Dendritische cel gerichte lentivirale vectoren voor antitumor immuuntherapie
Cleo GOYVAERTS
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biochemie en de Biotechnologie Major Biomedische Biotechnologie Academiejaar 2009-2010
Promotor Universiteit Gent: Prof. dr. Xavier Saelens Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie Promotor Vrije Universiteit Brussel: Prof. dr. Kris Thielemans Wetenschappelijk begeleider: Dr. Karine Breckpot Vakgroep Fysiologie en Immunologie Laboratorium voor Moleculaire en Cellulaire Therapie
i
Dankwoord Aan het eindresultaat van deze thesis zijn vier leerrijke maar intensieve maanden voorafgegaan die ik zonder steun nooit tot een goede afloop had kunnen brengen. In de mate van het mogelijke zou ik alle mensen die hierbij hun steentje hebben bijgedragen dan ook van harte willen bedanken. Vooreerst zou ik mijn begeleidster Karine Breckpot willen bedanken voor alle steun en toeverlaat op elk uur van de dag. Haar gedrevenheid vormde voor mij als jonge wetenschapster een bron van inspiratie om vol motivatie aan mijn toekomst te beginnen. Daarnaast had ik ook heel graag mijn oprechte dank betuigd aan Prof. Xavier Saelens, zonder hem was ik nooit in contact gekomen met labo Immunologie en Fysiologie aan de Vrije Universiteit Brussel. Hij gaf mij de kans om te doen wat mij interesseert, iets waar ik hem enorm dankbaar voor ben. Verder had ik ook graag Prof. Kris Thielemans bedankt voor zijn schouderklopjes en ondersteuning waar nodig. Ook verschillende mensen van het labo verdienen een dankwoordje. Sandra, bedankt voor alle hulp met de injecties alsook bioluminescentie experimenten met de muizen. Voor deze experimenten had ik ook Cindy en Lander graag bedankt. Verder ook dank aan Carlo, Elsy en Xavier voor hun hulp bij al het klonerings- en precipitatie werk, bedankt Joeri Aerts, Aude, Petra, Uschi, Perpetua en Roger voor de leuke sfeer en boeiende tips. Bedankt ook aan Lucia voor het zorgvuldig nalezen van mijn thesis. Voor ik afsluit, had ik ook heel graag mijn beste vrienden Jan, Vanessa, Liesbeth, Lotte, Hendrik, Kathleen en Mart bedankt voor de vriendschap die ik nodig had op minder positieve momenten. Bedankt mama, papa en Marco voor het geduld en geloof in mezelf dat ik soms verloor en tot slot bedankt Vince voor alles wat je voor mij gedaan hebt. Keer op keer, dag en nacht stond je voor me klaar om me op te beuren, teksten na te lezen en vooral om er voor mij te zijn.
i
Inhoudsopgave Dankwoord .................................................................................................................................. i Inhoudsopgave ........................................................................................................................... ii Lijst met afkortingen ................................................................................................................. iv Nederlandstalige samenvatting ................................................................................................ vii English summary ...................................................................................................................... vii Inleiding ..................................................................................................................................... 1 1. Antitumor immuuntherapie ................................................................................................ 1 1.1. De relatie tussen oncologie en immunologie .............................................................. 1 1.1.1. Immuunbewaking ................................................................................................. 1 1.1.2. Modulatie van het immuunsysteem door de tumor .............................................. 2 1.2. Het belang van immuuntherapie in de 21ste eeuw ...................................................... 4 2. Dendritische cel gebaseerde immuuntherapie .................................................................... 6 2.1. De polyvalente dendritische cel .................................................................................. 6 2.2. Dendritische cellen in actieve antitumor immuuntherapie .......................................... 9 3. Immuunmodulatie via lentivirale vectoren ...................................................................... 11 3.1. Van lentivirus tot lentivirale vector ........................................................................... 11 3.2. In vitro transductie van dendritische cellen............................................................... 13 3.4. In vivo transductie van dendritische cellen ............................................................... 13 3.4.1. Transcriptionele targeting .................................................................................. 15 3.4.2. Transductionele targeting van dendritische cellen ............................................. 15 Doelstellingen........................................................................................................................... 18 Resultaten ................................................................................................................................. 20 1. Optimalisatie van de lentivirale vector productie ........................................................... 20 1. 1. Vergelijk van de Ca3-(PO4)2- en FuGENE®-gebaseerde transfectie methode ......... 20 1.2.
Controle van de aangewende transferplasmiden .................................................. 22
1.2.1. Controle transferplasmide pASIET tsred FLuc .................................................. 23 1.2.2. Controle transferplasmide pSIN Thy1.1 ............................................................ 24 1.3. Productie van tVSV.G gepseudotypeerde lentivirale vectoren ................................. 25 2. Evaluatie van het transductiepatroon van breed tropisme en gerichte lentivirale vectoren in vitro ............................................................................................................................. 27 3. Evaluatie van de lentivirale vector biodistributie na directe administratie in C57BL/6 muizen ............................................................................................................................. 30 3.1. In vivo bioluminescentie beeldvorming met breed tropsime lentivirale vectoren .... 30 3.2. Opsporen van in situ lentiviraal getransduceerde cellen ........................................... 32 Discussie................................................................................................................................... 36 ii
Conclusie .................................................................................................................................. 41 Materialen en methoden ........................................................................................................... 42 1. Lentivirale vector productie ............................................................................................ 42 2. Evaluatie van het transductiepatroon van breed tropisme en gerichte lentivirale vectoren in vitro ............................................................................................................................. 43 3. Evaluatie van de lentivirale vector biodistributie na directe administratie in C57BL/6 muizen ............................................................................................................................. 44 4. Flow cytometrie .............................................................................................................. 45 Referentielijst ........................................................................................................................... 46 Bijlagen .................................................................................................................................... 53 Cell lines and mice ............................................................................................................... 53 Materials ............................................................................................................................... 53 I. Thawing of human embryonal kidney cells (293T) ...................................................... 55 II. Maintaining human embryonal kidney cells (293T) ................................................... 55 III. Transfection with de Ca3-(PO4)2-DNA transfection method ..................................... 55 IV. Transfection with the FuGENE®-based lipofection method ...................................... 56 V. Slow speed concentration of lentiviral vectors............................................................ 57 VI. Characterization of lentiviral vectors ......................................................................... 58 VII. Immunization of mice ............................................................................................... 60 VIII. Isolation of spleen and preparation of the single cell suspensions .......................... 61 IX. In vivo bioluminescence imaging ............................................................................... 61 X. Isolation of lymph nodes and preparation of single cell suspensions ......................... 61 XI. Sorting of CD11c positive cells from the lymph node............................................... 62 XII. Flow cytometry ......................................................................................................... 62
iii
Lijst met afkortingen ABTS BD BDCA2 BSA CA CCR CD CLR CMV cPPT CTL CTLA-4 CTS DAMP DC DC-SIGN DC-STAMP DMEM DNA ds dsred ts Fluc dUTP EDTA EFU eGFP ELISA env FACS FIV Flt3-L gag GLP GM-CSF GMP HIV HLA HMGB1 HSP HSR IFN Ig IL imDC IMDM IN
2,2'-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid Beckton Dickinson blood dendritic cell antigen 2 bovine serum albumin capside eiwitten chemokine receptor cluster of differentiation C-type lectine receptor cytomegalovirus centrale polypurine tract cytotoxische T lymfocyt cytotoxische T lymfocyt antigen 4 centrale terminatie sequentie damage geassocieerde moleculaire patronen dendritische cel dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin dendritic cell-specific transmembrane protein Dulbecco’s Modified Eagle Medium deoxyribonucleic acid dubbelstrengig red shifted thermostabiel Firefly Luciferase deoxyuridine trifosfaat ethyleendiaminetetra-acetic acid expression focus units enhanced green fluorescent protein enzyme-linked immunosorbent assay envelop fluorescence activated cell-sorting feline immunodeficiency virus FMS-like tyrosine kinase 3 ligand group specific antigen gemeenschappelijke lymfoïde precursor granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gemeenschappelijke myeloïde precursor humaan immunodeficiëntie virus human leukocyte antigen high-mobility group box 1 proteins heat shock protein heparaan sulfaatreceptor interferon immuunglobuline interleukine immature dendritische cel Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium integrase iv
IU iv LC LTR LV MA MACS matDC mbSCF MHC MLV-A MMP MOI mRNA NADP Nb NC NF-κB NK NO NLR OVA PBS PD-L1 PFU PGE2 PMN PR/pro PS pol RLU RNA RNS RNI ROS ROI rpm RT sc scFv SFFV SIN SIV ss STAT3 SU
infectious units intraveneus Langerhans’ cel long terminal repeat lentivirale vector matrix eiwitten magnetische cel sortering mature dendritische cel membraangebonden stamcel factor major histocompatibility complex amfotroof murine leukemia virus matrix metalloprotease multiplicity of infection messenger ribonucleic acid nicotinamide adenine dinucleotide phosphate nanobody nucleocapside eiwitten nucleaire factor-kappaB natural killer stikstof oxide Nod-like receptor ovalbumine phosphate buffered saline programmed death ligand 1 plaque forming units prostaglandine E2 polymorfonucleaire cel protease protamine sulfaat polymerase relative light units ribonucleic acid reactieve stikstof species reactieve stikstof intermediairen reactieve zuurstof species reactieve zuurstof intermediairen revolutions per minute reverse transcriptase subcutaan single chain variabel fragment spleen focus forming virus zelfinactiverende simian immunodeficiency virus enkelstrengig signal transducer and activator of transcription 3 oppervlakte viraal glycoproteïne v
TAA TAM TGF-β Th TIMP-1 TLR TM TNF-α Treg TRP-2 TU tVSV.G VEGF VSV.G
tumor geassocieerd antigen tumor geassocieerde macrofaag transforming growth factor-β T helper tissue inhibitor of metalloproteinases Toll-like receptor transmembranair viraal glycoproteïne tumor necrosis factor-α regulatoire T cel tyrosinase related protein-2 transducing units getrunceerd vesicular stomatitis virus glycoproteïne vascular endothelial growth factor vesicular stomatitis virus glycoproteïne
vi
Nederlandstalige samenvatting Antikanker immuuntherapie met lentivirale vectoren (LVs), die coderen voor tumor geassocieerde antigenen is succesvol gebleken in verscheidene muismodellen. De huidige LVs hebben echter een breed infectiepatroon waardoor ze naast dendritische cellen (DCs) ook andere celtypes transduceren. Dit kan interfereren met de gewenste antitumor immuunrespons en houdt een verhoogd risico op insertionele mutagenese in. Daarom wensen we LVs te ontwikkelen die specifiek DCs infecteren. LVs gepseudotypeerd met een fusogeen maar bindingsdefectief envelop proteïne (tVSV.G) in combinatie met het ‘Nanobody’ (Nb) DC2.1 dat DCs en macrofagen bindt, werden vergeleken met breed tropisme en controle vectoren (bevatten het ß-lactamse specifiek Nb BCII10). We toonden aan dat de productie van Nbbevattende LVs minder efficiënt is dan de productie van breed tropisme LVs. Met flow cytometrie hebben we aangetoond dat deze laatste T en B cellen, alsook DCs en macrofagen transduceerden, terwijl DC2.1-gerichte LVs enkel DCs en macrofagen transduceerden in vitro. BCII10-gerichte vectoren infecteerden geen van deze populaties. Verder werd de biodistributie van LVs nagegaan met in vivo bioluminiscentie beeldvorming of flow cytometrie. De hieruitvolgende data toonden eenzelfde transductiepatroon van de geëvalueerde LVs in vivo als voordien werd geobserveerd in vitro. Deze data vormen een eerste aanwijzing dat Nbs kunnen aangewend worden om de transductie van LVs te richten naar specifieke celtypes, hier DCs en macrofagen. Dergelijke LVs zijn een interessant middel voor tal van immunologische studies en, belangrijker, zijn een stap voorwaarts in de ontwikkeling van een veilig LV-gebaseerd antikanker vaccin.
English summary Anti-cancer immunetherapy using tumor antigen encoding lentiviral vectors (LVs) has proven to be succesful in several mouse cancer models. However, the currently applied LVs have a broad tropism resulting in transduction of not only dendritic cells (DCs), but also other cell types. The latter can interfere with the anti-tumor immune response. Moreover, this enhances the risk of insertional mutagenesis. Therefore, we aspire to develop LVs that specifically infect DCs. To that end, LVs pseudotyped with a fusogenic, but binding defective envelope protein (tVSV.G) together with ‘Nanobody’ (Nb) DC2.1 that binds DCs and macrophages, were compared to broad tropism and control LVs (ß-lactamse specific Nb BCII10). We demonstrated that the production of Nb-displaying LVs was less efficient than the production of broad tropism LVs. Nonetheless we showed in flow cytometry that the latter were able to transduce T and B cells, as well as DCs and macrophages, whereas DC2.1-targeted LVs only transduced DCs and macrophages in vitro. BCII10-displaying LVs weren’t able to transduce any of these cells. Furthermore, we evaluated the biodistribution of these LVs using in vivo bioluminiscence imaging or flow cytometry. In vivo we observed a similar transductionprofile of the LVs as in vitro. Here we show for the first time that Nbs can be applied to target LVs to specific cell types, in this case DCs and macrophages. Such LVs are an interesting tool in immunology and more importantly are a step forward in the development of a safe LV-based anti-cancer vaccine.
vii
Inleiding
Inleiding 1. Antitumor immuuntherapie 1.1. De relatie tussen oncologie en immunologie Gedurende lange tijd werd oncologie op een reductionistische manier benaderd. Alleen gemuteerde cellen werden als de actieve componenten beschouwd bij de progressie van een tumor. In een multicellulair organisme communiceren cellen echter voortdurend met hun micro-omgeving om vervolgens via regulatie van genexpressie te differentiëren en homeostase te bewaren (Buess et al., 2007). De interacties die deze communicatie mogelijk maken, kunnen enerzijds tussen de cel en extracellulaire matrix plaatsgrijpen waarbij voornamelijk structurele componenten (basaal membraan, collageen, en andere) en groeifactoren belangrijk zijn. Anderzijds kan ook direct cel-cel contact plaatsvinden met cellen uit de omgeving zoals endotheliale cellen, immuuncellen en fibroblasten. Ook kankercellen interageren met hun micro-omgeving. Een tumor wordt daarom niet langer beschouwd als een heterogene verzameling van genetisch instabiele cellen, maar als een orgaan waar voortdurend interacties plaatsgrijpen. Dit wordt het heterotypisch kankermodel genoemd, waarbij kankercellen in staat zijn om hun micro-omgeving te manipuleren en naburige cellen te gebruiken als ‘collaborateurs’ (Axelrod et al., 2006) (Fig. 1). Vanuit dit heterotypisch model kan kanker gezien worden als een immuunziekte. Onder normale omstandigheden herkent en elimineert het afweersysteem getransformeerde cellen: een fenomeen dat immuunbewaking wordt genoemd (Burnet, 1957; Klein & Klein, 2005). Verscheidene interacties tussen tumorcellen en naburige immuuncellen werken deze eliminatie echter vaak tegen. Fig. 1 Tumoren als complexe weefsels (Hanahan & Weinberg, 2000). Een tumor werd vroeger beschouwd als een delende verzameling van genetisch instabiele cellen (reductionistische kijk, links). Vandaag wordt een tumor echter als een orgaan benaderd waarin kankercellen voortdurend interageren met hun micro-omgeving die bestaat uit onder andere immuuncellen, fibroblasten en endotheliale cellen (heterotypisch kankermodel, rechts).
Dit leidt enerzijds tot een immuunselectie van zwak immunogene tumorcellen en anderzijds tot een tumor geassocieerde immuunsubversie (Zitvogel et al., 2006). Naast zijn tumoreliminerende rol, kan het immuunsysteem echter ook de initiatie en progressie van kanker in de hand werken waarbij tumorcellen bepaalde immunologische componenten aanwenden voor hun ontwikkeling.
1.1.1. Immuunbewaking Dat het immuunsysteem in staat is om lichaamseigen van lichaamsvreemd te onderscheiden en alleen de lichaamsvreemde elementen te elimineren, werd voor het eerst gepostuleerd in 1908 door Paul Ehrlich in zijn immuunbewaking hypothese (Bremers et al., 2000).
1
Inleiding In de jaren ‘50 werd deze hypothese uitgebreid voor cellulaire immuniteit t.o.v. tumorcellen door Macfarlane Burnet (Burnet, 1957) en Thomas L. (Klein & Klein, 2005). Zij stelden in hun tumorbewaking hypothese dat ook tumorcellen door ons lichaam als vreemd kunnen worden herkend en net als geïnfecteerde cellen selectief verwijderd kunnen worden. Deze hypothese werd gesteund door observaties zoals een verhoogde incidentie aan niet-virale tumoren in immuundeficiënte patiënten alsook de sterke infiltratie van immuuncellen in tumorweefsel (Seliger, 2008). Een andere aanwijzing is dat de staat van het afweersysteem een impact heeft op de antitumor immuunrespons (Rubin, 2008). Deze wordt geïnduceerd na herkenning van getransformeerde lichaamseigen cellen door ‘natural killer’ (NK) cellen en/of T cellen. NK cellen maken deel uit van het aangeboren immuunsysteem en worden geactiveerd door een verminderde MHC (major histocompatibility complex) klasse I expressie, een veel voorkomend fenomeen bij tumorcellen. T cellen daarentegen behoren tot het adaptief immuunsysteem en dienen geactiveerd te worden door antigen presenterende cellen zoals dendritische cellen (DCs), macrofagen en/of B lymfocyten. Deze zijn in staat om antigenen op te nemen, te verwerken en te presenteren via MHC klasse I of II moleculen aan de T cel receptor van respectievelijk CD8+ of CD4+ T cellen. Tumorcellen bevatten tumor geassocieerde antigenen (TAAs) die kunnen functioneren als ‘verklikkers’ van hun aanwezigheid. Sinds de identificatie van het eerste humane melanoma TAA en de herkenning van dit TAA door cytotoxische T cellen (CTLs) in 1992 is het tumor immunologisch onderzoek in een stroomversnelling gekomen (Sato et al., 2009; van der Bruggen et al., 1991). Ondertussen werden reeds verschillende TAAs beschreven. Deze worden door verscheidene kankers van verschillende histologische oorsprong tot expressie gebracht en worden onderverdeeld in vier categorieën: (1) kanker/testis antigenen, (2) overgeëxpresseerde weefselspecifieke antigenen, (3) producten van gemuteerde en gereorganiseerde genen, alsook gemodificeerde glycolipiden en -proteïnen en tenslotte (4) virale proteïnen (Abbas, 2009; Van den Eynde & van der Bruggen, 1997).
1.1.2. Modulatie van het immuunsysteem door de tumor Ondanks het bestaan van TAAs en tumorspecifieke T cellen in kankerpatiënten blijkt hun afweersysteem niet in staat om alle tumorcellen te elimineren (Vuk-Pavlovic, 2008). Het uitblijven van een protectieve antitumor immuunrespons is onder andere te wijten aan het feit dat TAAs meestal endogene componenten zijn die als ‘eigen’ herkend worden waardoor de meeste TAA-specifieke T cellen vooraf centraal in de thymus of perifeer door deletie of activatie-geïnduceerde celdood geëlimineerd werden (Walker, 2002). Daarnaast worden de TAA-afgeleide epitopen meestal gepresenteerd in een tolerogene omgeving. Om een protectieve T cel respons op te wekken moet het MHC/peptide complex (signaal 1) immers gepresenteerd worden in de aanwezigheid van costimulatoire moleculen zoals CD40, CD80, CD83 en CD86 (signaal 2) in een inflammatoire omgeving (signaal 3) (Breckpot & Escors, 2009). Aangezien signalen 2 en 3 meestal niet aanwezig zijn in de tumorale micro-omgeving zal er ook geen geschikte immuunrespons opgewekt worden. Tot slot blijkt een tumor zelf een heel aantal mechanismen in te schakelen om deze tolerogene status te creëren. Voorbeelden hiervan zijn: (1) secretie van immuunsuppressieve cytokines zoals ‘transforming growth factor-β’ (TGF-β) en interleukine-10 (IL-10), (2) expressie van immuunmodulatoire enzymen (bijvoorbeeld indoleamine-2,3-deoxygenase), (3) gebrek aan costimulatoire moleculen, in combinatie met expressie van co-inhibitorische moleculen (bijvoorbeeld ‘programmed death
2
Inleiding ligand 1’ [PD-L1]), (4) expressie van apoptose inducerende signalen (bijvoorbeeld PD-L1, Fas ligand), (5) expressie van niet-klassieke ‘human leukocyte antigens’ (HLA) en (6) gebrek aan of verminderde expressie van MHC klasse I antigen verwerkende componenten (Seliger, 2008). Naast de inhibitorische werking van deze mechanismen op effector T cellen, zijn tumorcellen ook in staat om de inductie van verschillende immuunregulatoire cellen te promoten. Een voorbeeld hiervan is de productie van IL-10 door de tumor waardoor immature DCs (imDCs) zich in de tumoromgeving ontwikkelen tot cellen die anergie veroorzaken van TAA-specifieke T cellen (Steinbrink et al., 1999). Andere belangrijke immuunregulatoire celtypes zijn geïnduceerde CD4+CD25+ regulatoire T cellen (Tregs), type 1 regulatoire cellen, invariante NK T cellen, tumor geassocieerde macrofagen (TAMs) en immature myeloïde cellen (Jonuleit et al., 2001; Lizée et al., 2006; Solinas et al., 2009). Naast de capaciteit om een tolerogene status te creëren in de tumoromgeving, blijken kankercellen ook in staat om de pleiotrope eigenschappen van immuuncellen te moduleren tot de vorming van een ideale inflammatoire omgeving waarin ze ongeremd kunnen prolifereren en invaderen (Khatami, 2009). Verschillende proinflammatoire mechanismen die onder andere membraandegradatie, invasie en migratie naar bloed- en lymfevaten induceren en aldus metastasen in de hand werken, spelen hierbij een rol. Een illustratie hiervan zijn de alternatief gepolariseerde TAMs die door promotie van tumorcel proliferatie, angiogenese, verhoogde matrix ‘turnover’ en repressie van het immuunsysteem een grote impact hebben op tumorprogressie (Solinas et al., 2009).
Fig. 2 Rol van oxidanten in inflammatie en tumor ontwikkeling (Khatami, 2009). De activatie van hematopoëtische cellen (polymorfonucleaire of neutrofielen) (PMNs), differentiatie en infiltratie van mononucleaire cellen zoals mastcellen, NK cellen, DCs, macrofagen, eosinofielen of basofielen veroorzaakt de vorming van oxidanten zoals ROS-ROI en RNS-RNI, stikstof oxide (NO) en een verhoogde nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) /NADPH ratio. Dit gebeurt via activatie van enzymes zoals NADPH oxidase of myeloperoxidase die 02-radicalen, H202 en zoutzuur produceren en zo cellyse vergemakkelijken, MMP-2,7,8,9 activeren en ’tissue inhibitor of metalloproteinases-1’ (TIMP-1) inhiberen wat resulteert in vasculaire hyperpermeabiliteit, chemoattractie en infiltratie van PMNs. Oxidanten gegenereerd gedurende apoptose worden tegengewerkt door wondhelingsfactoren (antioxidanten) zoals NF-κB wat op zijn beurt resulteert in de generatie van IL-8, IL-10 en prostaglandine E2 (PGE2) om het apoptotisch proces te beëindigen en weefselherstel te initiëren. Een ongepaste productie van (anti)oxidanten kan leiden tot immuunsuppressie, DNA schade, tumorgroei, angiogenese en metastase.
3
Inleiding Daarnaast blijkt chronische ontsteking een belangrijke prikkel te zijn bij het ontstaan van kanker. Reeds in de 19de eeuw postuleerde Virchow dat chronische inflammatie kan leiden tot de ontwikkeling van kanker (Aggarwal BB, 2009). Dit werd door epidemiologisch onderzoek bevestigd. Er wordt geschat dat 25% van alle kankers het gevolg zijn van een chronische ’irritatie’ (Schetter et al., 2009). Voorbeelden zijn hepatocellulaire carcinomas, geassocieerd met chronische hepatitis B en C virale infecties of maagkanker ten gevolge van een chronische Helicobacter pylori infectie (Abbas, 2009). Dit is te wijten aan het oncogene potentieel van een chronische infectie waardoor genetische en epigenetische instabiliteit, verhoogde angiogenese en celproliferatie gestimuleerd worden. Moleculaire mediatoren van dit gecombineerd inflammatoir en tumorigeen fenomeen zijn onder andere ROS en NOS (reactieve zuurstof en stikstof species), transcriptiefactoren als nucleaire factor-kappaB (NFκB) en ‘signal transducer and activator of transcription 3’ (STAT3) en hun genproducten IL1, IL-6, ‘tumor necrosis factor-α’ (TNF-α), chemokines, cyclo-oxygenase-2, matrix metalloproteases (MMPs), ‘vascular endothelial growth factor’ (VEGF) (Aggarwal BB, 2009) (Fig. 2).
