De realisatie van dit eindwerk na een stage in het Interdisciplinair Research Centrum aan de

Woord vooraf

De realisatie van dit eindwerk na een stage in het Interdisciplinair Research Centrum aan de KULAK te Kortrijk, was enkel mogelijk dankzij de hulp en inzet van een aantal personen, die ik hier graag zou bedanken.

In de eerste plaats wil ik Prof. Dr. M. De Cuyper bedanken om me de kans te geven om mijn stage te lopen aan het IRC en voor de grote hulp bij het schrijven van dit eindwerk. Bedankt voor de uitstekende begeleiding en opvolging tijdens het onderzoek. Uw enthousiasme is vaak een grote stimulans geweest en ik waardeer het geduld en vertrouwen die u in mij stelde.

Daarnaast wil ik graag Dhr. Christophe Wille bedanken voor de deskundige begeleiding tijdens mijn stage en het nalezen van dit eindwerk.

Ik wil ook een woordje van dank richten aan alle medewerkers van het IRC, bij wie ik steeds met al mijn vragen terecht kon. Dankjewel voor de continue hulp en de warme sfeer op de werkvloer. Een speciale dank gaat daarbij uit naar Lien Defour. Bedankt voor de enorme hulp bij het praktische werk, de uitleg en de handige tips bij het schrijven van deze thesis! Daarnaast wil ik ook graag Wim Noppe bedanken voor de hulp bij de gaschromatografie en Stefaan Soenen voor alle uitleg en de aangename samenwerking.

Het onderzoekswerk en het schrijven van dit eindwerk kwam mijn humeur niet altijd ten goede. Daarom wil ik ook mijn vrienden bedanken voor hun steun en warmte. Bedankt om altijd geïnteresseerd te luisteren naar wat ik na zo’n stagedag te vertellen had!

Tenslotte wil ik ook mijn ouders bedanken, omdat ze me de kans gegeven hebben om na mijn graduaatopleiding van biomedische laboratoriumtechnieken mijn diploma uit te breiden tot industrieel ingenieur biochemie. Bedankt om mij al die jaren te steunen en te motiveren. Ik hoop dat ik jullie trots gemaakt heb.

Tine, juni 2008

I

INHOUDSOPGAVE

Woord vooraf Lijst met symbolen en gebruikte afkortingen Lijst met tabellen Lijst met figuren

1.

INLEIDING .................................................................................................... 1

2.

LITERATUURSTUDIE ..................................................................................... 3 2.1

LIPOSOMEN ................................................................................................. 3

2.1.1 Fosfolipiden ......................................................................................... 3 2.1.2 Vesikels................................................................................................ 4 2.2

MAGNETOLIPOSOMEN................................................................................... 6

2.2.1 Magnetische vloeistof .......................................................................... 7 2.2.2 Magnetoliposomen .............................................................................. 8 2.3

CYTOCHROOM C OXIDASE ............................................................................ 8

2.3.1 Fysiologische functie ........................................................................... 9 2.3.2 Structuur ...........................................................................................10 2.3.3 Membraaneiwit .................................................................................. 11

3.

4.

MATERIAAL ................................................................................................. 13 3.1.

PRODUCTEN............................................................................................... 13

3.2.

SOLVENTEN ............................................................................................... 15

3.3.

BUFFERS .................................................................................................... 16

3.4.

APPARATUUR EN MATERIALEN .................................................................... 17

METHODEN ................................................................................................. 19 4.1

AANMAAK VAN LIPOSOMEN DOOR MIDDEL VAN SONICATIE.......................... 19

4.2

MAGNETOLIPOSOMEN, OPGEBOUWD UIT 1 TYPE FOSFOLIPIDEN .................. 22

II

4.2.1 Aanmaak ............................................................................................ 22 4.2.1.1. Dialyse ............................................................................................................22 4.2.1.2. Magnetische scheiding door middel van hoog-gradiënt magnetoforese ................24

4.2.2 Karakterisatie met behulp van spectrofotometrie ............................. 27 4.2.2.1. Fosfaatbepaling ................................................................................................29 4.2.2.2. Ijzerbepaling ....................................................................................................32

4.3

MAGNETOLIPOSOMEN, OPGEBOUWD UIT 2 TYPES FOSFOLIPIDEN ................ 35

4.3.1 Aanmaak ............................................................................................ 35 4.3.2 Karakterisatie met behulp van gaschromatografie............................ 39 4.4

ONDERZOEK NAAR DE ACTIVITEIT VAN CO IN AANWEZIGHEID VAN

VERSCHILLENDE SOORTEN MAGNETOLIPOSOMEN EN LIPOSOMEN OP VERSCHILLENDE TIJDSTIPPEN .............................................................................. 44 4.4.1 Aanmaak van de (magneto)proteoliposomen .................................... 45 4.4.2 Kinetische analyse ............................................................................. 46

5.

