých výrobců Automatické pipety Špičky na automatické pipety Cykler Minicentrifuga Zařízení na horizontální elektroforézu Transiluminátor Fotodokumentační zařízení
III. Stanovení Pyrenophora teres Pro stanovení P. teres jsou třeba následující chemikálie a zařízení: primery (syntéza firmou Applera)
DTM340i DTT350j DT376b RacB-81
Primer forward Primer revers Taq Man sonda 5´-TGATGCGCTGGAGTGAGACAC-3´ 5´-TGTACATACGCCGCATCACG-3´ 5´-TCGTGGATACTCTACATAGGT-3´ 5´-CTTGATGCGCTGGAGTGAGA-3´ 5´-TGCATTTCCACCTACTGGTATGTAC-3´ 5´-ACGTCTCATGGATACTC-3´ 5´-TACACCTACGCTTGACGCATG-3´ 5´-GATATCTTCATCTGCGGACCG-3´ 5´-AGTTGTTTGTGGTTTTC-3´ 5´-AGGCGCACCCTACTACATCG-3´ 5´-ACCACCTTTATTGCCGCATC-3´ 5´-AGCTCGAAGACCCAACT-3´
9
Primery a Taq Man sondy: DTM340 F + R + sonda-FAM DTT350 F + R + sonda-FAM DT376 F + R + sonda-FAM RacB81 F + R + sonda-VIC
TM 60°C 60°C 60°C 60°C
Velikost produktu 81 bp 66 bp 91 bp 81 bp
AmpliTag GOLD polymeráza vč. pufru a MgCl2 (Applera) dNTP mix vč. dUTP (Applera) UNG (uracil N-glykosyláza) (Applera) H2O up (Sigma Aldrich) Optické PCR destičky (Applera - PN 4306737) – lze použít i jednotlivé optické zkumavky Víčka v provedení stripů po 8 (Applera - PN 4323032) – lze použít i folii na PCR destičky Automatické pipety Špičky na automatické pipety Cykler pro provádění PCR v reálném čase, např. ABI PRISM 7700 (Applera), ABI PRISM 7900 (Applera); lze použít i jakýkoliv typ Light-cycleru. Minicentrifuga Centrifuga na destičky
Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat I. Odběr vzorků a izolace DNA ¾ Odebrané listy jsou umístěny mezi listy filtračního papíru, opatřeny popisem: místem sběru, datem sběru, odrůdou hostitele, příp. určením druhu a formy patogena a odhadem míry napadení ve stupnici 1 – 9 a usušeny. ¾ K asi 0,5 mg suchého materiálu v 2ml ependorfce je přidáno 700μl 2% roztoku CTAB a 1 karbidová kulička. Ependorfky jsou umístěny do adapteru homogenizátoru a třepány při frekvenci 30Hz 1,5 minuty. Poté jsou vzorky 30 minut inkubovány ve vodní lázni při teplotě 60°C. 10
¾
¾
¾ ¾
¾ ¾
¾
Během inkubace je přidáno 10mg PVP. Pak je směs ochlazena na laboratorní teplotu. Ke směsi je přidán 1x objem směsi chloroformu a izoamylalkoholu (24:1). Po asi 5 minutách třepání jsou vzorky centrifugovány při maximálních otáčkách po dobu 10 minut a je odebrána vodná fáze. Tento krok je ještě jednou zopakován. K roztoku vzorku je přidáno 50μl 3M roztoku CH3COONa (pH = 4,8) a min. 1x objem 99% vychlazeného etanolu. Nedojde-li k precipitaci DNA, jsou vzorky inkubovány po dobu asi 30 minut v mrazáku při teplotě -20°C. Poté jsou vzorky centrifugovány při maximálních otáčkách po dobu 5 minut. Supernatant je odstraněn a k peletce precipitované DNA je přidáno 500μl 70% roztoku etanolu. Vzorky jsou inkubovány min. 1 hodinu při teplotě 4°C. Supernatant je odstraněn, k peletce DNA je přidáno 500 μl 70% roztoku etanolu a vzorky jsou inkubovány alespoň 1 hodinu při teplotě 4°C. Supernatant je odstraněn včetně zbytků etanolu pomocí vakuové odparky (dokud peletka neskáče při poklepu na uzavřenou! ependorfku). DNA je rozpuštěna v odpovídajícím množství TE pufru přes noc při teplotě 4°C. K roztokům DNA je přidáno 20μl roztoku RNázy (20mg/ml) a vzorky jsou inkubovány 10 minut při 37°C. Kvalita a koncentrace izolované DNA je ověřena elektroforézou v 0,8% agarózovém gelu. K 1 μl vzorku DNA je přidáno 10μl H2O a 3μl loading pufru a směs je nanesena na gel. DNA je vizualizována ethidiumbromidem (0,3μl/ 60 ml gelu) a detekována pod UV lampou. Koncentrace DNA vzorku je odhadnuta srovnáním se standardem λ Hind III (6μl - podle koncentrace standardu). Vzorky DNA jsou naředěny na pracovní koncentraci 50ng/μl; tato koncentrace je ověřena spektrofotometricky 11