1.2. Het belang van immuuntherapie in de 21ste eeuw Volgens de Wereld Gezondheid Organisatie vormt kanker wereldwijd de voornaamste doodsoorzaak met zo’n 7,9 miljoen doden in 2007 (WHO, 2009). Het Belgische Kanker Register telde in 2006 zo’n 57.702 nieuwe gevallen van kanker, waarvan 31.640 mannen en 26.062 vrouwen (Register, 2009). In België blijkt één man op drie en één vrouw op vier geconfronteerd te worden met de ziekte voor z’n 75ste. Bij mannen komt prostaatkanker het meeste voor, gevolgd door long- en colorectale kanker. Bij vrouwen is borstkanker de meest voorkomende kanker, gevolgd door colorectale en longkanker. Volgens de ‘Cancer Statistics’ van 2009 opgemaakt door de ‘American Cancer society’ kende het aantal nieuwe kanker gevallen en het sterftecijfer vanaf 1990 to 2005 een lichte daling. Over deze periode bleven ongeveer 650.000 mensenlevens gespaard (Jemal, 2009). Ondanks deze daling, eist kanker nog steeds een hoog dodental, dat zelfs de mortaliteit van hart- en vaatziektes overstijgt (Fig. 3). Deze cijfers illustreren dat de vooruitgang op vlak van kankerwetenschap, ‘screening’, diagnose en therapie die gemaakt werd in de afgelopen 20 jaar, slechts een geringe daling van de mortaliteit met zich mee heeft gebracht. Vaak toegepaste therapieën bij kanker zijn chirurgische ingreep, chemo- en radiotherapie. Deze behandelingen tasten naast kankercellen ook gezonde cellen aan, waardoor de patiënt veel bijwerkingen ondervindt. Daarnaast worden kankercellen vaak resistent aan een bepaalde therapie ten gevolge van hun genomische instabiliteit. Daarom wordt er gezocht naar alternatieve of bijkomende behandelingswijzen, die selectief kankercellen treffen. In dit opzicht lijkt actieve of passieve antitumor immuuntherapie interessant (Ely, 2009). Bij passieve immuuntherapie wordt de patiënt behandeld met componenten zoals tumorspecifieke effector T cellen of antilichamen. Zo werd beschreven dat een groot aantal metastasen vernietigd konden worden bij kankerpatiënten die eerst een lymfodepleterende behandeling ondergingen, gevolgd door een adoptieve tumorreactieve T cel transfer (Gattinoni et al., 2006). Het voordeel van passieve immuuntherapie is het ontstaan van een snelle immuunrespons; nadelig is dat deze niet leidt tot geheugen T cellen en blijvende bescherming.
4
Inleiding
Fig. 3 Mortaliteitscijfers voor kanker en hartziektes bij individuen jonger dan 85 jaar van 1975 tot 2005 (Jemal, 2009).
Het gebruik van actieve vaccinatie om ziektes te bestrijden kende in het verleden reeds enkele succesverhalen. Een voorbeeld is de uitroeiing van het variola virus op 9 december 1979, 200 jaar nadat Edward Jenner voor het eerst een 13-jarige jongen inoculeerde met het vaccinia virus (Andre, 2003). Immunisatie als kankertherapie werd voor het eerst aangewend door William Coley. In 1893 injecteerde hij kankerpatiënten met een bacterieel extract dat leidde tot de regressie van het aanwezige fibreuze sarcomaweefsel (Bremers et al., 2000; Emens & Jaffee, 2003). Op dit principe is de huidige actieve kankerimmuuntherapie gebaseerd. Het immuunsysteem van de patiënt wordt aangewend om door middel van een TAA-gebaseerd vaccin een antitumor immuunrespons op te wekken. Ondertussen werden reeds verschillende klinische trials uitgevoerd om het principe van kankervaccinatie aan te tonen. Ondanks de eerder lage respons, resulteerde vaccinatie bij enkele gevallen in complete remissie (Emens & Jaffee, 2003; Riker et al., 2007). De belangrijkste voordelen van een kankervaccin zijn de lage toxiciteit en tumorspecificiteit. Daarnaast wordt door een efficiënt vaccin reeds na enkele injecties een blijvende bescherming gegarandeerd door de aanmaak van geheugen T cellen. Deze TAA-gebaseerde vaccins leiden tot een verhoogd aantal tumorspecifieke T cellen. Desondanks is het voorkomen van objectieve klinische responsen eerder beperkt (10-40%) (Lurquin et al., 2005). De belangrijkste reden voor het frequente gebrek aan een klinische respons is de immuuntolerantie die door de tumor in de hand wordt gewerkt. Tumorspecifieke T cellen worden vaak onderdrukt door de aanwezigheid van suppressieve immuuncellen, alsook door de verscheidene immuuncel onderdrukkende factoren die door de tumorcellen zelf tot expressie worden gebracht. Een mogelijke oplossing is een gecombineerde therapie waarbij naast immunisatie ook gepoogd wordt om immuunsuppressieve mechanismen te onderdrukken.
5
Inleiding
2. Dendritische cel gebaseerde immuuntherapie 2.1. De polyvalente dendritische cel De DC werd voor het eerst beschreven in 1973 door Ralph M. Steinman en Zanvil A. Cohn als een nieuw celtype in de perifere lymfoïde organen van muizen (Steinman & Cohn, 1973). De DC heeft haar naam te danken aan haar prominent stervormig of ‘boomachtig’ uiterlijk (‘dendron’ is Grieks voor boom) (Fig. 4).
Fig. 4 Fase-contrast micrografie van een DC geïsoleerd uit de muriene milt (X4500) (Steinman, 2007). De nucleus is groot en onregelmatig van vorm. Het cytoplasma ligt georganiseerd in ‘uitsteeksels’ of dendrieten van variërende grootte en vorm, vele daarvan bevatten fase-dense mitochondriën.
Later bleek dat deze morfologie gecorreleerd was aan de functionaliteit van de DC als immunogene cel (Steinman & Witmer, 1978). DCs gebruiken namelijk hun beweeglijke dendrieten om hun omgeving af te tasten, op zoek naar antigenen. Vandaag worden DCs beschouwd als professionele antigen presenterende cellen met een uitzonderlijke capaciteit om naïeve T cellen te stimuleren en een primaire immuunrespons te initiëren (Liu, 2001). Ondanks het belang van deze capaciteit, is het onmogelijk om aan DCs één functie toe te wijzen aangezien deze cellen een heterogene groep vormen met verschillende subtypes, anatomische locaties en functies (Palucka et al., 2008). Eén eigenschap hebben alle DC subtypes gemeen: hun precursor cel. ImDCs worden continu geproduceerd in het beenmerg vanuit de CD34+ hematopoëtische stamcel. Deze precursor cel kan differentiëren in de ‘gemeenschappelijke lymfoïde precursor’ (GLP) of de ‘gemeenschappelijke myeloïde precursor’ (GMP) (Fig. 5). De GMPs kunnen vervolgens differentiëren in een CD11c+CD1a+ en een CD11c+CD1a- populatie die op hun beurt ontwikkelen tot imDCs. Naast deze immature populatie kunnen GMPs ook aanleiding geven tot het ontstaan van een CD11c+CD123lo pre-DC1 terwijl CLPs steeds differentiëren tot CD11c-CD123hi pre-DC2 (Liu, 2001; Tuyaerts et al., 2007). Wanneer de imDCs migreren vanuit het bloed naar de epidermis worden ze Langerhans’ cellen (LCs) genoemd. Deze worden gekenmerkt door de expressie van onder andere CD1, Langerin en E-cadherine en wekken preferentieel een cellulaire immuunrespons op na maturatie (Ueno et al., 2007) (Fig. 6). Ze activeren voornamelijk CD8+ en CD4+ T cellen om zo een T helper (Th)1 of Th2 respons op te wekken. Th1 cellen secreteren de cytokines interferon-γ (IFN-γ), TNF- en - en zijn voornamelijk van belang bij intracellulaire infecties en eliminatie van kankercellen. Th2 cellen secreteren onder andere IL-4, -5, -10, -13 en -15 die een humorale immuunrespons induceren en het lichaam zo behoeden voor parasitaire infecties (Kaiko et al., 2008; van Duin et al., 2006). Wanneer de imDCs vanuit het bloed echter migreren naar de dermis of een andere perifeer weefsel, spreekt men van interstitiële imDCs. Deze worden gekarakteriseerd door de secretie van IL-10 naast de expressie van CD13, CD14, CD11b en ‘DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin’ (DC-SIGN). Verder induceren ze een humorale immuunrespons en stimuleren ze naast een Th2 respons de differentiatie van B cellen tot IgMproducerende plasmacellen. De pre-DC1 kan verder ontwikkelen tot een myeloïde imDC na
6
Inleiding onder andere fagocytose, stimulatie met ‘granulocyte-macrophage colony-stimulating factor’ (GM-CSF) en/of IL-4. Deze myeloïde DC is in staat om grote hoeveelheden IL-12 te produceren en aldus een Th1 en CTL respons op te wekken. De pre-DC2 ontplooit zich daarentegen eerder na IL-3 of virale stimulans tot een immature plasmacytoïde DC die gekenmerkt wordt door de oppervlaktemolecule ‘blood DC antigen 2’ (BDCA2) en zijn kwaliteit om grote hoeveelheden type I interferon aan te maken. Daarnaast is deze cel in staat om zowel een Th1 als Th2 respons uit te lokken en daarnaast IL-10 producerende CD8+ T suppressor cellen te activeren.
Fig. 5 Schematische voorstelling van de DC ontwikkeling, plasticiteit, maturatie en functie (Liu, 2001). Zoals aangegeven in de tekst ontstaan DCs uit een gemeenschappelijke precursor cel (CD34+ hematopoëtische stamcel), waarna ze via een GMP of GLP differentiëren tot respectievelijk immature LCs, interstitiële DCs en myeloïde DCs of plasmacytoïde DCs. Antigenherkenning kan leiden tot DC maturatie en een daaropvolgende adaptieve immuunrespons.
Zoals fig. 6 illustreert, worden er aldus vier ‘grote’ DC subtypes gedefinieerd die zich zowel in het beenmerg, de perifere weefsels, het bloed als de lymfoïde organen kunnen bevinden. LCs en interstitiële imDCs bevinden zich in rust in de periferie. Zij migreren na opname van een lichaamsvreemd of -eigen antigen via het lymfestelsel naar de nabijgelegen lymfeknopen om daar respectievelijk een T cel respons te initiëren of te inhiberen. De myeloïde en plasmacytoïde imDCs bevinden zich daarentegen in het bloed, de (ontstoken) perifere weefsels en de lymfoïde organen. De migratie en locatie van DCs wordt gecontroleerd door de expressie van chemokine receptoren (CCR). Zo zal CCR7 zorgen voor de migratie van DCs naar de T cel rijke zone van lymfoïde organen terwijl CCR5 zorgt voor verplaatsing van DCs richting ontstoken weefsel. Opmerkelijk is de functionele plasticiteit waarover de DC beschikt. Lang werd gedacht dat DCs de sensors van het lichaam waren, die ‘vreemde’ antigenen opspoorden en de gepaste adaptieve immuunrespons opwekten. Later werd duidelijk dat de DC naast deze immunogene rol ook een belangrijke functie vervult bij het opwekken en behouden van zowel centrale als perifere tolerantie tegenover lichaamseigen antigenen. Deze functie kan grotendeels worden toegeschreven aan de imDCs die op verschillende manieren te werk gaan.
7
Inleiding Fig. 6 Humane DC subsets in vivo (Ueno et al., 2007). In de huid kunnen zowel LCs als interstitiële DCs teruggevonden worden. In het bloed vindt men zowel myeloïde als plasmacytoïde DCs terug. Elk subtype brengt een verschillende set van moleculen tot expressie, bijvoorbeeld CLRs en TLRs. Hierdoor zijn DCs in staat om op verschillende inflammatoire signalen te reageren en afhankelijk van het signaal de gepaste immuunrespons op te wekken.
Ze elimineren effector T cellen in lymfoïde organen; veroorzaken anergie bij bestaande T cellen; induceren nieuwe regulatoire en suppressieve T cellen en expanderen in de thymus geproduceerde Tregs (Andre et al., 2009; Hawiger et al., 2001). Tolerantie is noodzakelijk om stoornissen als auto-immuunziekten of chronische inflammatie te vermijden maar wordt tevens misbruikt door kankercellen. Wanneer imDCs echter een lichaamsvreemd antigen opnemen, kunnen deze door de aanwezige activatie stimuli matureren tot immunogene DCs. Maturatie is het proces dat imDCs ondergaan om te evolueren van antigen opnemende naar antigen presenterende cellen. ImDCs zijn gespecialiseerd in het opnemen van pathogenen, apoptotische cellen en antigenen onder de vorm van een opgeloste stof, partikel of ligand via respectievelijk macropinocytose, fagocytose of receptor gemedieerde endocytose (Thery & Amigorena, 2001). Tijdens het maturatieproces verliest de imDC haar antigen opname capaciteit terwijl de expressie en stabiliteit van MHC klasse I en II moleculen toeneemt. Daarnaast wordt de mature DC (matDC) gekenmerkt door een verhoogde expressie van adhesie en costimulatoire moleculen zoals CD40, CD54, CD80, CD83 en CD86, alsook een verhoogde secretie van proinflammatoire cytokines zoals IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 en IL-23. Finaal verlaagt de matDC zijn expressie van CCR5 terwijl die van CCR7 verhoogt, wat migratie naar naburige lymfeknopen teweeg brengt (Palucka et al., 2008; Tuyaerts et al., 2007; Ueno et al., 2007; van Duin et al., 2006). Het maturatieproces kan geïnitieerd worden door verschillende stimuli zoals: (1) micro-organismen die gedetecteerd worden via ‘Toll-like receptoren’ (TLRs),’ Nod-like receptoren' (NLRs) en C-type lectine receptoren (CLRs), zoals DEC-205, BDCA2, Langerin en DC-SIGN; (2) immuuncellen zoals T cellen, NK cellen en NK T cellen; (3) cellulaire producten zoals CD40 ligand en proinflammatoire cytokines als IL-1β, TNF-α, IL-6 en PGE2; (4) producten van apoptotische cellen of ‘damage geassocieerde moleculaire patronen’ (DAMPs) zoals ‘heat shock proteins’ (HSPs), ‘highmobility group box 1 proteins’ (HMGB1), β-defensine en urinezuur. Omdat imDCs slechts lage hoeveelheden MHC en costimulatoire moleculen tot expressie brengen, werd gedacht dat deze tolerantie induceren terwijl matDCs immuniteit opwekken. Deze hypothese werd gesterkt nadat werd aangetoond dat immunisatie met imDCs leidde tot de inductie van tolerantie (Dhodapkar & Steinman, 2002). Een andere aanwijzing was dat ongeveer 50% van de DCs in de lymfoïde organen immatuur zijn en daar lichaamseigen antigenen presenteren om zo een tolerogeen antigen geheugen te voorzien (Wilson et al., 2004). Ondertussen werd echter aangetoond dat ook matDCs kunnen bijdragen aan T cel tolerantie door de inductie van Tregs (Banerjee et al., 2006). De beslissing om al dan niet tolerantie te induceren, is gelinkt aan de aard en sterkte van de activatie signalen. Stimuli van bacteriën of virussen zoals lipopolysacchariden en dubbelstrengig (ds)RNA of proinflammatoire cytokines zoals TNF-α en IFN-α die de productie van cytokines als IL-12 en IFN-α door DCs promoten, werken een
8
Inleiding Th1 respons in de hand (Vieira et al., 2000). Anti-inflammatoire moleculen zoals IL-10 en PGE2 en/of de actie van inhibitorische moleculen zoals ‘cytotoxic T lymphocyte antigen 4’ (CTLA-4) en PD-1 kunnen dan weer resulteren in een Treg respons. Dat subtiele verschillen in activatie signaal een groot effect hebben op de uiteindelijk DC respons, bewezen Luft et al. die aantoonden dat myeloïde DCs migreren na zwakke en transiënte CD40 signalisatie terwijl een sterk en persisterend CD40 signaal een blokkerend effect heeft op DC migratie (Luft et al., 2004). Tot slot blijken DCs belangrijk te zijn bij de opbouw van een immuun geheugen door secretie van IL-15 dat de inductie van geheugen CD8+ T cellen begunstigt (Steinman, 2003). DCs zijn dus een heterogene verzameling van cellen, met verschillende anatomische locaties en functies. In de huid bevinden zich voornamelijk LCs en interstitiële DCs terwijl in het bloed en lymfoïde organen voornamelijk myeloïde en plasmacytoïde DCs te vinden zijn. DCs regelen de adaptieve immuunrespons en vervullen zowel een immunogene als tolerogene functie.
2.2. Dendritische cellen in actieve antitumor immuuntherapie Het adaptief immuunsysteem kan een antitumor immuunrespons opwekken door presentatie van TAAs aan T lymfocyten. Deze laatste moeten hiervoor geactiveerd worden door antigen presenterende cellen zoals DCs die opgenomen en verwerkte TAAs presenteren in een stimulerende context. De DCs zullen TAA-afgeleide epitopen presenteren via MHC klasse II en zo CD4+ helper T cellen activeren. Daarnaast zijn DCs ook in staat om opgenomen en verwerkte epitopen te presenteren via MHC klasse I en hierbij CD8+ CTLs te activeren, een proces dat kruispresentatie wordt genoemd. Dit is het belangrijkste mechanisme van TAApresentatie aangezien alleen op deze manier CD8+ effector cellen ontstaan die in staat zijn om een efficiënte antikanker immuunrespons op te wekken. Er zijn verschillende componenten die de DC kan opnemen om kruispresentatie van TAAs te bekomen: (1) dode tumorcellen; (2) opgeloste antigenen, eventueel gebonden aan chaperones; (3) antigenbevattende vesikels of exosomen; (4) kleine antigene proteïne fragmenten via ‘gap junctions’; (5) plasmamembraan fragmenten die van de tumorcellen werden ‘afgeknabbeld’ en tot slot (6) peptide-MHC klasse I complexen na direct contact van de DC met een dode tumorcel (Melief, 2008). Tumoren zijn echter in staat om T cel stimulatie door DCs te omzeilen door een negatieve invloed uit te oefenen op de DCs in de tumor micro-omgeving. Zo werd bijvoorbeeld beschreven dat STAT3 vaak constitutief geactiveerd is in diverse kankers. Deze transcriptiefactor controleert de secretie van factoren die de DC functies onderdrukken en de inductie van antitumor tolerantie bewerkstelligen (Wang et al., 2004). Aangezien de DC belangrijk is bij het opwekken van een (antitumor) immuunrespons, lijkt deze aantrekkelijk voor therapeutische manipulatie van het immuunsysteem. Bij klassieke vaccinatie worden immers ook DCs, meerbepaald LCs en interstitiële DCs ‘getarget’ door een antigen/adjuvans mix te injecteren in de huid. Daarom is het niet verwonderlijk dat ook voor actieve TAA-gebaseerde antitumor immuuntherapie deze professionele antigen presenterende cel in aanmerking komt. Wanneer men echter TAAs in de huid injecteert, bestaat de kans dat er onvoldoende opname is door DCs of dat de TAAs in een tolerogene context worden gepresenteerd. Een eerste methode om deze problemen te omzeilen, is het ex vivo genereren, laden met TAAs en activeren van autologe DCs die na kwaliteitscontrole als cellulair
9
Inleiding antikanker vaccin worden toegediend aan de patiënt. Hoewel uit de eerste fase I klinische studies besloten kan worden dat deze vaccinatie veilig is en een immuunrespons opwekt, bewijst het frequente gebrek aan een klinische respons dat verschillende parameters beter gecontroleerd moeten worden (Ueno et al., 2007). Een eerste parameter is de isolatie van de geschikte DC of DC precursor en voor deze laatste de daaropvolgende differentiatie tot DC (Tuyaerts et al., 2007). Een tweede parameter zijn de componenten waarmee de DC geladen wordt zoals: (1) TAA-afgeleide peptiden of proteïnen; (2) de volledige proteïne-inhoud van een tumorcel en (3) gengebaseerde DNA of mRNA constructen die coderen voor één of meerdere TAAs bijvoorbeeld afgeleverd onder de vorm van virale vectoren. Een derde en cruciale parameter is de maturatiestatus van de DC aangezien deze mee bepaalt of er tolerantie dan wel immuniteit wordt geïnduceerd (Chen et al., 2001). Een belangrijke factor die de DC helpt om lichaamseigen van lichaamvreemde antigenen te onderscheiden en een kritische rol vervult in de opwekking van een adaptieve immuunrespons door onder andere antigenopname, remodellering van het cytoskelet en de efficiëntie van antigenpresentatie te beïnvloeden, zijn TLR signalen. Daarnaast helpt de TLR signalisatie ook de matDC te beschermen tegen Treg inhibitie (Breckpot & Escors, 2009). Dus om ex vivo gegenereerde matDCs te bekomen, kunnen best TLRs gestimuleerd worden. Zo beschreven Warger et al. dat gecombineerde activatie van beenmerg afgeleide DCs via meerdere TLR liganden, een snelle en langdurige DC activatie tot stand bracht en dat de geactiveerde CD4+ en CD8+ T cellen ongevoelig waren voor inhibitie door Tregs (Warger et al., 2006). Daarnaast stimuleert de TLR signalisatieroute voornamelijk een Th1 type respons en een verhoogde expressie van CCR7 wat de migratie van de DC naar regionale lymfeknopen promoot (van Duin et al., 2006). Het grote nadeel van deze ex vivo strategie is het patiëntspecifieke karakter, de arbeidsintensiviteit, de nood aan speciaal opgeleid personeel en hoge kostprijs. In vivo modificatie van DCs, waarbij wordt getracht het antigen alsook de activatie signalen in situ af te leveren, zou deze nadelen kunnen omzeilen. Mogelijke strategieën kunnen opgedeeld worden in niet-virale en virale strategieën. Deze laatste, meer bepaald het gebruik van lentivirale vectoren (LVs) vormt het onderwerp van deze thesis en wordt hieronder meer in detail besproken.
10
Inleiding
3. Immuunmodulatie via lentivirale vectoren 3.1. Van lentivirus tot lentivirale vector Lentivirussen behoren tot de Retroviridae en worden gekenmerkt door een diploïd, 7-12 kb enkelstrengig (ss) RNA genoom met positieve polariteit dat door ‘reverse’ transcriptie wordt omgezet tot een dsDNA kopij (Fig.7) (Coffin, 1997). De diploïdie van het lentivirale genoom laat genetische recombinatie toe en verklaart deels hun succes als verwekkers van het verworven immuundeficiëntiesyndroom bij mens (‘human immunodeficiency virus’ [HIV]) en dier (‘simian immunodeficiency virus’ [SIV], ‘feline immunodeficiency virus’ [FIV] en andere) (Breckpot et al., 2008). Het lentivirale virion is sferisch en heeft een diameter van 80120 nm. Zijn envelop bestaat uit een plasmamembraan afgeleide fosfolipide dubbellaag waarin de oppervlakte (SU) en transmembranaire (TM) virale glycoproteïnen ingebed liggen (Fig. 7). De interne niet-geglycosyleerde structurele proteïnen omvatten matrix (MA), capside (CA) en nucleocapside (NC) eiwitten. Tot slot bevinden zich in het virion steeds enkele exemplaren van de enzymen ‘reverse transcriptase’ (RT), integrase (IN) en protease (PR).
Fig. 7 Schematische doorsnede van een retroviraal partikel (Coffin, 1997). De virale envelop bestaat uit een lipide dubbellaag waarin zich virale proteïnen bevinden. Deze bestaan uit de TM en SU componenten, gelinkt via een disulfidebrug en worden gecodeerd door de env genen. Interne niet-geglycosyleerde structurele proteïnen, worden gecodeerd door de gag regio van het virale genoom en omvatten MA, CA en NC proteïnen. De producten van de pol-coderende regio zijn het RT en IN terwijl het PR gecodeerd wordt door het pro gen, gelegen tussen het gag en pol gen.
De replicatiecyclus van lentivirussen begint bij de binding van SU aan specifieke cellulaire receptoren op het oppervlak van de gastheercel (Flint S.J., 2009). Deze interactie resulteert in conformationele veranderingen van SU en TM waardoor het hydrofobe fusiepeptide van TM kan insereren in de celmembraan. Deze interactie bepaalt het tropisme van het lentivirus en initieert de fusie tussen het cel- en virale membraan (Schaffer et al., 2008). Vervolgens komt het virale nucleocapside-complex in het cytoplasma terecht en begint de ‘reverse transcriptie’ van het virale RNA (Fig. 8). Het product hiervan is een lineaire dsDNA molecule. Na vorming van een pre-integratie-complex wordt het virale DNA samen met het IN, de nucleus binnengeloodst. Integratieve recombinatie, gekatalyseerd door het IN, resulteert in random insertie van het virale DNA in het gastheergenoom. Transcriptie van het geïntegreerd viraal DNA of provirus door cellulair RNA polymerase II levert RNA moleculen op. Deze worden benut als mRNA moleculen of als nieuw viraal ssRNA. De belangrijkste genen van het lentivirus die worden overgeschreven tot mRNA zijn: (1) het env (envelop) gen dat codeert voor SU en TM; (2) het gag (group specific antigen) gen dat codeert voor de interne structurele proteïnen nl. de MA, CA en NC eiwitten; (3) het pol (polymerase) gen dat codeert voor de enzymen IN en RT dat zowel DNA polymerase als de hiermee geassocieerde RNaseH activiteit omvat en tot slot het pro (protease) gen dat codeert voor het PR. Daarnaast bevat het genoom de twee regulatoire genen Tat en Rev plus verschillende accessoire genen zoals Vpr, Vpu, Vif en Nef die onder andere de virale genexpressie en virulentie reguleren (Fig. 8).