RESULTATEN ............................................................................................... 50 5.1.

IMPACT VAN SONICATIE OP DE ACTIVITEIT VAN CYTOCHROOM C OXIDASE IN

AAN- EN AFWEZIGHEID VAN FOSFOLIPIDE VESIKELS ............................................. 50 5.2.

INVLOED VAN DE MEMBRAANLADING OP DE GRAAD VAN ENZYM

REACTIVATIE ....................................................................................................... 52 5.2.1 Reactivatie van CO met vesikels ........................................................ 52 5.2.2 Reactivatie van CO met MLs .............................................................. 52 5.3.

KINETICA’S IN FUNCTIE VAN DE CO-DENSITEIT OP HET MEMBRAAN-

OPPERVLAK .......................................................................................................... 54 5.4.

STEALTH-(MAGNETO)LIPOSOMEN................................................................ 56

5.4.1 Controle van de lipide-coating van DMPC - DSPE~PEG5000 MLs ......... 56 5.4.2 Enzymatische activiteit van Stealth (magneto)proteoliposomen ...... 58 6.

DISCUSSIE .................................................................................................. 61

Literatuurlijst Appendix

III

Lijst met symbolen en gebruikte afkortingen

(C2H5)2O

Diethylether

°C

Graden Celsius

µg

Microgram

µL

Microliter

µm

Micrometer

µM

Micromolair

µmol

Micromol

3/8’’

3/8 inch

A

Absorbantie

ADP

Adenosinedifosfaat

ATP

Adenosinetrifosfaat

C

Molaire concentratie

C17H34O2

Heptadecaanzuur

CH3COCl

Acetylchloride

CH3OH (MeOH)

Methanol

CHCl3

Chloroform

CO

Cytochroom c oxidase

cyt c

Cytochroom c

Da

Dalton

DL-

Dilauroyl-

DM-

Dimyristoyl-

DMPC

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DMPE-PEG2000

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]

DMPG

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)]

DO-

Dioleoyl-

DP-

Dipalmitoyl-

DS-

Distearoyl-

DSPE-PEG5000

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[methoxy(polyethyleneglycol)-5000]

E.C.

Enzyme Commission

et al.

et alii: en medewerkers

Fe3O4

Ijzeroxide/magnetiet

GLC

Gas liquid chromatography

H

Magnetisch veld

H2Odest

Gedestilleerd water

H2SO4

Zwavelzuur

IV

H3PO4

Fosforzuur

HCl

Zoutzuur

HClO4

Perchloorzuur

HGM

Hoog-gradiënt magnetoforese

HNO3

Salpeterzuur

Hz

Hertz

IMR

Intermembranaire ruimte

kHz

KiloHertz

KOH

Kaliumhydroxide

KULAK

Katholieke Universiteit Leuven Afdeling Kortrijk

L

Liter

l

Weglengte

LA

Laurinezuur

LUV

Large unilamellar vesikels

m

Meter

mg

Milligram

ML

Magnetoliposoom

mL

Milliliter

MLV

Multilamellar vesikels

mM

Millimolair

Mo

Molybdeen

N

Normaliteit

N2

Stikstof

N2H4.2HCl

Hydraziniumchloride

Na2HPO4.12H2O

Dinatriumwaterstoffosfaat

Na2MoO4

Natriummolybdaat

Na3PO4.12MoO3

Natriumfosfomolybdaat

nm

Nanometer

PC

Fosfatidylcholine / Lecithine

PE

Fosfatidylethanolamine / Cefaline

PEG

Polyethyleenglycol

PG

Fosfatidylglycerol

PL PO4

Fosfolipiden 3-

Fosfaat

RES

Reticulo-endotheliaal systeem

rpm

Rounds per minute

SUV

Small unilamellar vesikels

TES

N-tris-[hydroxymethyl]methyl-2-amino-ethaansulfonzuur

UV

Ultravoilet

ves

Vesikel(s)

V

VF

Verdunningsfactor

VIS

Zichtbaar licht

M

Molaire extinctie coëfficiënt

χV

Magnetische susceptibiliteit

ε

VI

Lijst met tabellen Tabel 2.1:

Nomenclatuur van de vetzuurketens bij fosfolipiden

Tabel 2.2:

De meest voorkomende kopgroepen bij fosfolipiden

Tabel 4.1:

Overzicht van de verschillende samenstellingen van liposoom-CO oplossingen

Tabel 4.2:

Aanmaak van de ijkmengsels bij PO43--bepaling

Tabel 4.3:

Aanmaak van de ijkmengsels bij Fe3+-bepaling

Tabel 4.4:

Praktische uitwerking van het verdunningsschema bij Fe3+-bepaling

Tabel 4.5:

Samenstelling van het ijkmengsel bij GLC

Tabel 5.1:

Schematische weergave van de werkwijze bij de aanmaak van proteovesikels met een verschillend aantal moleculen CO/vesikel

Tabel 5.2:

Resultaten GLC analyse van bovenstaande stalen

VII

Lijst met figuren

Figuur 2.1:

Algemene structuur van een fosfolipide

Figuur 2.2:

Algemene structuur van een liposoom (met PEG-ketens)

Figuur 2.3:

Diffusie van fosfolipiden in een membraan

Figuur 2.4:

Schematische voorstelling van de vorming van magnetoliposomen

Figuur 2.5:

Situering van de rol van cytochroom c oxidase (complex IV) in de oxidatieve fosforylering

Figuur 2.6:

Schematisch beeld van een cytochroom c oxidase molecule, ingebed in een membraanstructuur

Figuur 2.7:

Schematische voorstelling van een biologische membraan

Figuur 4.1:

Opstelling bij sonicatie

Figuur 4.2:

Elektronenmicroscopische opname van magnetoliposomen

Figuur 4.3:

Principe van dialyse

Figuur 4.4:

Schematische weergave van hoog-gradiënt magnetoforese

Figuur 4.5:

De schematische opbouw van een spectrofotometer

Figuur 4.6:

Voorstelling van het elektromagnetisch spectrum als een kleurencirkel

Figuur 4.7:

Voorbeeld van een opgestelde ijklijn bij spectrofotometrische fosfaatbepaling

Figuur 4.8:

Voorstelling van het rode complex dat Fe3+ vormt met tiron

Figuur 4.9:

Voorbeeld van een opgestelde ijklijn bij spectrofotometrische ijzerbepaling

Figuur 4.10: Uitwisseling van fosfolipiden tussen DMPG – DSPE~PEG5000 (50/50; m/m) vesikels en DMPG MLs. Dit kinetisch mengsel wordt gebruikt voor de aanmaak van DMPG – DSPE~PEG5000 ML Figuur 4.11: Overzicht van de opeenvolgende stappen bij de aanmaak van gePEGyleerde MLs Figuur 4.12: Schematische voorstelling van de gaschromatograaf Figuur 4.13: De vlamionisatiedetector bij gaschromatografie Figuur 4.14: Absorptiespectrum van cytochroom c

VIII

Figuur 5.1:

Oxidatie van cyt c door CO in afwezigheid van vesikels en in aanwezigheid van asolectine vesikels. Na 300 seconden reactietijd wordt het eindpunt van de reactie bekomen door toevoeging van K3Fe(CN)6.

Figuur 5.2:

Oxidatie van cyt c door CO in aanwezigheid van asolectine vesikels in functie van de sonicatietijd

Figuur 5.3:

Activiteit van CO na inbouw in DMPC-DMPG (80/20; m/m) en DMPG vesikels (A) en MLs (B)

Figuur 5.4:

Grafische voorstelling van de relatie tussen de k1-waarden en de CO-densiteit op het membraanoppervlak. Elk kinetisch mengsel bevat eenzelfde hoeveelheid enzym.

Figuur 5.5:

GLC chromatogrammen na analyse van bovenstaande stalen

Figuur 5.6:

Grafische voorstelling van de relatie tussen de k1-waarden en de CO-densiteit op het membraanoppervlak van Stealth (magneto)liposomen

Figuur 6.1:

Weergave van de 2 mogelijk te volgen wegen van het substraat cyt c om zich naar het enzym CO te begeven

Figuur 6.2:

Het CO-cyt c complex, ingebed in een Stealth membraanstructuur

IX

1. INLEIDING

Aan de Katholieke Universiteit Leuven Afdeling Kortrijk (KULAK) wordt in het Interdisciplinair Research Centrum (IRC) onderzoek verricht op biologische celmembranen en artificiële modellen van deze structuren. Deze laatste worden aangeduid als fosfolipidenvesikels of liposomen. Het uitwerken van applicaties binnen het domein van de (bio)medische wetenschap neemt in dit onderzoek een belangrijke plaats in. In de loop van de laatste decennia werden in diverse laboratoria liposomen uitvoerig bestudeerd als drager van farmaca, die zich lokaliseren hetzij in de fosfolipide-dubbellaag voor apolaire moleculen, of in de inwendige waterige caviteit voor polaire drugs [Romberg

et al., 2007; Soenen et al., 2008]. De strategie van het associëren van farmaca met liposomen is er op gericht een ander verdelingspatroon van de drugsmolecule te verkrijgen na injectie in het lichaam. In het verleden is inderdaad gebleken dat deze manier van drugtoediening zijn vruchten heeft afgeworpen, zeker wanneer op het liposoommembraan een ligand of eiwit (bijvoorbeeld een antilichaam) wordt gekoppeld dat complementair is aan een epitoop die aan het oppervlak van de maligne cel tot expressie wordt gebracht. Op deze manier zal na injectie van het liposoom-drug formulaat in de bloedbaan, het complex zich grotendeels doelrichten (targetten) naar de maligne cel en daar zijn druglading zeer lokaal vrijstellen [Torchilin, 2006]. In de praktijk wordt echter vastgesteld dat het overgrote deel van de ingespoten vesikels toch nog opgenomen wordt in cellen met macrofagocytaire eigenschappen. Het betreft hier voornamelijk de cellen van de lever (Kupffer cellen) en de milt. Er bestaat nog enige onduidelijkheid over het mechanisme waarmee de opname geschiedt. Algemeen wordt echter aangenomen dat de opname wordt getriggerd door serumeiwitten (opsonines) die eerst binden aan het liposoomoppervlak en die dan als ‘herkenningsvlag’ of prooi fungeren

voor

de

cellen

van

het

reticulo-endotheliaal

systeem

(RES).

Het

liposoomoppervlak kan echter minder herkenbaar gemaakt worden door het aanbrengen – via organochemische weg – van PEG ketens op het membraanoppervlak. Dit eindwerk situeert zich in het kader van de detectie van eiwitbinding aan liposomen. De hoeveelheid eiwit die geassocieerd is met het liposoomoppervlak kan echter – zeker wanneer de eiwitbinding eerder zwak is – niet correct afgeleid worden uit een eiwitdosage

1

na afzondering van de liposomen uit een incubatiemengsel (bijvoorbeeld bloedserum voor geïnjecteerde liposoom-drug complexen) [Lynch en Dawson, 2008]. Om dit praktisch meetprobleem op te lossen werd er in dit werk een origineel alternatief uitgewerkt. Als modeleiwit werd gebruik gemaakt van cytochroom c (cyt c) waarvan de biofysische en biochemische eigenschappen in de literatuur reeds uitvoerig werden beschreven [Wahlgren et al., 1993]. De binding aan het liposoomoppervlak kan uiterst gevoelig en op een dynamische wijze gemeten worden door inbouw van het gezuiverde membraanenzym cytochroom c oxidase (CO) dat het Fe2+, aanwezig in de heemgroep van cyt c, omzet tot Fe3+.

Deze

reactie

kan

uiterst

precies

gemonitord

worden

met

behulp

van

spectrofotometrische metingen in het zichtbare golflengtegebied. Om binding van wateroplosbare serumeiwitten aan liposoomoppervlakken tegen te gaan werd door Allen et al. (1987) gebruik gemaakt van gePEGyleerde fosfolipiden die in de liposoommembraan werden ingebouwd. Hierdoor wordt het liposoomoppervlak minder herkenbaar voor het RES van lever en milt. In tegenstelling tot bijvoorbeeld eiwitten, die een duidelijke secundaire en tertiaire structuur vertonen, hebben flexibele PEG ketens immers geen eenduidige driedimensionele architectuur waardoor ze als het ware regelmatig van gedaante veranderen. Liposomen met ingebouwde drugmolecules krijgen hierdoor aan de buitenkant een voortdurend wisselend aanzien en blijven langer in circulatie. Afgezien

van

de

potentialiteiten

van

liposomen

als

drugcarriers

werden

deze

nanobiocolloïden in het verleden eveneens verder geperfectioneerd en gebruikt voor diagnostische doeleinden. Door bijvoorbeeld de interne waterige caviteit op te vullen met een magnetische Fe3O4 kern kan met behulp van MRI de verdeling van de partikels (zogenaamde magnetoliposomen) in het lichaam gevolgd worden [Bulte et al., 1999]. Omwille van de interessante perspectieven van magnetoliposomen (MLs) wordt eiwitbinding aan deze structuren eveneens in dit werk bestudeerd.