na přístroji Quant Pro (nutné pouze pro kvantitativní stanovení). II. Detekce Pyrenophora teres ¾ Do PCR zkumavek nebo PCR destičky je napipetována reakční směs. Doporučuje se připravit si nejprve mastermix do zvláštní zkumavky, ten rozpipetovat a k němu nakonec přidat po 2μl roztoku vzorků DNA naředěných na konc. 50ng/μl. Reakční směs: primer mix (5μM) 1,0μl → 0,33 μM dNTP (2,5 mM) 1,5μl → 0,25 mM pufr (BioTools) (10x)1,5μl → 1 x MgCl2 (15mM) 2,0μl → 2,0 mM Tth polymeráza (BioTools) (5U/μl)0,2μl →1 U templátová DNA (50ng/μl) 2,0μl → 100ng H2O 6,8μl reakční objem 15,0μl ¾ Vzorky jsou zcentrifugovány na minicentrifuze nebo na centriguze na PCR destičky a jsou umístěny v cykleru. PCR reakce se sestává z následujících kroků: 1 cyklus: 35 cyklů:
95°C ........... 5 min. 95°C ........... 30 sec. ........... 30 sec. TM 72°C ........... 40 sec. 1 cyklus: 72°C ........... 5 min. 10°C .......... ∝ ¾ Produkty reakce jsou separovány elektroforeticky v 2,5% agarózovém gelu, vizualizovány ethidiumbromidem a detekovány pod UV lampou. Velikost produktů je odečítána porovnáním s velikostním standardem λ Eco1471/PvuI (100bp). ¾ Každá analýza obsahuje vždy pozitivní kontrolu (templátovou DNA extrahovanou z čistých kultur hub P. 12
teres f. sp. teres a P. teres f. sp. maculata ředěnou na koncentraci 50ng/μl) negativní kontrolu (reakční směs bez templátové DNA) a vzorky. ¾ Výstupem analýzy je vypracovaný protokol s dokumentačními obrázky elektroforetogramů a tabulkou, kde jsou výsledky analýzy přehledně shrnuty. III. Stanovení Pyrenophora teres ¾ PCR reakce s primerovými páry a Taq Man sondami PTM340-FAM, PTT350-FAM, PT376-FAM a Acl379VIC či RacB81-VIC jsou prováděny jako uniplex. Taq Man sondy pro detekci houbového patogena jsou značeny fluorescenční barvou FAM a sondy detekující DNA rostlinného hostitele fluorescenční barvou VIC. ¾ Detekce patogena je prováděna metodou relativní kvantifikace: obsah patogena v listovém pletivu hostitelské rostliny je získán z kalibrační křivky (osa x:počáteční koncentrace DNA standardů/ osa y: Ct reakcí se standardy) a je vztažen k obsahu rostlinné DNA. Hodnota Ct je definována jako cyklus PCR, ve kterém dojde ke statisticky významnému vzrůstu fluorescence. ¾ Reakce jsou prováděny podle protokolu č. 402823: Taq Man PCR Reagent Kit with AmpliTag Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). Reakční směs: Primer mix [5μM] 1,5 μl 0,3 μM Taq Man sonda [5μM] 1,0 μl 0,3 μM Pufr 10x 2,5 μl 1x MgCl2 [25mM] 2,5 μl 2,5 mM dNTP mix 4,0 μl 0,8/0,4mM UNG (uracil N-glykosyláza) [1U/1μl] 0,25 μl 0,25 U AmpliTag Gold DNA polymeráza [5U/1μl] 0,25 μl 1U 8,0 μl H2O Templátová DNA [50ng/1μl] 5,0 μl 250 ng Reakční objem 25,0 μl 13
Vzorky: Vzorky a standardy jsou pipetovány do optických PCR destiček (PN 4306737) a překryty optickými víčky v provedení stripů po 8 víčkách (PN 4323032) fy Applied Biosystems. Uspořádání vzorků v destičce je následující: A
1 st1
2 st1
3 st1
4 5 6 vz1 vz1 vz1
7 vz9
8 vz9
9 vz9
10 11 12 vz17 vz17 vz17
B
st2
st2
st2
vz2 vz2 vz2
vz10
vz10
vz10 vz18 vz18 vz18
C
st3
st3
st3
vz3 vz3 vz3
vz11
vz11
vz11 vz19 vz19 vz19
D
st4
st4
st4
vz4 vz4 vz4
vz12
vz12
vz12 vz20 vz20 vz20
E
st5
st5
st5
vz5 vz5 vz5
vz13
vz13
vz13 vz21 vz21 vz21
F
st6
st6
st6
vz6 vz6 vz6
vz14
vz14
vz14 vz22 vz23
nk
G
st7
st7
st7
vz7 vz7 vz7
vz15
vz15
vz15 vz22 vz23
nk
H
st8
st8
st8
vz8 vz8 vz8
vz16
vz16
vz16 vz22 vz23
nk
o st1 - st8 je ředicí řada směsi standardů patogena a rostliny o nk je negativní kontrola – mastermix bez templátové DNA o vz1 - vz23 představují vzorky s neznámým obsahem DNA ¾ Vzorky jsou zcentrifugovány na minicentrifuze nebo na centriguze na PCR destičky a jsou umístěny v cykleru ABI PRISM7700 (Applera). PCR reakce se sestává z následujících kroků: PCR reakce:
50°C ……………. 2 min. 95°C …………….. 10 min. 40 cyklů: 95°C …………….. 15 sec. 60°C ……………… 1 min.