11
Inleiding
U3 R U5
Fig. 8 Schematische voorstelling van het natieve HIV-1 genoom (Delenda, 2004). Alle genen van het provirus (gag, pol, pro, vif, vpr, vpu, ref, tat, env en nef) worden langs weerszijde geflankeerd door identieke ‘long terminal repeats’ (LTRs) die op hun beurt opgedeeld worden in drie fragmenten: een U3-, R- en U5fragment. Het is de U3 regio waarin zich de provirale transcriptionele controle elementen bevinden waaronder de eigenlijke promotor en verschillende ‘enhancer’ sequenties. Ψ staat symbool voor het inkapsel signaal. Aan het 3’ uiteinde van het pol gen bevinden zich twee sequenties nl. de centrale polypurine tract (cPPT, rode lijn) en de centrale terminatie sequentie (CTS, groene lijn). Beide sequenties zorgen ervoor dat het RT t.h.v. deze regio een partiële driestrengige DNA flap vormt, cruciaal bij de vorming van het pre-integratie-complex en de daaropvolgende migratie door de nucleaire porie van niet-delende cellen.
Het gebruik van retrovirussen, evolutief verwant aan lentivirussen, als vectoren voor gentransfer werd ongeveer 27 jaar geleden geïntroduceerd door Mann et al. De retrovirale vectoren werden afgeleid van het oncogene ‘Moloney leukaemia retrovirus’ (Mann et al., 1983). Als gevolg van de instabiliteit van retrovirale partikels, de lage titers en het gebrek aan transductie van niet-delende cellen, werd gezocht naar alternatieven. Dit leidde tot ontwikkeling van lentivirus gebaseerde vectoren (Breckpot et al., 2007a; Naldini et al., 1996). In het kader van antitumor immuuntherapie hebben LVs enkele interessante karakteristieken. Ten eerste zorgt de integratie van het provirus in het gastheergenoom voor een permanente genetische modificatie van de geïnfecteerde cellen die tegelijk bestand is tegen ‘gene silencing’. Dit leidt tot een langdurige en stabiele expressie van het transgen. Ten tweede zijn LVs in staat om delende en niet-delende cellen, zoals imDCs te infecteren (Dullaers & Thielemans, 2006). Ten derde hebben ze een relatief grote genetische capaciteit waardoor meerdere genen kunnen ingebracht worden. Ten vierde bevatten LVs signalen die het aangeboren immuunsysteem kunnen stimuleren. Zo activeren lentivirale ds- en ssRNA intermediairen de imDC via de 2-5A synthetase/RNaseL, de proteïne kinase R en verschillende TLR pathways (Breckpot et al., 2007b; Breckpot et al., 2010; Tan et al., 2005). Tot slot blijken ze, in tegenstelling tot adenovirale en andere virale vectoren, geen antivector immuunrespons op te wekken, wat hun herhaaldelijk gebruik als vaccin mogelijk maakt (Flint S.J., 2009). Aangezien het natieve lentivirus sterk pathogeen is voor mens en dier, is het noodzakelijk om een recombinante LV te ontwikkelen die veilig is voor therapeutische toepassing. Daarom is de productie van recombinante LVs gebaseerd op de scheiding van cis- en trans-werkende sequenties waarbij drie of meer plasmiden gebruikt worden om humane embryonale niercellen (293T) transiënt te transfecteren. Deze plasmiden zijn: (1) een transferplasmide, (2) een inpakplasmide met de trans geleverde gag en pol genen en (3) één of meerdere plasmiden coderend voor envelop proteïnen. Het transferplasmide is het enige plasmide dat van het virale genoom is afgeleid, waarbij alle viraal coderende regio’s werden vervangen door de expressiecassette (Dullaers & Thielemans, 2006). Tal van modificaties werden aangebracht om de veiligheid en de transgenexpressie te verbeteren. Zo wordt er gebruik gemaakt van minimale zelfinactiverende (SIN) transferplasmiden die naast de expressiecassette en lentivirale cis-werkende componenten, een 3’ LTR bevatten waarin een deel van de U3 regio werd gedeleteerd. Dit verlaagt het risico op het ontstaan van replicatiecompetente virussen en vermijdt problemen ten gevolge van promotor interferentie (Breckpot et al., 2008).
12
Inleiding Verder werd de nucleaire import verbeterd door de sequenties van de centrale polypurine tract (cPPT) en zijn centrale terminatie sequentie (CTS) in het plasmide te insereren. Naast het transferplasmide, is ook het envelop coderend plasmide variabel. Het is mogelijk om de HIV envelop te vervangen door de envelop van andere virussen. Dit wordt pseudotypering genoemd. Meestal wordt er gebruik gemaakt van het ‘vesiculair stomatitis virus’ glycoproteïne (VSV.G), wat de LV een breed tropisme en stabiliteit geeft (Marsac et al., 2002; Schaffer et al., 2008).
3.2. In vitro transductie van dendritische cellen Tot nu toe bestaan er tientallen publicaties die LV-transductie van humane en muriene DCs beschrijven (Breckpot et al., 2008). Daaruit blijkt dat de transductie van DCs afhankelijk is van parameters zoals (1) het transferplasmide (Breckpot et al., 2003), (2) het DC generatie protocol (Breckpot et al., 2004; Dyall et al., 2001; Firat et al., 2002; Metharom et al., 2005; Salmon et al., 2001; Schroers & Chen, 2004), (3) het aantal LVs per cel of de ‘multiplicity of infection’ (MOI) (Gruber et al., 2003) en (4) het tijdstip van evaluatie, daar ten gevolge van pseudotransductie de efficiëntie kort na transductie wordt overschat (Dullaers et al., 2004). Daarnaast behouden de LV-gemodificeerde DCs hun capaciteit om te matureren. Belangrijk is dat men heeft aangetoond dat LVs uiterst geschikt zijn om TAAs in imDCs te brengen, dat deze TAAs worden verwerkt en gepresenteerd in MHC klasse I en indien gekoppeld aan een MHC klasse II targeting signaal zoals dat van de ‘invariant chain’ ook kunnen gepresenteerd worden in MHC klasse II. Op deze manier werden reeds CD8+ en/of CD4+ T cel responsen opgewekt tegen TAAs zoals MAGE-3, Melan-A en tyrosinase in humane modellen en naast het model antigen ovalbumine, ook tegen ‘tyrosinase related protein-2’ (TRP-2), erbB2 en hepatoma antigenen in muismodellen (Breckpot et al., 2003; Firat et al., 2002; Lizee et al., 2004; Metharom et al., 2005; Mossoba et al., 2008; Wang et al., 2006). Hoewel het opwekken van een T cel respons een goede parameter is om de efficiëntie van ex vivo LVgetransduceerde DCs als vaccin te meten, is het therapeutisch effect van doorslaggevend belang. Tal van studies in tumordragende muizen hebben aangetoond dat LV-gemodificeerde DCs inderdaad een therapeutisch effect hebben, dat zelfs sterker is dan vaccinatie met een peptide/adjuvans of vaccinatie met peptide of mRNA geladen DCs (Dullaers et al., 2006; He et al., 2005; Metharom et al., 2005). Hieruit kan besloten worden dat LV-getransduceerde DCs in staat zijn om antigene peptiden te presenteren in de context van zowel MHC klasse I als II moleculen en dat ze een immuunrespons opwekken die tot regressie van reeds aanwezige tumoren kan leiden.
3.4. In vivo transductie van dendritische cellen Om TAA-coderende LVs als antitumor vaccin te kunnen inzetten, dienen ze aan bepaalde voorwaarden te voldoen. Belangrijk is dat LVs het TAA evenals activatie signalen afleveren aan professionele antigen presenterende cellen, zodat deze migreren naar de lymfoïde organen om daar TAA-afgeleide peptiden te presenteren aan T cellen. De groep van VandenDriessche et al zijn als eerste nagegaan welke celtypes in vivo getransduceerd worden na intraveneuze (iv) injectie van breed tropisme LVs. Zij observeerden een efficiënte gentransfer naar hepatocyten, splenocyten alsook niet-delende MHC klasse II+ cellen (VandenDriessche et al., 2002).
13
Inleiding Dit was een eerste aanwijzing dat LVs in situ antigen presenterende cellen transduceren. Palmowski et al toonde aan dat de MHC klasse II+ cellen, beschreven door VandenDriessche et al, CD11c+ DCs waren (Palmowski et al., 2004). Later werd door verschillende groepen aangetoond dat er transgenexpressie in de regionale lymfeknopen kan teruggevonden worden na subcutane (sc) injectie van LVs in muizen (Dullaers et al., 2006; Esslinger et al., 2003; He et al., 2006). Dit was een eerste aanwijzing voor de migratie van in de huid getransduceerde antigen presenterende cellen naar nabijgelegen lymfeknopen (Dullaers et al., 2006; Esslinger et al., 2003). Het was uiteindelijk He et al die aantoonde dat sc injectie van LVs resulteerde in transductie van LCs en interstitiële DCs, die vervolgens migreren naar de nabijgelegen lymfeknopen (He et al., 2006). Om het potentieel van LVs als antitumor vaccin verder te bestuderen, werd nagegaan of directe toediening van TAA-coderende LVs resulteert in een sterke T cel respons. In tal van studies waar LVs codeerden voor verschillende TAAs en toegediend werden via verschillende administratieroutes, werd aangetoond dat deze strategie resulteerde in een sterke, aanhoudende TAA-specifieke T cel respons. Deze studies worden samengevat in Tabel 1. Tabel 1 Overzicht van de dosis, toedieningsroute en het antigen in de respectievelijke LV-gebaseerde kanker vaccinatie studies in muismodellen (Breckpot et al., 2008) EFU: ‘expression focus units’, PFU: ‘plaque-forming units’, IU: ‘infectious units’, TU: ‘transducing units’, sc: subcutaan, iv: intraveneus. Referentie
Dosis
Route
Antigen
Esslinger et al
7
sc (voetzool, staartbasis)
Cw3, mini Melan-A
Palmowski et al Kim et al Rowe et al Dullaers et al
2 x 10 EFU 6
1 x 10 PFU
iv (staartvene)
NY-ESO
6
sc (voetzool)
TRP-2
7
iv (staartvene)
OVA
7
sc (voetzool)
OVA
6
1,6 x 10 PFU 1 x 10 IU 2 x 10 TU
He et al
1 x 10 TU
sc (voetzool)
OVA
Chapatte et al
7
sc (staartbasis)
Melan-A
2 x 10 EFU
Daarnaast werd ook de therapeutische waarde van directe toediening van TAA-coderende LVs in deze studies hard gemaakt. Tot slot werd aangetoond dat directe toediening van LVs een meerwaarde biedt in vergelijking met immunisatie door middel van peptide/adjuvans of ex vivo LV-getransduceerde DCs in die zin dat de CTL respons langer aanhield, slechts partieel afhankelijk was van Th1 cellen en dat sterke geheugen T cel responsen werden opgewekt (Chapatte et al., 2006; Dullaers et al., 2006; Esslinger et al., 2003). Daarnaast toonde de studie van Annoni et al aan, in welke LVs werden aangewend voor de correctie van hemofilie B (Factor IX gentransfer), dat een opgewekte transgen respons niet onderdrukt kon worden door transgenspecifieke Tregs (Annoni et al., 2007). Deze studie suggereert dat de T cel respons die ontstaat na immunisatie met LVs niet onderhevig is aan Treg onderdrukking. Dit heeft belangrijke implicaties voor het gebruik van LVs als antitumor vaccin, aangezien Tregs één van de best gekarakteriseerde immuunrespons inhiberende factoren zijn. Naast dit immunologisch voordeel bieden LVs als antitumor vaccin een aantal praktische voordelen t.o.v. in vitro gemanipuleerde DCs. Deze zijn: (1) de mogelijkheid om LVs lang te bewaren, (2) het potentieel gebruik bij alle patiënten en gelinkt hieraan (3) de mogelijkheid voor directe toediening op tijdstip van diagnose. Er zijn echter ook enkele belangrijke aandachtspunten verbonden aan het in vivo gebruik van LVs.
14
Inleiding Ten eerste moet vermeden worden dat replicatie competente LVs gevormd worden. Hiervoor werden tal van veiligheidsmechanismen ingebouwd. Deze werden beschreven in de sectie ‘3.1. Van lentivirus tot lentivirale vector’. Ten tweede zijn de breed tropisme LVs in staat om naast antigen presenterende cellen ook andere celtypes te infecteren. Dit heeft twee gevolgen. Enerzijds kan antigen presentatie door niet antigen presenterende cellen interfereren met de antitumor immuunrespons (hetzij positief door kruispresentatie, hetzij negatief door inductie van tolerantie), anderzijds bestaat het risico op insertionele mutagenese aangezien LVs als provirus insereren in het gastheergenoom. Enkele strategieën werden ontwikkeld om deze problemen te omzeilen. Integrase-deficiënte of plaatsspecifiek integrerende LVs werden ontwikkeld om de kans op insertionele mutagenese te verlagen (Karwacz et al., 2009). Verder wordt gewerkt aan de ontwikkeling van LVs die gericht zijn naar DCs, om interferentie met de immuunrespons en/of het risico op insertionele mutagenese te omzeilen. Dit laatste kan door respectievelijk transcriptionele en/of transductionele ‘targeting’ van de LV naar de DC.
3.4.1. Transcriptionele targeting Bij transcriptionele targeting wordt een DC-specifieke transgenexpressie beoogd door de constitutief actieve promotor, zoals de cytomegalovirus promoter (CMV), in de expressiecassette van het transferplasmide te vervangen door een DC-specifieke promoter (Breckpot et al., 2007b). Volgende promotoren werden hiervoor aangewend: de B7-DC, CCL17, dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP), CD11c en dectine-2 promotor (Cui et al., 2002; Dresch et al., 2008; Lopes et al., 2008). Lopes et al toonden verder aan dat de dectin-2 promoter niet alleen resulteert in DC-specifieke genexpressie, maar dat immunisatie met dergelijke NY-ESO-1 coderende LVs resulteerde in een antigenspecifieke CD4+ en CD8+ T cel respons, die vergelijkbaar is met de respons opgewekt na immunisatie met LVs met een constitutieve promoter. Ondanks het potentieel om de transgenexpressie te beperken tot antigen presenterende cellen, zal het gebruik van DC-specifieke promotoren de infectie van andere celtypes en aldus de kans op insertionele mutagenese niet verkleinen. Een strategie om dit te omzeilen is transductionele ‘targeting’ waarbij het tropisme van de LV beperkt wordt tot de cel van interesse.
3.4.2. Transductionele targeting van dendritische cellen Het tropisme van LVs wordt bepaald door de envelop glycoproteïnen. Pseudotypering maakt het mogelijk om via verandering van deze glycoproteïnen LVs te genereren met een specifiek transductie patroon. Tot op heden is er echter geen natuurlijk DC-specifiek envelop glycoproteïne geïdentificeerd. Daarom werd in eerste instantie getracht bestaande envelop proteïnen door middel van genetische ‘engineering’ te modificeren om zo DC-specifieke binding te verkrijgen zonder de membraanfusie te verstoren. Een voorbeeld van deze laatste toepassing is de constructie van een LV waarbij de VSV.G envelop vervangen werd door een chimere vorm van een ‘single chain’ antilichaam (scFv) gekoppeld aan: (1) het N-terminale uiteinde van het VSV.G proteïne (Dreja & Piechaczyk, 2006), (2) het amfotrofe muriene leukemia virus envelop (MLV-A) proteïne (Gennari et al., 2009) of (3) het sindbis virus envelop proteïne (Morizono et al., 2009; Zhang et al., 2010). Deze manipulaties resulteerden echter in envelop glycoproteïnen met lage stabiliteit en beperkte bindings- en fusiecapaciteit.
15
Inleiding Maar het sindbis glycoproteïne biedt een alternatieve mogelijkheid aangezien het in staat is om twee verschillende receptoren te binden nl. de alom geëxpresseerde heparaan sulfaat receptor (HSR) en de DC-SIGN receptor. Door de binding met de eerste receptor te verhinderen via de inclusie van mutaties in het HSR bindend deel van de envelop, kon zo een DC-specifiek glycoproteïne geconstrueerd worden (Yang et al., 2008). Belangrijk is dat dit tot op vandaag de enige strategie is waarmee DC-specifieke transductie in vivo werd aangetoond. Daarnaast bleken ook deze DC-gerichte LVs in staat om een sterke T cel respons te genereren die tumorregressie tot gevolg heeft. Problematisch blijft echter het gebrek aan stabiele virale partikels. Een alternatieve methode om LVs te richten naar specifieke celtypes werd voorgesteld door Chandrashekran et al. Aangezien retrovirussen en LVs hun envelop verwerven na ‘budding’ vanuit de celmembraan van de producerende cellijn, zal elk glycoproteïne uitgedrukt op dit celmembraan, geïncorporeerd worden in de virale envelop. Zo werd een membraan gebonden vorm van stamcel factor (mbSCF) in de membraan van een retrovirus producerende cellijn gebracht waarna ecotrope retrovirussen geproduceerd werden. De ecotrope envelop laat geen transductie van humane cellen toe, daar humane cellen geen ecotrope receptor bevatten. Echter, binding van de mbSCF aan zijn receptor, c-kit, resulteerde in transductie van de humane c-kit+ cellen door de mbSCF-bevattende en met een ecotrope envelop gepseudotypeerde LVs (Chandrashekran et al., 2004). Deze strategie werd later door Yang et al uitgebreid naar LVs (Yang et al., 2006). Zij incorporeerden zowel een fusogeen proteïne (afgeleid van influenza A of sindbis virus) als antilichaam gericht tegen CD20 (B cel merker) in de plasmamembraan van de LV producerende cellijn. Hiermee werden vervolgens LVs geproduceerd die zowel in vitro als in vivo specifiek B cellen transduceerden. Deze strategie zou kunnen vertaald worden naar DCs, waarbij als DC-specifieke factor gebruik gemaakt kan worden van antilichamen die specifiek gericht zijn tegen een CLR zoals de BDCA-2 receptor of DEC-205 (Bonifaz et al., 2004; Dzionek et al., 2001; Yang et al., 2008). Enkele nadelen aan het gebruik van antilichamen of scFvs als therapeutische agentia zijn het gebrek aan stabiliteit, hun grootte en de immunogeniciteit waardoor humane antimuis antilichamen ontstaan. Daarom werd naar alternatieven gezocht. In dit opzicht lijken ‘Nanobodies’ (Nbs) veel potentieel te hebben. Hamers-Casterman et al ontdekten dat een deel van de humorale respons van kamelen, dromedarissen, lama’s en sommige haaiensoorten gebaseerd is op een uniek repertoir van volledig functionele antilichamen die alleen zware ketens bevatten (HamersCasterman et al., 1993) (Fig. 9). Deze ontdekking gaf aanleiding tot een nieuw antilichaam technologie platform gebaseerd op het enkelvoudige variabele domein van deze camelide zware keten antilichamen, genaamd ‘Nanobody (Nb)’ (Fig.9).
Fig. 9 Schematische voorstelling van de conventionele (links) en zware keten IgG antilichamen (midden) aanwezig in het camelide serum en het hiervan afgeleide ‘Nb’ (rechts) (Revets et al., 2005).
16
Inleiding Dit Nb biedt enkele interessante voordelen t.o.v. de conventionele antilichamen zoals de gemakkelijke manier van kloneren, zijn nanoformaat, de superieure stabiliteit en het gebrek aan immunogeniciteit (Harmsen & De Haard, 2007; Revets et al., 2005). Hieruit ontstond het idee om een DC-specifiek Nb op de celmembraan van een LV-producerende cellijn tot expressie te brengen, samen met een bindingsdefectieve (getrunceerde) vorm het VSV.G proteïne (tVSV.G) (Fig. 10). Deze strategie wordt de ‘Nanobody display technologie’ genoemd en vormt het onderwerp van deze thesis.
(a)
(b)
Fig. 10 Strategie om LVs te produceren met de VSV.G envelop (links) of de tVSV.G envelop samen met een DC-specifiek Nb (rechts) (Breckpot et al., 2008). 293T cellen worden transiënt getransfecteerd met drie respectievelijk vier plasmiden: (1) het inpakplasmide, pCMV∆R8.9 (gag/pol), (2) het transferplasmide (virale RNA), (3) het envelop coderende plasmide (a) al dan niet samen met (4) het plasmide dat codeert voor een membraangebonden Nb (b). De laatste twee worden overgeschreven en getransleerd tot respectievelijk de envelop en het Nb dat vervolgens op de celmembraan wordt uitgedrukt. De eerste twee geven aanleiding tot respectievelijk de structurele componenten, enzymen en het virale RNA die in de cel het nucleocapside vormen. Dit zal door ‘budding’ een deel van de celmembraan meenemen, waardoor de envelop en het Nb op het virale oppervlak terecht komen.
17
Doelstellingen
Doelstellingen In het kader van actieve immuuntherapie is het van belang om een vaccin te ontwikkelen dat een sterke en langdurige TAA-specifieke CTL respons kan opwekken. Hiervoor lijken LVs een interessant middel om TAAs alsook activatiesignalen in vivo aan DCs af te leveren. De tot nu toe aangewende LVs hebben echter een breed tropisme waardoor ze niet alleen DCs maar ook andere celtypes transduceren wat kan interfereren met de gewenste antitumor immuunrespons. Daarnaast resulteert dit breed infectiepatroon in een verhoogde kans op insertionele mutagenese. Om de bioveiligheid van het vaccin te verhogen, willen we LVs ontwikkelen die enkel DCs kunnen transduceren. Dit kan het risico op insertionele mutagenese en interferentie met de immuunrespons sterk verlagen. Deze thesis kadert dan ook in een project dat de ontwikkeling van DC-gerichte LVs beoogt. Om DC-specifieke targeting te bekomen, combineren we een bindingsdefectieve envelop, die wel nog fusie kan mediëren, met een DC-specifieke bindingsmolecule. Als envelop wordt gebruik gemaakt van tVSV.G. Deze tVSV.G werd recent voorgesteld door Dr. J. Reiser (Lousiana State University) op ‘the American Society of Gene & Cell Therapy’ (2008). Er werd beschreven dat deze envelop geen bindingscapaciteit bevat maar nog wel fusie kan mediëren indien alternatief gebonden aan de doelwitcel. Wanneer bijvoorbeeld tVSV.G gepseudotypeerde LVs alternatief gebonden werden aan c-kit+ cellen door middel van mbSCF, werden deze cellen efficiënt getransduceerd. Het voordeel van de tVSV.G t.o.v. reeds beschreven fusogene moleculen is dat deze, net als zijn niet getrunceerde versie, stabiliteit geeft aan de LVs waardoor hoge titers kunnen verkregen worden. Als DCspecifieke bindingsmolecule werd geopteerd voor de DC-specifieke Nbs, DC1.8 en DC2.1. Deze werden gegenereerd en gekarakteriseerd door Dr. K. De Groeve (Dienst Cellulaire en Moleculaire Immunologie, Vrije Universiteit Brussel). Er werd aangetoond dat DC1.8 enkel bindt op DCs, meer specifiek LCs, waar DC2.1 naast DCs ook bindt aan macrofagen (De Groeve et al., 2010). Combinatie van beide resulteert in LVs waarvan het oppervlak zowel de tVSV.G als het Nb bevat. Voorgaand onderzoek heeft uitgewezen dat dergelijke LVs (1) aan hoge titer geproduceerd kunnen worden, (2) het Nb op hun viraal oppervlak bevatten en ten slotte (3) in staat zijn om selectief beenmerg afgeleide DCs (DC1.8) en/of macrofagen (DC2.1) te transduceren in vitro, terwijl LVs die een niet DC-bindend Nb (BCII10 dat bindt aan het ß-lactamase van Bacillus cereus) bevatten geen transductie van DCs konden bewerkstelligen (Fig. 11). De doelstelling van deze thesis is meervoudig: (1) optimalisatie van de LV-productie, (2) het uitbreiden van de in vitro data naar primaire cellen en (3) evaluatie van de biodistributie van breed tropisme en gerichte LVs in vivo. Optimalisatie van de LV-productie is vereist daar we voor grotere dierproeven en latere klinische studies grote hoeveelheden LVs met hoge titer nodig hebben. De titer van de LVs wordt deels bepaald door de efficiëntie waarmee de plasmiden die coderen voor de virale componenten, in de productie cellen worden getransfecteerd. Daarom worden in deze thesis twee transfectiemethodes, namelijk Ca3-(PO4)2-DNA transfectie en lipofectie m.b.v FuGENE®, vergeleken.
18
Doelstellingen Fig. 11 Selectieve transductie van DCs met tVSV.G gepseudotypeerde en Nbbevattende LVs. Fibroblasten, T cellen, macrofagen en DCs werden geïncubeerd met enerzijds breed tropisme en anderzijds tVSV.G/Nbbevattende LVs. Alle celtypes werden getransduceerd door VSV.G gepseudotypeerde LVs (rode lijn, panel 1). Waar geen enkel celtype werd getransduceerd door het controle virus (tVSV.G/BCII10, panel 2). LVs die het Nb DC1.8 of DC2.1 bevatten waren in staat om respectievelijk DCs en/of macrofagen te transduceren.