2

2. LITERATUURSTUDIE

2.1 LIPOSOMEN 2.1.1

Fosfolipiden

Fosfolipiden zijn de basisbouwstenen van biologische membranen. Ze liggen hierbij geordend in een dubbellaag en doen dienst als barrière tussen het inwendige en uitwendige milieu van een cel. Hun algemene structuur bestaat uit een glycerolmolecule, waaraan twee vetzuren en een fosfaatgroep gebonden zijn.

Figuur 2.1: Algemene structuur van een fosfolipide (Bron: http://www.mediter-roma.com/EMULSIOLIPOLISI%20ULTRASONICA.htm)

De vetzuurketens zijn door middel van een esterbinding verbonden met de alcoholfuncties op twee koolstofatomen van de glycerolmolecule. Deze vetzuren kunnen onderling verschillen, zowel op vlak van de lengte (het aantal koolstofatomen kan variëren van 12 tot 24) als op vlak van het aantal onverzadigde bindingen in de keten. Onder de vorm van twee apolaire staarten vormen ze het apolaire gedeelte van een fosfolipide. Hieronder is een tabel te zien met veel voorkomende vetzuurketens.

3

Tabel 2.1: Nomenclatuur van de vetzuurketens bij fosfolipiden

Koolstofskelet

Naam vetzuur

C12 C14 C16 9,10 C18:1 | ∆cis C18

laurinezuur myristinezuur palmitinezuur oliezuur stearinezuur

Naam als deel van fosfolipide dilauroyldimyristoyldipalmitoyldioleoyldistearoyl-

Afkorting DLDMDPDODS-

Aan het derde koolstofatoom is een fosfaatgroep gebonden, die nog verder veresterd is met een OH-bevattende molecule. Het glycerolskelet, de fosfaatgroep en het alcoholresidu vormen samen het polaire gedeelte van het fosfolipide, de polaire kop. De meest voorkomende polaire kopgroepen worden weergegeven in onderstaande tabel.

Tabel 2.2: De meest voorkomende kopgroepen bij fosfolipiden

Naam van R-OH

Naam van het PL

Afkorting

Structuurformule van R-OH

ethanolamine choline glycerol

fosfatidylethanolamine fosfatidylcholine fosfatidylglycerol

PE PC PG

HO-(CH2)2-NH3 + HO-(CH2)2-N(CH3)3 HO-CH2CH(OH)CH2OH

2.1.2

+

Netto lading PL bij pH = 7,0 zwitterionisch zwitterionisch negatief

Vesikels

In een waterige omgeving vormen fosfolipiden structuren waarbij ze hun hydrofobe staarten afschermen van de watermoleculen. Dit gebeurt onder de vorm van dubbellagen, waarbij de apolaire staarten zich naar elkaar richten en de polaire koppen naar buiten gericht zijn. Afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegde energie (bijvoorbeeld door middel van ultrasone golven) kunnen sferische structuren verkregen worden met een enkele dubbellaag of een serie concentrische dubbellagen, telkens met een inwendige waterige ruimte. Deze driedimensionale vesikels worden liposomen genoemd en worden onderverdeeld in drie subcategoriën:
Multilamellar vesikels (MLV) Deze vesikels hebben een diameter die kan oplopen tot 1 µm en zijn opgebouwd uit meerdere concentrische dubbellagen. MLVs worden reeds gevormd bij hevig schudden van waterige fosfolipidenoplossingen.

4


Large unilamellar vesikels (LUV) LUV’s hebben eveneens een diameter die kan oplopen tot 1 µm, maar ze bestaan uit slechts een enkele dubbellaag. Ze ontstaan via gecontroleerde dialyse van een detergent-lipide mengsel of via extrusie doorheen membranen met poriën die een welgekende diameter hebben.
Small unilamellar vesikels (SUV) Deze vesikels kunnen op reproduceerbare wijze bekomen worden door middel van sonicatie. Hierbij worden grote hoeveelheden energie toegevoegd aan waterige fosfolipidenoplossingen. SUV’s bestaan uit slechts één dubbellaag en hun diameter bedraagt tussen de 25 en 50 nm.

