DEN S MLÉKEM NA MENDELU

DEN S MLÉKEM NA MENDELU Minisborník p ísp vk na akci v rámci Ingrových dn 2012

Ing. Miroslav J zl, Ph.D. ÚSTAV TECHNOLOGIE POTRAVIN, MENDELU

29. února 2012 BRNO

PROGRAM SOUBORU P EDNÁŠEK

DEN S MLÉKEM NA MENDELU v rámci „Ingrových dn 2012“ st eda 29. února 2012, aula MENDELU a jako klí ová aktivita projektu OPVK Komplexní vzd lávání lidských zdroj v mléka ství 08:55-09:00 Zahájení Ing. Miroslav J zl, Ph.D. 09:00-11:30 Dopolední p ednášky prof. Ing. Pavel Jelen, Ph.D., University of Alberta, CAN: Jakost mlé ných výrobk ve sv tovém výzkumu a publikacích (09:00-09:50) Ing. Ji í Kopá ek, CSc., MSM: Mýty o jogurtech (09:50-10:45) doc. Ing. Ji í Št tina, VŠCHT Praha: Syrovátkové bílkoviny - význam ve výživ a fyzikální vlastnosti (10:45-11:30) 11:30-13:00 P estávka (prohlížení poster

a prezentace kysaných mlé ných výrobk

firmy

DANONE a.s.) 13:00-15:00 Odpolední p ednášky prof. Ing. Jana Dostálová, CSc.: Srovnání výživové hodnoty mléka a sójových nápoj (13:00-13:45) doc. Ing. Eva Samková, Ph.D., J U v eských Bud jovicích: Mastné kyseliny mlé ného tuku skotu a faktory ovliv ující jejich zastoupení (13:45-14:15) MVDr. Halina Mat jová, doc. MUDr. Jind ich Fiala, CSc., Masarykova univerzita Brno: Aktuální nutri ní pohled na mléko a mlé né výrobky (14:15-14:40) doc. Ing. Kv toslava Šustová, Ph.D., Ing. Tá a Lužová, Ph.D.: Cestování za sýry (14:40-15:00) 09:00-15:00 Posterová sekce Ing. Miroslav J zl, Ph.D. a kolektiv: Komplexní vzd lávání lidských zdroj v mléka ství a aktuální problematika

jakosti

mlé ných

výrobk

ešených

Ústavem

technologie

potravin,

AF MENDELU

Tato akce je spolufinancována z Evropského sociálního fondu a státním rozpo tem eské republiky 2

Obsah P EDNÁŠKOVÁ SEKCE Dostálová J., Šípková A.: Srovnání výživové hodnoty mléka a sójových nápoj .......

4

Kalhotka L.: Dekarboxylasová aktivita bakterií kontaminujících mléko a mlé né výrobky............................................................................................................

10

Mat jová, H., Fiala, J.: Aktuální zdravotní pohled na mléko a mlé né výrobky.........

22

Samková E., Špi ka J., Hanuš O.: Vliv plemene a individuality na složení mlé ného tuku skotu........................................................................................

24

Kolá ová M., Sládková P., Rožnovská D.: Vliv doby skladování na r st probiotických kultur v jogurtu......................................................................... P ÍLOHY

30 37

3

SROVNÁNÍ VÝŽIVOVÉ HODNOTY MLÉKA A SÓJOVÝCH NÁPOJ Jana Dostálová – Anna Šípková Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT, Praha Abstract The nutritive value of soy drinks (after older terminology soy milks) is compared with nutritive value of cow milk. Soy drinks have some advantages (they have no lactose, no cholesterol, fat has better fatty acids composition, higher content of lecithin and vitamin E, contain isoflavons etc.), but they can not be considered as equivalent replacement of cow milk from many reasons, especially lower biological value of proteins and low content of calcium with low bioavailability (in case of none fortification) and presence of some natural toxic or antinutritive compounds. Some dry soy beverages have low content of soy extract and therefore low proteins content and they content fat with unsuitable fatty acids composition (saturated fatty acids and trans-unsaturated fatty acids). Úvod Mléko pat í k základním potravinám, má vysokou výživovou hodnotu, zejména nezastupitelná je jeho role jako bohatého zdroje dob e využitelného vápníku.

Je doloženo, že lidé mléko

konzumovali od pradávna (písemné zmínky o konzumaci mléka nacházíme u všech starov kých národ a ve všech historických dobách se konzumovalo i v echách a na Morav ). P esto se objevila v médiích za átkem 90. let minulého století ada negativních informací o mléku a mnoho z nich se objevuje i v sou asnosti.

ada „odborník na výživu“ varuje, že mléko „je jedovaté“,

„zahle uje“, „je potrava pouze pro mlá ata“, „podporuje vznik osteroporózy“ a mnoho dalších nesmyslných tvrzení. Jako náhrada za mléko se doporu ují r zné rostlinné nápoje, zejména nápoje sójové. D íve se tyto výrobky nazývaly mléka, ale podle sou asné potraviná ské legislativy (podle vyhlášky Ministerstva zem d lství . 329/1997 Sb. ve zn ní platných p edpis ) se nesmí používat názvu sójové mléko, ale sójový nápoj. V zemích EU bylo toto legislativní opat ení p ijato již v roce 1994. Termín mléko se smí používat pouze pro produkt mlé né žlázy savc . K tomuto opat ení došlo proto, aby spot ebitel v d l, že konzumuje potravinu o zcela odlišném složení a tudíž se zcela odlišným p ínosem k výživ

lov ka. V následujícím textu zhodnotíme z hlediska výživového

složení kravského mléka a sójových nápoj tekutých i sušených. V p ípad sušených sójových nápoj uvedeme i výsledky vlastních analýz p ítomného tuku.

4

Sójové nápoje (d íve sójová mléka) Sójové „mléko“ je typická východoasijská potravina. Je velmi populární zejména v ín , odkud také z po átku našeho letopo tu pocházejí nejstarší písemné zmínky o jeho používání. Výroba sójového „mléka“ se však rozší ila až ve 20. století, kdy také za alo pronikat i do Evropy a USA. V pr b hu devadesátých let minulého století se i na našem trhu objevila ada výrobk na bázi sójových bob , ozna ovaná nejprve jako sójová mléka, pozd ji podle nové legislativy sójové nápoje. Sójové nápoje jsou ídké emulze, specifické chuti, p ipomínající mléko. Jejich složení závisí na použitém technologickém postupu výroby. Složení sójových nápoj uvád né v r zných literárních zdrojích je uvedeno v tabulce . 1 a obsah mastných kyselin v tabulce . 2. Tabulka . 1: Pr m rné složení tekutých sójových nápoj a plnotu ného kravského mléka (%) Živina g/100g Bílkoviny Tuky Sacharidy Popel Energie (kJ/kcal) Cholesterol Laktóza

FAO 3,6 2,3 3,4 204/49 0 0

Sójové nápoje tekuté Wikipedia Benk 3,5 4,0 2,0 2,5 2,9 3,0 0,5 0,4 0 0

0 0

USDA 3,3 1,8 6,3 0,7 226/54 0 0

Kravské mléko Kadlec a kol. 3,2 4,0 4,6 0,7 14 mg 4,6

Tabulka . 2. Obsah mastných kyselin v sójovém nápoji a v kravském mléce (g/100 g výrobku) (USDA) Mastné kyseliny

Sójový nápoj

Kravské mléko

Nasycené

0,205

2,278

Monoenové

0,401

1,057

Polyenové

0,961

0,136

Technologické postupy Tradi ní postup výroby sójových nápoj spo ívá v rozemletí namo ených sójových bob , pova ení s vodou, odst ed ní získané emulze (sediment se nazývá okara), její pasteraci a homogenizaci. Je patentována ada modifikací tohoto postupu. Zcela jiný postup navrhlo Americké ministerstvo zem d lství, který spo ívá ve výrob plnotu né sójové mouky extruzí, její dispergaci ve vod , homogenizaci a sprejovém usušení. Existují i další technologické postupy výroby sušených sójových nápoj , které se v tšinou obohacují vápníkem. Sójové nápoje se vyráb jí i r zn ochucené a na trhu jsou i sm si s mlékem kravským v r zném pom ru. N které sušené sójové nápoje obsahují 5

jen velmi malý podíl extraktu sójových bob . Sójová sušina je nahrazena sušeným kuku i ným sirupem a áste n hydrogenovaným sójovým olejem. Výživové hodnocení Sójové nápoje nemohou sloužit jako rovnocenná náhrada mléka. Jejich p edností je nep ítomnost cholesterolu a laktózy, lepší kvalita tuku z hlediska složení mastných kyselin, vyšší obsah lecitinu a vitaminu E a p ítomnost isoflavon , látek, které u starších žen p sobí preventivn proti osteoporose a kardiovaskulárním onemocn ním. Velkým nedostatkem (pokud se nejedná o nápoje obohacené) je nízký obsah vápníku (v pr m ru 25 mg/100g, zatímco tekuté mléko obsahuje pr m rn 120 mg/100g), který je navíc málo využitelný (max. 10%; v mléce je využitelnost vápníku cca 30 %), nep ítomnost vitamin D a B12 a dále nižší biologická hodnota bílkovin. V n kterých sušených výrobcích je velice nízký obsah bílkovin (pouze n kolik procent – v námi analyzovaných výrobcích se obsah bílkovin pohyboval v rozmezí 2,1-5,5 %, s výjimkou jednoho nápoje ozna eného extra protein, který obsahoval 28 % bílkovin, zatímco kravské sušené mléko obsahuje zhruba 25 % bílkovin). Jsou to v podstat sm si upravených škrob s tukem (v tšinou ve stejném množství jako v sušeném plnotu ném mléce) a malým množstvím extraktu ze sójových bob . Tuk sušených nápoj

má asto nevhodné složení mastných kyselin (vysoký obsah trans-nenasycených nebo

nasycených mastných kyselin). Sušené sójové nápoje obsahují, na rozdíl od sušeného kravského mléka) vždy i látky p ídatné – stabilizátory (nej ast ji fosfore nan draselný), emulgátory a protispékavé látky (oxid k emi itý). Nevýhodou také je, že sójové boby jsou daleko v tším alergenem než kravské mléko a obsahují pestrou škálu p írodních toxických a antinutri ních látek, v etn látek které zp sobují nadýmání, které mohou z ásti p ejít i do sójových nápoj . Nejvýznamn jšími atinutri ními látkami sójových bob jsou inhibitory proteas (trypsinua chymotrypsinu), které snižují využitelnost bílkovin. Další jsou lektiny (zp sobují zpomalení r stu), goitrogenní látky (ovliv ují nep ízniv

innost štítné

žlázy) a antivitaminy. Všechny tyto látky lze spolehliv odstranit teplem, a proto v sójových nápojích, pokud jsou vyrobeny seriozními výrobci, nebezpe í z jejich p íjmu nehrozí. Další negativní složky jsou již tepeln stabilní. P edevším je to kyselina fytová, která váže minerální látky do obtížn

využitelných komplex

fytoestrogeny (v poslední dob

a zp sobuje jejich nižší využitelnost, dále saponiny,

se poukazuje i na jejich p íznivé p sobení), nestravitelné

oligosacharidy (rafinosa, stachyosa, verbaskosa aj.) zp sobující nadýmání, lysinoalanin, alergeny a puriny. N kterými speciálními postupy je lze do ur ité míry odstranit, ale s jejich p ítomností v sójových nápojích musíme po ítat. Uvedené antinutri ní a toxické látky se, krom posledních t í, v 6