Voor het tweede luik van deze thesis zal gebruik gemaakt worden van breed tropisme LVs (VSV.G) en LVs gepseudotypeerd met tVSV.G, die ofwel het niet DC-bindend Nb BCII10, ofwel het DC-specifiek Nb DC2.1 bevatten. Deze LVs zullen aangewend worden om vers geïsoleerde miltcellen in vitro te transduceren, waarna zal nagegaan worden welke celtypes getransduceerd werden. Hiervoor zal gebruik gemaakt worden van flow cytometrie. Ten slotte zal de biodistributie van de gerichte LVs vergeleken worden met deze van breed tropisme LVs. Hiervoor zullen ‘Firefly Luciferase’ (FLuc) en ‘enhanced Green Fluorescent Protein’ (eGFP) coderende LVs gebruikt worden die via verschillende routes geïnjecteerd zullen worden in C57BL/6 muizen waarna in vivo bioluminescentie beeldvorming en flow cytometrie zullen worden aangewend om respectievelijk de biodistributie en de getransduceerde celtypes te evalueren. Daarnaast zal ook gebruik gemaakt worden van de Thy1.1 (CD90.1) coderende LVs om met behulp van flow cytometrie de getransduceerde celtypes nader te bestuderen. De resultaten die uit deze experimenten voortvloeien zullen aangeven of de ‘Nanobody display technologie’ kan vertaald worden naar in vivo toepassingen. Dit is een belangrijke vereiste om deze technologie bruikbaar te maken voor klinische studies.
19
Resultaten
Resultaten 1. Optimalisatie van de lentivirale vector productie 1. 1. Vergelijk van de Ca3-(PO4)2- en FuGENE®-gebaseerde transfectie methode Een tiental jaren geleden werden LVs in het gastlaboratorium geïntroduceerd. Sindsdien werd aangetoond dat LVs kunnen aangewend worden voor de manipulatie van DCs in vivo, meerbepaald de introductie van TAA en simultane aflevering van activatie signalen (Breckpot et al., 2010). Deze karakteristieken maken TAA-coderende LVs interessant als antikanker vaccin (Breckpot et al., 2007b). Om het in vivo gebruik van LVs veiliger te maken, willen we LVs ontwikkelen die enkel DCs kunnen transduceren. Voor het gebruik van DC-gerichte LVs in muismodellen en de vertaling ervan naar klinische studies, is het belangrijk om een schaalvergroting van de LV-productie uit te voeren. Een belangrijke stap in de productie is de transfectie van 293T cellen met plasmiden die coderen voor de virale componenten, zijnde de structurele proteïnen en enzymes, het virale RNA alsook één of meerdere envelop glycoproteïnen. Verschillende methoden werden ontwikkeld om plasmide DNA in dierlijke cellen te introduceren (= transfectie). In deze thesis hebben we ons toegespitst op het vergelijk van twee chemische transfectiemethoden. Hiermee wordt het DNA in complex gebracht om interactie met de celmembraan te bevorderen. De eerste methode is Ca3-(PO4)2-DNA transfectie waarbij de cellen het plasmide DNA opnemen in de vorm van calciumfosfaat precipitaten door middel van endocytose. De tweede methode is gebaseerd op de vorming van een lipofiel complex dat fusie met de celmembraan toelaat (= lipofectie), waardoor het plasmide DNA rechtstreeks in het cytoplasma van de productie cel terecht komt. Voor deze laatste werd gebruik gemaakt van FuGENE®, een commercieel verkrijgbaar lipofectie agens. Zoals eerder vermeld werden beide methoden met elkaar vergeleken voor de productie van VSV.G gepseudotypeerde, eGFP coderende LVs (n = 3). Hiervoor werd telkens eenzelfde aantal 293T cellen, meer bepaald 107 per T175 (2x) getransfecteerd met het inpakplasmide (pCMV∆R8.9), het VSV.G coderende plasmide (pMD.G) en het eGFP coderende SIN transferplasmide (pHR’ trip CMVeGFP SIN). De verschillen tussen beide methoden naast het gebruik van respectievelijk Ca3-(PO4)2 (2 M CaCl2 en 2x HeBS) en FuGENE® zijn verder (1) de hoeveelheid plasmide DNA, respectievelijk 90 µg en 8,75 µg per 107 cellen per T175 en (2) het aantal collecties van het virushoudend supernatant, respectievelijk twee en drie. Volgende parameters werden voor dit vergelijk geëvalueerd (1) de transgen expressie in de productiecellen na de laatste virus afname (transfectie efficiëntie), (2) de virale titer en tenslotte (3) de kost, gerelateerd aan de producties. Om de transfectie efficiëntie te bepalen werden de LV-producerende 293T cellen na de laatste LV-collectie (72 uur na transfectie) via flow cytometrie geëvalueerd voor de expressie van eGFP. We observeerden in Ca3-(PO4)2-DNA getransfecteerde 293T cellen gemiddeld een twee maal hoger percentage eGFP+ cellen in vergelijk met de FuGENE®-getransfecteerde cellen (Fig. 12). Bovendien werd bij de eGFP+ cellen van de eerstgenoemden ook een sterkere fluorescentie intensiteit vastgesteld wat aanduidt dat er gemiddeld per cel meer eGFP moleculen aanwezig zijn (Fig. 12a).
20
Resultaten
Fig. 12 Bepaling van de transfectie efficiëntie. Als maat van de transfectie efficiëntie werd 72 uur na transfectie de expressie van het transgen eGFP in de productiecellen bepaald met behulp van flow cytometrie. De grafieken + in (a) tonen het percentage eGFP cellen (x-as) in niet-getransfecteerde cellen (controle, links), Ca3-(PO4)2-DNA ® (midden) en FUGENE -getransfecteerde (rechts) 293T cellen. Deze data zijn representatief voor de drie + uitgevoerde experimenten. De grafiek in (b) is een samenvatting van het aantal eGFP cellen verkregen per experiment. De horizontale lijn toont het gemiddelde.
Vervolgens werden de LV-bevattende supernatanten van de 1ste en 2de (evenals 3de afname voor de FuGENE®-gebaseerde lipofectie) samengevoegd en 0,22 µm gefiltreerd. Hiervan werd een aliqout (4 ml) afgenomen om de titer van de LV-stock vóór concentratie te bepalen (Fig. 13a). Het resterende LV-bevattend supernatant werd over 50 ml tubes verdeeld, de LVs gepelleteerd door centrifugatie gedurende 12 tot 16 uur aan 4000 rpm bij 4°C en vervolgens geresuspendeerd in PBS gesupplementeerd met 10 µg/ml protamine sulfaat (PS) zodat een 200 maal geconcentreerde stock werd verkregen.
Fig. 13 Bepaling van de LV-titer voor (a) en na (b) concentratie (200x). Per well van een 6-well plaat werden 105 293T cellen getransduceerd met een seriële verdunningsreeks van de bekomen LV-stocks. Na 36 uur werden de cellen geanalyseerd in flow cytometrie. Om de hoeveelheid TU/ml te bekomen werd volgende formule gebruikt: # getransduceerde 293T cellen x het % transgen positieve cellen x verdunningsfactor transductie volume x 100 De resultaten van de drie uitgevoerde experimenten werden in de figuur samengevat als gemiddelde ± standaarddeviatie (stdev). De grafiek in (a) toont de titer van de LV-producties uitgevoerd met de Ca3-(PO4)2DNA transfectie of de FUGENE®-gebaseerde lipofectie vóór concentratie. In deze grafiek werd aangeduid dat de titer verkregen met de de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie meer dan 1.5 x 106 TU/ml is, daar met de sterkste LV-verdunning (1/10) nog steeds een hoog percentage eGFP + cellen werd verkregen (± 90%) en de berekende titer daarom een onderschatting is van de eigenlijke titer. Analoog aan (a) wordt in (b) de titer van de LV-stocks ná concentratie getoond.
21
Resultaten Opnieuw werd de titer bepaald door 293T cellen te infecteren met een seriële verdunningsreeks van de LVs (Fig. 13b). Flow cytometrie werd aangewend om het percentage getransduceerde (= eGFP+) cellen te bepalen. Dit percentage laat toe om de titer of het aantal TU in de virale stock te berekenen. Uit figuur 13 blijkt dat de LV-productie met behulp van de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie resulteert in een hogere LV-titer dan de productie met behulp van de FuGENE®-gebaseerde lipofectie. Tot slot werd de kostprijs van beide protocols vergeleken. Hierbij werden de prijs van plastic materiaal, media, transfectie agentia en DNA in rekening gebracht. De berekening en finale kostprijs voor de productie van 107 TU LVs is samengevat in Tabel 2. Uit deze tabel kan afgeleid worden dat ondanks het groot verbruik aan DNA en slechts twee collecties (i.p.v. drie voor de FuGENE®-gebaseerde lipofectie) Ca3-(PO4)2-DNA transfectie goedkoper is dan de FuGENE®-gebaseerde lipofectie (Tabel 2). In conclusie, productie van LVs met behulp van Ca3-(PO4)2-DNA transfectie scoort beter dan productie van LVs met behulp van FuGENE®-gebaseerde lipofectie en dit op vlak van LV-opbrengst en kostprijs. Alle volgende LV-producties werden dan ook uitgevoerd met behulp van Ca3-(PO4)2-DNA transfectie.
Tabel 2 Overzicht van de materialen en hun kostprijs die werden gebruikt per LV-productie. Deze tabel geeft naast de prijs van de verbruiksartikelen ook het gemiddeld aantal TU/ml, het volume van de virale stock na concentratie en hieruitvolgend het totaal aantal TU dat gemiddeld werd verkregen per productie. Dit laatste cijfer werd gebruikt om de kost voor de productie van 10 7 TU te bepalen.
1.2. Controle van de aangewende transferplasmiden Tijdens dit project werden vier verschillende LVs aangewend, meer bepaald LVs die de volgende transgenen bevatten: (1) ‘red shifted’ thermostabiele Firefly luciferase (tsred FLuc), alsook eGFP (tsred FLuc-Ires-eGFP), (2) Ires-eGFP, (3) eGFP en tenslotte (4) Thy1.1. Deze werden gebruikt om getransduceerde cellen respectievelijk met in vivo bioluminiscentie beeldvorming (tsred FLuc-Ires-eGFP en de controle Ires-eGFP) en flow cytometrie (eGFP en Thy1.1) op te volgen. Om deze LVs te produceren werden SIN transferplasmiden die reeds aanwezig waren in het gastlaboratorium, respectievelijk pASIET tsred FLuc, pASIET, pHR’ trip CMVeGFP SIN en pSIN Thy1.1 gebruikt (Fig. 14).
22
Resultaten Het plasmide, pHR’ trip CMVeGFP SIN, bleek uit voorgaand experiment (Fig. 12) reeds een betrouwbaar reportersysteem dat resulteert in efficiënte eGFP expressie in getransfecteerde, evenals getransduceerde 293T cellen. Omdat de transferplasmiden, pASIET tsred FLuc en pSIN Thy1.1 niet eerder werden gebruikt voor LV-productie in het gastlaboratorium, werden LVs aangemaakt met deze transferplasmiden. Vervolgens werden 293T cellen met de LVs getransduceerd, waarna de expressie van de reporters werd geëvalueerd in vitro.
Fig. 14 Schematische voorstelling van de gebruikte SIN transferplasmiden; pHR’ trip CMVeGFP SIN (a), pASIET tsred FLuc (b), pASIET (c) en pSIN Thy1.1 (d). Elk plasmide wordt langs weerszijde geflankeerd door een LTR. Belangrijk is dat de U3 regio van de 3’ LTR werd gedeleteerd, wat resulteert in SIN transferplasmiden. Verder bevat elk construct een inpaksignaal Ψ, een ‘rev responsive element’ (RRE), een cPPT, geflankeerd door zijn CTS en een expressiecassette. De expressiecassette van plasmide (a), (b) en (c) bevat een cytomegalovirus (CMV) promoter die de expressie van respectievelijk eGFP, tsred FLuc-IreseGFP en Ires-eGFP controleert. In de laatstgenoemden staat Ires voor ‘internal ribosomal entry site’ die de expressie van twee genen gedreven door eenzelfde promoter toelaat. In construct (d) wordt de Thy1.1 expressie gedreven vanaf de ‘spleen focus forming virus’ (SFFV) promoter.
1.2.1. Controle transferplasmide pASIET tsred FLuc De reporter FLuc is afkomstig van het vuurvliegje Photinus pyralis. FLuc is een enzyme dat de oxidatie van luciferine en adenosinetrifosfaat (ATP) tot oxyluciferine en adenosinemonofosfaat katalyseert. Bij deze reactie wordt groen licht (577 nm) uitgezonden (Sadikot & Blackwell, 2005). Deze eigenschap heeft geleid tot het gebruik van FLuc om genexpressie op te volgen. In deze studie maken we gebruik van een gemuteerde versie van FLuc, namelijk tsred FLuc (Branchini et al., 2007), welke werd gekloneerd in de vector pASIET. Deze FLuc mutant is stabiel bij 37°C (ts) en zendt rood licht uit (‘red shifted’, 610 nm), twee eigenschappen die zijn gebruik als reporter in kleine levende dieren zoals de muis mogelijk maken. LVs aangemaakt met dit transferplasmide werden tijdens het project dan ook aangewend om de biodistributie van breed tropisme en gerichte LVs na te gaan na directe administratie in muizen. Om de eGFP en tsred FLuc expressie te controleren voor het aanvangen van de in vivo experimentent, werden VSV.G gepseudotypeerde LVs aangemaakt met pASIET tsred FLuc of pASIET (controle). Vervolgens werden 293T cellen geïnfecteerd met deze LVs. Twee dagen na transductie werden de getransduceerde 293T cellen geanalyseerd.
23
Resultaten Hiervoor werden ze onderworpen aan flow cytometrie en luminometrische analyse om enerzijds de expressie van eGFP en anderzijds de activiteit van tsred FLuc te evalueren. Figuur 15 toont aan dat 293T cellen getransduceerd met LV aangemaakt met pASIET of pASIET tsred FLuc, eGFP uit drukken (Fig. 15a), waar enkel de laatstgenoemde ook tsred FLuc activiteit vertonen (Fig. 15b). Het transferplasmide pASIET tsred FLuc kan m.a.w. aangewend worden om LVs aan te maken voor in vivo bioluminiscentie beeldvorming experimenten.
Fig. 15 Evaluatie van de eGFP en tsred FLuc expressie in 293T cellen getransduceerd met LVs aangemaakt met het transferplasmide pASIET of pASIET tsred FLuc. De expressie van eGFP werd nagegaan met behulp van flow cytometrie, waar de expressie van het tsred FLuc met luminometrie werd geëvalueerd. In (a) worden de flow cytometrische data getoond van niet-getransduceerde 293T cellen (links) en 293T cellen getransduceerd met LVs die ofwel enkel Ires-eGFP (midden) ofwel tsred FLuc en eGFP (rechts) coderen. De grafiek in (b) toont het aantal ‘relative light units’ (RLU) dat werd bekomen nadat Dluciferine bij 20 µl van het lysaat van voornoemde 293T cellen werd gebracht. Deze RLU zijn een maat voor de tsred FLuc activiteit.
1.2.2. Controle transferplasmide pSIN Thy1.1 Het SIN transferplasmide pSIN Thy1.1 bevat een expressiecassette waarin de SFFV promoter de expressie van Thy1.1 (CD90.1) controleert (Fig. 14d). Thy1.1 is een thymocyt specifiek oppervlakte antigen en kan gebruikt worden als reporter in muizen met een Thy1.2 achtergrond. Deze eigenschap werd in dit project gebruikt om in vivo getransduceerde cellen op te sporen. Ter controle van de SFFV promoter gedreven Thy1.1 expressie, werden LVs aangemaakt met het transferplasmide pSIN Thy1.1, waarmee 293T cellen werden getransduceerd. Twee dagen later werden de 293T cellen, na ‘labeling’ met een anti-Thy1.1 antilichaam geanalyseerd in flow cytometrie (Fig. 16).
Fig. 16 Flow cytometrische analyse van 293T cellen getransduceerd met pSIN Thy1.1. De expressie van Thy1.1 werd nagegaan met behulp van flow cytometrie. Niet-getransduceerde, Thy1.1 gelabelde 293T cellen (links) dienen als controle voor de evaluatie van de Thy1.1 expressie in getransduceerde 293T cellen (rechts). .
24
Resultaten Uit figuur 16 blijkt dat Thy1.1 sterk tot expressie komt in de 293T cellen en dat dergelijke LVs dus kunnen aangewend worden voor de voornoemde in vivo experimenten.
1.3. Productie van tVSV.G gepseudotypeerde lentivirale vectoren Zoals eerder vermeld gaan we in het vervolg van deze thesis het transductiepatroon vergelijken van breed tropisme of VSV.G gepseudotypeerde LVs met LVs gepseudotypeerd met een tVSV.G die verder een DC-irrelevant Nb (BCII10) of DC-specifiek Nb (DC2.1) bevatten. Eerder werden dergelijke LVs aan vergelijkbare titers bekomen door productie met behulp van de FuGENE®-gebaseerde lipofectie. In onze handen bleek deze laatste methode echter minder efficiënt dan de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie waardoor we voor alle daaropvolgende producties gebruik gemaakt hebben van deze transfectiemethode. Omdat de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie methode zeer gevoelig is voor de hoeveelheid ‘input’ DNA werd eerder in het gastlaboratorium nagegaan wat de ideale hoeveelheid DNA is voor transfectie van 10 tot 15 x 106 293T cellen. Daarnaast werd nagegaan wat de ideale verhouding was voor de LV-productie, m.a.w. de transfectie van envelop coderend plasmide (VSV.G coderend pMD.G of tVSV.G coderend pUB6 tVSV.G) , gag/pol coderend plasmide (pCMV∆R8.9) en tenslotte transferplasmide. Uit deze optimalisatie bleek dat de ideale hoeveelheid DNA 90 µg was en de ideale verhouding 1:2:3 of 15 µg envelop coderend plasmide, 30 µg pCMV∆R8.9 en 45 µg transferplasmide. In de huidige productie dienen we naast deze drie plasmiden ook het Nb-coderend plasmide (pDISPLAY-BCII10 of pDISPLAY-DC2.1) in te brengen. Op basis van de vorige FuGENE®-gebaseerde LVproducties willen we de verhouding Nb-coderend plasmide t.o.v. envelop coderend plasmide houden op 1 t.o.v. 2. Dit komt neer op een extra hoeveelheid ‘input’ DNA van 7,5 µg. Daarom werd nagegaan of dit verschil geen effect had op de transfectie efficiëntie en daaruit volgend de LV-opbrengst.
Fig. 17 Bepaling van de transfectie efficiëntie na transiënte transfectie van productiecellen met respectievelijk drie en vier plasmiden. Tweeënzeventig uur na transfectie werden de LV productiecellen geoogst, gewassen en geanalyseerd in flow cytometrie. De histogrammen tonen de expressie van eGFP (x-as) in niet-getransfecteerde 293T cellen (niet) of 293T cellen getransfecteerd voor de productie van VSV.G, tVSV.G/BCII10 of tVSV.G/DC2.1 bevattende LVs en zijn representatief voor de 11 uitgevoerde transfecties.
Na elke LV-productie werd daarom een deel van de overgebleven productiecellen geoogst en gewassen om vervolgens de transgen expressie (eGFP) te analyseren in flow cytometrie. Uit figuur 17 blijkt dat de transfectie met drie plasmiden voor de productie van VSV.G gepseudotypeerde LVs in een hoger percentage eGFP+ cellen resulteerde dan de transfectie met vier plasmiden voor de productie van de tVSV.G met Nb gepseudotypeerde LVs (Fig. 17). Daarnaast toonden de voornoemde productiecellen een sterkere expressie van het transgen (gemiddelde fluorescentie intensiteit).
25
Resultaten Het verschil in eGFP expressie in de verschillende condities kan op twee manieren verklaard worden. Een eerste verklaring zou kunnen zijn dat de transfectie met drie plasmiden efficiënter is dan deze met vier plasmiden, m.a.w. dat de extra 7,5 µg ‘input’ DNA (het Nbcoderend plasmide) nefast is voor de transfectie en bijgevolg de LV-productie. Een tweede verklaring zou kunnen liggen in het type LVs dat wordt geproduceerd. Bij de productie van breed tropisme LVs (drie plasmide transfectie) wordt verondersteld dat de geobserveerde eGFP expressie in de productiecellen het gevolg is van de transfectie, alsook transductie met de geproduceerde LVs. Dit laatste is uitgesloten bij de productie van de tVSV.G/Nb bevattende LVs (vier plasmide transfectie) daar deze niet kunnen binden aan de productiecellen en bijgevolg deze laatste niet kunnen infecteren. Daarom werden de virushoudende supernatanten verder verwerkt en vervolgens gekarakteriseerd in de RT assay, die de ‘reverse transcriptase’ hoeveelheid in de LV-stock bepaald. Deze RT assay gaf aan dat de hoeveelheid RT in de LV-stock geproduceerd na vier plasmide transfectie, onafhankelijk van het Nb-coderend plasmide, beduidend lager lag dan de RT hoeveelheid in de VSV.G gepseudotypeerde LV-stock (Fig. 18). De hoeveelheid RT in VSV.G gepseudotypeerde LV-stocks werd verder gecorreleerd aan het aantal TU. Hiervoor werden de VSV.G gepseudotypeerde LVs gekarakteriseerd zoals beschreven in sectie ‘1.1. Vergelijk van de Ca3-(PO4)2- en FuGENE®-gebaseerde transfectie methode’. Hieruit bleek dat 1 ng RT overeenstemt met 5 x 104 TU.
Fig. 18 Bepaling van de hoeveelheid RT (# ng RT/µl) in de verschillende LV-stocks. Voor de karakterisatie van de LVs, werd de RT activiteit van zowel de VSV.G als tVSV.G/Nb gepseudotypeerde LVstocks bepaald met behulp van een RT assay. Hierbij dient vermeld te worden dat er geen verschil werd waargenomen tussen de RT activiteit van LVs gepseudotypeerd met tVSV.G in combinatie met de Nb BCII10 (n = 4) of DC2.1 (n = 4), terwijl er gemiddeld een verschil van ongeveer 4,5 maal werd waargenomen tussen de hoeveelheid RT tussen VSV.G (n = 3) en tVSV.G/Nb gepseudotypeerde LVs.
We kunnen aldus besluiten dat de geobserveerde transgen expressie in de productiecellen na transfectie een indicatie is voor de LV-opbrengst. Belangrijk is dat de LV-opbrengst van de VSV.G gepseudotypeerde LVs gemiddeld 4,5 maal hoger is dan deze van de tVSV.G gespeudotypeerde LVs.
26
Resultaten
2. Evaluatie van het transductiepatroon van breed tropisme en gerichte lentivirale vectoren in vitro Vandaag wordt LV-transductie beschouwd als een vaste waarde om het genexpressie patroon van primaire cellen te modificeren (Terskikh et al., 2005). Totnogtoe werd het transductie patroon van gerichte LVs enkel bepaald op in vitro gegenereerde cellen (muis DCs) of cellijnen, zoals 3T3NIH (fibroblast cellijn), EL4 (T cel lymfoma cellijn), A20 (B cel lymfoma cellijn) en RAW246.7 (macrofaag cellijn). Hieruit bleek dat DC2.1 gerichte LVs in staat waren om DCs en macrofagen te transduceren. Om deze data uit te breiden naar de celtypes die in vivo kunnen getransduceerd worden (= primaire cellen), werd nagegaan of eenzelfde transductiepatronen kon aangetoond worden na transductie van vers geïsoleerde miltcellen. Er dient vermeld te worden dat de muizen gebruikt voor miltcelisolatie acht dagen eerder iv werden geïnjecteerd met 10 µg plasmide DNA, dat codeerde voor de hematopoëtische groeifactor ‘FMS-like tyrosine kinase 3-ligand’ (Flt3-L) om zo een aanrijking van het aantal DCs in de milt te verkrijgen. Acht dagen na deze Flt3-L voorbehandeling werden de muizen geëuthanaseerd, de milt geïsoleerd en mechanisch herleid tot een celsuspensie. Flow cytometrische analyse toonde aan dat deze celsuspensie gemiddeld 3,5% ± 2,1% CD11c+ cellen bevatte (n = 2, data niet getoond). Vervolgens werden 5 x 105 miltcellen getransduceerd met eGFP coderende LVs (MOI 25 of 250 ng RT) gepseudotypeerd met VSV.G of tVSV.G in combinatie met het Nb BCII10 of DC2.1 (n=2). Twee dagen na transductie werden de miltcellen geoogst, gewassen en gelabeld met een anti-CD3, anti-CD11c, anti-CD11b, anti-F4/80 en een anti-B220 antilichaam om zo een onderscheid te maken tussen respectievelijk T cellen, DCs, myeloïde cellen, macrofagen en B cellen in flow cytometrie. Ter illustratie werden de verschillende aangekleurde populaties getoond (Fig. 19).
Fig. 19 Flow cytometrische analyse van verschillende celpopulaties in de vers geïsoleerde miltcelsuspensie. Twee dagen na transductie werden de miltcellen gelabeld met een anti-CD3, anti-CD11c, anti-CD11b, anti-B220 en een anti-F4/80 antilichaam om zo een onderscheid te maken tussen respectievelijk T cellen, myeloïde DCs, monocyten/macrofagen en interstitiële DCs, B cellen en macrofagen in flow cytometrie. De getoonde data zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten.