Figuur 2.2: Algemene structuur van een liposoom (met PEG-ketens) (Bron: http://www.nowhow.nl/nederlands/Portfolio/liposoom.htm)

Bij het uitvoeren van de hieronder vermelde experimenten wordt gebruik gemaakt van SUV’s. In hun centrale waterige ruimte kunnen polaire stoffen ingesloten worden, terwijl apolaire stoffen zich in de dubbellaag nestelen [Kamps & Scherphof, 2003]. Er moet opgemerkt worden dat zo’n modelmembraan geen statisch geheel is: de fosfolipiden kunnen volgens 2 types diffusie in het membraan bewegen. Bij het proces dat transmembranaire diffusie of flip-flop genoemd wordt, kunnen fosfolipiden uit de

5

buitenste lipidelaag naar de binnenste overgaan en omgekeerd. Er wordt verondersteld dat dit proces slechts uiterst zelden gebeurt, omdat de polaire kopgroep van de fosfolipide dan doorheen de binnenste zone van de dubbellaag met apolaire staarten zou moeten bewegen.

In

tegenstelling

tot

deze

vorm

van

beweeglijkheid,

is

de

laterale

diffusiesnelheid veel groter. Hierbij kunnen de fosfolipiden zich lateraal verplaatsen in het vlak van de dubbellaag volgens een denkbeeldige x- en y-as. Er is als het ware een uitwisseling tussen naburige fosfolipiden in dezelfde lipidelaag van het vesikel.

Figuur 2.3: Diffusie van fosfolipiden in een membraan (Bron: Voet & Voet, 1995) (a) Transmembranaire diffusie (flip-flop) (b) Laterale diffusie

2.2 MAGNETOLIPOSOMEN Magnetoliposomen (ML) zijn opgebouwd uit een magnetietkern (Fe3O4) die bedekt wordt door een dubbellaag van fosfolipiden [De Cuyper & Joniau, 1988]. Deze structuren kunnen erg waardevol zijn bij medische toepassingen, aangezien de biologische aard van hun coatingmoleculen zorgt voor een hoge graad van biocompatibiliteit [Lacava et al.,

2004; Kim et al., 2005; Torchilin, 2006]. Aangezien de “vreemde” substantie, het magnetiet, gelinkt wordt aan fosfolipiden, die zelf belangrijke bouwstenen zijn van natuurlijke celmembranen, mag verwacht worden dat immunologische problemen hierdoor grotendeels vermeden kunnen worden [Van den Bos et al., 2003]. Een tweede

6

voordeel is dat ze magnetiseerbaar zijn, waardoor ze van andere deeltjes gescheiden kunnen worden in een magnetisch veld.

2.2.1

Magnetische vloeistof

Om ML te bereiden, wordt uitgegaan van een magnetische vloeistof [Rosensweig, 1966]. Dit is een geconcentreerde oplossing van superparamagnetische Fe3O4 colloïden, die een modale diameter hebben van ongeveer 15 nm. ‘Paramagnetisch’ wil zeggen dat de deeltjes na verwijderen van het extern magnetisch veld geen restmagnetisme vertonen, wat bij ferromagnetische stoffen wel het geval is. ‘Super’ wijst erop dat de elektronenspins, analoog aan ferromagnetisme, zich heel gemakkelijk volgens de uitwendige magnetische veldlijnen oriënteren [De Cuyper, 1996], dit in tegenstelling tot klassiek paramagnetisme. De magnetische vloeistof is een uiterst stabiele, homogene suspensie in een waterig milieu die zelfs na maanden niet zal uitzakken, dit dankzij twee factoren:




Om de magnetische vloeistof stabiel te houden, dienen de individuele ijzeroxide nanocolloïden gecoat te worden met stabiliserende moleculen. Zo wordt ervoor gezorgd dat er een zekere afstand bewaard wordt tussen de deeltjes. Indien de coating elektrisch geladen is, zullen de elektrostatische afstotingskrachten de stabiliteit van de oplossing verder bevorderen. Om als coating geschikt te zijn, moet de stof aan bepaalde voorwaarden voldoen. Het is een dispergerend agens dat oplosbaar moet zijn in de vloeibare fase en dat sterk moet adsorberen aan het ferromagnetisch materiaal. Als geschikte coating voor de ijzeroxide kernen kan laurinezuur (LA) gebruikt worden.




Naast deze sterische/elektrostatische stabiliserende factor speelt ook de afmeting van de partikels een grote rol. Door de nanometer dimensies van de ijzeroxide kernen wordt de gravitatiekracht overschaduwd door de thermische agitatie (Brownse beweging), waardoor clustervorming verhinderd wordt.