kravském mléce prakticky nevyskytují. N které z nich jsou sice obsaženy v krmivech, ale živo išný organismus p sobí jako filtr a do mléka jich p echází jen velmi nepatrné množství. Jak již bylo uvedeno, v tšina negativn p sobících látek obsažených v sójových nápojích se tepelným ošet ením inaktivuje, ale ást z stává, a proto bychom sójových nápoj , stejn jako ostatních výrobk ze sóji nem li konzumovat velká množství. Sójové nápoje nejsou z hlediska senzorického pro v tšinu našich spot ebitel p íliš atraktivní, a proto se asto ochucují r znými p ísadami nebo se vyráb jí sm si s kravským mlékem nebo syrovátkou. V p ípad sm sí je nutné výrobky ozna it, že se jedná o sm s s kravským mlékem, protože lidé, kte í trpí laktosovou intoleranci nebo alergií na mlé né bílkoviny by po požití sm sného výrobku mohli mít i vážné zdravotní potíže. Z výše uvedeného vyplývá, že sójové nápoje nejsou plnohodnotnou náhradou kravského mléka. Nejv tšími nedostatky jsou nižší biologická hodnota bílkovin, u n kterých i jejich nízký obsah, nižší obsah a malá využitelnost minerálních látek (pokud se nejedná o výrobky minerálními látkami obohacené), p edevším vápníku a zinku, nep ítomnost vitamin D a B12 a p ítomnost antinutri ních a toxických látek. Sójové nápoje mají na druhé stran n které p ednosti, zejména nep ítomnost cholesterolu a p ízniv jší složení mastných kyselin tuku. V p ípad , kdy je náhrada sójovými výrobky nezbytná, nap . u kojenc nesnášejících kravské mléko, je nutné používat pouze speciální výrobky, ze kterých byly odstran ny antinutri ní látky vhodnými technologickými postupy a výrobky obohaceny t mi živinami, kterých mají sójové výrobky nedostatek Vlastní analýzy sušených sójových nápoj Na našem pracovišti jsme analyzovali složení mastných kyselin tuku 10 sušených sójových nápoj , které jsme nakoupili ve tvrtém tvrtletí roku 2009 v pražské tržní síti. Obsah tuku byl stanoven po obnov

nápoje dvojnásobnou extrakcí sm sí rozpoušt del (ethanol, hexan, diethylether).

Kvalitativní a kvantitativní analýza mastných kyselin byla provedena v izolovaném tuku po p evedení na methylestery na kapilární kolon Supelco SP 2560, plynový chromatograf Hewlett Packard 6890 s plamenovým ioniza ním detektorem.

7

Výsledky Tabulka 3. Obsah tuku (%) a složení mastných kyselin v % z celkových mastných kyselin tuku sušených sójových nápoj Vzorek Název výrobku 1

Soja Milk natural

2

Zajíc Sojový nápoj Plus

3

Soja Milk vanilka

4

Soja Milk cappuccino

5

Soja Milk extra protein

6

Zajíc Sójový nápoj s vlákninou

7 8

Zajíc Sójový nápoj s p íchutí smetany ActiveMilk

9

Soja Milk jahoda

10

Zajíc Sojový nápoj Natural

Obsah tuku 24 26 24 24 10 23 25,5 17,3 24 27,4

TFA

SAFA MUFA

PUFA

Ostatní

0,46

93,19

3,48

2,61

0,26

48,27

25,35

23,35

1,74

1,29

0,14

96,48

1,37

1,95

0,05

0,11

92,29

4,63

2,70

0,27

0,12

94,95

2,08

2,71

0,15

48,96

25,54

23,64

0,72

1,14

49,33

24,96

23,48

0,78

1,45

48,15

25,74

24,16

0,90

1,06

0,62

95,34

1,69

1,93

0,42

49,17

25,18

23,51

0,78

1,36

Diskuse výsledk Z výsledk našich analýz plyne, že tuk poloviny sušených sójových nápoj obsahoval velmi vysoké množství (48,2 - 49,3 %) trans-nenasycených mastných kyselin (byl použit áste n ztužený tuk). Obsah trans-nenasycených mastných kyselin v jedné porci (25 g sušeného výrobku) p ekro il u ty výrobk (Zajíc Sójový nápoj Plus, Zajíc Sójový nápoj s vlákninou, Zajíc Sójový nápoj s p íchutí a Zajíc Sójový nápoj natural) tolerovatelný denní p íjem 2,5 g. Druhá polovina vzork sice transnenasycené mastné kyseliny neobsahovala, ale podle složení mastných kyselin obsahovala tuk kokosový nebo palmojádrový s vysokým obsahem nasycených mastných kyselin (92,3 – 96,5%) s vysokým podílem kyseliny laurové a myristové, které mají silné aterogenní ú inky. Z hlediska kardiovaskulárních onemocn ní nemá mlé ný tuk výhodné složení, ale tuk p ítomný v námi analyzovaných sušených sójových nápojích je ješt výrazn horší. Záv r Sójové nápoje jsou zpest ením sortimentu potraviná ských výrobk a pot ebným výrobkem pro vegany a lidi nesnášející laktosu nebo mající alergii na mlé né výrobky. Pro zdravou populaci by však v žádném p ípad nem ly sloužit jako náhrada mléka, protože se jedná o potravinu zcela jiného složení. Složení sušených sójových nápoj je z hlediska výživového velmi nevýhodné, jak 8

bylo podrobn uvedeno v textu. O významu pro výživu mnoho napoví surovinové složení a údaje o obsahu jednotlivých nutrient , a proto je nutné sledovat údaje na etiket , zvlášt p i použití t chto výrobk pro výživu d tí, t hotných a kojících žen a starých lidí. Souhrn V p ísp vku je zhodnocena výživová hodnota sójových nápoj a srovnána s výživovou hodnotou mléka kravského. Sójové nápoje mají ve srovnání s kravským mlékem ur ité p ednosti (neobsahují laktosu, cholesterol, tuk má vhodn jší složení mastných kyselin, vyšší obsah lecitinu a vitaminu E, obsahují pozitivn p sobící látky nap . isoflavony aj.), ale nelze je považovat za rovnocennou náhradu mléka, zejména z d vodu nižší biologické hodnoty bílkovin a nízkého obsahu špatn využitelného vápníku (pokud nejsou obohaceny) a obsahu n kterých p írodních toxických a antinutri ních látek. N které sušené sójové nápoje obsahují velmi malé množství extraktu sójových bob a tudíž mají nízký obsah bílkovin a obsahují p idaný tuk o nevhodném složení mastných kyselin (nasycené mastné kyseliny nebo trans-nenasycené mastné kyseliny).

Literatura And l M., Bayer M., Dlouhý P., Dostálová J., Drbohlav J., Kunešová M., Nevoral J., Tláskal P.: Mléko a mlé né výrobky ve výživ , potraviná ská komora eské republiky, Praha 2010 Benk, E: Ind. Obst. u. Gemüseverwert, 71, s. 390, 1986 Dostálová J.: Význam sóje v lidské výživ , Ústav v deckotechnických informací pro zem d lství (nyní ÚZEI), Praha 1990 Kadlec P., Melzoch K., Vold ich M a kol.: Co byste m li v d t o výrob potravin?, KEY Publishing s.r.o., Ostrava, 2009 USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 23 (2010) Wikipedia, free encyklopedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Soy_milk, 15.4.2011)

Kontaktní adresa:

Anna Šípková, Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6, R

9

DEKARBOXYLASOVÁ AKTIVITA BAKTERIÍ KONTAMINUJÍCÍCH MLÉKO A MLÉ NÉ VÝROBKY Libor Kalhotka Ústav agrochemie, p doznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, AF MENDELU, Zem d lská 1, 613 00 Brno ÚVOD Biogenní aminy jsou p ítomny ve všech živých organismech a jsou pro organismus nepostradatelné. V nadlimitních koncentracích však mohou mít na organismus negativní vliv. V potravinách a krmivech p edstavují biogenní aminy jedny z nežádoucích zplodin kone ného rozkladu bílkovin. Z hlediska potravin a výživy je rozhodující cestou vzniku biogenních amin dekarboxylace p irozených aminokyselin p sobením enzym n kterých bakterií. Dekarboxylace je d j, kdy se odbourává karboxylová skupina – COOH a vytvá í se oxid uhli itý, ú inný enzym se pak nazývá dekarboxylasa (KALA et K ÍŽEK, 2002) Tvorba biogenních amin je složitý proces závislý na mnoha faktorech, jejichž identifikace je obtížná (BOVER-CID et al., 2000). Vznik a množství biogenních amin v potravinách nebo potraviná ských surovinách lze tedy ovlivnit omezením bakteriálního r stu nebo inhibicí aktivity p íslušných enzym p sobením ady faktor . K nejvýznamn jším pat í teplota, aktivita vody, pH, doba skladování, obsah solí a redox potenciál. Teplota prost edí významn ovliv uje enzymatickou aktivitu mikroorganism a tím samoz ejm i vznik biogenních amin . Obecn platí, že produkce biogenních amin je úm rná teplot a dob skladování. Teplota skladování m že ovlivnit obsah biogenních amin v potravinách (SILLA SANTOS, 1996). Mezi potraviny v nichž se mohou vyskytnout biogenní aminy, pat í mléko a p edevším mlé né fermentované výrobky, zejména sýry. Mezi bakterie, které se mohou vyskytnout v mléce a mlé ných výrobcích, mohou produkovat dekarboxylasy a podílet se tak na jejich vzniku, pat í nap . druhy rodu Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Shigella, Salmonella, Lactobacillus, Streptococcus a Enterococcus (VYLET LOVÁ et al., 2010). Koncentrace biogenních amin v erstvém mléce je nepatrná. V erstvém mléce, mlé ných nápojích a výrobcích, které nejsou fermentované, se nacházejí aminy (propylamin, hexylamin, alifatické di- a polyaminy, histamin a tyramin) v množství mén než 1 mg/kg. Krom toho se zde m že vyskytovat putrescin, kadaverin, spermin a spermidin (GREIFOVÁ et al., 2003). P ítomnost polyamin

v sýrech má s nejv tší pravd podobností p vod v mléce (SILLA SANTOS, 1996).

Nejvýznamn jšími fermentovanými mlé nými výrobky s nejvyšším množstvím biogenních amin jsou sýry. Tvorba biogenních amin v sýrech je závislá na koncentraci aminokyselin nebo peptid , 10

které ú inkují jako prekurzory jejich tvorby, p ítomnosti bakterií schopných dekarboxylovat aminokyseliny, pH, koncentraci solí, vodní aktivit , množství mikroorganism a na p ítomnosti kofaktor jako je pyridoxalfosfát (je ve velkém množství p ítomný v sýrech), nezanedbatelnou roli zde hraje i dlouhá doba zrání sýr . Podmínkou vzniku toxického množství v sýrech je proteolýza, která je p i zrání sýr považována za jeden z nejd ležit jších pochod ovliv ujících kvalitu sýra. Na proteolýze mlé ných bílkovin se podílejí nativní proteasy z mléka a proteasy kontaminující mikroflóry, podle MARINO et al. (2000) existuje pozitivní korelace mezi koncentrací kadaverinu a množstvím Enterobacteriaceae v sýrech, ale hlavn

bakterie startovacích kultur Lactobacillus

lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium (GREIFOVÁ et al., 2003). Podíl mikroorganism startovacích kultur na tvorb biogenních amin potvrzují i STRATTON (1991) a LEUSCHNER et al. (1998).