Flow cytometrische analyse, waarbij niet getransduceerde miltcellen fungeerden als controle, toonde aan dat VSV.G gepseudotypeerde LVs in staat zijn om alle geëvalueerde populaties te transduceren, zij het met verschillende efficiënties (Fig. 20). Zo zien we het laagste percentage transgen+ cellen in de CD3, B220 en CD11b celpopulatie terwijl de macrofagen gedefinieerd als F4/80+, een duidelijke transgen positiviteit vertonen, die zelfs hoger ligt dan deze geobserveerd bij de CD11c+ DCs. LVs gepseudotypeerd met tVSV.G en het Nb BCII10,
27
Resultaten blijken niet in staat om de geëvalueerde celpopulaties te transduceren waarbij de percentages van transgen+ cellen bij alle celtypes overeenstemmen met de waarden van de nietgetransduceerde cellen. Dit bevestigt de betrouwbaarheid van deze LVs als negatieve controle.
Fig. 20 Flow cytometrische analyse van LV-getransduceerde primaire miltcellen. Vers geïsoleerde miltcellen werden niet getransduceerd (PBS) of getransduceerd met verschillend gespeudotypeerde LVs, waarna transgenexpressie in CD3 (bovenste rij), CD11c (tweede rij), B220 (derde rij), CD11b (vierde rij) en F4/80 (onderste rij) positieve cellen werd nagegaan met behulp van flow cytometrie. In tegenstelling tot tVSV.G/BCII10-bevattende LVs, bleken VSV.G gepseudotypeerde LVs in staat alle celtypes te transduceren. Belangrijk is dat LVs gepseudotypeerd met tVSV.G/DC2.1 in staat zijn om DCs (CD11c) en macrofagen (F4/80), alsook myeloïde cellen (CD11b) te transduceren.
28
Resultaten De transductie met tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs toonde een duidelijke transductie van F4/80+ cellen (macrofagen) en hoewel aan lagere efficiëntie eveneens de transductie van CD11c+ DCs en CD11b+ cellen (myeloïde cellen), maar niet van B220+ of CD3+ cellen (respectievelijk B en T cellen) (Fig. 20). Opmerkelijk hierbij is dat deze preferentieel F4/80+ macrofagen transduceren, wanneer vergeleken met de transductie van CD11c+ en CD11b+ cellen. Deze data stemmen overeen met voorgaande in vitro experimenten met gegeneerde muis DCs en verschillende cellijnen, waar DC2.1 gerichte LVs ook zowel alleen DCs als macrofagen konden modificeren (Fig. 11).
29
Resultaten
3. Evaluatie van de lentivirale vector biodistributie na directe administratie in C57BL/6 muizen 3.1. In vivo bioluminescentie beeldvorming met breed tropsime lentivirale vectoren Er werd reeds eerder aangetoond dat directe toediening van breed tropisme LVs resulteert in transductie van niet-antigen presenterende cellen, alsook in de transductie van antigen presenterende cellen, zoals DCs, macrofagen en B cellen, die vervolgens migreren naar lymfoïde organen om daar een transgen specifieke immuunrespons op te wekken (Breckpot et al., 2008). Wij wensen LVs (DC2.1) gericht naar DCs en/of macrofagen in vivo op te volgen, meer bepaald na te gaan of we (1) t.h.v. de injectie site een signaal hebben, wat een tegenindicatie zou zijn voor de specificiteit en (2) t.h.v. de drainerende lymfeknoop een signaal hebben, wat een indicatie is voor de migratie van getransduceerde antigen presenterende cellen naar de lymfoïde organen om daar te interageren met T cellen. Daarom werd eerst met breed tropisme, tsred FLuc coderende LVs nagegaan welke injectie route ons toelaat om een signaal t.h.v. de injectiesite en drainerende lymfeknoop met in vivo bioluminiscentie beeldvorming te evalueren. Hiervoor werden C57BL/6 muizen geïnjecteerd met ofwel vehikel (PBS met 10 µg/ml PS) ofwel 1 tot 3 x 107 TU LVs, subcutaan (sc) in de voetzool of staartbasis (n = 2, aantal muizen per experiment is 2). Daarnaast werd ook intranodale injectie van LVs getest als strategie om de LVs te injecteren in een anatomische regio waar veel antigen presenterende cellen, in het bijzonder DCs terug te vinden zijn (n = 1, aantal muizen per experiment is 2). De LVbiodistributie werd telkens 24 tot 36 uur na injectie geëvalueerd. Hiervoor werden de muizen iv geïnjecteerd met D-luciferine en geanalyseerd door middel van bioluminescentie beeldvorming (Fig. 21a). Indien de drainerende lymfeknoop geen signaal gaf, werden de muizen geëuthanaseerd en de lymfeknoop geïsoleerd. Deze werd vervolgens geïnjecteerd met D-luciferine (10 µl) en opnieuw geanalyseerd (Fig. 21b). Uit deze resultaten bleek dat de injectiesite, respectievelijk de staartbasis, voetzool of inguinale lymfeknoop, onafhankelijk van de injectieroute, een sterke tsred FLuc activiteit vertoonde. Deze tsred FLuc activiteit is een maat voor de aanwezigheid van LVgetransduceerde cellen. Na intranodale injectie was er tsred FLuc activiteit in de lymfeknoop waarneembaar met de in vivo bioluminiscentie beeldvorming. Dit was niet het geval voor de drainerende lymfeknoop van sc geïnjecteerde muizen. Aanwezigheid van getransduceerde cellen kon aangetoond worden na isolatie en verdere ex vivo beeldvorming van de drainerende lymfeknoop van muizen geïnjecteerd in de voetzool, maar niet in de staartbasis. Om de tsred FLuc+ cellen aanwezig in de lymfeknoop van sc (voetzool) en intranodaal geïnjecteerde muizen verder te analyseren werden de geïsoleerde lymfeknopen herleid tot een celsuspensie die in flow cytometrie werd geëvalueerd voor de aanwezigheid van eGFP + (tsred FLuc-Ires-eGFP) cellen. Ondanks het duidelijke tsred FLuc signaal en desgevolgend LVgetransduceerde cellen, zijn we er niet in geslaagd om deze op overtuigende wijze in flow cytometrie aan te tonen (Fig. 21c).
30
Resultaten
Fig. 21 In vivo bioluminescentie beeldvorming van sc en intranodaal geïnjecteerde C57BL/6 muizen. In (a) worden de overlays van de beeldvorming van muizen geïnjecteerd met LVs t.h.v. de staartbasis (links), voetzool (midden) of inguinale lymfeknoop (rechts) getoond. De getoonde foto’s zijn representatief voor 4 (sc) en 2 (intranodaal) muizen. In (b) worden de lymfeknopen van muizen geïnjecteerd t.h.v. de voetzool met ofwel vehikel (PBS) ofwel LVs getoond na resectie en daaropvolgende beeldvorming. De flow cytometrie grafieken in (c) tonen de expressie van eGFP in de CD11c populatie van de lymfeknoop geïsoleerd van muizen geïnjecteerd t.h.v. de voetzool met ofwel vehikel (PBS) ofwel LVs. De data in (b) en (c) zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten met telkens twee muizen per groep.
Op basis van deze experimenten werd besloten om na te gaan of tVSV.G gepseudotypeerde LVs die verder het Nb BCII10 bevatten na sc voetzool of intranodale injectie aanleiding geven tot een tsred FLuc signaal, om het gebruik van LVs gepseudotypeerd met dit Nb als negatieve controle te evalueren. In deze experimenten werden muizen geïnjecteerd met vehikel of breed topisme LVs aangewend als respectievelijk negatieve en positieve controle (n = 2, aantal muizen per experiment is 2 per groep). Opnieuw was er een duidelijk tsred FLuc signaal t.h.v. de voetzool en lymfeknoop na sc voetzool injectie en t.h.v. de inguinale lymfeknoop na intranodale injectie van VSV.G gepseudotypeerde LVs. Na injectie met tVSV.G/BCII10 LVs werd geen bioluminiscentie gemeten. Dit suggereert dat er geen cellen werden getransduceerd in vivo (data niet getoond), wat de reeds bestaande in vitro data zou bevestigen. In het volgende experiment werd besloten om breed tropsime, niet gerichte (tVSV.G/BCII10) en gerichte (tVSV.G/DC2.1) LVs met elkaar te vergelijken. Hiervoor werden 3 x 107 TU van de respectievelijke LVs sc in de voetzool geïnjecteerd (n = 1, aantal muizen per groep is 2). Zesendertig uur later werd de biodistributie van deze LVs met behulp van in vivo bioluminiscentie beeldvorming nagegaan. Analoog aan het voorgaande experiment gaven de negatieve controles, zijnde muizen geïnjecteerd met vehikel of tVSV.G/BCII10 LVs, geen signaal (Fig. 22). Opnieuw was er een duidelijk signaal t.h.v. de voetzool (Fig. 22a) en de lymfeknoop (Fig. 22b) bij de muizen geïnjecteerd met VSV.G gepseudotypeerde LVs. Er was geen bioluminiscentie waarneembaar, noch t.h.v. de injectiesite, noch t.h.v. de drainerende lymfeknoop na administratie van gerichte, meerbepaald tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs (Fig. 22). Dit laatste is tegenstrijdig met de bekomen in vitro data.
31
Resultaten Verschillende verklaringen zijn mogelijk voor dit resultaat: (1) er werden in vivo geen cellen getransduceerd door de tVSV.G/DC2.1 LVs, wat zou betekenen dat de voorgestelde strategie niet werkt of (2) er werden wel cellen getransduceerd, maar aan een te lage efficiëntie om met deze techniek te kunnen visualizeren. Rekening houdend met de bestaande in vitro data (Fig. 11 en 20) lijkt deze laatste verklaring het meest plausibel en dienen we dus naar een alternatief te zoeken om in vivo getransduceerde cellen op te sporen.
Fig. 22 In vivo bioluminescentie beeldvorming na sc, voetzool injectie van vehikel (PBS), breed tropisme (VSV.G), niet gerichte (tVSV.G/BCII10) en gerichte (tVSV.G/DC2.1) LVs in C57BL/6 muizen. De foto’s in (a) tonen de overlay tussen de zwart-wit foto van de respectievelijke muizen en het foton emissie beeld. In (b) wordt de luminiscentie van de geïsoleerde en met D-luciferine geïnjecteerde lymfeknopen getoond. Deze data zijn afkomstig van 1 experiment, waarin telkens twee muizen per groep werden behandeld.
3.2. Opsporen van in situ lentiviraal getransduceerde cellen De negatieve beeldvormings- en flow cytometrische resultaten uit voorgaande experimenten, hebben er ons toe aangezet om een alternatief te zoeken om in situ getransduceerde cellen op te sporen. Er werd reeds eerder beschreven dat in vivo getransduceerde CD11c+ cellen kunnen opgespoord worden met behulp van flow cytometrie wanneer het transgen Thy1.1 wordt gebruikt als reporter in C57BL/6, Thy1.2 muizen (Breckpot et al., 2010). Daarom werden in eerste instantie C57BL/6 Thy1.2 muizen sc t.h.v. de staartbasis geïnjecteerd met 1 x 107 TU Thy1.1 coderende, VSV.G gepseudotypeerde LVs of als controle met vehikel (PBS met 10 µg/µl PS) zoals beschreven door Breckpot et al (Breckpot et al., 2010) (n = 1, drie muizen per groep). Na 36 uur werden de inguinale en mesenteriale lymfeknopen geïsoleerd, per groep samengevoegd en herleid tot een celsuspensie. Vervolgens werden de CD11c+ cellen gesorteerd, waarna de CD11c- en CD11c+ fractie werd geëvalueerd voor de aanwezigheid van Thy1.1+ cellen.
32
Resultaten De CD11c+ cellen verkregen uit de lymfeknoop van vehikel behandelde muizen vertoonden een laag, maar verwaarloosbaar signaal voor Thy1.1 (Fig. 23). De CD11c+ cellen uit de lymfeknopen van muizen die VSV.G gepseudotypeerde, Thy1.1 coderende LVs hadden gekregen, toonden een kleine populatie Thy1.1+ cellen (Fig. 23a), die in de grootteorde van de bovenvermelde studie lag (Breckpot et al., 2010). Daarnaast werd in de CD11c- celfractie eveneens een klein percentage Thy1.1+ cellen aangetoond (Fig. 23b).
Fig. 23 Flow cytometrische analyse van lymfeknoop afgeleide celsuspensies na sc (staartbasis) injectie met VSV.G gepseudotypeerde LVs, coderend voor Thy1.1. De flow cytometrie grafieken in (a) tonen de Thy1.1 positiviteit (y-as) van de CD11c+ cellen (x-as), waar deze in (b) de Thy1.1 positiviteit (y-as) van de CD11c- cellen (x-as) toont. De resultaten zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten.
Tenslotte werd nagegaan of we in vivo getransduceerde cellen konden terugvinden na directe toediening van tVSV.G/BCII10 en tVSV.G/DC2.1 LVs. Hierbij werden C57BL/6 Thy1.2 muizen sc t.h.v. de staartbasis geïnjecteerd met 3 x 107 TU Thy1.1 coderende, breed tropisme (VSV.G, positieve controle), niet gerichte (tVSV.G/BCII10, negatieve controle) en gerichte LVs (tVSV.G/DC2.1) of vehikel (negatieve controle) zoals hierboven beschreven (n = 1, twee muizen per groep). Na 36 uur werden de inguinale en mesenteriale lymfeknopen geïsoleerd. Opmerkelijk hierbij was de significante vergroting van deze lymfeknopen bij de muizen geïnjecteerd met VSV.G en tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs. Per groep werden de lymfeknopen vervolgens samengevoegd, herleid tot een celsuspensie en aan een telling onderworpen. Ook hieruit bleek gemiddeld een drievoudige stijging van het aantal cellen in de lymfeknopen van de muizen behandeld met VSV.G en tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs in vergelijk met deze behandeld met PBS of de tVSV.G/BCII10 bevattende LV wat suggereert dat LV administratie van de twee eerstgenoemden en niet de laatstgenoemde, de migratie van DCs en/of proliferatie van lymfocyten in de drainerende lymfeknopen stimuleert. Vervolgens werden de CD11c+ cellen aangerijkt, waarna de CD11c- en CD11c+ fractie werd geëvalueerd voor de aanwezigheid van Thy1.1+ cellen. Zowel de CD11c+ als CD11c- cellen verkregen uit de lymfeknopen van vehikel behandelde muizen getuigden van een zeer laag tot onbestaand Thy1.1+ signaal (Fig. 24). Deze lage percentages lagen bovendien in dezelfde grootteorde van de Thy1.1+ percentages in de CD11c+ en CD11c- fracties uit de lymfeknopen van muizen geïnjecteerd met tVSV.G/BCII10 gepseudotypeerde LVs. Deze transductiepatronen van beide negatieve controles stemmen overeen met de in vivo bioluminescentie data.
33
Resultaten In tegenstelling tot deze negatieve controles vertoonde de CD11c+ celfractie uit de regionale lymfeknopen van VSV.G gepseudotypeerde LVs een duidelijk percentage Thy1.1+ cellen (4,1%), dat beduidend hoger lag dan dat van voorgaand experiment (0,7%, Fig. 23). De verklaring hiervoor is dat voor dit experiment een drie maal hogere LV dosis geïnjecteerd werd t.o.v. het voorgaande experiment. De CD11c- fractie uit de regionale lymfeknopen van deze muizen vertoonde echter een vergelijkbaar percentage Thy1.1+. Tot slot konden we in de CD11c+ celfractie van muizen geïnjecteerd met de DC-gerichte tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs een duidelijke fractie Thy1.1+ cellen (2%) aantonen, wat in vivo DCspecificiteit impliceert (Fig. 24). Bovendien bleek het percentage Thy1.1+ cellen in de CD11cfractie in vergelijking met deze van muizen behandeld met de VSV.G gepseudotypeerde LVs half zo laag, wat een eerste aanwijzing vormt voor hun beperkt maar gericht tropisme.
Fig. 24 Flow cytometrische analyse van lymfeknoop afgeleide celsuspensies na sc (staartbasis) injectie met VSV.G gepseudotypeerde LVs, coderend voor Thy1.1. De flow cytometrie grafieken in (a) tonen de Thy1.1 positiviteit (y-as) van de CD11c+ cellen (x-as), waar deze in (b) de Thy1.1 positiviteit (y-as) van de CD11c- cellen (x-as) toont.
Vervolgens werden de cellen van de CD11c- fractie aangekleurd met het anti-Thy1.1, een anti-B220 en anti-F4/80 antilichaam. Flow cytometrie werd gebruikt om deze stalen te evalueren. Een aspecifiek signaal voor Thy1.1 werd waargenomen bij de kleuring van B220+ cellen (ongeveer 1% van de B220+ cellen verkregen van de lymfeknoop van vehikel geïmmuniseerde muizen). Eenzelfde Thy1.1 positiviteit werd waargenomen in de B220+ celfractie verkregen van lymfeknopen van muizen geïmmuniseerd met tVSV.G/BCII10 of tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs. Daar dit signaal als achtergrond of aspecifieke kleuring wordt beschouwd, suggereren deze data dat de LVs niet in staat zijn om B220+ cellen te transduceren. Dit confirmeert tevens de voorgaande in vitro data. Belangrijk is te benadrukken dat VSV.G gepseudotypeerde LVs wel in staat zijn om deze cellen in situ te transduceren (Fig. 25).
34
Resultaten
Fig. 25 Flow cytometrische analyse van lymfeknoop afgeleide celsuspensies na sc (staartbasis) injectie met VSV.G gepseudotypeerde LVs, coderend voor Thy1.1. De flow cytometrie grafieken in het bovenste panel tonen de Thy1.1 positiviteit (y-as) van de B220+ cellen (x-as), waar deze in het onderste panel de Thy1.1 positiviteit (y-as) van de F4/80+ cellen (x-as) toont.
Analyse van de F4/80+ cellen toonde een kleine populatie getransduceerde cellen in de celfracties verkregen van de lymfeknoop van muizen geïnjecteerd met breed tropisme en tVSV.G/DC2.1 LVs. Dergelijke Thy1.1+ F4/80+ cellen werden niet teruggevonden in de PBS geïnjecteerde muizen of muizen geïmmuniseerd met tVSV.G/BCII10 LVs. Deze data zijn een eerste aanwijzing dat de LVs gepseudotypeerd met tVSV.G in combinatie met het Nb DC2.1 in situ dezelfde celpopulaties transduceren als in vitro, namelijk CD11c+ (DCs) en F4/80+ cellen (macrofagen).
35
Discussie
Discussie Er werd reeds door verschillende onderzoeksgroepen aangetoond in verscheidene muismodellen (Chapatte et al., 2006; Dullaers et al., 2006; Esslinger et al., 2003) dat LVs interessante kandidaten zijn voor de ontwikkeling van een vigoureus antitumor vaccin. De vertaling van deze muis data naar een humane setting, vereist de verdere ontwikkeling van LVs. Deze ontwikkeling behelst tenminste drie aspecten: (1) verhoging van de productie efficiëntie, (2) LV-bioveiligheid en tenslotte (3) inductie van een efficiënte antitumor immuunrespons, dit na in situ transductie van DCs voor de aflevering van TAAs en activatie signalen (Breckpot et al., 2007a). In deze thesis kwamen de eerste twee aspecten aan bod. (1) Productie efficiëntie. Voor kleinschalige LV-producties worden meestal 293T cellen transiënt gecotransfecteerd met plasmiden coderend voor enerzijds de virale enzymen, structurele proteïnen en envelop en anderzijds een transferplasmide naar keuze (Dull et al., 1998; Esslinger et al., 2003; Palmowski et al., 2004). Ook tijdens dit project zijn we voor alle LV-producties op deze manier te werk gegaan waarbij in totaal vier verschillende transferplasmiden werden aangewend, meer bepaald coderend voor: (1) tsred FLuc alsook eGFP (tsred FLuc-Ires-eGFP), (2) Ires-eGFP, (3) eGFP en tenslotte (4) Thy1.1 (Fig. 14). Deze plasmiden werden gecontroleerd en als betrouwbare reportersystemen bevonden voor de geplande LV-gebaseerde experimenten (Fig. 12, 15 en 16). Omdat LV producties met verschillende chemische transfectiemethoden kunnen uitgevoerd worden, is het belangrijk om na te gaan welke methode zich het beste leent voor grootschalige producties, vereist voor in vivo toepassingen in diermodellen en kliniek. We vergeleken de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie met de FuGENE®-gebaseerde lipofectie voor de productie van VSV.G gepseudotypeerde, eGFP coderende LVs. Ondanks veelvuldig vergelijk van deze methoden in het verleden kon hieruit immers geen éénduidig besluit getrokken worden (Jiang et al., 1991; Kott et al., 1998; Thompson et al., 1999). We observeerden in de Ca3-(PO4)2DNA getransfecteerde 293T cellen niet alleen een hoger percentage eGFP+ cellen, maar ook een hogere fluorescentie intensiteit per cel (Fig. 12). Daarenboven lagen de titers van de LVstocks gemiddeld 10 maal hoger bij de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie vergeleken met de FuGENE®-gebaseerde lipofectie (Fig. 13). Opmerkelijk is wel de waargenomen inter-assay variatie van de eerstgenoemde methode. Deze variatie werd eerder beschreven door Thompson et al en kan aldus als een inerte eigenschap van de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie beschouwd worden (Thompson et al., 1999). Tot slot werd een kostenraming gemaakt van beide protocols die aantoont dat ondanks het groot verbruik aan DNA en slechts twee collecties (i.p.v. drie voor de FuGENE®-gebaseerde lipofectie), de Ca3-(PO4)2-DNA transfectie met een kostprijs van 4 euro per 107 TU, 100 maal goedkoper is dan FuGENE®gebaseerde lipofectie (Tabel 2). Vandaag worden reeds pokkenvirus afgeleide TAAcoderende virale vectoren (ALVAC) uitgetest in klinische trials voor de behandeling van kanker. Hieruit blijkt dat herhaalde vaccinatie (drie tot zeven injecties) met 0,5 x 107 tot 1 x 109 TU een antitumor immuunrespons induceert (Astsaturov et al., 2003; Kantoff et al.; Spaner et al., 2006). Gebaseerd op deze dosis, de inductie van antitumor immuniteit en voorgaande kostenraming, zou de aanmaak van een LV-vaccin, gerekend op vijf injecties van 3 x 108 TU per vaccinatie slechts 600 euro bedragen in vergelijk met 10.000 euro voor een DC-gebaseerde cellulaire antikanker therapie (persoonlijke communicatie J. Corthals, Vrije Universiteit Brussel). We kunnen besluiten dat ondanks de inter-assay variatie, de Ca3-(PO4)2DNA transfectie methode het meest geschikt lijkt voor grootschalige LV producties.
36
Discussie Omdat deze methode gevoelig is aan de hoeveelheid te transfecteren DNA, werd verder nagegaan of de productie van LVs gepseudotypeerd met tVSV.G in combinatie met een Nb, welke steunt op een vier plasmide transfectie, even efficiënt verloopt als de productie van breed tropisme (VSV.G) LVs, welke gebaseerd is op een drie plasmide transfectie. We observeerden dat de LVs gepseudotypeerd met VSV.G een vier maal hogere opbrengst gaven in vergelijking met de LVs gespeudotypeerd met tVSV.G en een Nb, waarbij het gebruikte Nb geen beduidend effect had op deze resultaten. Dit resultaat is waarschijnlijk te wijten aan de transfectiemethode, daar voordien werd aangetoond dat de lipofectie-gebaseerde productie van tVSV.G/Nb gepseudotypeerde LVs in hoge titers resulteerde, die vergelijkbaar waren met de titers bekomen met breed tropisme LVs (persoonlijke communicatie K. Breckpot, Vrije Universiteit Brussel). Daarnaast werd het aangewende tVSV.G beschreven door Whitt et al, die aantoonden dat de tVSV.G dient te bestaan uit enerzijds een natief transmembranaircytoplasmatisch domein en anderzijds een extracellulair membraan-proximaal gedeelte van minstens 42 aminozuren (het ‘budding’ domein) om LV-opbrengsten te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met de VSV.G gepseudotypeerde LV-levels (Jeetendra et al., 2002; Robison & Whitt, 2000). Er dient vermeld te worden dat wanneer Zhang et al dit tVSV.G construct aanwendden voor de productie van LVs gericht naar c-kit+ cellen, zij eveneens lage titers aan tVSV.G bevattende LV-partikels verkregen (Zhang et al., 2010). Dit werd deels toegeschreven aan hemifusie, waarbij syncytia gevormd worden tussen de celmembranen van de tVSV.G expresserende productiecellijnen. Zij maakten echter ook gebruik van de Ca3(PO4)2-transfectie methode voor de inbreng van vier plasmiden in 293T productiecellen. De lage opbrengsten van tVSV.G/Nb gepseudotypeerde LVs vormden een knelpunt in de vooruitgang van dit project en belemmert ook het gebruik van deze methode voor grootschalige LV-producties. Om dit probleem te omzeilen zal in de toekomst voor de verschillende Nbs een stabiele Nb-expresserende productiecellijn gegenereerd worden. Stabiele cellijnen, waarbij bijvoorbeeld de gag/pol genen of het VSV.G coderend construct stabiel uitgedrukt werden met behulp van een induceerbaar doxycycline expressiesysteem, werden in het verleden al aangewend om de LV-producties op te krikken (Klages et al., 2000). Het gebruik van een induceerbaar systeem is nuttig wanneer de constante expressie van het transgen toxisch is voor de cel. We verwachten echter dat de Nbs weinig schadelijk zijn voor de productiecellen en aldus geen represseerbaar expressiesysteem vereisen, wat de ontwikkeling van een stabiele Nb-expresserende cellijn vergemakkelijkt. (2) Bioveiligheid en LV-vaccin werking. De tot nu toe gebruikte LVs hebben een breed infectiepatroon. In verscheidene studies werd aangetoond dat directe administratie van dergelijke LVs, hetzij iv, hetzij sc resulteert in de transductie van antigen presenterende cellen, alsook keratinocyten, hepatocyten en andere (Breckpot et al., 2008; He et al., 2006; VandenDriessche et al., 2002). Dit brengt twee aandachtspunten met zich mee, enerzijds het risico op insertionele mutagenese van permanent gemodificeerde en langlevende celtypes en anderzijds de kans dat niet antigen presenterende cellen het TAA (transgen) zullen uitdrukken en aldus kunnen interfereren met de gewenste antitumor immuunrespons. Daarom wordt in het kader van bioveiligheid en LV-werking gezocht naar manieren om LVs specifiek te richten naar DCs (eventueel macrofagen), daar dit cellen zijn met een relatief kort half leven, wat resulteert in snelle klaring van LVs. Verder worden DCs beschouwd als een natuurlijk adjuvant en zijn ze dus uitermate geschikt om een TAA-specifieke immuunrespons op te wekken (Lopes et al., 2008; Yang et al., 2008).