7

2.2.2

Magnetoliposomen

Rondom de Fe3O4-nanopartikels kan nu een fosfolipidenlaag gelegd worden door incubatie van de laurinezuur-gestabiliseerde magnetische vloeistof met gesoniceerde SUV’s. Deze incubatie gebeurt gedurende 2-3 dagen met een overmaat vesikels, terwijl gedialyseerd wordt bij 37°C. De buffer wordt hierbij regelmatig ververst. De laurinezuurmoleculen verlaten op

die manier langzaam de magnetietkern en diffunderen door de

membraanporiën in de uitwendige bufferoplossing. De drijvende kracht in het dialyseproces is de concentratiegradiënt. De poriën van het dialysemembraan zijn te klein om de fosfolipidenvesikels door te laten, terwijl de veel kleinere, wateroplosbare laurinezuur-moleculen dit wel kunnen. De fosfolipiden kunnen dan de weggaande laurinezuurmoleculen vervangen aan het oppervlak van de magnetietkern, waardoor de ML gevormd worden. [De Cuyper & Joniau, 1988]

Figuur 2.4: Schematische voorstelling van de vorming van magnetoliposomen

2.3 CYTOCHROOM C OXIDASE Cytochroom c oxidase (CO) is een groot transmembraan eiwitcomplex dat o.a. voorkomt in de mitochondriën van eukaryote cellen, waar het ingebed is in het binnenste mitochondriale membraan. Alle cytochromen hebben typische absorptiebanden, waardoor ze spectrofotometrisch relatief gemakkelijk te bestuderen zijn.

8

2.3.1

Fysiologische functie

CO behoort tot de hoofdklasse van de oxidoreductasen, die alle eiwitten omvat die redoxreacties katalyseren, en wordt nog verder onderverdeeld onder de subklasse van de eiwitten die inwerken op de heemgroepen (E.C. 1,9,3,1). Cytochromen zijn 1-elektrontransfererende stoffen, waarin de heemgroep omgezet wordt van Fe2+ naar Fe3+ en omgekeerd. CO heeft een belangrijke functie in de natuur. Het maakt namelijk als complex IV deel uit van de respiratorische keten tijdens de oxidatieve fosforylatie. De respiratorische keten is een systeem van proteïnecomplexen die in het binnenste membraan van de mitochondriën gelegen zijn. CO is betrokken bij de laatste oxidatieve stap van het energiemetabolisme en katalyseert hierbij het elektronentransport van cytochroom c naar moleculaire zuurstof, waardoor 2 watermoleculen verkregen worden. 4 Fe2+-cytochroom c – 4 e- → 4 Fe3+-cytochroom c O2 + 8 H+ + 4 e- → 2 H2O + 4 H+ De energie die vrijkomt bij het doorlopen van de oxidatieve keten wordt gebruikt om een protonengradiënt over het membraan op te bouwen. Bij de translocatie onder invloed van het membraanproteïne ATP synthetase van de 4 protonen uit de bovenstaande reactie, komt energie vrij die uiteindelijk gebruikt wordt bij de fosforylering van ADP tot ATP.

Figuur 2.5: Situering van de rol van cytochroom c oxidase (complex IV) in de oxidatieve fosforylering (IMR= intermembranaire ruimte) (Bron: http://nl.wikipedia.org/wiki/oxidatieve_fosforylering)

9

2.3.2

Structuur

Het eiwitcomplex CO heeft een massa van 200 kDa [Tsukihara et al., 1995]. Het bestaat uit 2 kopiën van 13 verschillende subunits en bevat prostetische heemgroepen. Bij zoogdieren zijn 10 subunits van het complex van oorsprong nucleair, terwijl de 3 overige subunits gesynthetiseerd worden in het mitochondrion. Het hydrofobe gedeelte van het enzym maakt ongeveer de helft van de enzymmassa uit. CO bevat 2 heemcentra (cytochromen a en a3) en 2 koperatomen (CuA en CuB), die respectievelijk geassocieerd zijn met de cytochromen a en a3. De reductie van moleculaire zuurstof naar water vraagt 4 elektronen. Deze worden door cyt c geleverd aan complex IV. De koper- en heemgroepen van dit complex nemen deel aan het elektronentransport van cyt c naar O2, door voortdurend over te gaan van de gereduceerde vorm (Fe2+) naar de geoxideerde vorm (Fe3+) en omgekeerd. X-stralen kristallografie is de beste methode om de structuur van een eiwit te bestuderen. Onderstaande figuur geeft de structuur van CO weer die door middel van deze methode is verkregen.

Figuur 2.6: Beeld van een cytochroom c oxidase molecule, ingebed in een membraanstructuur (Bron: http://en.wikipedia.org/wiki/Cytochrome_c_oxidase)

10

2.3.3

Membraaneiwit

Biologische membranen bestaan uit lipide dubbellagen waarin eiwitten opgenomen zijn. Deze membraaneiwitten kunnen ingedeeld worden volgens hun type van inbedding in het membraan.