V menší mí e se na tvorb

biogenních amin mohou podílet i bakterie rodu Propionibacterium a Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. Podle LEUSCHNER et al., 1998 se na tvorb biogenních amin v sýru gouda mohou podílet i laktobacily používané p i výrob . Jako p í inu vyšší etnosti otrav biogenními aminy uvádí KALA et K ÍŽEK (2005) vysoké obsahy tyraminu a nebo histaminu. Sýry jsou po rybách nej ast jší potravinou zp sobující otravy histaminem (SILLA SANTOS, 1996). DOEGLAS et al. (1967) uvád jí, že gouda obsahující 65 mg histaminu/100g byla p í inou otrav v Holandsku. Vyšší obsahy t chto amin jsou v sýrech zrajících pod mazem (typu tvar žk

i romaduru) a v sýrech polom kkých a plís ových. Další skupinou jsou

sýry vyráb né z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek (nap . brynza). Ve tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny biogenních amin nižší. Množství tyraminu v sýrech m že dosáhnout 500mg/kg, když jsou p ítomny proteolytické enzymy a tyrosindekarboxylasa pozitivní kmeny Enterococcus faecalis (GREIFOVÁ 2003; GREIF et GREIFOVÁ, 2006). KEBARY et al. (1999) udávají množství biogenních amin v sýrech až nad 1g/kg. V edaru byla detekována množství tyraminu 1500 mg/kg (HÁLÁSZ et al., 1994). Tyramin zp sobuje zúžení periferních cév zvýšenou respiraci, slin ní, migrény a zvýšení hladiny krevního cukru. HALÁSZ et al. (1994) uvádí, že tyramin je pravd podobn

tvo en aerobní mikroflórou a ne laktobacily

p idanými v pr b hu výroby. Sýry jsou dobrým substrátem pro tvorbu biogenních amin , ale minimální výskyt otrav ukazuje, že p i zachování správných technologických postup se možnosti jejich tvorby minimalizují. (GÖRNER et VALÍK, 2004)

11

METODIKA Princip: p i dekarboxylaci aminokyseliny obsažené v diagnostickém médiu odšt pí p íslušná dekarboxylasa karboxylovou skupinu z aminokyseliny za vzniku CO2 a alkalického aminu. Pozitivní výsledek se pak projeví zbarvením indikátoru zp sobeným zm nou pH. Postup: sterilní zkumavky 80 x 10 mm byly pln ny 1 ml diagnostického média (BROOKS et SODEMAN, 1974) pro testováni E. coli, bacil a enterokok nebo 2 ml diagnostického média (DAVIS, 1955, modifikace CCM) pro testování laktobacil , zality 0,5 ml parafinového oleje a sterilizovány 15 min. p i 121 °C. Do takto p ipravených zkumavek byla o kovací kli kou inokulována 24 hodinová mikrobiální kultura. Pro testování bylo použito 7 aminokyselin: lysin (LYS), arginin (ARG), ornithin (ORN), phenylalanin (PHE), histamin (HIS), tyrosin (TYR) a tryptofan (TRP). Pro testování dekarboxylasové aktivity bylo použito 9 izolát Enterococcus, izolovaných z kozího mléka a sýr

bakterií rodu

(Tab 1). Dále pak 20 izolát

Bacillus

licheniformis získaných z mléka z Výzkumného ústavu pro chov skotu, s.r.o., Rapotín (Tab. 2). Inkubace zkumavek probíhala p i 6, 25, 30 a 37 °C po dobu 10 dn . 25 izolát Escherichia coli získaných v tšinou z mléka a mlé ných výrobk (Tab. 3) a dodaných rovn ž z VUCHS Rapotín. Inkubace zkumavek probíhala p i 30 a 37 °C (izoláty íslo 12 – 25 pouze p i 37 °C) a 12 kmen laktobacil izolovaných ze sýr (Tab. 4) dodaných z Výzkumného ústavu mlékárenského Tábor. Inkubace zkumavek probíhala p i 25, 30 a 37 °C (kmeny laktobacil 6,8,10,12,13 pouze p i 37 °C) po dobu 10 dn , v jejichž pr b hu byly hodnoceny barevné zm ny. Tab. 1: Identifikace bakterií rodu Enterococcus Vzorek .

Identifikace

P vod

1

Enterococcus faecium

syrové kozí mléko (Šoš vka)

2

Enterococcus faecium

syrové kozí mléko (Šoš vka)

3

Enterococcus spp.

kozí sýr (Ratibo ice)

4

Enterococcus mundtii

kozí sýr (Šoš vka)

5

Enterococcus faecium

syrové kozí mléko (Šoš vka)

6

Enterococcus faecium

syrové kozí mléko (Šoš vka)

7

Enterococcus faecium

syrové kozí mléko (Šoš vka)

8

Enterococcus durans

kozí sýr (Ratibo ice)

9

Enterococcus durans

kozí sýr (Ratibo ice)

12

Tab. 2: Testované izoláty Bacillus lichenifoemis Izolát . 1Bl 2Bl 3Bl 4Bl 5Bl 6Bl 7Bl 8Bl 9Bl 10Bl 11Bl 12Bl 13Bl 14Bl 15Bl 16Bl 17Bl 18Bl 19Bl 20Bl

Izolace mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko mléko

P vod Trnov kravín Rychlý Pavel Újezd dojírna I cisterna Bohemilk Bureš Jan Pisty Medv dice firma Klapý Brejcha Václav linka 2 linka 4 P emysl Brodský Šedivec II kravín Dolní Sloupnice Opatovec cisterna 9 cisterna 2 Hostice II Hostice IV Ing. Divišová Blažena Fa. Chlumek

Druh bakterie B.licheniformis B.lichenifomis. B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis B.licheniformis

Tab. 3: Identifikace izolát Escherichia coli Izolát

P vod

1 Ec 2 Ec 3 Ec 4 Ec 5 Ec 6 Ec 7 Ec 8 Ec 9 Ec 10 Ec 11 Ec 12 Ec 13 Ec 14 Ec 15 Ec 16 Ec 17 Ec 18 Ec 19 Ec 20 Ec 21 Ec 22 Ec 23 Ec 24 Ec 25 Ec

Syrové kravské mléko - bazén Malonty 17.4.2008 Syrové kravské mléko - bazén Malonty 17.4.2008 Syrové kravské mléko - individuální vzorek Jedlí 22.4.2008 Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kozí mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Syrové kravské mléko Kozí sýr - tržní sí , kozí farma B ezí Kozí sýr - tržní sí , Král sýr kozí, Polsko Kozí sýr Kozí sýr Syrové ov í mléko Ov í sýr Ov í sýr Syrové ov í mléko Syrové ov í mléko Syrové ov í mléko Ov í sýr – tržní sí , Hypernova SR, dod. Regia Logistik Ov í sýr – tržní sí , Tesco Brno Mléko bazén - Kv tná II 2009 Voda – studna Rapotín 2009

13

Tab. 4: Testované kmeny laktobacil Izolát . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Výsledek identifikace Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus subsp.curvatus neidentifikováno Lactobacillus curvatus subsp.curvatus

P vod vysokodoh ívaný sýr vysokodoh ívaný sýr vysokodoh ívaný sýr vysokodoh ívaný sýr nízkodoh ívaný sýr nízkodoh ívaný sýr m kký sýr nízkodoh ívaný sýr sbírkový kmen sbírkový kmen vysokodoh ívaný sýr m kký sýr

VÝSLEDKY A DISKUSE V pr b hu 10 dn

byla u vybraných mikroorganism

testována dekarboxylasová aktivita p i

r zných teplotách. B hem kultivace bylo zjišt no, že za ur itých podmínek byly všechny izoláty enterokok

(Tab. 1, Obr. 1 a 2) schopny dekarboxylovat aminokyseliny arginin a tyrosin.

Dekarboxylací argininu vzniká biogenní amin agmatin a z tyrosinu tyramin (VELÍŠEK, 1999). Aminokyseliny

lysin,

ornitin,

fenylalanin,

histamin

a

tryptamin

nebyly

testovanými

mikroorganismy v bec dekarboxylovány. Dekarboxylace byla významnou m rou ovlivn na teplotou kultivace. Zatímco p i 6 °C nevykázal pozitivní reakci ani jeden z testovaných izolát , p i 30 °C a 37 °C reagovaly tém

všechny. Intenzita barevných reakcí byla ovlivn na rovn ž dobou

kultivace. Zatímco p i 30 °C byla reakce tyraminu u všech pozitivních vzork velice pozvolná, pozitivní reakce u argininu p i 37 °C byla silná už prvních dnech testování (zejména u vzorku 3 a 4). Lze íci, že enterokoky vykazovaly v tší schopnost dekarboxylovat arginin.

Enterokoky

izolované ze sýru (vzorky 3 a 4) vykazovaly oproti ostatním testovaným izolát m vyšší dekarboxylasovou aktivitu pro tyramin. Mohou se tak také významn podílet na produkci tyraminu v sýrech.

Obr. 1: Dekarboxylace argininu enterokoky v pr b hu 10 dn p i 37 °C

Obr. 2: Dekarboxylace tyrosinu enterokoky v pr b hu 10 dn p i 30 °C

14

Dalším testovaným druhem mikroorganism byl Bacillus licheniformis. Ten je spolu s B. cereus, B. subtilis astým kontaminantem syrového i tepeln ošet eného mléka a mlé ných výrobk (FRANK, 2001 GRIFFITHS, 2009). Je to fakultativn anaerobní, gram-pozitivní, pohyblivá, sporulující ty inka 0,6-0,8 x 1,5-3,0 µm velká, vyskytující se jednotliv v párech nebo etízcích. Teplota r stu se pohybuje v rozmezí od 15 °C do 50-55 °C (u izolát z geotermálního prost edí až 68 °C). Optimální pH r stu je mezi 5,7 až 6,8. Roste i p i 7 % NaCl. Je obvykle arginindihydrolasa pozitivní, fenylalanin nedeaminuje, lysin ani ornitin nedekarboxyluje (LOGAN et DE VOS, 2009). B. licheniformis pat í mezi bacily s menší proteolytickou aktivitou (N ME KOVÁ et al., 2010). M že být p vodcem enterotoxikos a septických stav (R ŽI KA, 2003). Pr myslov m že být využit k produkci antibiotik (BEDNÁ et al., 1996). V pr b hu 10 dn

bylo p i teplotách 6, 25, 30 a 37 °C testováno 20 izolát

Bacillus

licheniformis získaných z mléka (Tab. 2). Po 10 dnech inkubace byly zjišt ny následující výsledky (Obr. 3). Kultivací p i 6 °C nebyla ani u jednoho z testovaných izolát zjišt na dekarboxylasová aktivita. Dekarboxylasová aktivita byla prokázána p i kultivaci ve 25 °C u 13 izolát (tyrosin), ve 30 °C u 18 izolát pro tyrosin, 4 pro ornitin, 2 pro phenylalanin, a 1 pro arginin a ve 37 °C u 20 izolát pro tyrosin, 6 pro tryptofan, 5 pro ornitin, 4 pro phenylalanin a 1 izolátu pro lysin, p i emž první pozitivní reakce byly zaznamenány již po 48 h kultivace. Z výsledk

je z ejmé, že

dekarboxylasová aktivita rostla p ímo úm rn s r stem teploty kultivace. Kup íkladu Bacillus macerans izolovaný z italského sýra byl schopen produkovat histamin p i 43, 37, 30, 22 a 4 °C, ale nejvyšší produkce bylo dosaženo p i maximálním r stu bakterií za 30 °C (RODRIGUEZ-JEREZ et al., 1994). V modelovém p ípadu p i skladování trvanlivého polotu ného mléka ve 4 °C nebyla u B. licheniformis zaznamenána proteolýza, p i skladování ve 24 °C byl po t ech týdnech zjišt n pokles obsahu bílkovin a zvýšení množství volného tyrosinu (JANŠTOVÁ et al., 2004). Zv tšující se po et izolát B. licheniformis vykazující dekarboxylasovou aktivitu tedy odpovídá teplotním nárok m. Ze sedmi testovaných aminokyselin bylo nejvíce pozitivních reakcí zjišt no u tyrosinu. 10. den kultivace byla dekarboxylasová aktivita pro tuto aminokyselinu zjišt na u 13 izolát kultivovaných p i 25 °C, 18 izolát p i 30 °C a 20 izolát p i 37 °C, p i této teplot byly reakce až na výjimky nejintenzivn jší. První pozitivní reakce u n kterých izolát byly zjišt ny již po 48 h kultivace. Intenzita reakcí se s dobou kultivace zvyšovala. Dekarboxylasová aktivita byla dále zjišt na u tryptofanu, ale pouze u 6 izolát

kultivovaných p i 37 °C.