37
Discussie Het transductiepatroon van de LVs gepseudotypeerd met het breed tropisme VSV.G, met het bindinsdefectieve tVSV.G in combinatie met het ß-lactamase specifieke Nb BCII10 en met tVSV.G gecombineerd met DC-specifieke Nbs DC1.8 of DC2.1, werd in voorgaand onderzoek geëvalueerd op in vitro gegenereerde cellen. Hieruit bleek dat de LVs, gepseudotypeerd met tVSV.G en het Nb DC1.8 enkel DCs transduceren, waar deze die het Nb DC2.1 bevatten ook macrofagen kunnen transduceren. Om het potentieel van DC-gerichte LVs verder in vitro te evalueren, werden tijdens dit project vers geïsoleerde primaire miltcellen van Flt3-L voorbehandelde C57Bl/6 muizen getransduceerd met eGFP coderende VSV.G, tVSV.G/BCII10 of tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeeerde LVs (Fig. 19). Uit de daaropvolgende flow cytometrische analyse bleken de breed tropisme LVs in staat om de geëvalueerde celtypes, zijnde DCs, B en T cellen alsook macrofagen te transduceren (Fig. 20). Zoals verwacht bleken de LVs gepseudotypeerd met tVSV.G/BCII10 hier niet toe in staat. De met Nb DC2.1 gerichte LVs waren daarentegen wel in staat om miltcellen te transduceren, meerbepaald DCs en macrofagen, maar geen B of T cellen. Opmerkelijk is wel het hoge percentage getransduceerde F4/80+ getransduceerde macrofagen in vergelijking met dat van de DCs, wat overeenstemt met voorgaande in vitro resultaten met gegeneereerde muis DCs en de RAW264.7 cellijn (Fig. 11). Deze bevindingen wijzen erop dat tVSV.G met Nb DC2.1 gepseudotypeerde LVs in staat zijn om specifiek DCs en macrofagen te transduceren, in tegenstelling tot de breed tropisme VSV.G gepseudotypeerde LVs. Verder vormen deze in vitro data een eerste aanwijzing van hun in vivo potentieel als veilige vaccins. Om de biodistributie van de LVs na directe administratie na te gaan werd gebruik gemaakt van enerzijds in vivo bioluminescentie beeldvorming na injectie van tsred FLuc-Ires-eGFP coderende LVs en anderzijds flow cytometrie (eGFP) op de celsuspensies van de drainerende lymfeknoop, daar eerder werd aangetoond dat getransduceerde DCs migreren naar deze site (Breckpot et al., 2010). Samengevat toonden we aan dat sc injectie van breed tropisme LVs in de voetzool of staartbasis resulteerde in een hoge foton emissie t.h.v. de injectie site (Fig. 21 en 22). Dit was een eerste aanwijzing voor het aspecifieke infectie karakter van deze LVs. Slechts injectie in de voetzool of intranodaal resulteerde in een duidelijk signaal t.h.v. de lymfeknoop. We zijn er echter niet in geslaagd om met behulp van flow cytometrie op overtuigende wijze de aanwezigheid van getransduceerde cellen in deze lymfeknopen aan te tonen (Fig. 21c). Directe toediening van tVSV.G/Nb gepseudotypeerde LVs resulteerde niet in foton emissie, noch na injectie van tVSV.G/BCII10, noch na injectie van tVSV.G/DC2.1 bevattende LVs (Fig. 22). Dit resultaat kan twee oorzaken hebben: (1) de aangewende technieken zijn niet gevoelig genoeg om de getransduceerde cellen t.h.v. de injectieplaats en regionale lymfeknoop te detecteren of (2) de ontwikkelde DC-gerichte LVs blijken in vivo geen aanleiding te geven tot infectie van DCs of macrofagen, in tegenstelling tot wat de gegenereerde in vitro data impliceren. Tot op heden is alleen de groep van Yang et al er in geslaagd om DC-specifieke transductie in vivo aan te tonen. Zij slaagden erin om na directe administratie van eGFP coderende LVs gepseudotypeerd met een gemuteerde versie van het sindbis glycoproteïne (bindt hierdoor enkel nog op DC-SIGN) eGFP+ DCs in de lymfeknoop celsuspensie aan te tonen met behulp van flow cytometrie. Ook zij hebben getracht om in vivo bioluminiscentie beeldvorming aan te wenden als middel om de LV-biodistributie na te gaan. Net als wij, slaagden zij erin om met VSV.G gepseudotypeerde LVs t.h.v. de injectiesite en lymfeknoop getransduceerde (FLuc) cellen aan te tonen. Echter, deze strategie bleek onsuccesvol voor het opsporen van in situ getransduceerde cellen na injectie van DCspecifieke LVs. Dit werd toegeschreven aan de dunbezaaide distributie van de DCs welke
38
Discussie buiten de gevoeligheid van de huidige bioluminescentie methode ligt (Yang et al., 2008). Om deze strategie te optimaliseren, zou in de toekomst gebruik gemaakt kunnen worden van LVs die coderen voor de laatste nieuwe generatie van luciferases namelijk het ‘enhanced FLuc’ (gecodeerd door het Luc2 gen) (Promega, 2007). Deze variant werd beschreven door Kim et al als een geoptimaliseerd reportersysteem om de expressie in zoogdiercellen beter te visualiseren doordat een viervoudige stijging van licht emissie door middel van codon optimalisatie en verwijdering van potentiële transcriptiefactor bindingsplaatsen gegarandeerd wordt (Kim et al., 2010). Gebaseerd op de bevindingen van Yang et al en onze eigen negatieve beeldvormings- en flow cytometrische resultaten, werd besloten om de DC-gericht transductie in vivo op alternatieve wijze aan te tonen. Breckpot et al beschreven eerder dat de reporter Thy1.1 toelaat in vivo getransduceerde CD11c+ cellen te evalueren in Thy1.2 C57BL/6 muizen met behulp van flow cytometrie (Breckpot et al., 2010). Na enige optimalisatie, werden de verschillend gepseudotypeerde LVs analoog aan bovenbeschreven studie sc t.h.v. de staartbasis geinjecteerd om vervolgens 36 uur later de inguinale en mesenteriale lymfeknopen te isoleren en de afgeleide celsuspensies in flow cytometrie te evalueren. Preliminaire data tonen aan dat VSV.G gepseudotypeerde LVs in staat zijn om DCs, B cellen en macrofagen te transduceren, waar de tVSV.G/BCII10 LVs dit niet kunnen. Hoewel kleinere percentages getransduceerde cellen werden geobserveerd na injectie met tVSV.G/DC2.1 gepseudotypeerde LVs, zien we toch een fractie Thy1.1+ DCs en macrofagen, maar geen Thy1.1+ B cellen (Fig. 24 en 25). Deze eerste data bevestigen onze in vitro data en geven aanleiding tot voorzichtig optimisme dat de LVs gepseudotypeerd met tVSV.G en Nb DC2.1 in staat zijn om in vivo specifiek DCs en macrofagen te transduceren. Deze experimenten moeten echter herhaald worden om de reproduceerbaarheid ervan aan te tonen. Verder worden in vivo experimenten gepland met Thy1.1 coderende tVSV.G/DC1.8 gepseudotypeerde LVs omdat voorgaande in vitro data aangeven dat deze enkel DCs transduceren. Daarnaast is het van belang om de getransduceerde celtypes in meer detail te fenotyperen. Recent, werd beschreven dat Nb DC2.1 CD11c+ en CD11b+ miltcellen bindt, waar Nb DC1.8 enkel CD11c+ miltcellen bindt. Daarnaast werd na directe injectie van deze Nbs in de huid aangetoond dat het voornoemde Nb co-lokaliseert met dermale macrofagen, gedefinieerd als CD11b+ en MGL+, waar Nb DC1.8 co-lokaliseert met dermale DCs, gedefinieerd als CD11c+ Langerin+ en MGL- (De Groeve et al., 2010). Daar er nog steeds controverse heerst rond welke (dermale) antigen presenterende cellen een rol spelen in de inductie van CTL responsen na intradermale vaccinatie met lentivirale vectoren (Furmanov et al., 2010; He & Falo, 2006; He et al., 2006) zouden DC1.8 of DC2.1 gerichte LVs, indien zij inderdaad verschillende celtypes transduceren een waardevol hulpmiddel zijn om dit verder te bestuderen. Dit brengt ons tot het laatste, maar wel zeer belangrijk aandachtspunt in de optimalisatie van LVgebaseerde antitumor vaccins, namelijk hun capaciteit om een CTL respons op te wekken. (3) De efficiëntie van het LV-vaccin om een CTL respons op te wekken. Onze preliminaire data suggereren dat breed tropisme LVs efficiënter DCs transduceren dan de DC2.1-gerichte LVs. Desondanks, mogen hieruit geen voorbarige conclusies getrokken worden omtrent hun potentieel om ook een efficiëntere immuunrespons te genereren. Het brede tropisme van de eerstgenoemde LVs zorgt immers voor de transductie van heel wat niet antigen presenterende cellen wat zowel op een positieve (door kruispresentatie) als negatieve manier (via inductie van tolerantie) de immuunrespons kan beïnvloeden. Daarom is het belangrijk om in de
39
Discussie toekomst ook het immunogene potentieel van de Nb DC1.8 als Nb DC2.1-bevattende LVs te vergelijken met elkaar en met dat van de breed tropisme LVs. Zoals bovenvermeld binden Nb DC1.8 en DC2.1 verschillende celtypes in de dermis. Hoewel algemeen geweten is dat huid afgeleide DCs in staat zijn om verwerkte antigenen rechtstreeks te presenteren aan CD8+ T cellen na intradermale injectie met LVs, blijkt de bijdrage van de verschillende huid DC subtypes en zelfs antigen presenterende cellen in het algemeen (dermale macrofagen) in dit proces onduidelijk. Recent werd aangetoond dat in afwezigheid van Langerin+ DCs nog steeds een efficiënte CD8+ T cel respons gegenereerd kon worden en dat de migratie van Langerin- dermale DCs naar de regionale lymfeknopen zes maal hoger ligt dan deze van de Langerin+ dermale DCs (Furmanov et al., 2010). Dit suggereert dat de doelwitcel van de tVSV.G/DC1.8 gepseudotypeerde LV, de Langerin+ dermale DC, slechts een beperkte rol speelt in het opwekken van een vaccin-gemedieerde immuunrespons. Dit benadrukt het belang van (1) het opsporen en gedetailleerd fenotyperen van de in situ getransduceerde cellen, niet alleen wat betreft celtype, maar ook hun activatie en (2) het evalueren van een antigen specifieke immuunrespons, preferentieel gebruik makend van een relevant TAA zoals TRP-2. Hierbij is het van belang na te gaan in welke mate de getransduceerde celtypes CTLs en CD4+ Th1 cellen opwekken en tevens de immuunsuppressieve mechanismen van onder andere Treg omzeilen en ze aldus kunnen bijdragen aan de rejectie van tumorcellen.
40
Conclusie
Conclusie De preliminaire data beschreven in deze thesis suggereren dat LVs die op hun viraal oppervlak het tVSV.G en Nb DC2.1 bevatten, specifiek DCs en macrofagen, maar niet T of B cellen transduceren en dit zowel in vitro als in vivo. Deze data vormen een eerste bewijs dat Nbs kunnen aangewend worden om LVs gepseudotypeerd met tVSV.G naar specifieke celtypes te richten, wat mogelijkheden biedt voor celspecifieke in vivo diagnostiek. In het specifieke geval van DC-gerichte LVs, kunnen we stellen dat deze enerzijds een stap voorwaarts zijn in de ontwikkeling van een klinisch toepasbaar LV-gebaseerd antikanker vaccin en dat deze anderzijds een uitstekend middel vormen om immunologische processen, zoals de rol van DC subtypes en kruispresentatie in het opwekken van een transgen specifieke immuunrespons, te bestuderen.
41
Materialen en methoden
Materialen en methoden 1. Lentivirale vector productie (I) De LV-productie cellijn. 293T cellen zijn humane embryonale niercellen die makkelijk transfecteerbaar zijn. Daarom werden ze aangewend voor LV-productie. De 293T cellijn, verkregen van Prof. Dr. M. Collins (University College London, Verenigd Koninkrijk), werd onderhouden in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Lonza) waaraan 10% hitte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (Biochrom AG), 100 U/ml penicilline, 100 µg/ml streptomycine en 2 mM L-glutamine (Lonza) werd toegevoegd (DMEM+). De cellen werden drie maal per week uitgezaaid en geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 (bijlagen I en II). (II) Plasmiden. Het inpakplasmide pCMV∆R8.9 dat codeert voor de structurele proteïnes en virale enzymen, evenals het VSV.G coderende plasmide pMD.G werden verkregen van Dr. D. Trono (University of Geneva, Zwitserland). Het tVSV.G coderende plasmide pUB6 tVSV.G was een gift van Dr. J. Reiser (Lousiana State University, Verenigde Staten). De plasmiden die coderen voor de membraangebonden Nbs, pDISPLAY-DC1.8, pDISPLAYDC2.1 en pDISPLAY-BCII10, werden verkregen van Dr. K. De Groeve (Vrije Universiteit Brussel, België). De SIN transferplasmiden pASIET en pASIET red shifted thermostabiel Firefly Luciferase (tsred FLuc) bevatten naast twee LTRs en een inpaksignaal, een expressiecassette waarin de CMV promoter de expressie van respectievelijk Ires-eGFP en tsred FLuc-Ires-eGFP drijft. Deze plasmides werden verkregen van T. Bos (Vrije Universiteit Brussel). De SIN transferplasmiden pHR’ trip CMVeGFP SIN en pSIN Thy1.1 bevatten een expressiecassette waarin de expressie van eGFP of Thy1.1 onder de controle van respectievelijk de CMV of SFFV promoter staat. Deze werden eerder beschreven (Breckpot et al., 2003; Breckpot et al., 2010). De verschillende transferplasmiden werden gecontroleerd op respectievelijk de expressie van Ires-eGFP, tsred FLuc-Ires-eGFP, eGFP en Thy1.1. Hiervoor werden LVs geproduceerd met de verschillende transferplasmiden, die vervolgens werden gebruikt om 293T cellen te transduceren. Twee dagen na transductie werden de 293T cellen losgespoten en gecontroleerd op de expressie van eGFP of Thy1.1 via flow cytometrie. Voor de controle van tsred FLuc expressie werden de cellen overgebracht naar een epje met 100 µl lysebuffer. Na 15 minuten werd vanuit dit epje dan 20 µl overgebracht naar een 96-well plaat waaraan nog 80 µl D-luciferine (Luciferase Assay System, Promega) werd toegevoegd. Onmiddellijk daarna kon dan de hoeveelheid uitgezonden licht uitgedrukt in RLU, gemeten worden met de luminometer (PerkinElmer 1420 Multilabel Counter Vortex3™) en geanalyseerd worden met de ‘Wallac 1420 Manager’ software. (III) Transfectiemethoden. 293T cellen werden 24 uur na uitplaten getransfecteerd met een transferplasmide, inpakplasmide en een envelop coderend plasmide, al dan niet samen met een Nb-coderend plasmide door middel van Ca3-(PO4)2-DNA transfectie (SIGMAALDRICH) of FuGENE®-gebaseerde lipofectie (Roche Diagnostics). Beide protocols werden uitvoerig beschreven in Breckpot et al (Breckpot et al., 2010) alsook in bijlagen III en IV. Na opname van de verschillende plasmiden door de 293T cellen, worden LVs aangemaakt die via ‘budding’ de productiecel verlaten. Het virushoudend cultuurmedium werd op verschillende tijdstippen na transfectie gecollecteerd en bewaard bij -80°C tot verder gebruik. Na de laatste LV-collectie werden de 293T cellen geoogst, gewassen en vervolgens door middel van flow cytometrie geëvalueerd voor de expressie van het ingebrachte transgen (transfectie efficiëntie).
42
Materialen en methoden (IV) Concentratie van de LVs. Het virushoudend supernatant werd 0,22 µm gefilterd (Millipore) en gedurende 12 tot 16 uur gecentrifugeerd bij 4°C aan 4000 ‘revolutions per minute’ (rpm) in de ‘Eppendorf centrifuge 5810 R’ waarna het supernatant werd verwijderd en de LV-pellet opgelost in ‘phosphate buffered saline’ (PBS, Lonza) waaraan 10 µg/ml protamine sulfaat (PS, LEO Pharma) werd toegevoegd (bijlage V). De virale stock werd 400 tot 1000 maal geconcentreerd. Aliqouts van de LVs werden bewaard bij -80°C. (V) Karakterisatie van de LVs. VSV.G gepseudotypeerde LVs werden op twee verschillende wijzen gekarakteriseerd. Enerzijds werden 293T cellen getransduceerd met een seriële verdunningsreeks van de LVs waarna de cellen gedurende twee dagen werden geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 (bijlage VIa). Nadien werden de 293T cellen geoogst, gewassen en werd met behulp van flow cytometrie bepaald wat het percentage transgen+ cellen bedroeg. Dit percentage laat toe het aantal TU per ml virale stock te bepalen. Hiervoor werd volgende formule gebruikt: aantal getransduceerde 293T cellen x het percentage transgen+ cellen x verdunningsfactor transductie volume x 100
Anderzijds werd de RT activiteit van de LVs bepaald als maat voor het aantal LVs per ml virale stock. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de ‘Reverse Transcriptase assay’ (Roche Applied Bioscience) (bijlage VIb). Deze immuunassay laat een kwantitatieve bepaling van de lentivirale RT activiteit toe die verantwoordelijk is voor de incorporatie van digoxigenine- en biotine-geconjugeerde deoxyuridine trifosfaat moleculen (dUTPs) in één en dezelfde DNA molecule. De detectie en kwantificatie van het gesynthetiseerde DNA als parameter van de RT activiteit wordt bepaald door middel van een ‘enzyme-linked immunosorbent assay’ (ELISA). Het aantal TU/ml werd vervolgens gelinkt aan de hoeveelheid RT uitgedrukt in ng/ml (gemiddeld komt 1 ng overeen met 5 x 104 TU). Deze assay werd tevens uitgevoerd voor de karakterisatie van tVSV.G gepseudotypeerde LVs.
2. Evaluatie van het transductiepatroon van breed tropisme en gerichte lentivirale vectoren in vitro (I) Muizenstam. Voor elk experiment werden 6 tot 12 weken oude C57BL/6 muizen gebruikt. Deze werden aangekocht bij Harlan (Horst, Nederland) en gehuisvest in het animalarium te Jette in overeenstemming met de regelgeving van de commissie voor ethisch proefdierengebruik (CEP nummer: 9-214-1). (II) Voorbehandeling met ‘FMS-like tyrosine kinase 3’ (Flt3)-ligand. Acht dagen voor milt isolatie werd de C57BL/6 muis voorbehandeld met de hematopoëtische groeifactor Flt3ligand. Een plasmide, coderend voor deze factor, werd hiervoor aan 10 µg/200 µl 0,9% NaCl iv geïnjecteerd. (III) Isolatie van milt en bereiding van de celsuspensie. Eerst werd de muis geëuthanaseerd door middel van nekdislocatie, waarna deze met 70% ethanol werd gedesinfecteerd. Alle verdere stappen werden uitgevoerd in een laminaire luchtstroom kast om de miltcellen steriel te houden (bijlage VIII). De geïsoleerde milt werd overgebracht naar een 6-well plaat op een 70 µm nylon gaasje (filter, Becton Dickinson) waaraan 7 ml PBS werd toegevoegd. Nadat de milt was fijngemalen met de achterkant van een spuit, werd de bekomen celsuspensie overgebracht naar een 50 ml tube en 5 minuten gecentrifugeerd aan 1500 rpm. Na
43
Materialen en methoden centrifugatie werd het supernatant verwijderd en de rode bloedcellen gelyseerd door toevoegen van 2 ml rode bloedcel lyse buffer. Na 2 minuten werd hieraan 8 ml Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM, Lonza) toegevoegd, waarna de cellen werden gepeletteerd door centrifugatie bij 1500 rpm gedurende 5 minuten bij kamer temperatuur. Het supernatant werd verwijderd en de cellen werden in 10 ml IMDM geresuspendeerd. Het aantal geïsoleerde cellen werd bepaald door middel van de Bürker telkamer. (IV) LV-transductie. Miltcellen werden getransduceerd met eGFP coderende VSV.G, tVSV.G/BCII10 en tVSV.G/DC2.1 LVs aan de volgende condities: 5 x 105 cellen werden getransduceerd aan MOI 25 (dit stemt overeen met 12,5 x 106 TU of 250 ng RT) in een finaal volume van 500 µl IMDM in aanwezigheid van 10 µg/ml PS. Niet getransduceerde cellen werden meegenomen als controle. Twee dagen later werd de transductie van miltcellen met behulp van flow cytometrie geanalyseerd.
3. Evaluatie van de lentivirale vector biodistributie na directe administratie in C57BL/6 muizen (I) Muizenstam. Voor deze dierproeven werden 6 tot 12 weken oude C57BL/6 muizen gebruikt zoals beschreven in deel 2 van de ‘Materialen en methoden’. (II) Administratie van LVs. Muizen werden met 1 tot 3 x 107 TU tsred FLuc-Ires-eGFP of Thy1.1 coderende LVs of enkel vehikel (PBS met 10 µg/ml PS) geïmmuniseerd. Volgende toedieningsroutes werden geëvalueerd: (1) sc t.h.v. de staartbasis (100 µl), (2) sc t.h.v. de voetzool (25 µl) en (3) intranodaal (10 µl) (bijlage VII). (III) In vivo bioluminiscentie beeldvorming. Bioluminiscentie beeldvorming is een niet invasieve techniek die toelaat genexpressie te meten in het levende dier en is gebaseerd op het vermogen om licht uit te stralen als gevolg van een enzymatische reactie. Hier werd gebruik gemaakt van de reactie gekatalyseerd door tsred FLuc met zijn substraat D-luciferine (Promega, MW 318,4 g/mol and 30 mg/ml NaCl). Muizen werden geïnjecteerd met breed tropisme of gerichte LVs die coderen voor tsred FLuc-Ires-eGFP. Luciferase activiteit werd 36 uur later geëvalueerd met behulp van in vivo bioluminiscentie beeldvorming (bijlage IX). Hiervoor werden de muizen met behulp van gasanesthesie (isofluraan 2,5%; Abbott) in slaap gehouden en intraperitoneaal geïnjecteerd met D-luciferine (30 mg/kg, Promega). Vervolgens werd de beeldvorming uitgevoerd met een gekoelde ‘charge coupled device’ camera (Biospace Photon Imager) die de uitgezonden fotonen omzet in elektronen om zo een beeld te genereren (opnames duren 15 minuten). Na elke opname werden de muizen door middel van nekdislocatie geëuthanaseerd en konden de poplietale (na sc injectie in de voetzool) of inguinale (na sc injectie in de staartbasis) lymfeknopen geïsoleerd worden. Na injectie met 10 µl D-luciferine werden deze dan gedurende 5 minuten geanalyseerd in de luminometer. (IV) Opsporen van in situ LV-getransduceerde cellen. Om na te gaan welke celtypes in situ worden getransduceerd, werden muizen 36 uur voor lymfeknoop isolatie geïnjecteerd met breed tropisme of gerichte LVs. Vervolgens werd een celsuspensie gemaakt van de lymfeknopen door deze te injecteren met collagenase III (SIGMA-ALDRICH) en gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen (bijlage X). Vervolgens werden de lymfeknopen getransfereerd naar een 6-well plaat op een 70 µm nylon filter en met behulp van de achterkant van een spuit fijngemalen. Vervolgens werd de nylon filter nagespoeld met 5 ml
44
Materialen en methoden PBS, de celsuspensie getransfereerd naar een 15 ml tube en gecentrifugeerd bij 1500 rpm gedurende 5 minuten bij kamer temperatuur. De celpellet werd vervolgens geresuspendeerd in PBS met 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). CD11c+ cellen werden aangerijkt door middel van positieve selectie met anti-CD11c microbeads (Miltenyi Biotech) in een magnetisch veld (bijlage XI) alvorens de CD11c+ en CD11c- fracties te analyseren in flow cytometrie (bijlage XII).