14
¾ Ke sběru a analýze dat slouží program ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. Na základě hodnot počátečních koncentrací DNA standardů ředicí řady, měřených spektrofotometricky a hodnot Ct reakcí s DNA ředicí řady je vytvořena kalibrační křivka. Z ní a z naměřených hodnot CT reakcí se vzorky jsou programem ABI PRISM 7700 Sequence Detection System odečteny hodnoty počátečního obsahu DNA. Z hodnot počátečního množství DNA hostitele (Hordeum vulgare) a houbového patogena (P. teres f.sp. teres a/nebo P. teres f. sp. maculata) je vypočítán hmotnostní zlomek obsahu DNA rostliny ku obsahu DNA obou forem patogena P. teres. ¾ Výstupem analýzy je vypracovaný protokol s dokumentačními obrázky kalibračních křivek a tabulkou, kde jsou uvedeny hodnoty Ct, odvozené hodnoty počátečního množství DNA a vypočtený hmotnostní zlomek obsahu DNA rostliny ku obsahu DNA obou forem. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Oba typy analýz jak detekce, tak i kvantitativní stanovení Pyrenophora teres jsou založeny na PCR reakci. Před vlastní analýzou je nutné extrahovat DNA z napadených listů ječmene. Tato extrakce je časově nejnáročnější, vzhledem k obvyklé kapacitě centrifugy lze extrahovat 40 vzorků denně. Analýza 96 vzorků (počet pozic v PCR destičce) včetně extrakce DNA a obou analýz (detekce i stanovení) trvá 4 dny v případě, že na analýze pracuje 1 člověk. Kvantitativní stanovení Pyrenophora teres je výrazně finančně náročnější než detekce – tedy určení je-li některá z forem Pyrenophora teres ve vzorku přítomna či není. Detekce Pyrenophora teres v 96 vzorcích činí 11000,-Kč nepočítaje mzdu pracovníka a cena kvantitativní detekce je pro 96 vzorků 53000,Kč bez mzdy pracovníka. Celková cena obou analýz je 61000,-Kč nepočítaje mzdu pracovníka. 15
Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Jak detekce tak i stanovení Pyrenophora teres v napadených listech ječmene jsou dobře aplikovatelné pro rutinní využití. Jediným úskalím metody je jsou-li analyzovány vzorky, kde je listová čepel již téměř zničena houbami způsobujícími listové skvrnitosti. Tyto patogeny totiž produkují toxiny a další sekundární metabolity, které mohou inhibovat PCR reakci; a tak přestože je Pyrenophora teres ve vzorku přítomna může být nedetekována (falešný negativní výsledek). Přednosti metody, možnosti rozšíření Základní předností metody je přesná druhově specifická detekce obou forem Pyrenophora teres. Rozpoznání původce pouze podle symptomů na listech je někdy zavádějící a i zkušený fytopatolog se může zmýlit. Další předností je, že lze přítomnost houby zjistit už v ranných fázích infekce. Je tedy možné včas aplikovat postřiky. Rovněž testování linií ječmene v případě šlechtění na rezistenci nemusí trvat tak dlouho apod. Další doporučená literatura LEIŠOVÁ L, MINAŘÍKOVÁ V., KUČERA L., OVESNÁ J. (2005b): Genetic diversity of Pyrenophora teres isolates as detected by AFLP analysis. Journal of Phytopathology 153: 569-578. LEISOVA L., MINARIKOVA V., KUCERA L., OVESNA J. (2006): The quantification of Pyrenophora teres in infected barley leaves using real-time PCR. Journal of Microbiological Methods 67: 446-455. ROSYPAL S., DOŠKAŘ J., PETRZIK K., RŮŽIČKOVÁ V. (2002): Úvod do molekulární biologie, Díl čtvrtý: Výklad základních metod molekulární biologie, 3. inovované vydání, Brno 2002, 10851109. 16
VONDREJS V., STORCHOVÁ Z. (2000): Genové inženýrství, 1. díl, Karolinum, Praha 2000. VONDREJS V. (2001): Genové inženýrství, 2. díl, Karolinum, Praha 2001.
17
Autor: Název: Vydal: Tisk a vazba:
Mgr. Leona Leišová, Ph.D. Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně
Vyšlo v roce 2007 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: Autor fotografií:
[email protected] L. Leišová
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN 978-80-87011-27-0
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