Schopnost dekarboxylovat

aminokyseliny byla zjišt na rovn ž u n kolika málo izolát pro fenylalanin (6) a ornithin (9) kultivace p i 30 a 37 °C, jedna slabá pozitivní reakce pro arginin byla zjišt na u izolátu 8Bl (p i 30 15

°C) a u izolátu 13Bl pro lysin (p i 37 °C). Protože B. licheniformis lysin ani ornithin nedekarboxyluje (LOGAN

et DE VOS, 2009), m že se v p ípadech, kdy byla u t chto

aminokyselin zaznamenána pozitivní reakce jednat o reakce falešn pozitivní, které se mohou n kdy vyskytnout ( BOVER-CID et HOLZAPFEL, 1999). Ve v tšin námi zjišt ných p ípad šlo o slabé reakce. U histidinu nebyla dekarboxylasová aktivita zjišt na u žádného izolátu. Podobné výsledky byly rovn ž zjišt ny u 7 testovaných izolát Bacillus licheniformis (DOSED L et al., 2009). Pokud by tedy mléko nebo mlé né výrobky byly kontaminovány testovanými izoláty B. licheniformis, mohly by se tyto bakterie podílet na tvorb biogenních amin a to p edevším na tvorb tyraminu.

Obr. 3: Intenzita reakcí dekarboxylace tyrosinu B. licheniformis 10. den p i teplotách 6, 25, 30 a 37 °C

K významným kontaminant m mléka pat í rovn ž Escherichia coli. Po 10 dn

bylo p i

teplotách 30 a 37 °C (izoláty 12 - 25 pouze p i 37 °C) testováno 25 izolát E. coli (viz Tab. 3). Po 10 dnech inkubace byly zjišt ny následující výsledky. Z 11 testovaných izolát p i 25 °C byla barevná reakce prokazující dekarboxylasovou aktivitu zjišt na u 2 izolát

pro arginin, 10 pro

ornitin, 7 pro fenylalanin, 10 pro tyrosin a 9 pro tyramin, u lysinu a histidinu nebyla dekarboxylasová aktivita zjišt na. P i teplot 37 °C bylo testováno 25 izolát E. coli u nichž byla zjišt na dekarboxylasová aktivita pro arginin u 2 izolát , pro ornitin u 21 izolát , pro fenylalanin u 12 izolát , pro histidin u 1izolátu, pro tyrosin u 22 izolát , a pro tryptofan u 19 izolát . U lysinu nebyla dekarboxylasová aktivita op t zaznamenána. Optimální r stová teplota E. coli je 37 °C (SEDLÁ EK, 2007). To potvrdili svými zjišt ními i GREIF et GREIFOVÁ (2004), kte í nejrychlejší nár st kolonií nam ili p i 37 °C. U izolát

1Ec, 2Ec a 3Ec, které byly již d íve

testovány i p i 6 °C, nebyla p i této teplot prokázána dekarboxylasová aktivita. Význam optimální 16

teploty pro funkci dekarboxylas a tvorbu biogenních amin zd raz ují ve svých pracích SILLA SANTOS (1998), BOVER-CID et HOLZAPFEL (1999). P i testování dekarboxylasové aktivity u kmen E. coli, jíž se zabývali GREIFOVÁ et al. (2003) se tato bakterie ukázala jako významný producent biogenních amin . P i všech teplotách testování docházelo k produkci kadaverinu a putrescinu. Optimální teplota r stu E. coli je 37 °C a p i této teplot je schopna produkovat kadaverin již po devíti hodinách kultivace (GREIFOVÁ et al., 2003). U námi testovaných izolát však dekarboxylasová aktivita pro lysin, z n jž se tvo í kadaverin, nebyla zjišt na. Producenty biogenních amin

mohou být rovn ž bakterie mlé ného kysání. Krom

definovaných mezofilních a termofilních zákysových kultur se p i výrob n kterých sýr uplat ují i kultury nedefinované. Nezákysové bakterie mlé ného kysání jsou skupinou tvo enou p edevším mezofilními laktobacily (Lactobacillus casei, L. rhamnosus, L. paracesei, L. plantarum, L. curvatus). Tyto bakterie pochází p edevším z nepasterovaného mléka, u sýr vyráb ných z mléka pasterovaného je jejich zdrojem rekontaminace mléka ze za ízení i z p edešlých výrob. B hem 10 dn bylo p i teplotách 25, 30 a 37 °C (kmeny 6, 8, 10, 12, 13 pouze p i 37 °C) testováno 12 mikrobiálních kmen laktobacil izolovaných ze sýr (Tab. 4). Po 10 dnech inkubace byly zjišt ny tyto výsledky: p i 25 °C byla zjišt na silná pozitivní reakce kmen 2, 5, 11 u argininu a slabá reakce kmene 9 u ornithinu. Inkubace p i 30 °C se projevila silnou pozitivní reakcí kmene 5 a 11 u argininu a slabou reakcí kmene 9 u ornithinu a histidinu. P i 37 °C byla prokázána silná pozitivní reakce kmene 11 u argininu a slabá reakce kmene 2 u tyrosinu, kmene 5 u lysinu a argininu, kmen 10, 12, 13 u tyrosinu a kmene 9 u ornithinu. Optimální r stová teplota laktobacil je 30 až 40 °C (SEDLÁ EK 2007). Význam optimální teploty pro funkci dekarboxylas a tvorbu biogenních amin zd raz ují ve svých pracích SILLA SANTOS (1998), BOVER-CID et HOLZAPFEL (1999) a GREIFOVÁ et al. (2003). Mnohé kmeny laktobacil

v etn L. curvatus

jsou uvád ny jako

producenti tyraminu (CHOUDHURY et al., 1990; DE LLANO et al., 1998; BOVER-CID et al., 2001; PEREIRA et al., 2001). Také n které naše kmeny vykázaly pozitivní, i když ne p íliš silnou reakci na tyramindekarboxylasu. Nejsiln jší dekarboxylasová aktivita u námi testovaných kmen byla však prozatím zjišt na u argininu (Obr. 4). Protich dné údaje uvádí literatura u schopnosti bakterií mlé ného kvašení tvo it histamin. SILLA SANTOS (1998) a BOVER-CID et al. (2001) nepozorovali u laktobacil aktivitu histidindekarboxylasy, naopak p ítomnost tohoto enzymu u mnoha laktobacil uvádí BOVER-CID et HOLZAPFEL (1999) a DAPKEVICIUS et al, (2000). Slabá aktivita histidindekarboxylasy byla prozatím zjišt na pouze u jednoho námi testovaného kmene.

17

síla reakce

3 1/2

1

3

2

2 1/2

3 4

2

5 6

1 1/2

7

1

8 9

1/2

10

0 Lys

Lys

Lys

Arg

Arg

Arg

Orn

Orn

Orn

Phe

Phe

Phe

His

His

His

Tyr

Tyr

Tyr

Trp

Trp

Trp

25°C

30°C

37°C

25°C

30°C

37°C

25°C

30°C

37°C

25°C

30°C

37°C

25°C

30°C

37°C

25°C

30°C

37°C

25°C

30°C

37°C

11 12

Obr. 4: Pozitivní reakce testování dekarboxylasové aktivity laktobacil 10. den inkubace p i 25, 30 a 37 °C.

KALA et K ÍŽEK, (2002) uvádí, že dekarboxylasové aktivity, stanovené r znými autory u téhož mikrobiálního druhu, mohou být rozdílné, jelikož uvnit jednotlivých druh existují desítky kmen , které se mohou v této vlastnosti velmi výrazn lišit. Teplota prost edí významn ovliv uje enzymatickou aktivitu mikroorganism . Podle ASCAR et TREPTOW (1986) je optimum pro innost L-lysindekarboxylasy p i teplot 37 °C. I u námi testovaných izolát byla vyšší aktivita dekarboxylas provázená intenzivn jší barevnou reakcí, s jistými výjimkami, zjišt na p i 37 °C. Kultivací p i 6 °C nebyla ani u jednoho z testovaných izolát

enterokok , B. licheniformis a

vybraných E. coli zjišt na dekarboxylasová aktivita. S ohledem na možnou produkci biogenních amin lze tedy tuto teplotu považovat za vyhovující pro uchovávání mléka a mlé ných výrobk . D ležitým faktorem je také as. Mnoho autor uvádí, že obsah biogenních amin stoupá s asem a teplotou skladování (SUZZI et GARDINI, 2003). V rámci našeho testování byly sledovány zm ny intenzity barevných reakcí indikujících aktivitu dekarboxylas po dobu 10 dn . BOVER-CID et HOLZAPFEL (1999) sledovali své vzorky 4 dny v anaerobním i aerobním prost edí, JOOSTEN et NORTHOLT (1987) vzorky kultivovali 7 dní p i 30 °C. Delší dobu testování pak nedoporu ují vzhledem k možnosti zkreslení reakcí vlivem jiných metabolických reakcí. Aktivita dekarboxylas se ale u našich izolát projevila ve v tšin p ípad již mnohem d íve, v p ípad ornitinu p i 37 °C již v b hem prvních 24 h, v následujících dnech pak docházelo v tšinou jen k zvyšování intenzity barevné reakce Koncentrace biogenních amin

v etn

tyraminu ale nebývají v erstvém mléce a

nefermentovaných mlé ných výrobcích vysoké (mén jak 1 mg/kg), jak uvád jí GREIFOVÁ et al. (2003). U sýr m že být naopak množství biogenních amin , p edevším tyraminu a histaminu, vysoké (KALA et K ÍŽEK, 2005 KOMPRDA et al., 2007).