4. Flow cytometrie (I) Bepalen van de transfectie efficiëntie. De transfectie efficiëntie van productiecellen getransfecteerd met pHR’ trip CMVeGFP SIN, pASIET of pASIET tsred FLuc werd bepaald met flow cytometrie. Dit gebeurde met de Beckton Dickinson FACSCanto Flow cytometer waar de eGFP+ celfractie een signaal geeft in het FL1 kanaal. Voor de bepaling van de transfectie efficïente van productiecellen getransfecteerd met pSIN Thy1.1, werden de cellen na de oogst en wasstap, gedurende 30 minuten ‘gelabeld’ met een phycoerythrinegeconjugeerd anti-Thy1.1 antilichaam (eBioscience, bijlage XII). De Thy1.1+ celfractie kon na een finale wasstap geanalyseerd worden in het FL2 kanaal van de flow cytometer. (II) Berekenen van de LV-titer. Voor het bepalen van de titer van VSV.G gepseudotypeerde LV werden de 293T cellen gedurende twee dagen geïncubeerd met een seriële verdunningsreeks van de LV-stock. Cellen getransduceerd met LVs die codeerden voor eGFP, Ires-eGFP of tsred FLuc-Ires-eGFP werden in het FL1 kanaal afgelezen, waar deze getransduceerd met LVs coderend voor Thy1.1 eerst werden gelabeld met het phycoerythrinegeconjugeerd anti-Thy1.1 antilichaam en vervolgens werden afgelezen in het FL2 kanaal. (III) Fenotyperen van LV-getransduceerde cellen. Tijdens het fenotyperen van cellen wordt nagegaan welke merkers de cellen al dan niet tot expressie brengen. Wanneer een merker zich aan het celoppervlak bevindt, kan deze gedetecteerd worden via flow cytometrie door deze met een specifiek antilichaam te labelen. De milt afgeleide celsuspensies werden voor flow cytometrische analyses in drie fracties verdeeld en vervolgens aangekleurd met: (a) een allophycocyanine-geconjugeerd anti-CD11c antilichaam (BD Biosciences, gelezen in kanaal 4) en een biotine-geconjugeerd anti-CD3, (b) een biotine-geconjugeerd anti-B220 antilichaam en een phycoerythrine-geconjugeerd CD11b antilichaam (BD, gelezen in het FL2 kanaal) en (c) een biotine-geconjugeerd anti-F4/80 antilichaam en een phycoerythrine-geconjugeerd CD11b antilichaam. De drie biotine-geconjugeerde antlichamen werden gedetecteerd met behulp van respectievelijk een streptavidine-phycoerythrine (a) (BD, gelezen in het FL2 kanaal) en streptavidine-allophycocyanine (b en c) (BD, gelezen in het FL3 kanaal) (bijlage XII). Bij de lymfeknoop afgeleide celsuspensies werden de CD11c+ en CD11c- fracties van elkaar gescheiden met behulp van magnetische cel sortering alvorens beide aan te kleuren met een allophycocyanine-geconjugeerd anti-CD11c antilichaam. Indien de muizen geïnjecteerd waren met LVs coderend voor Thy1.1, werden hun lymfeknoop afgeleide celsuspensies ook aangekleurd met het phycoerythrine-geconjugeerde anti-Thy1.1 antilichaaam (eBioscience, gelezen in het FL2 kanaal) om zo de getransduceerde van niet-getransduceerde fractie te onderscheiden. Milt en lymfeknoop afgeleide cellen, getransduceerd met eGFP coderende LVs werden op eGFP positiviteit geëvalueerd in het FL1 kanaal. De cellen werden afgelezen met behulp van de Beckton Dickinson FACSCanto Flow cytometer. Analyse van de data werd uitgevoerd met FACSDiva software (bijlage XII).
45
Referentielijst
Referentielijst Abbas AKL, Andrew H.; Pillai,Shiv (2009) Cellular and molecular immunology 6edn.: Saunders Elsevier. Aggarwal BB GP (2009) Inflammation and cancer: how friendly is the relationship for cancer patients? Current Opinion in Pharmacology 9(4): 351-369 Andre FE (2003) Vaccinology: past achievements, present roadblocks and future promises. Vaccine 21(7-8): 593-595 Andre S, Tough DF, Lacroix-Desmazes S, Kaveri SV, Bayry J (2009) Surveillance of antigen-presenting cells by CD4+ CD25+ regulatory T cells in autoimmunity: immunopathogenesis and therapeutic implications. Am J Pathol 174(5): 1575-1587 Annoni A, Battaglia M, Follenzi A, Lombardo A, Sergi-Sergi L, Naldini L, Roncarolo MG (2007) The immune response to lentiviral-delivered transgene is modulated in vivo by transgene-expressing antigen-presenting cells but not by CD4+CD25+ regulatory T cells. Blood 110(6): 1788-1796 Astsaturov I, Petrella T, Bagriacik EU, de Benedette M, Uger R, Lumber G, Berinstein N, Elias I, Iscoe N, Hammond C, Hamilton P, Spaner DE (2003) Amplification of virus-induced antimelanoma T-cell reactivity by high-dose interferon-alpha2b: implications for cancer vaccines. Clin Cancer Res 9(12): 4347-4355 Axelrod R, Axelrod DE, Pienta KJ (2006) Evolution of cooperation among tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103(36): 13474-13479 Banerjee DK, Dhodapkar MV, Matayeva E, Steinman RM, Dhodapkar KM (2006) Expansion of FOXP3high regulatory T cells by human dendritic cells (DCs) in vitro and after injection of cytokine-matured DCs in myeloma patients. Blood 108(8): 2655-2661 Bonifaz LC, Bonnyay DP, Charalambous A, Darguste DI, Fujii S, Soares H, Brimnes MK, Moltedo B, Moran TM, Steinman RM (2004) In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. J Exp Med 199(6): 815-824 Branchini BR, Ablamsky DM, Murtiashaw MH, Uzasci L, Fraga H, Southworth TL (2007) Thermostable red and green light-producing firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. Anal Biochem 361(2): 253-262 Breckpot K, Aerts JL, Thielemans K (2007a) Lentiviral vectors for cancer immunotherapy: transforming infectious particles into therapeutics. Gene Ther 14(11): 847-862 Breckpot K, Dullaers M, Bonehill A, van Meirvenne S, Heirman C, de Greef C, van der Bruggen P, Thielemans K (2003) Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med 5(8): 654-667 Breckpot K, Emeagi P, Dullaers M, Michiels A, Heirman C, Thielemans K (2007b) Activation of immature monocyte-derived dendritic cells after transduction with high doses of lentiviral vectors. Hum Gene Ther 18(6): 536-546 Breckpot K, Emeagi PU, Thielemans K (2008) Lentiviral vectors for anti-tumor immunotherapy. Curr Gene Ther 8(6): 438-448 Breckpot K, Escors D (2009) Dendritic Cells for Active Anti-cancer Immunotherapy: Targeting Activation Pathways Through Genetic Modification. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 9(4): 328-343 Breckpot K, Escors D, Arce F, Lopes L, Karwacz K, Van Lint S, Keyaerts M, Collins M (2010) HIV-1 lentiviral vector immunogenicity is mediated by TLR3 and TLR7. J Virol Breckpot K, Heirman C, Neyns B, Thielemans K (2004) Exploiting dendritic cells for cancer immunotherapy: genetic modification of dendritic cells. J Gene Med 6(11): 1175-1188
46
Referentielijst
Bremers AJ, Kuppen PJ, Parmiani G (2000) Tumour immunotherapy: the adjuvant treatment of the 21st century? Eur J Surg Oncol 26(4): 418-424 Buess M, Nuyten DS, Hastie T, Nielsen T, Pesich R, Brown PO (2007) Characterization of heterotypic interaction effects in vitro to deconvolute global gene expression profiles in cancer. Genome Biol 8(9): R191 Burnet M (1957) Cancer; a biological approach. I. The processes of control. Br Med J 1(5022): 779-786 Chandrashekran A, Gordon MY, Casimir C (2004) Targeted retroviral transduction of c-kit+ hematopoietic cells using novel ligand display technology. Blood 104(9): 2697-2703 Chapatte L, Colombetti S, Cerottini JC, Levy F (2006) Efficient induction of tumor antigen-specific CD8+ memory T cells by recombinant lentivectors. Cancer Res 66(2): 1155-1160 Chen Z, Dehm S, Bonham K, Kamencic H, Juurlink B, Zhang X, Gordon JR, Xiang J (2001) DNA array and biological characterization of the impact of the maturation status of mouse dendritic cells on their phenotype and antitumor vaccination efficacy. Cell Immunol 214(1): 60-71 Coffin JH, SH.; Varmus, HE. (1997) Retroviruses, Woodbury, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cui Y, Golob J, Kelleher E, Ye Z, Pardoll D, Cheng L (2002) Targeting transgene expression to antigenpresenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood 99(2): 399-408 De Groeve K, Deschacht N, De Koninck C, Caveliers V, Lahoutte T, Devoogdt N, Muyldermans S, De Baetselier P, Raes G (2010) Nanobodies as tools for in vivo imaging of specific immune cell types. J Nucl Med 51(5): 782-789 Delenda C (2004) Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med 6 Suppl 1: S125-138 Dhodapkar MV, Steinman RM (2002) Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood 100(1): 174-177 Dreja H, Piechaczyk M (2006) The effects of N-terminal insertion into VSV-G of an scFv peptide. Virol J 3: 69 Dresch C, Edelmann SL, Marconi P, Brocker T (2008) Lentiviral-mediated transcriptional targeting of dendritic cells for induction of T cell tolerance in vivo. J Immunol 181(7): 4495-4506 Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L (1998) A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol 72(11): 8463-8471 Dullaers M, Breckpot K, Van Meirvenne S, Bonehill A, Tuyaerts S, Michiels A, Straetman L, Heirman C, De Greef C, Van Der Bruggen P, Thielemans K (2004) Side-by-side comparison of lentivirally transduced and mRNA-electroporated dendritic cells: implications for cancer immunotherapy protocols. Mol Ther 10(4): 768779 Dullaers M, Thielemans K (2006) From pathogen to medicine: HIV-1-derived lentiviral vectors as vehicles for dendritic cell based cancer immunotherapy. J Gene Med 8(1): 3-17 Dullaers M, Van Meirvenne S, Heirman C, Straetman L, Bonehill A, Aerts JL, Thielemans K, Breckpot K (2006) Induction of effective therapeutic antitumor immunity by direct in vivo administration of lentiviral vectors. Gene Ther 13(7): 630-640 Dyall J, Latouche JB, Schnell S, Sadelain M (2001) Lentivirus-transduced human monocyte-derived dendritic cells efficiently stimulate antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Blood 97(1): 114-121
47
Referentielijst Dzionek A, Sohma Y, Nagafune J, Cella M, Colonna M, Facchetti F, Gunther G, Johnston I, Lanzavecchia A, Nagasaka T, Okada T, Vermi W, Winkels G, Yamamoto T, Zysk M, Yamaguchi Y, Schmitz J (2001) BDCA-2, a novel plasmacytoid dendritic cell-specific type II C-type lectin, mediates antigen capture and is a potent inhibitor of interferon alpha/beta induction. J Exp Med 194(12): 1823-1834 Ely S (2009) Personalized medicine: individualized care of cancer patients. Transl Res 154(6): 303-308 Emens LA, Jaffee EM (2003) Cancer vaccines: an old idea comes of age. Cancer Biol Ther 2(4 Suppl 1): S161168 Esslinger C, Chapatte L, Finke D, Miconnet I, Guillaume P, Levy F, MacDonald HR (2003) In vivo administration of a lentiviral vaccine targets DCs and induces efficient CD8(+) T cell responses. J Clin Invest 111(11): 1673-1681 Firat H, Zennou V, Garcia-Pons F, Ginhoux F, Cochet M, Danos O, Lemonnier FA, Langlade-Demoyen P, Charneau P (2002) Use of a lentiviral flap vector for induction of CTL immunity against melanoma. Perspectives for immunotherapy. J Gene Med 4(1): 38-45 Flint S.J. ELW, . Racaniello V.R, Skalka A.M. (2009) Principles of virology, Vol. Volume 1 Molecular Biology, Third edition edn. Washington, DC: ASM Press. Furmanov K, Elnekave M, Lehmann D, Clausen BE, Kotton DN, Hovav AH (2010) The role of skin-derived dendritic cells in CD8(+) T cell priming following immunization with lentivectors. J Immunol 184(9): 48894897 Gattinoni L, Powell DJ, Jr., Rosenberg SA, Restifo NP (2006) Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat Rev Immunol 6(5): 383-393 Gennari F, Lopes L, Verhoeyen E, Marasco W, Collins MK (2009) Single-chain antibodies that target lentiviral vectors to MHC class II on antigen-presenting cells. Hum Gene Ther 20(6): 554-562 Gruber A, Chen I, Kuhen KL, Wheat JC, Law P, Wong-Staal F (2003) Generation of dendritic cells from lentiviral vector-transduced CD34+ cells from HIV+ donors. J Med Virol 70(2): 183-186 Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363(6428): 446-448 Hanahan D, Weinberg RA (2000) The hallmarks of cancer. Cell 100(1): 57-70 Harmsen MM, De Haard HJ (2007) Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Appl Microbiol Biotechnol 77(1): 13-22 Hawiger D, Inaba K, Dorsett Y, Guo M, Mahnke K, Rivera M, Ravetch JV, Steinman RM, Nussenzweig MC (2001) Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo. J Exp Med 194(6): 769-779 He Y, Falo LD (2006) Induction of T cell immunity by cutaneous genetic immunization with recombinant lentivector. Immunol Res 36(1-3): 101-117 He Y, Zhang J, Donahue C, Falo LD, Jr. (2006) Skin-derived dendritic cells induce potent CD8(+) T cell immunity in recombinant lentivector-mediated genetic immunization. Immunity 24(5): 643-656 He Y, Zhang J, Mi Z, Robbins P, Falo LD, Jr. (2005) Immunization with lentiviral vector-transduced dendritic cells induces strong and long-lasting T cell responses and therapeutic immunity. J Immunol 174(6): 3808-3817 Jeetendra E, Robison CS, Albritton LM, Whitt MA (2002) The membrane-proximal domain of vesicular stomatitis virus G protein functions as a membrane fusion potentiator and can induce hemifusion. J Virol 76(23): 12300-12311
48
Referentielijst
Jemal AS, Rebecca; Ward, Elizabeth; Hao, Yongping; Xu, Jiaquan; Thun, Michael J. (2009) Cancer Statistics, 2009. Cancer Journal for Clinicians 59(4): 225-249 Jiang CK, Connolly D, Blumenberg M (1991) Comparison of methods for transfection of human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol 97(6): 969-973 Jonuleit H, Schmitt E, Steinbrink K, Enk AH (2001) Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells. Trends Immunol 22(7): 394-400 Kaiko GE, Horvat JC, Beagley KW, Hansbro PM (2008) Immunological decision-making: how does the immune system decide to mount a helper T-cell response? Immunology 123(3): 326-338 Kantoff PW, Schuetz TJ, Blumenstein BA, Glode LM, Bilhartz DL, Wyand M, Manson K, Panicali DL, Laus R, Schlom J, Dahut WL, Arlen PM, Gulley JL, Godfrey WR Overall survival analysis of a phase II randomized controlled trial of a Poxviral-based PSA-targeted immunotherapy in metastatic castration-resistant prostate cancer. J Clin Oncol 28(7): 1099-1105 Karwacz K, Mukherjee S, Apolonia L, Blundell MP, Bouma G, Escors D, Collins MK, Thrasher AJ (2009) Nonintegrating lentivector vaccines stimulate prolonged T-cell and antibody responses and are effective in tumor therapy. J Virol 83(7): 3094-3103 Khatami M (2009) Inflammation, aging, and cancer: tumoricidal versus tumorigenesis of immunity: a common denominator mapping chronic diseases. Cell Biochem Biophys 55(2): 55-79 Kim JB, Urban K, Cochran E, Lee S, Ang A, Rice B, Bata A, Campbell K, Coffee R, Gorodinsky A, Lu Z, Zhou H, Kishimoto TK, Lassota P (2010) Non-invasive detection of a small number of bioluminescent cancer cells in vivo. PLoS One 5(2): e9364 Klages N, Zufferey R, Trono D (2000) A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther 2(2): 170-176 Klein G, Klein E (2005) Surveillance against tumors--is it mainly immunological? Immunol Lett 100(1): 29-33 Kott M, Haberland A, Zaitsev S, Buchberger B, Morano I, Bottger M (1998) A new efficient method for transfection of neonatal cardiomyocytes using histone H1 in combination with DOSPER liposomal transfection reagent. Somat Cell Mol Genet 24(4): 257-261 Liu YJ (2001) Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity. Cell 106(3): 259-262 Lizee G, Gonzales MI, Topalian SL (2004) Lentivirus vector-mediated expression of tumor-associated epitopes by human antigen presenting cells. Hum Gene Ther 15(4): 393-404 Lizée G, Radvanyi LG, Overwijk WW, Hwu P (2006) Improving antitumor immune responses by circumventing immunoregulatory cells and mechanisms. Clin Cancer Res 12(16): 4794-4803 Lopes L, Dewannieux M, Gileadi U, Bailey R, Ikeda Y, Whittaker C, Collin MP, Cerundolo V, Tomihari M, Ariizumi K, Collins MK (2008) Immunization with a lentivector that targets tumor antigen expression to dendritic cells induces potent CD8+ and CD4+ T-cell responses. J Virol 82(1): 86-95 Luft T, Maraskovsky E, Schnurr M, Knebel K, Kirsch M, Gorner M, Skoda R, Ho AD, Nawroth P, Bierhaus A (2004) Tuning the volume of the immune response: strength and persistence of stimulation determine migration and cytokine secretion of dendritic cells. Blood 104(4): 1066-1074 Lurquin C, Lethe B, De Plaen E, Corbiere V, Theate I, van Baren N, Coulie PG, Boon T (2005) Contrasting frequencies of antitumor and anti-vaccine T cells in metastases of a melanoma patient vaccinated with a MAGE tumor antigen. J Exp Med 201(2): 249-257
49
Referentielijst
Mann R, Mulligan RC, Baltimore D (1983) Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus. Cell 33(1): 153-159 Marsac D, Loirat D, Petit C, Schwartz O, Michel ML (2002) Enhanced presentation of major histocompatibility complex class I-restricted human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag-specific epitopes after DNA immunization with vectors coding for vesicular stomatitis virus glycoprotein-pseudotyped HIV-1 Gag particles. J Virol 76(15): 7544-7553 Melief CJ (2008) Cancer immunotherapy by dendritic cells. Immunity 29(3): 372-383 Metharom P, Ellem KA, Wei MQ (2005) Gene transfer to dendritic cells induced a protective immunity against melanoma. Cell Mol Immunol 2(4): 281-288 Morizono K, Pariente N, Xie Y, Chen IS (2009) Redirecting lentiviral vectors by insertion of integrin-tageting peptides into envelope proteins. J Gene Med 11(7): 549-558 Mossoba ME, Walia JS, Rasaiah VI, Buxhoeveden N, Head R, Ying C, Foley JE, Bramson JL, Fowler DH, Medin JA (2008) Tumor protection following vaccination with low doses of lentivirally transduced DCs expressing the self-antigen erbB2. Mol Ther 16(3): 607-617 Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259): 263-267 Palmowski MJ, Lopes L, Ikeda Y, Salio M, Cerundolo V, Collins MK (2004) Intravenous injection of a lentiviral vector encoding NY-ESO-1 induces an effective CTL response. J Immunol 172(3): 1582-1587 Palucka AK, Ueno H, Fay J, Banchereau J (2008) Dendritic cells: a critical player in cancer therapy? J Immunother 31(9): 793-805 Promega. (2007) Technical manual: pGL4 luciferase reporter vectors. In Corporation P (ed.). Register BC (2009) Belangrijke cijfers. Revets H, De Baetselier P, Muyldermans S (2005) Nanobodies as novel agents for cancer therapy. Expert Opin Biol Ther 5(1): 111-124 Riker AI, Radfar S, Liu S, Wang Y, Khong HT (2007) Immunotherapy of melanoma: a critical review of current concepts and future strategies. Expert Opin Biol Ther 7(3): 345-358 Robison CS, Whitt MA (2000) The membrane-proximal stem region of vesicular stomatitis virus G protein confers efficient virus assembly. J Virol 74(5): 2239-2246 Rubin B (2008) Natural immunity has significant impact on immune responses against cancer. Scandinavian Journal of Immunology 69: 275-290 Sadikot RT, Blackwell TS (2005) Bioluminescence imaging. Proc Am Thorac Soc 2(6): 537-540, 511-532 Salmon P, Arrighi JF, Piguet V, Chapuis B, Zubler RH, Trono D, Kindler V (2001) Transduction of CD34+ cells with lentiviral vectors enables the production of large quantities of transgene-expressing immature and mature dendritic cells. J Gene Med 3(4): 311-320 Sato N, Hirohashi Y, Tsukahara T, Kikuchi T, Sahara H, Kamiguchi K, Ichimiya S, Tamura Y, Torigoe T (2009) Molecular pathological approaches to human tumor immunology. Pathol Int 59(4): 205-217 Schaffer DV, Koerber JT, Lim KI (2008) Molecular engineering of viral gene delivery vehicles. Annu Rev Biomed Eng 10: 169-194
50
Referentielijst Schetter AJ, Heegaard NH, Harris CC (2009) Inflammation and cancer: interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways. Carcinogenesis 31(1): 37-49 Schroers R, Chen SY (2004) Lentiviral transduction of human dendritic cells. Methods Mol Biol 246: 451-459 Seliger B (2008) Different regulation of MHC Class I antigen processing components in human tumors. Journal of Immunotoxicology 5 (4): 361-367 Solinas G, Germano G, Mantovani A, Allavena P (2009) Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. J Leukoc Biol 86(5): 1065-1073 Spaner DE, Astsaturov I, Vogel T, Petrella T, Elias I, Burdett-Radoux S, Verma S, Iscoe N, Hamilton P, Berinstein NL (2006) Enhanced viral and tumor immunity with intranodal injection of canary pox viruses expressing the melanoma antigen, gp100. Cancer 106(4): 890-899 Steinbrink K, Jonuleit H, Muller G, Schuler G, Knop J, Enk AH (1999) Interleukin-10-treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific anergy in CD8(+) T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 93(5): 1634-1642 Steinman RM (2003) Some interfaces of dendritic cell biology. APMIS 111(7-8): 675-697 Steinman RM (2007) Dendritic cells: Understanding immunogenicity. European Journal of Immunology 37: S53-60 Steinman RM, Cohn ZA (1973) Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med 137(5): 1142-1162 Steinman RM, Witmer MD (1978) Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 75(10): 5132-5136 Tan PH, Beutelspacher SC, Xue SA, Wang YH, Mitchell P, McAlister JC, Larkin DF, McClure MO, Stauss HJ, Ritter MA, Lombardi G, George AJ (2005) Modulation of human dendritic-cell function following transduction with viral vectors: implications for gene therapy. Blood 105(10): 3824-3832 Terskikh AV, Ershler MA, Drize NJ, Nifontova IN, Chertkov JL (2005) Long-term persistence of a nonintegrated lentiviral vector in mouse hematopoietic stem cells. Exp Hematol 33(8): 873-882 Thery C, Amigorena S (2001) The cell biology of antigen presentation in dendritic cells. Curr Opin Immunol 13(1): 45-51 Thompson CD, Frazier-Jessen MR, Rawat R, Nordan RP, Brown RT (1999) Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line, RAW 264.7. Biotechniques 27(4): 824-826, 828-830, 832 Tuyaerts S, Aerts JL, Corthals J, Neyns B, Heirman C, Breckpot K, Thielemans K, Bonehill A (2007) Current approaches in dendritic cell generation and future implications for cancer immunotherapy. Cancer Immunol Immunother 56(10): 1513-1537 Ueno H, Klechevsky E, Morita R, Aspord C, Cao T, Matsui T, Di Pucchio T, Connolly J, Fay JW, Pascual V, Palucka AK, Banchereau J (2007) Dendritic cell subsets in health and disease. Immunol Rev 219: 118-142 Van den Eynde BJ, van der Bruggen P (1997) T cell defined tumor antigens. Curr Opin Immunol 9(5): 684-693 van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, Knuth A, Boon T (1991) A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254(5038): 1643-1647 van Duin D, Medzhitov R, Shaw AC (2006) Triggering TLR signaling in vaccination. Trends Immunol 27(1): 49-55
51
Referentielijst
VandenDriessche T, Thorrez L, Naldini L, Follenzi A, Moons L, Berneman Z, Collen D, Chuah MK (2002) Lentiviral vectors containing the human immunodeficiency virus type-1 central polypurine tract can efficiently transduce nondividing hepatocytes and antigen-presenting cells in vivo. Blood 100(3): 813-822 Vieira PL, de Jong EC, Wierenga EA, Kapsenberg ML, Kalinski P (2000) Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 164(9): 4507-4512 Vuk-Pavlovic S (2008) Rebuilding immunity in cancer patients. Blood Cells Mol Dis 40(1): 94-100 Walker LA, AK (2002) The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay in the periphery. Nature Reviews Immunology 2: 11-19 Wang B, He J, Liu C, Chang LJ (2006) An effective cancer vaccine modality: lentiviral modification of dendritic cells expressing multiple cancer-specific antigens. Vaccine 24(17): 3477-3489 Wang T, Niu G, Kortylewski M, Burdelya L, Shain K, Zhang S, Bhattacharya R, Gabrilovich D, Heller R, Coppola D, Dalton W, Jove R, Pardoll D, Yu H (2004) Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nat Med 10(1): 48-54 Warger T, Osterloh P, Rechtsteiner G, Fassbender M, Heib V, Schmid B, Schmitt E, Schild H, Radsak MP (2006) Synergistic activation of dendritic cells by combined Toll-like receptor ligation induces superior CTL responses in vivo. Blood 108(2): 544-550 WHO (2009) Quick cancer facts. Wilson NS, El-Sukkari D, Villadangos JA (2004) Dendritic cells constitutively present self antigens in their immature state in vivo and regulate antigen presentation by controlling the rates of MHC class II synthesis and endocytosis. Blood 103(6): 2187-2195 Yang L, Bailey L, Baltimore D, Wang P (2006) Targeting lentiviral vectors to specific cell types in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 103(31): 11479-11484 Yang L, Yang H, Rideout K, Cho T, Joo KI, Ziegler L, Elliot A, Walls A, Yu D, Baltimore D, Wang P (2008) Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nat Biotechnol 26(3): 326-334 Zhang XY, Kutner RH, Bialkowska A, Marino MP, Klimstra WB, Reiser J (2010) Cell-specific targeting of lentiviral vectors mediated by fusion proteins derived from Sindbis virus, vesicular stomatitis virus, or avian sarcoma/leukosis virus. Retrovirology 7: 3 Zitvogel L, Tesniere A, Kroemer G (2006) Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol 6(10): 715-727