18

ZÁV R Testované mikroorganismy pat í mezi významné producenty biogenních amin . Teplota prost edí tedy významn

ovliv uje enzymatickou aktivitu mikroorganism

biogenních amin . Obecn

platí, že produkce biogenních amin

a tím samoz ejm

i vznik

je úm rná teplot

a dob

skladování. Nejvyšší dekarboxylasové aktivity bylo dosaženo p i 30 a 37 °C. Naopak p i 6 °C nebyla dekarboxylasová aktivita prokázána. S ohledem na možnou produkci biogenních amin lze tedy tuto teplotu považovat za vyhovující pro uchovávání mléka a mlé ných výrobk . Dekarboxylasové aktivity, stanovené r znými autory u téhož mikrobiálního druhu, mohou být rozdílné, jelikož uvnit jednotlivých druh existují desítky kmen , které se mohou v této vlastnosti velmi výrazn lišit. POD KOVÁNÍ P ísp vek vznikl s podporou projektu MŠMT 2B08069 Národní program výzkumu - NPV II, program 2B - Výzkum vztah mezi vlastnostmi kontaminující mikroflóry a tvorbou biogenních amin

jako rizikových toxikant

v systému hodnocení zdravotní nezávadnosti sýr

na

spot ebitelském trhu.

LITERATURA

ASKAR, A., TREPTOW, H. (1986): Biogene Amine in Lebensmitteln. Vorkommen, Bedeutung und Bestimmung. Eugen Ulmer GmbH and Co., Stuttgart, Germany. 197 s., ISBN 3800121328 BEDNÁ , M., FRA KOVÁ, V., SCHINDLER, J., SOU EK, A., VÁVRA, J. (1996): Léka ská mikrobiologie. Marvil, Praha BOVER-CID, S., HOLZAPFEL, W.H. (1999): Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. of Food Microbiology 53, p.33-41. BOVER-CID, S., HUGAS, M., IZQUIERDO-PULIDO, M., VIDAL-CAROU, M.C. (2000): Reduction of biogenic amine formation using a negative amino acid-decarboxylase starter culture for fermentation of Fuet sausages. Journal of Food Protection, 63, p. 237-243. BOVER-CID, S., HUGAS, M., IZQUIERDO-PULIDO, M., VIDAL-CAROU, M.C. (2001): Amino aciddecarboxylase activity of bacteria isolated from fermented pork sausages. Int. J. of Food Microbiology 66, p. 185-189. BROOKS, K., SODEMAN, T. (1974): A rapid method for determining decarboxylase and dihydrolase activity. J. Clin. Pathol. 27, p. 148-152. DAPKEVICIUS, M.L.N.E., NOUT, M.J.R., ROMBOUTS, F.M., HOUBEN, J.H., WYMENGA, W. (2000): Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms. Int. J. of Food Microbiology 57, p. 107-114. DAVIS, G.H.G. (1955): The classification of lactobacilli from the human mouth. J. Gen. Microbiol. 13, p. 481-493. De LLANO, D.G., CUESTA, , P., RODRIGUEZ, A. (1998): Biogenic amine production by wild lactococcal and leuconostoc strains. Letters in Applied Microbiology 26, p. 270-274. DOEGLAS H. - HUISMAN J. - NATER J.: Histamine intoxication after cheese. Lancet 2, 1967, 1361-2.

19

DOSED L, L., KALHOTKA, L., VYLET LOVÁ, M., N MCOVÁ, M. (2009): Vliv teploty a asu na dekarboxylázovou aktivitu Bacillus licheniformis. [online]. In II. Konference studentské v decké a odborné innosti. s. 9. URL: http://konference2009.ptacisvet.cz/4download/sbornik2009.pdf. FRANK, J.P. (2001): Milk and Dairy Products. In Doyle, M.P. et al. Food Microbiology: fundamentals and frontiers, ASM Press Washington, DS 2001, ISBN 1-55581-208-2. GÖRNER F. - VALÍK L'. (2004): Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Malé centrum, Bratislava, 528 s. GREIF, G., GREIFOVÁ, M. (2006): Štúdium analýzy biogénnych amínov vo vybraných mlie nych výrobkoch.Mliekarstvo, no. 2, vol. 37, s. 38-42 GREIFOVÁ, M., GREIF, G., NOVORO NÍKOVÁ, B., KUBOVÁ, A. (2003): Biogénne amíny v mlie nych výrobkoch a ich tvorba enterokokami. Mliekarstvo 4/34, s. 31-33. GRIFFITHS M. W. (2009): Food safety issues and the mikrobiology of milk and dairy products. In Heredia, N., Wasley, I., García, S. Microbiologically Safe Foods, WileyHoboken, New Jersey 2009, ISBN 978-0-47005333-1. HALÁSZ A. - BARÁTH A. - SIMON-SAKARDI L. - HOLZAPFEL W. (1994): Biogenic amines and their production by microorganisms in food, Trends in Food Science Technology 5, p 42 - 49 CHOUDHURY, N., HANSEN, W., ENGESSER, D., HAMMES, W.P., HOLZAPFEL, W.H. (1990): Formation of histamine and tyramine by lactic acid bacteria in decarboxylase medium. Lett. Appl. Microbiol. 11, p. 278-281. JANŠTOVÁ, B., LUKÁŠOVÁ, J., DRA KOVÁ, M., VORLOVÁ, L. (2004): Influence of Bacillus spp. Enzymes on ultra high temperature-treated milk proteins. Acta Veterinaria, Brno, vol. 73, p. 393 - 400 KALA , P., K ÍŽEK, M. (2002): Biogenní aminy a polyaminy v potravinách. Výživa a potraviny . 1, pp. 12-13. KALA , P., K ÍŽEK, M. (2005): Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví. Potraviná ská revue 2/2005, s. 40-42. KEBARY, K.M.K., EL-SONBATY, A.H., BADAWI, R.M. (1999): Effect of heating milk and accelerating ripening of low fat Ras cheese on biogenic amines and free amino acids development. Food Chemistry 64, p. 67-75 KOMPRDA, T., SM LÁ, D., NOVICKÁ, K., KALHOTKA, L., ŠUSTOVÁ, K., PECHOVÁ, P., (2007): Content and distribution of biogenic amines in dutch-type hard cheese. Food Chemistry 102/1, p. 129-137. LEUSCHNER, R.G.K., KURIHARA, R., HAMMES, W.P. (1998): Effect of enhanced proteolysis on formation of biogenic amines by lactobacilli during Gouda cheese ripening. Int. J. of Food Microbiol. 44, p. 15-20 LOGAN, N. A., DE VOS, P.(2009): Genus I Bacillus. In De Vos et al. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology Vol. Three The Firmicutes. Springer 2009, ISBN 978-03-387-95041-9. MARINO, M., MAIFRENI, M., MORET, S., RONDININI, G. (2000): The capacity of Enterobacteriaceae species to produce biogenic amines in cheese. Letters in Appl. Microbiol. 31/2, p. 169-173 N ME KOVÁ, I., ROUBAL, P., PECHA OVÁ, M.,UHROVÁ, B., SOLICHOVÁ, K., PLOCKOVÁ, M. (2010): Bacillus cereus a další bacily v mléce – význam pro mlékárenské technologie. Krom ížské mléka ské dny 2010, Sborník p ednášek, Kromilk, a.s., s. 91-95. PEREIRA, C. I., RARRETO CRESPO, M.T., SAN ROMÃO, M.V. (2001): Evidence of proteolytic activity and biogenic amines production in Lactobacillus curvatus and Lactobacillus homobiochii. Int. Journal of Food Microbiology 68, p. 211-216. RODRIGUEZ-JEREZ, J.J., GIACCONE, V., COLAVITA, G., PARISI, E. (1994): Bacillus macerans – a new potent histamine producing microorganisms isolated from Italian cheese. Food Microbiology 11, p. 409415 R ŽI KA, F. (2003): Grampozitivní sporulující aerobní ty inky. In Votava, M. a kol. Léka ská mikrobiologie speciální. NEPTUN Brno (2003), ISBN: 80-902896-6-5 SEDLÁ EK, I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno, 270 s. ISBN 80-210-4207-9 SILLA SANTOS, M. H. (1996): Biogenic amines: their importance in foods. Int. J. of Food Sci. 29. s. 213231

20

SILLA SANTOS, M. H. (1998): Amino acid decarboxylase capability of microorganisms isolated in Spanish fermented meat products. Int. Journal Food Microbiology 39, p. 227-230.

STRATTON, J.E., HUTKINS, R.W., TAYLOR, S.L. (1991): Biogenic amines in cheese and other fermented foods. A review. J. of Food Protection 54/6, p. 460-470 VELÍŠEK, J. (1999) : Chemie potravin 1 – 3, OSSIS Tábor, ISBN 80-902391-2-9. VYLET LOVÁ, M., MANGA, I., HANUŠ, O. (2010): Výskyt mikroorganism s možnou dekarboxylázovou aktivitou u vzork mléka a sýr . In ŠUSTOVÁ, K. -- KUCHTÍK, J. -- KALHOTKA, L. -J ZL, M. -- FALTA, D. Farmá ská výroba sýr a kysaných mlé ných výrobk . 1. vyd. Zem d lská 1, 613 00 Brno: Mendelova univerzita v Brn , 2010, s. 35--36. ISBN 978-80-7375-402-0.

Kontaktní adresa: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Ústav agrochemie, p doznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, MENDELU, Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika, e-mail: [email protected]

21

AKTUÁLNÍ ZDRAVOTNÍ POHLED NA MLÉKO A MLÉ NÉ VÝROBKY Halina Mat jová – Jind ich Fiala Léka ská fakulta, Masarykova univerzita, Brno SOUHRN Šedesát milion let staré a stále nepostradatelné, co je to ? Pod touto otázkou najdeme mléko, které s objevením se savc na Zemi p ibližn p ed šedesáti miliony let stále poskytuje životn d ležité nutrienty. Vliv mléka na zdraví je stále kontroverzní téma, p edstavující dva tém tábory. Na jedné stran

nesmi itelné názorové

ada pseudov deckých guru poukazuje na mléko jako na potravinu ur enou

výhradn pro mlá ata (tele) a mléko obvi uje ze vzniku ady nemocí a tvrdí, že za vším stojí všemocný mlékárenský pr mysl a jeho lobbing. Opa ná názorová skupina n kdy naopak vidí v mléce jen pozitiva. Pokud skute n tato p evažují, pak lze mléko oprávn n doporu ovat jako sou ást správné výživy. Dopad konzumace na lidské zdraví na základ

medicíny založené na d kazech pochází z

epidemiologických studií, které hodnotí v reálných kvótních podmínkách p ímý vztah mezi konzumací mléka, eventuáln

mlé ných výrobk a výskytem ur itého onemocn ní. Jako d kaz

nesta í, že v mléce je obsažena ur itá složka, které je obecn p ipisován ur itý zdravotní efekt jak v pozitivním, tak negativním smyslu. Je t eba vid t a posuzovat efekt stravy jako pouze jeden z mnoha faktor ovliv ujících zdraví. Mezi n pat í vlivy jako genetika, pohlaví, životní styl (pohybová aktivita, kou ení stres). Navíc i mezi jednotlivci je zna ná individuální variabilita, což m že mít za následek, že stejná potravina je pro n koho prosp šná a pro jiného nikoliv. Mezi pozitivní vlivy mléka lze adit samotný obsah živin a bioaktivních látek v mléce. V posledních letech byly publikovány ady systematických p ehled a meta analýz, které ukázaly pozitivní vliv mléka z hlediska prevence rakoviny tlustého st eva, osteoporózy, hypertenze a cukrovky. Jako negativní je pohled na mléko z hlediska alergie na bílkovinu mléka, aterogenity mlé ného tuku a rakoviny prostaty. Samostatnou kapitolou je laktózová intolerance, která v podstat

nemocí není. Avšak

m že

konzument m mléka p inášet ur ité zdravotní komplikace v závislosti na množství laktózy v r zných mlé ných výrobcích a rozdílné velikosti jejich pr m rné porce. Dále se na mléko a mlé né výrobky m žeme dívat jako na funk ní potraviny. Mléko se adí mezí hlavní zdroje jodu v eské republice.Rovn ž mlé né výrobky mohou být nosi em fytosterol a p ispívat tak ke snížení hladiny cholesterolu v krvi. Nejnov ji dle novozelandské dvojit zaslepené 22

studii m že odst ed né mléko obohacené glykomakropeptidy a extrakt mlé ného tuk p edcházet akutním záchvat m dny. Pak je zde ada mýt

a pov r o mléce jako oblíbené zahle ování, akné, tvorba ledvinných kamen ,

špatná využitelnost vápníku z mléka, znehodnocení mléka antibiotiky, pasterizací atd., které se nezakládají na v decky d kazuchtivé medicín . V neposlední ad je nutno se o mléce zmínit v souvislosti i s nar stající epidemií obezity a to o p isp ní mlé ných výrobk p i strategii regulace chuti, redukce hmotnosti nebo prevenci nadváhy. Zvážíme-li všechna pro a proti, tak výrazn p evažují pozitiva. V tšina z b žn tradovaných negativ jsou vymyšlená tvrzení bez jakéhokoliv podkladu. Mléko a mlé né výrobky jsou i nadále naprosto oprávn nou sou ástí správné výživy. Dle nejnov jších výsledk lze o ekávat spíše posilování jejich pozitivního významu než naopak. Kontaktní adresa: MVDr. Halina Mat jová, doc. MUDr. Jind ich Fiala, CSc., Léka ská fakulta, Masarykova univerzita, Brno.

23

VLIV PLEMENE A INDIVIDUALITY NA SLOŽENÍ MLÉ NÉHO TUKU SKOTU Eva Samková1 – Ji í Špi ka2 – Oto Hanuš 1

Katedra veterinárních disciplín a kvality produkt , 2

Katedra aplikované chemie,

Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích, ZF, Studentská 13, 370 05 eské Bud jovice 3

Výzkumný ústav pro chov skotu, Rapotín

Abstract Fatty acids are essential in terms of human nutrition. Especially representation of unsaturated fatty acids and CLA (conjugated linoleic acid) is important for possible consumer health benefits. Beside the dairy cow nutrition also genetical (breed) impacts are asserted on fatty acid profile of milk fat. In comparison of two breed groups of individual milk samples (Czech Fleckvieh, n = 78; Holstein, n = 86) the differences in representation of lauric (C12:0; 4.69 > 4.42%) and palmitic acid (C16:0; 32.75 < 34.1%; P<0.05) were stated. The differences in C18 acids were not found. There was found interesting difference (near statistical significance) for representation of healthy desirable CLA (0.42 > 0.38%). In some of our previous results this difference was also higher in the same trend. The mentioned dependencies show that selection use for desirable changes of fatty acid profile of milk fat should be possible. Keywords: cow, milk, fatty acids, breed, individuality

ÚVOD Složení mléka a jeho komponent významným zp sobem ovliv uje jakost kone né suroviny. Mlé ný tuk je významný z hlediska nutri ního, technologického a výrazn se podílí na senzorických vlastnostech produkt (Velíšek a Hajšlová, 2009). I když v mlé ném tuku bylo identifikováno více než 400 mastných kyselin (Jensen, 2002), pouze 17 z nich má zastoupení vyšší než 0,5 % (Samková, 2011). N které mastné kyseliny jsou vzhledem k provedeným studiím (p . Mensink, 2005) hodnoceny spíše negativn (trans isomery nenasycených mastných kyselin, kyseliny laurová, myristová a palmitová), u ostatních byly prokázány pozitivní ú inky (kyselina olejová, esenciální mastné kyseliny linolová a alfa-linolenová), v etn kyseliny stearové, která je azena do skupiny nasycených mastných kyselin (German et al., 2009). 24

Zastoupení mastných kyselin je ovlivn no mnoha faktory. I když nejvýrazn jší z nich je jist faktor výživy dojnic (Kala a Samková, 2010), zm ny ve spektru mastných kyselin v d sledku úpravy krmné dávky mají v tšinou krátkodobý charakter. Významnou roli ve složení mlé ného tuku sehrávají také faktory, kde se uplat uje vliv jedince, tj. nap . vliv plemene nebo individuality dojnice (Samková, 2011). Ve srovnání s vlivy výživy nebyly v posledních dvaceti letech tyto faktory v takové mí e sledovány.

MATERIÁL A METODY Vzorky mléka pro stanovení složení mléka a zastoupení mastných kyselin v mlé ném tuku byly odebrány p i pravidelných m sí ních kontrolách užitkovosti v pr b hu celého roku 2005 od skupin dojnic eského strakatého a holštýnského plemene vyrovnaných podle po adí a stadia laktace (tabulka 1). Tabulka 1: Charakteristika skupin dojnic eského strakatého (C) a holštýnského skotu (H)

po adí laktace dny laktace

x 2,0 151

C (n=78) sx min 0,9 1 28 104

max 4 200

mléko (kg) tuk (%) bílkoviny (%) laktóza (%)

19,4 4,27 3,62 4,83

4,7 0,70 0,32 0,25

30,4 6,60 4,49 5,30

5,8 2,76 2,84 4,00

x 2,2 151

H (n=86) sx min 0,9 1 31 101

max 4 200

0,1564 0,9777

22,1 4,14 3,45 4,82

5,8 0,90 0,40 0,21

38,4 6,70 4,83 5,30

0,0019 0,3033 0,0039 0,8666

4,5 2,28 2,70 4,30

p

Obsahy tuku, bílkovin a laktózy byly ur eny spektrofotometricky p ístrojem MilkoScan 4000 (Foss Electric). Mastné kyseliny z mlé ného tuku byly stanoveny metodou plynové chromatografie (Pešek et al., 2006). Výsledky analýz byly zpracovány s využitím možností programu Statistica CZ 6.1 (Statsoft CR), ke sledování vlivu plemene byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, pro testy významnosti rozdíl mezi skupinami Fisher v LSD test.

VÝSLEDKY A DISKUZE Obsah mlé ného tuku je v porovnání s ostatními složkami mléka mnohem více prom nlivý a velká variabilita (daná zejména varia ním rozp tím) byla zjišt na i v obsazích jednotlivých mastných kyselin (tabulka 2). Zjišt né výsledky potvrzují, že plemeno vysv tluje ur itou ást variability v zastoupení mastných kyselin, jak uvádí již Kelsey et al. (2003). V tší rozdíly mezi plemeny 25

v zastoupení mastných kyselin jsou patrné u mastných kyselin tvo ených „de novo“, tj. v mlé né žláze (mastné kyseliny s krátkým a st edn dlouhým et zcem). Takový výsledek je pom rn logický, nebo se zde uplat uje užší vazba na genetickou ást ízení metabolismu vlastního jedince, na rozdíl od dalších interferen ních vliv spektra bachorové mikroflóry. V zastoupení kyseliny laurové (C12:0) a palmitové (C16:0) byly mezi plemeny také zjišt ny statisticky významné rozdíly (P<0,05). I když na zastoupení mastných kyselin s vyšším po tem uhlík (>C18) má mnohem v tší vliv výživa dojnic v etn bachorové fermentace (Chilliard et al., 2007), n kte í auto i p i ítají variabilitu ve složení mlé ného tuku mezi plemeny rozdílné aktivit

enzymu stearoyl-CoA-

desaturáza (Mele et al., 2007). Tento klí ový enzym se ú astní metabolismu lipid v mlé né žláze dojnic a je zodpov dný za biosyntézu nenasycených mastných kyselin z nasycených. V d sledku aktivity stearoyl-CoA-desaturázy vzniká ve tkáních p ibližn 80% CLA (Mosley et al., 2006). V daném souboru však statisticky významné rozdíly u kyselin C18 mezi plemeny zaznamenány nebyly (tabulka 2), což m že potvrzovat hypotézu siln jšího vlivu výživy na jejich zastoupení. Tabulka 2: Zastoupení vybraných mastných kyselin (%) v mlé ném tuku dojnic eského strakatého (C) a holštýnského skotu (H) C (n=78) x sx min C12:0 4,69 0,70 2,92 C14:0 14,11 1,30 10,41 C16:0 32,75 2,82 25,74 C18:0 6,74 1,41 3,13 C18:1 20,63 2,93 14,74 C18:2n-6 1,62 0,34 0,73 C18:3n-3 0,38 0,11 0,16 CLA 0,42 0,13 0,14 CLA: konjugovaná kyselina linolová

max 6,37 17,12 40,93 11,99 29,10 3,30 0,90 0,78

x 4,42 13,73 34,10 6,66 20,24 1,60 0,37 0,38

H (n=86) sx min 0,79 2,01 1,52 7,94 3,87 26,57 1,81 2,88 3,48 12,55 0,29 0,88 0,09 0,22 0,13 0,09

p max 6,25 17,82 44,04 12,66 36,60 2,18 0,62 0,67

0,0388 0,1598 0,0213 0,7723 0,5580 0,8356 0,6293 0,1178

Je nutné si uv domit, že p i snaze o zm nu složení mlé ného tuku sm rem k vyššímu zastoupení zdraví prosp šných mastných kyselin, je možné aplikovat také genetické poznatky (Samková, 2011). Specifický zájem byl v literatu e v nován d divosti obsah mastných kyselin (Stoop et al., 2008) a korela ním závislostem mezi mastnými kyselinami a ukazateli mlé né užitkovosti (Soyeurt et al., 2007). Tyto závislosti ukazují, že pro trvalejší zm ny složení by bylo možné využít selekce dojnic. Zajímavý je rozdíl mezi sledovanými plemeny blízký statistické významnosti (tabulka 2) pro zastoupení zdravotn (spot ebitelsky) žádoucí CLA. V n kterých našich d ív jších výsledcích byl tento rozdíl ve stejném trendu i vyšší. Svou roli sehrává i rozdílná produkce mléka v pr b hu 26

laktace i b hem laktace (Kelsey et al., 2003). Zmi ované závislosti ukazují, že využití selekce pro žádoucí zm ny složení profilu mastných kyselin mlé ného tuku by možné bylo.

ZÁV R Široká variabilita ve spektru mastných kyselin mezi plemeny i v rámci individuality dojnic dávají prostor pro zm ny složení mlé ného tuku. Tyto znalostí je možné využít p i výrob mlé ných produkt se specifickým zastoupením mastných kyselin s ohledem na konkrétní požadavky. Na menších farmách dojnic, zejména v systému low input nebo na ekologických farmách (s p ímým prodejem mléka nebo produkt ) tak existuje reálná možnost cílené produkce mléka s „garantovaným” (vysoce pravd podobn ) pozitivn

pozm n ným profilem mastných kyselin

mlé ného tuku s ohledem na spot ebitelské zdravotní benefity práv

cíleným výb rem nejen

plemene, ale i vhodných jedinc za pot ebné soub žné modifikace krmných postup .