52
Bijlagen
Bijlagen Cell lines and mice The following cells and mice were used in the procedures described in the section “Protocols”: - human embryonal kidney cells (293T) - C57BL/6 (H-2Kb) female mice, 6-8 weeks old (Harlan)
Materials The following materials were used in the procedures described in the section “Protocols”: - plasmid DNA (precipitated and stored in 70% ethanol): (1) packaging plasmid pCMV∆R8.9, (2) VSV.G or tVSV.G coding plasmids pMD.G and pUB6 tVSV.G respectively, (3) Nb BCII10, DC1.8 and DC2.1 coding plasmids pDISPLAY-BCII10, pDISPLAY-DC1.8 and pDISPLAY-DC2.1 respectively, (4) transferplasmids pASIET, pASIET tsred FLuc, pHR’ trip CMVeGFP SIN en pSIN Thy1.1 coding for respectively Ires-eGFP, tsred FLuc-IreseGFP, eGFP or Thy1.1. - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Lonza) supplemented with 10% fetal calf serum (Harlan), 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin and 2 mM L-Glutamine (Lonza) (DMEM+) - Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) supplemented with 50 µM ß-mercapto ethanol (IMDM+) - OptiMem (Invitrogen) - phosphate buffered saline (PBS, Lonza) - PBS supplemented with 10 µg/ml protamine sulphate (PS, LeoPharma) - PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) and 0,02% NaN3 (FACS buffer) - 90% fetal calf serum (Harlan) with 10% dimethylsulfoxide - PBS with 2mM EDTA (MACS buffer) - red blood cell lysis buffer - collagenase III (8000 U/ml, SIGMA-ALDRICH) - 70% ethanol - 2 M CaCl2 - 2x HeBS (pH 7,5 ± 0,5 and 0,22 µm filtered) - cryotubes (NUNCTM) - trypsin/EDTA (Lonza) - FuGENE® Transfection Reagent (Roche Diagnostics) - RT assay (Roche Diagnostics) - Beetle Luciferin with potassium salt (Promega, MW 318,4 g/mol and 30 mg/ml NaCl)
53
Bijlagen - 6-well plates - Falcon flasks of 175 cm2 surface (T175, Falcon) - micropipettes (Gilson Inc.) - plugged microtips – p20, p200, p1000 (Neptune) - pipette boy(s) - pipettes (2, 5, 10 and 25 ml, Sarstedt) - 5 (FACS), 15 and 50 ml tubes (BD Falcon) - 0,22 µm filters (Millipore - StericupTM) - 70 µm nylon mesh (BD Falcon) - 0,5 and 2,5 ml syringes (BD Micro Fine and Terumo) - LS MACS columns with magnetic MACS frame (Miltenyi Biotec GMBH) - CD11c magnetic cell sorting beads (Miltenyi) - dissection material, such as scalpel, scissor, etcetera - incubator at 37°C and 5% CO2 - 37°C water bath - Bürker counting chamber - Trypan blue - Microscope (Axiovert 25 Zeiss) - Biospace Photon Imager connected to a computer and thermocube (Biospace Lab) - anesthetic device with an absorber and isoflurane 2,5% (Abbott) - antibodies (as well as 2.4G2 to block Fc receptor binding) - FACSCanto flow cytometer (BD) - ketamine (CEVA sante animale) - rompun (Bayer) - thermocube (Solid State Cooling Systems) - Biospace Photon Imager (Biospace Lab)
54
Bijlagen
Protocols I. Thawing of human embryonal kidney cells (293T) - 293T cells were frozen at 10 x 106 293T cells in 1 ml of 90% fetal calf serum and 10% dimethylsulfoxide per 1,5 ml cryotube and stored in liquid nitrogen - thaw the 293T cells in a 37°C water bath by gently shaking the cryotube until a small ice crystal is visible - transfer the thawed cells to a 15 ml tube containing 9 ml of OptiMem (4°C) and subsequently centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm (room temperature) - discard the supernatants - resuspend the cell pellet in 25 ml DMEM+ and transfer to a T175 - incubate the cells at 37°C and 5% CO2 until further use
II. Maintaining human embryonal kidney cells (293T) - 293T cells are grown up to 80% confluence - discard the supernatant of the 293T cell containing culture flask (T175) - wash the cells with 10 ml PBS - add 3 ml trypsin/EDTA - incubate 2-5 minutes at 37°C, 5% CO2 - tap the T175 flask to detach the cells - transfer the 293T cells in a 15 ml tube (or 50 ml in case of more than 1 flask) - rinse the flask with DMEM+ (3 to 6 ml, which is also transferred to the tube) - centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm (room temperature) - resuspend the cells in 10 ml DMEM+ (per T175) - transfer 2 ml of the cell suspension to a total volume of 25 ml DMEM+ in a T175 - incubate at 37°C and 5% CO2 or count the cells using a Bürker counting chamber and plate 10-15 x 106 cells per 25 ml DMEM+ per T175
III. Transfection with de Ca3-(PO4)2-DNA transfection method Day 1 - plate 293T cells at 10-15 x 106 cells per 25 ml DMEM+ in a T175 flask (cfr. Protocol II) Day 2 (the transfection is performed in the evening) - replace the culture medium of the producer cells with 25 ml DMEM+ - centrifuge the precipitated plasmid DNA stored in 70% ethanol for 10 minutes at 14000 rpm - remove the ethanol and solute the plasmid DNA in endofree water at 1 µg/µl
55
Bijlagen - prepare the transfection mix according to Table 1. - add 5 ml transfection mix in each T175 flask and incubate for 12-16 hours at 37°C, 5% CO2 Day 3 - replace the culture medium by 20 ml DMEM+ Day 4: first harvest - transfer the virus containing supernatant to 50 ml tubes - centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm (4°C) - filter 0,22 µm - store at -80°C until further use - add fresh DMEM+ (20 ml) to the 293T cell containing T175 Day 5: second harvest and evaluation of the transfection efficiency - the second harvest of the viral supernatant is performed as described for the first harvest - harvest the 293T producer cells - wash twice in FACS buffer - evaluate the expression of the reporter in flow cytometry (cfr. protocol XII)
Table 1 Components of the calcium phosphate-based transfection mix. Reagents (per T175)
Quantities
Methods
Endofree H2O
2,1 ml
pMD.G or pUB6tVSV.G*
15 µg
pCMVΔR8.9
30 µg
Transfer plasmid
45 µg
Transfer plasmid*
37,5 µg
pDISPLAY-BCII10, DC2.1 or DC1.8
7,5 µg
2 M CaCl2
310 µl
add CaCl2 drop wise
2 x HeBS
2,5 ml
add HeBS while bubbling
* production of tVSV.G pseudotyped and Nanobody containing lentiviral vectors (LVs)
IV. Transfection with the FuGENE®-based lipofection method Day 1 - plate the 293T cells at 10-15 x 106 cells per 25 ml DMEM+ in a T175 flask
56
Bijlagen Day 2 (the transfection is performed in the evening) - prepare the plasmid DNA as described in protocol III - prepare the transfection mix according to Table 2
Table 2 Components of the FuGENE®-based transfection mix. Reagents (per T175)
Quantities
Endofree H2O
31.25 µl
pMD.G
2,5 µg
pCMVΔR8.9
2,5 µg
Transfer plasmid
3,75 µg
OptiMem
500 µl
Methods
add the DNA and H20 in the first eppendorf tube
add OptiMem to a second eppendorf tube add the transfection reagent to the
®
FuGENE Transfection Reagent
45 µl
OptiMem, flick to mix and add the DNA to this mix
- leave at room temperature for 15 minutes - in the mean while replace the culture medium with fresh DMEM+ - add the transfection mix drop wise to the 293T cells - incubate for 12-16 hours at 37°C, 5% CO2 Day 3, 4 and 5 : first to third harvest and evaluation of the transfection efficiency - harvest the LV supernatant 24, 48 and 72 hours after transfection (cfr. protocol III) - transfection efficiency can be evaluated at day 5 as described in protocols III and XII
V. Slow speed concentration of lentiviral vectors - thaw the viral supernatant in a 37°C water bath and divide over a number of 50 ml tubes - centrifuge the tubes at 4000 rpm for 12-16 hours (4°C) - remove the supernatant - place the 50 ml tubes upside down on a paper towel for 10 minutes - resuspend the LV pellet in PBS containing 10 µg/ml PS (200-3000x concentrated) - aliquot the LV in labeled cryotubes and keep the vials at -80°C
57
Bijlagen VI. Characterization of lentiviral vectors a) Titration on 293T cells of VSV.G pseudotyped lentiviral vectors Day 1 - plate 293T cells at 1 x 105 cells per well in a 6-well plate in 2 ml DMEM+ Day 2 - prepare a serial dilution of the (un)concentrated LVs according to Table 3 or 4, respectively Table 3 Dilution series for titration of
Table 4 Dilution series for titration of
the LV stock before concentration. Dilution
Viral supernatant
Protamine
in DMEM+
sulphate
1
2 ml
2 µl
1/2,5
2 ml in 3 ml
3 µl
the LV stock after concentration. Dilution
Concentrated LV stock
Protamine
in DMEM+
sulphate
1/500
8 µl in 4 ml DMEM+
3 µl
1/5000
1 ml from step 1 with 9
8 µl
DMEM+ 1/5
2 ml from step 2
ml DMEM+ 2 µl
1/10000
with 2 ml DMEM+ 1/10
2 ml from step 3
1 ml from step 2 with 1
2 µl
ml DMEM+ 4 µl
1/50000
with 2 ml DMEM+
1 ml from step 2 with 9
10 µl
ml DMEM+
- remove the supernatant from the 293T cells - bring 2 ml of the prepared LV dilutions on a well with 293T cells - incubate for 3 days at 37°C, 5% CO2 Day 5 - harvest the 293T cells and transfer to a FACS tube - centrifuge for 3 minutes at 1500 rpm (room temperature) and discard the supernatant - wash the cells (2x) with 1 ml FACS buffer - centrifuge 3 minutes at 1500 rpm - resuspend the cell pellet in 250 µl FACS buffer - acquire the cells in flow cytometry (GFP or after staining for Thy1.1, cfr. protocol XII) b) Reverse Transcriptase assay (Roche) The RT assay contains: - HIV-1 RT (standard, bottle 1, -80°C) - incubation buffer (Tris-buffer, KCl, MgCl and DTT, bottle 2, 4°C) - nucleotides (digoxigenin-dUTP, biotin-dUTP and dTTP) - template (poly(A)xoligo(dT)15)
58
Bijlagen - lyses buffer (Tris-buffer, KCl, DTT, EDTA and Triton X-100, bottle 5, 4°C) - anti-digoxigenin-peroxidase (100x, polyclonal sheep-derived antibodies, vial 6, 4°C) - washing buffer (10x, bottle 7, 4°C) - conjugate dilution buffer (NaPO4 with blocking agent, bottle 8, 4°C) - 2,2'-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) substrate buffer (bottle 9) - ABTS substrate (1 tablet in 5 ml substrate buffer, bottle 10) - substrate enhancer (1 mg/ml ABTS substrate solution if low signal expected, bottle 11) - microplate strips (pre-coated with streptavidin and post-coated with blocking reagent) - strip frame - cover foil (to avoid evaporation)
Procedure:
The RT assay must be performed under nuclease-free conditions.
- label a 96-well plate - prepare a dilution series for each LV stock according to Table 5 - prepare the HIV RT working dilution as described in Table 6 - incubate for 30 minutes at room temperature - transfer 2 µl of each LV dilution to 38 µl lyses buffer in a new well (= 40 µl) - also transfer 40 µl of each working dilution into a new well - add 20 µl reaction mix (template, digoxigenin- and biotin-conjugated nucleotides) - incubate the 96-well plate for 1 to 15 h at 37°C (on average 3 hours)
Table 5 Dilution series per virusstock
Table 6 Dilution series for the HIV-1 RT
used in the RT assay.
working dilutions.
Dilution
Virusstock (µl)
Lysis buffer (µl)
Step
HIV-1 RT (µl)
Lysis buffer (µl)
1/50
1
49
0
0
75
HIV-1 RT concentratio n (ng/well) 0
1/100
25 µl from 1/50
25
1
5 (bottle 1)
195
2.0
1/200
25 µl from 1/100
25
2
75 of step 1
75
1.0
3
75 of step 2
75
0.5
4
75 of step 3
75
0.25
5
75 of step 4
75
0.125
6
75 of step 5
75
0.0625
- put the necessary number of microplate strips into the frame in the correct orientation
59
Bijlagen - transfer the samples and the HIV-1 RT working dilutions (60 µl) into the microplate wells - cover the microplate modules with a cover foil and incubate for 1h at 37°C - empty the microplate wells - rinse 5x with 200 µl of washing buffer per well for 30 seconds each - remove the washing buffer carefully - add 200 µl of anti-digoxigenin-peroxidase working dilution per well - cover the microplate modules with a cover foil and incubate for 1 h at 37°C - empty the microplate wells - rinse 5x with 200 µl of washing buffer per well for 30 seconds each - remove the washing buffer carefully - add 200 µl of ABTS substrate solution (1 tablet in 5 ml substrate buffer) per well - incubate at room temperature until color development is sufficient for photometric detection - measure the absorbance of the samples at 405 nm, using a microplate reader - set up the standard curve using SoftMax or Microsoft Excell software - calculate the amount of RT per sample (ng RT)
VII. Immunization of mice a) Subcutaneous injections: - at the tail base: inject up to 100 µl of vehicle (PBS containing 10 µg/ml PS) or 1 to 3 x 107TU LV (maximum volume of 100 µl) at the back side of the mouse, just above the tail - in the footpad: inject up to 50 µl of vehicle (PBS containing 10 µg/ml PS) or 1 to 3 x 107 TU LV (maximum volume of 50 µl) between the third and fourth toe of the mouse b) Intranodal injections: - anesthetize the mice with 300 µl of a ketamine (30 mg/kg) and rompun (6 mg/kg) solution - wash the mouse with soap (Hibiscrub) and shave its flank - make an incision in the skin at the anatomic location of the left inguinal lymph node - gently lift the inguinal lymph node out of the mouse - inject the lymph node with up to 10 µl PBS containing 10 µg/ml PS or 1 x 106 TU LV (maximum volume of 10 µl) - bring the lymph node back in the abdominal cavity and stitch the skin - disinfect the wound and let the mouse recover
60
Bijlagen VIII. Isolation of spleen and preparation of the single cell suspensions - euthanize the mouse by dislocation of the neck and disinfect with 70% ethanol - make an incision in the skin at the abdominal region - remove the spleen after removal of surrounding fat and membranes - put the isolated spleen on a 70 µm nylon mesh in a well of a 6-well plate in 7 ml PBS - crush the spleen with the bottom of a 2,5 ml syringe through the 70 µm mesh - use 2 x 1 ml PBS to rinse the 70 µm mesh - transfer the single cell suspension to a 50 ml tube - centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm (room temperature) - remove the supernatant and add 2 ml red blood cell lyses buffer for 2 minutes - add 8 ml IMDM+ and centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm (room temperature) - resuspend the cell pellet in 10 ml IMDM+
IX. In vivo bioluminescence imaging - turn on the computer, the thermocube (push ‘start’ to ensure that the cube cools down slowly to 18°C and check the level of water) and the Biospace Photon Imager (leave to cool down to -25°C) - remove the filter (if present) from the lens - open the software program ‘Photon Acquisition Software’ (press in the bioluminescence menu: ‘B’and Fxy on, ‘Autopilot’ off, establish the stopping conditions) - for the anesthetics: refill isoflurane in the appropriate reservoir, open the oxygen crane (position 2), weigh the absorber (when more than 1400 g, replace) and put on the anesthetic device (level 5 for few minutes, then level 2,5) - anesthetize each mouse at a time by putting it into the anesthetic device for 5 minutes - subsequently inject per 20 g mouse, 100 µl luciferin - place the anesthetized and injected mouse in the Photon Imager and press ‘start’ via the software program - analyze the data with the ‘M3 vision’ software program
X. Isolation of lymph nodes and preparation of single cell suspensions - put the isolated lymph nodes in a well of a 6-well plate in 1 ml collagenase III - inject each lymph node with the collagenase III solution (final concentration of 100 U/ml) - incubate the lymph nodes in the 6-well plate for 30-60 minutes at 37°C - transfer the lymph nodes onto a 70 µm filter in a new well of a 6-well plate - crush the lymph nodes through the filter with the bottom of a 2,5 ml syringe
61
Bijlagen - use 1 ml MACS buffer to rinse both wells in which the intact and crushed lymph nodes were incubated, as well as to rinse the 70 µm mesh - transfer the cell suspension to a FACS tube, rinse both wells again with MACS buffer - centrifuge the FACS tube for 3 minutes at 3000 rpm (room temperature) - discard the supernatant and resuspend the cells in 1 ml MACS buffer - count the cells using a Bürker counting chamber
XI. Sorting of CD11c positive cells from the lymph node - transfer the lymph node cells to a 15 ml tube, centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm - discard the supernatant and resuspend in 2,5 ml MACS buffer (4°C) - block Fc receptors through addition of 10% 2.4G2 - incubate 20 minutes at 4°C - wash the cells by adding 7 ml MACS buffer (4°C) - centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm - discard supernatant and resuspend in 200 µl MACS buffer (4°C) with 50 µl anti-CD11c antibody conjugated magnetic cell sorting beads - incubate 15 minutes at 4°C - wash the LS columns with 2 ml MACS buffer (4°C) before use - transfer each cell suspension to a column - wash the column 3x with 1 ml MACS buffer (4°C), collect the flow through (CD11c negative lymph node cells) - remove the column from the magnetic device and elute the positive cells by ‘pushing’ 2x 5 ml MACS buffer (4°C) through the LS column - centrifuge the CD11c positive and negative fraction 5 minutes at 1500 rpm - discard the supernatant and resuspend both fractions in 1 ml MACS buffer (4°C) - count the number of cells using a Bürker counting chamber - distribute each fraction over the appropriate number of FACS tubes - centrifuge the tubes for 3 minutes at 3000 rpm (room temperature) - discard the supernatant and proceed with protocol XII
XII. Flow cytometry a) Cell staining - the cells to be stained are 293T cells transfected for the production of Thy1.1 encoding LVs or transduced with these LVs, as well as spleen and lymph node cells either or not obtained after magnetic bead separations
62
Bijlagen - divide the cells into FACS tubes (1 - 4 x 105 cells per tube) - wash the cells with 1 ml of FACS buffer - centrifuge at 3000 rpm for 3 min and discard the supernatant - add 50 µl of antibody containing FACS buffer (for the staining of spleen and lymph node cells, 10% of 2.4G2 is added) (cfr. Tables 7, 8 and 9) - resuspend the cells by vortexing each tube at level 6 for about 8 seconds - incubate for 30 minutes at 4°C in the dark - wash the cells with 1 ml FACS buffer, centrifuge 3 minutes at 3000 rpm (room temperature) and discard the supernatant - add 50 µl of the appropriate ‘second staining solution’ to the tubes (cfr. Tables 7 and 8) - resuspend the cells by vortexing each tube at level 6 for about 8 seconds - incubate for 30 minutes at 4°C in the dark - wash the cells with 1 ml FACS buffer, centrifuge 3 minutes at 3000 rpm (room temperature) and discard the supernatant - add 200 µl of FACS buffer and resuspend the cells by vortexing each tube at level 6 for about 8 seconds
Table 7 Staining procedure for Thy1.1 expressing 293T cells. Antibody
Binds to:
Dilution
Company
phycoerythrin-conjugated anti-Thy1.1 antibody
CD90.1
400x
BD Biosciences
staining solution
Table 8 Staining procedure for the samples used to set up the acquisition. Antibody
Binds to:
Dilution
Company
T cells
1000x
homemade
First Biotin-conjugated anti-CD3 antibody staining solution
Second
Streptavidin-allophycocyanin
200x
Streptavidin -phycoerythrin
1000x
staining solutions
BD Biosciences Streptavidin -fluorescein isothiocyanaat
Biotin
100x
Streptavidin -peridinin-chlorophyll protein (PerCP250x Cy5.5)
63
Bijlagen Table 9 Staining of spleen or lymph node cells. Antibody First
1.
staining solutions
Binds to: allophycocyanin-conjugated
Dilution
Company
1.
conventional DC
20x
BD Biosciences
2.
CD90.1 positive cells
400x
eBioscience
3.
Monocytes/
100x
BD Pharmingen
anti-CD11c antibody 2.
phycoerythrin -conjugated anti-Thy1.1 antibody
3.
phycoerythrin-conjugated anti-CD11b antibody
4.
macrophages
biotin-conjugated anti-
4.
F4/80, anti-CD3 and anti-
Macrophages, T cells
1000x, 1000x and 50x
and B cells
eBioscience and (2x) homemade
B220 antibody Second
1.
Streptavidin – phycoerythrin
staining
2.
streptavidin-
solutions
biotin
1.
1000x
2.
200x
BD Biosciences
allophycocyanin
b) Acquisition of cells using the FACSCanto flow cytometer General information: - the labels GFP, PE, PerCP-Cy5.5 and APC are detected by the FL1, FL2, FL3 and FL4 detector respectively, for every label we need a negative control (not GFP, PE, PerCP-Cy5.5 or APC) and a single positive control - fluorescently labeled spherobeads are used once a month to calibrate the FACSCanto flow cytometer - if the machine is idle for more than a 1 minute, an H2O containing tube is put on the FACSCanto flow cytometer and the machine is set on ‘standby’ - the inspector allows to see the characteristics of the item that is hit at that time point (e.g. name of a folder, experiment, specimen, sample or cytometer settings correlated to a sample, etcetera) Procedure: - turn on the machine and the computer - open the FACSDiva software and after connection with the flow cytometer perform a fluidic start up, followed by the necessary cleaning steps, i.e. prime after FACS flow refill, bubble filter purge and de-gas flow cell - make a new folder, which is named year/month/day, e.g. 20100517 - under this folder make a new experiment, which is named according to the type of experiment and the cell type to be analyzed, e.g. sc injection of LV, lymph node cells - under this experiment set up the global work sheet (graphs visualizing the FSC/SSC and fluorescence intensity of the labels used), the cytometer settings (use the settings obtained with the spherobeads as a starting point), the specimens (e.g. setting, lymph node cells from vehicle or LV injected mice) and the samples (e.g. tube 1 and others)
64
Bijlagen - put the cursor on the first setting tube (unstained cells or negative control) - put machine in the high position and hit acquire, adjust the cytometer settings to have the negative control in the first decade (100 to 101) for all detectors - next check the single stained cells (settings) and where necessary compensate to avoid false positive signals - start the acquisition with the unstained cells by putting the precursor on the first setting tube, leaving the machine in the high position, hitting acquire and subsequently record (read at least 10000 events in the population to be analyzed, for instance CD11c) - when finished, press ‘next tube’ followed by ‘remove tube’ and replace the first tube with the next one, repeat the previous steps until all tubes are acquired - export the experiment to back up the data - the data can now be analyzed using FACSDiva Software - the FACSCanto flow cytometer needs to be cleaned by running FACSRinse, FACSSafe and Milli-Q for 2 minutes each - after this cleaning step, the fluidic shutdown procedure is started using the FACSDiva software, after which the computer and FACSCanto flow cytometer can be switched off
65