POD KOVÁNÍ P ísp vek byl zpracován s podporou projekt MZe R QH 81210 a projektu OP VK CZ.1.07/2. 3. 00/09.0081.

SOUHRN Mastné kyseliny jsou významné z hlediska lidské výživy. Zejména podíl nenasycených mastných kyselin a CLA (konjugovaná kyselina linolová) je významný pro možné spot ebitelské zdravotní benefity. Vedle výživy dojnic se uplat ují na profil mastných kyselin mlé ného tuku i vlivy genetické (plemeno). V porovnání dvou plemenných skupin individuálních vzork mléka ( eské strakaté, n = 78; holštýnské, n = 86) byl zjišt n rozdíl v zastoupení kyseliny laurové (C12:0; 4,69 > 4,42 %) a palmitové (C16:0; 32,75 < 34,1 %; P<0,05). Nebyly nalezeny významné rozdíly u kyselin C18. Zajímavý rozdíl (blízký statistické významnosti) byl nalezen pro zastoupení zdravotn žádoucí CLA (0,42 > 0,38 %). V n kterých našich d ív jších výsledcích byl tento rozdíl ve stejném trendu i vyšší. Zmi ované závislosti ukazují, že využití selekce pro žádoucí zm ny složení profilu mastných kyselin mlé ného tuku by možné bylo. Klí ová slova: dojnice, mléko, mastné kyseliny, plemeno, individualita

27

LITERATURA GERMAN J.B., GIBSON R.A., KRAUSS R.M., NESTEL P., LAMARCHE B., VAN STAVEREN W.A., STEIJNS J.M., DE GROOT L., LOCK A.L., DESTAILLATS F. (2009): A reappraisal of the impact of dairy foods and milk fat on cardiovascular disease risk. European Journal of Nutrition, 48, 191-203. CHILLIARD Y., GLASSER F., FERLAY A., BERNARD L., ROUEL J., DOREAU M. (2007): Diet, rumen biohydrogenation and nutritional quality of cow and goat milk fat. European Journal of Lipid Science and Technology, 109, 828-855. JENSEN R.G. (2002): The composition of bovine milk lipids: January 1995 to December 2000. Journal of Dairy Science, 85, 295-350. KALA

P., SAMKOVÁ E. (2010): The effects of feeding various forages on fatty acid

composition of bovine milk fat: A review. Czech Journal of Animal Science, 55, 521-537. KELSEY J.A., CORL B.A., COLLIER R.J., BAUMAN D.E. (2003): The effect of breed, parity, and stage of lactation on conjugated linoleic acid (CLA) in milk fat from dairy cows. Journal of Dairy Science, 86, 2588-2597 MELE M., CONTE G., CASTIGLIONI B., CHESSA S., MACCIOTTA N.P.P., SERRA A., BUCCIONI A., PAGNACCO G., SECCHIARI P. (2007): Stearoyl-Coenzyme A desaturase gene polymorphism and milk fatty acid composition in Italian Holsteins. Journal of Dairy Science, 90, 4458-4465. MENSINK R.P. (2005): Effects of stearic acid on plasma lipid and lipoproteins in humans. Lipids, 40, 1201-1205. MOSLEY E.E., SHAFII B., MOATE P.J., MCGUIRE M.A. (2006): cis-9, trans-11 conjugated linoleic acid is synthesized directly from vaccenic acid in lactating dairy cattle. Journal of Nutrition, 136, 570-575. PEŠEK M., SAMKOVÁ E., ŠPI KA J. (2006): Fatty acids and composition of their important groups in milk fat of Czech Pied cattle. Czech Journal of Animal Science, 51, 181-188. SAMKOVÁ, E.: Faktory ovliv ující zastoupení mastných kyselin mlé ného tuku skotu: Habilita ní práce. eské Bud jovice: JU ZF, 2011. 60 s. SOYEURT H., GILLON A., VANDERICK S., MAYERES P., BERTOZZI C., GENGLER N. (2007): Estimation of heritability and genetic correlations for the major fatty acids in bovine milk. Journal of Dairy Science, 90, 4435-4442. STOOP W.M., VAN ARENDONK J.A.M., HECK J.M.L., VAN VALENBERG H.J.F., BOVENHUIS H. (2008): Genetic parameters for major milk fatty acids and milk production traits of dutch Holstein-Friesians. Journal of Dairy Science, 91, 385-394. 28

VELÍŠEK J., HAJŠLOVÁ J. (2009): Chemie potravin 1. 1 ed. Tábor: OSSIS, pp. 580. 978-8086659-15-2.

Kontaktní adresa: Ing. Eva Samková, Ph.D., Katedra veterinárních disciplín a kvality produkt , Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích, Zem d lská fakulta, Studentská 13, 370 05 eské Bud jovice, eská republika, e-mail: [email protected].

29

VLIV DOBY SKLADOVÁNÍ NA R ST PROBIOTICKÝCH KULTUR V JOGURTU EFFECT OF STORAGE ON THE GROWTH OF PROBIOTIC CULTURES IN YOGURT Miroslava Kolá ová1 – Pavla Sládková1 – Doubravka Rožnovská1 1

Ústav technologie potravin, AF MENDELU v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno

Abstract The purpose of this experiment was verify the real samples of probiotics and synbiotic microorganisms in white yogurts for presence and declared numbers (CFU/g) of probiotics microorganisms. Analysis were conducted throughout the shelf life of products (28 days). Samples of yogurts were stored at 4 °C and collected at days (0, 7, 14, 21, 26 and 28) during of experiment. For determine the of observed probiotics microorganisms was used selective agar MRS with addition of antibiotic clindamycin hydrochloride for the species Lactobacillus acidophilus (37 °C/72 h anaerobic) BSM agar for the genus Bifidobacterium (42 °C/5 days anaerobic). From the results could be observed that the yogurt with addition of prebiotics (inulin) had a better influence on growth and time period of viability of probiotics microorganisms (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium) than probiotics. Keywords: probiotics microorganisms, prebiotic, synbiotic

ÚVOD Probiotika jsou definována jako živé mikroorganismy, které aplikovány v p im eném množství p ízniv ovliv ují zdravotní stav hostitele (Rayes et al., 2008; Jensen et al., 2012). Hlavním mechanismem ú inku probiotik je jejich vliv na funkci st evní slizni ní bariéry. Nej ast ji se jedná o rody Lactobacillus a Bifidobacterium. D ležitou roli v za le ování probiotických bakterií do výrobku hrají r zné faktory, nap íklad typy obal , skladovací teplota, složení fermenta ního média, dostupnost živin a v neposlední ad také kyselost produktu (Tamime, 2005). Probiotické bakterie musí být životaschopné b hem skladování, d ležité jsou i chu ové vlastnosti potraviny nebo potravinového dopl ku, ve kterých jsou obsaženy. Prebiotika jsou nestravitelné látky obsažené v potravinách, které podporují selektivn r st nebo aktivitu jedné bakterie nebo omezeného po tu st evních bakterií, a tím pozitivn ovliv ují složení st evní mikroflóry tlustého st eva, ímž mají celkov pozitivní vliv na zdraví p íslušného konzumenta. Kombinace prebiotika s probiotikem se nazývá synbiotikum. P íkladem synbiotika pro lidskou výživu je jogurt s obsahem 30

probiotických bifidobakterií a prebiotickou oligofruktózou nebo inulinem. Tato kombinace potom p ispívá k prodloužení p ežití probiotika, pro které je prebiotikum specifickým substrátem vhodným k fermentaci (Valcheva et al., 2012; Nevoral, Bronský, 2010). V sou asnosti je na tuzemském trhu k dispozici celá ada mlé ných výrobk

s deklarovanou

probiotickou mikroflórou. Dále je pozornost v nována výzkumu synbiotických

erstvých

fermentovaných mlék a jogurt (Buriti et al. 2007; Salem et al. 2007; Cardelli et al. 2008). V pop edí zájmu je také potenciální p sobení probiotik v prevenci a terapii onemocn ní a patofyziologických stav . MATERIÁL A METODY Ke sledování vlivu doby skladování na po et probiotických kultur byly použity 2 typy jogurt . Jako probiotikum byl ozna en bílý selský jogurt s probiotickou kulturou BIFI a Lactobacillus acidophilus o hmotnosti 200 g a jako synbiotikum bílý selský jogurt s probiotickou kulturou BIFI a Lactobacillus acidophilus s p ídavkem inulinu o hmotnosti 200 g. V pr b hu pokusu byly vzorky jogurt skladovány p i 4 °C a odebírány ve dnech (0, 7, 14, 21, 26 a 28). Do sterilního sá ku bylo naváženo 10 g výrobku, bylo p idáno 90 ml fyziologického roztoku (Merck, N mecko) a homogenizováno 90 s. Homogenizát byl následn

použit pro p ípravu

p íslušných ed ní. P íprava ed ní byla provedena dle SN EN ISO 8261. Kultivace probíhala plotnovou metodou pomocí zalití, p i níž byly stanovovány tyto skupiny mikroorganism : rod Lactobacillus acidophilus na MRS agaru (Biokar Diagnostics, Francie) s p ídavkem antibiotika clindamycin hydrochloride (0,5 mg/l, Sigma-Aldrich, N mecko) p i 37 °C po dobu 72 h anaerobn a rod Bifidobacterium na BSM agaru (Fluka, Švýcarsko) s p ídavkem BSM suplementu (Fluka, Švýcarsko) p i teplot 42°C po dobu 125 h anaerobn . Po ukon ení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách ode teny narostlé kolonie a výsledek vyjád en v KTJ/g. Vykultivované presumptivní kolonie byly 2x p eo kovány na selektivních živných p dách a použity pro izolaci a purifikaci DNA (Sambrook et al., 2001). Rodová identifikace bifidobakterií byla provedena metodou PCR dle autor

Roy a Sirois (2000). Rodová a druhová identita

probiotických bakterií Lactobacillus acidophilus byla provedena ve spolupráci s eskou sbírkou mikroorganism v Brn . Koncentrace H+ iont byla m ena pomocí p ístroje WTW pH 95 (Weilheim, N mecko). Mikrobiologické ukazatele byly m eny ve dvou opakováních u každého odebraného vzorku. Pr m ry z t chto dvou m ení byly použity ve statistickém vyhodnocení. Program Statistica 8 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) byl použit pro výpo et základních statistických charakteristik,

31

rozdíl

mezi skupinami vzork

v po tu mikrobiálních kolonií (jednostup ové t íd ní analýzy

rozptylu, v etn post hoc Duncanova testu). VÝSLEDKY A DISKUZE Bifidobacterium 10,5 * 10

Synbiotikum **

*

9,5 log KTJ/g

Probiotikum

*

**

9 8,5

**

8 7,5 7 0

7

14

21

28

Doba odb ru

* p > 0,05; ** p > 0,001 Obr. 1 Zm ny v po tech bifidobakterií v závislosti na dob skladování bílého probiotického a synbiotického jogurtu

Lactobacillus acidophilus 8,5

*

** Probiotikum

*

8

Synbiotikum

log KTJ/g

** 7,5 ** 7

6,5

6 0

7

14

21

28

Doba odb ru

* p > 0,05; ** p > 0,001 Obr. 2 Zm ny v po tech bakterií Lactobacillus acidophilus v závislosti na dob skladování bílého probiotického a synbiotického jogurtu. 32

pH 4,45

pH probiotikum

4,4

pH synbiotikum

4,35

pH

4,3 4,25 4,2 4,15 4,1 4,05 4 0

7

14

21

28

Doba skladování

Obr. 3 Vliv doby skladování na zm nu pH v probiotickém a synbiotickém jogurtu Experimentální výsledky prokázaly (Obr. 1 a 2), že u probiotického jogurtu došlo ve 14. dni skladování k nár stu jak bifidobakterií z p vodní hodnoty 8,12 log KTJ.g-1 na hodnotu 9,40 log KTJ.g-1, tak i bakterií Lactobacillus acidophilus z hodnoty 7,43 log KTJ.g-1 na hodnotu 7,91 log KTJ.g-1. Podobn jako u probiotického jogurtu došlo u jogurtu s p ídavkem prebiotik ke zvýšení po t ve 14. dni u druhu Lactobacillus acidophilus z 7,60 log KTJ.g-1 na 8,37 log KTJ.g-1 a u rodu Bifidobacterium z 8,20 log KTJ.g-1 na 10,10 log KTJ.g-1. Vyšší nár st probiotických kultur laktobacil

a bifidobakterií u jogurt

kontrolních i jogurt

s p ídavkem inulinu b hem doby

skladování byl zaznamenán také autorem Capela et al. (2006). Obdobn jako u jogurt byl sledován nár st probiotických kultur laktobacil a bifidobakterií p i skladování s p ídavkem inulinu nebo oligofruktosy u erstvých sýr (Buriti et al. 2007; Salem et al. 2007; Cardelli; et al. 2008) a u fermentovaného mléka (Desai et al. 2004), kde byl prokázán vyšší po et živých mikroorganism po 21 dnech skladování p i 4 °C u výrobk s p ídavkem inulinu oproti kontrolám bez p ídavku prebiotik. V našem pokusu byl od 14. do 28. dne zaznamenán pokles v po tu probiotických kultur u obou typ jogurt . Postupné snižování bakterií zaznamenal také autor Oliveira et al. (2011). Avšak po celou dobu skladování byly ve výrobku s prebiotikem vždy zaznamenány statisticky pr kazn vyšší po ty živých mikroorganism (laktobacil a bifidobakterií) než u kontrol (probiotický jogurt) bez p ídavku inulinu, jak zaznamenal také autor Donkor et al. (2007). Po ty bakterií Lactobacillus acidophilus u probiotického jogurtu na konci doby skladování (28. den) neodpovídaly hodnotám na ízených Ministerstvem zem d lství (Vyhláškou . 77/2003 Sb.). Tato vyhláška stanovuje minimální po et bakterií Lactobacillus acidophilus 107 KTJ.g-1, nam ené hodnoty v experimentu byly však 105 KTJ.g-1 33

V této studii byly m eny hodnoty pH obou výrobk , rovn ž po celou dobu skladování (Obr. 3). Životaschopnost a stabilita probiotik m že být vedle jiných faktor

ovlivn na také nízkými

hodnotami pH produktu (Tamime, 2005). Z výsledku na Obr. 3 je patrné, že probiotického jogurtu pokleslo pH b hem 28 dn

u

z po áte ní hodnoty 4,38 na hodnotu 4,05,

u synbiotického jogurtu pokleslo pH z po áte ní hodnoty 4,39 na hodnotu 4,23. U všech vzork tedy došlo ve srovnání po áte ní a kone né hodnoty k poklesu pH. Auto i Lourens-Hattingh et al. (2001); Maxa a Rada (2002) také pozorovali souvislost mezi tzv. p ekyselením výrobku a poklesem po tu mlé ných bakterií na konci doby trvanlivosti výrobku. Stejné záv ry publikoval i Kailasapathy et al. (2008). ZÁV R V experimentu bylo zjišt no, že u jogurtu s p ídavkem prebiotika byly po ty probiotických mikroorganism vyšší. K výraznému vzr stu došlo ve 14. dni, poté se však po ty bakterií za aly snižovat. Toto snížení mohlo být zp sobeno vlivem p ekyselení výrobku (Lourens-Hattingh et al., 2001; Maxa a Rada, 2002). U synbiotického jogurtu se ve 26. dni projevila delší životaschopnost probiotických kultur než u jogurtu kontrolního (probiotického). Tato skute nost potvrdila, že prebitikum jako živný substrát prodlužuje životaschopnost probiotik obsažených v synbiotiku (Oliviera, 2011). I p esto, že na konci doby skladování došlo k prokazatelnému snížení po tu jak u synbiotického, tak i probiotického jogurtu byly po ty životaschopných bifidobakterií (107 KTJ.g1

) v souladu s Vyhláškou (77/2003 Sb.) Ministerstva zem d lství. Vyhlášce nevyhovoval pouze

po et bakterií Lactobacillus acidophilus na konci doby skladování u probiotického jogurtu.

POD KOVÁNÍ Tato práce byla podpo ena grantem IGA MENDELU IP 19/2011.

SOUHRN Cílem této práce bylo ov it reálné vzorky probiotických a synbiotických bílých jogurt na zastoupení a deklarované po ty (KTJ/g) probiotických mikroorganism . Analýza probíhala po celou dobu trvanlivosti výrobk (28 dní). V pr b hu pokusu byly vzorky jogurt skladovány p i 4 °C a odebírány ve dnech (0, 7, 14, 21, 26 a 28). Ke stanovení sledovaných probiotických mikroorganism

byla použita selektivní živná p da MRS s p ídavkem antibiotika clindamycin

hydrochloride pro druh Lactobacillus acidophilus (anaerobní kultivace p i 37 °C po dobu 72 hodin) a p da BSM pro stanovení rodu Bifidobacterium (anaerobní kultivace p i 42 °C po dobu 5 dn ). Na 34

základ získaných výsledk lze konstatovat, že výrobek s p ídavkem prebiotika (inulinu) m l na r st a délku životaschopnosti probiotických mikroorganism

(Lactobacillus acidophilus,

Bifidobacterium) p ízniv jší vliv než výrobek probiotický. Klí ová slova: probiotické mikroorganismy, prebiotika, synbiotika LITERATURA BURITI, F., C., A. et al., 2007: Synbiotic potential of fresch cream cheese supplement with inulin and Lactobacillus paracasei in co-culture with Streptococcus thermophilus. Food Chemistry 104, 1605−1610 CAPELA, P. et al., 2006: Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yogurt and freeze-dried yogurt. Food research International 39, 203−211 CARPELLI, H., R. et al., 2008: Inulin and oligofructose impruve sensory quality and increase the probiotic viable count in potentially synbiotic petit-suisse cheese. Food science and Technology 41, 1037−1046 SN EN ISO 8261 P íprava analytických vzork a ed ní pro mikrobiologické zkoušení DESAI, A, .R. et al., 2004: Survival and activity of probiotic lactobacilli in skim milk containing prebiotics. Journal of food science 69, 57−60 DONKOR, O., N. et al., 2007: Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type yoghurt during cold storage. Int. Dairy Journal 17, 657−665 JENSEN, H. et al., 2012: In vitro testing of commercial and potential probiotic lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, Vol. 153, Issues 1–2, 216–222 KAILASAPATHY, K. et al., 2008: Survival of Lactobacillus acidophillus and Bifidobacterium animalis ssp. lactis in stirred fruit yogurts. Science Direct, 1317–1322 LOURENS-HATTINGH, A. et al.,2001: Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal 11, 1−17 MAXA, V., RADA, V., 2002: Význam bifidobaktérií a baktérií mlé ného kvašení pro výživu a zdraví. 2. vydání. Praha: ÚZPI, 40 s. ISBN 80-855120-57-7. NEVORAL, J., BRONSKÝ, J., 2010: Probiotika a jejich klinické užití. Postgraduální medicína.

35

OLIVIERA, S., R., P. et al., 2011: Effect inulin as prebiotic and synbiotic interactions between probiotics to improve fermented milk firmness. Journal of Food Engineering 107, 36–40 RAYES et al., 2008: Prebiotics, probiotics, synbiotics in surgery—are they only trendy, truly effective or even dangerous? Langenbecks Arch Surg 394, 547–555 ROY, D., SIROIS, S., 2000: Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the ldh gene. FEMS Microbiol. lett. 191: 17–24. SALEM, M., M., M. et al., 2007: The use of synbiotics for production low fat Labneh. Deutsche Lebensmittel-Rundschau 103, 124−132 SAMBROOK, J., FRITCH, E., F., MANIATIS, T., 2001: Molecular cloning, 3rd. Ed. New York: Cold spring Barbor Lab. Press. TAMIME, A., Y., 2005: Probiotic dairy products. Oxford, UK: Blackwell Pub., 216 s.

ISBN 1-

4051-2124-6. VALCHEVA, R. et al., 2012: Fructo-oligosaccharides as therapeutics for active Crohn's disease: Adequate power and no effect. Inflammatory Bowel Diseases, Vol. 18, Issue 2, 391–392 Vyhláška . 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje Kontaktní adresy Ing. Miroslava Kolá ová, Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika, e-mail: [email protected] Ing. Pavla Sládková, Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika, e-mail: [email protected]

36

P ÍLOHY

37

Seznam vybraných projekt OPVK ešených na Agronomické fakult (MENDELU)

CZ.1.07/2.3.00/09.0037: Další odborné vzd lávání jako cesta ke zkvalitn ní personálního zabezpe ení pracovník pro biotechnologický výzkum a vývoj - doc. RNDr. B etislav Brzobohatý, CSc. CZ.1.07/2.3.00/09.0090: Vzd lávání a týmová spolupráce v oblastech regenerace krajiny intenzivn narušené lidskou inností - Ing. Martin Brtnický CZ.1.07/2.3.00/09.0081: Komplexní vzd lávání lidských zdroj v mléka ství - doc. Ing. Kv toslava Šustová, Ph.D. CZ 1.07./2.4.00/12.0045: Posílení spolupráce mezi MZLU v Brn a dalšími institucemi v terciárním vzd lávání a výzkumu - Dr. Ing. Zden k Havlí ek CZ.1.07/2.4.00/12.0043: Partnerská sí v oblasti speciálních plodin - Ing. Gabriela R ži ková, Ph.D. CZ.1.07/3.2.09/01.0024: Udržitelnost hospoda ení v krajin - doc. RNDr. Jana Kotovicová, Ph.D. CZ.1.07/2.3/.00/09.0224: Budování výzkumných tým a rozvoj univerzitního vzd lávání výzkumných odborník pro mikro- a nanotechnologie (NANOTEAM) - doc. Ing. René Kizek, Ph.D. CZ.1.07/1.3.10/03.0005: Environmentální vzd lávání pro pedagogy ZŠ - prof. Ing. František Hrab , CSc. Více se o všech OPVK projektech m žete dozv d t na http://web2.mendelu.cz/af_291_projekty/

Tyto projekty jsou spolufinancovány z Evropského sociálního fondu a státním rozpo tem eské republiky

38

39

Název publikace: Editor: Rok Projekt OPVK Po et stran: Po et výtisk : Vydáno: Dostupné online:

Minisborník z akce Den s mlékem na MENDELU - sou ást elektronického Sborníku XXXVIII. Seminá e o jakosti potravin a potravinových surovin „Ingrovy dny“ Ing. Miroslav J zl, Ph.D. 2012 CZ.1.07/2.3.00/09.0081 39 160 Mendelova univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika, www.mendelu.cz http://www.mlekarstvi.cz/

P ísp vky jsou otišt ny ve verzi zaslané autorem, bez jazykové korektury.

40