Integrale of intrinsieke eiwitten zijn stevig aan het membraan gebonden door middel van hydrofobe interacties tussen het eiwit en de apolaire staarten van de fosfolipiden van het membraan. Hierdoor dringen deze eiwitten diep de dubbellaag in en sommige integrale membraaneiwitten, zoals cytochroom c oxidase, kunnen het membraan zelfs helemaal doorboren. De polaire koppen van de fosfolipiden interageren ook met het eiwit door het vormen van waterstofbindingen en zoutbruggen. Integrale eiwitten kunnen enkel van hun membraan gescheiden worden door behandeling met detergenten . Indien deze laatste verwijderd worden, ontstaan aggregaten die niet langer een significante enzymatische activiteit vertonen.




Perifere of extrinsieke eiwitten dringen niet of nauwelijks in het membraan, waardoor ze ervan gescheiden kunnen worden door relatief milde processen waarbij het membraan intact wordt gelaten. Dit kan door middel van hooggeconcentreerde zoutoplossingen

(zoals

1M

NaCl),

metaalchelerende

agentia

of

door

pH-

veranderingen. Perifere membraaneiwitten, zoals cytochroom c, zijn stabiel in waterige oplossing en binden nauwelijks met lipiden. Ze zijn geassocieerd met het membraan door te binden op het oppervlak door elektrostatische interacties en waterstofbindingen.

11

Figuur 2.7: Schematische voorstelling van een biologische membraan

(Bron: Voet & Voet, 1995)

12

3. MATERIAAL

3.1. PRODUCTEN

Fosfolipiden




DMPC

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

Avanti Polar Lipids, Lot # 140PC-239 MM = 677,94 g/mol




DMPG

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)]

Avanti Polar Lipids, Lot # 140PG-86a MM = 688,86 g/mol




1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-

DMPE~PEG2000

[methoxy(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids, Lot # 140PEG2PE-26 MM = 2693,32 g/mol




DSPE~PEG5000

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[methoxy(polyethyleneglycol)-5000]

Avanti Polar Lipids, Lot # 180PEG5PE-36 MM = 5801,15 g/mol

Substraat




Cytochrome c, from horse heart SIGMA chemical co. C-2506, Lot # 72H7060 MM = 12,384 g/mol

13

membraanenzym




Cytochroom c oxidase 11,4 mg eiwit/mL fosfaatbuffer (67 mM, pH 7,4, 0,25 M sucrose, 1,5% cholaat) Deze stockoplossing wordt bewaard bij -70°C

Algemeen




(C2H5)2O Diethylether p.a. Merck 1.00921.1000, Lot # K27912121 031 MM = 74,12 g/mol




Petroleumbenzine p.a. (60-80%) Merck 1.01774.2500, Lot # K26520474 933 D = 0,68 kg/L




CH3COCl Acetylchloride p.a. Merck 1.00031.0250, Lot # D429931 848 MM = 78,50 g/mol




C17H34O2 Heptadecaanzuur (99%) Sigma Chemical Co. H-3500, Lot # 64H2623 MM = 270,5 g/mol




Tiron 4,5-hydroxy-1,3-benzeendisulfonzuur, dinatriumzout monohydraat Aldrich 17,225-3 MM = 332,22 g/mol

14




Na2HPO4.12H2O Dinatriumwaterstoffosfaat Merck 1.06279. MM = 358,14 g/mol




N2H4.2HCl Hydraziniumchloride Merck 4601 MM = 104,97 g/mol




Na2S2O4 Dinatriumdithioniet MERCK, Lot # K21276907 534 MM = 174,11 g/mol




K3Fe(CN)6 Kaliumferricyanide UCB, Lot # 66372

3.2. SOLVENTEN




Chloroform, p.a. (CHCl3) MERCK, Lot # 05l K15240445 MM: 119,38 g/mol D = 1,47 kg/L




H2SO4 conc Zwavelzuur p.a. (99-100%) UCB, Lot # 95050014 MM = 98,07 g/mol

15




HCl rokend Rokend zoutzuur p.a. (37%) MERCK, Lot # K26229817 909 MM = 36,46 g/mol




HClO4 Perchloorzuur p.a. Janssen Chimica 22.331.21, Lot # 17968/4 MM = 100,46 g/mol




HNO3 conc Salpeterzuur p.a. (65 %) Janssen Chimica 22.331.21, Lot # 44872/1 MM = 63,01 g/mol




CH3OH Methanol p.a. MERCK, Lot # K24629809 802 MM = 32,04 g/mol




Gedestilleerd water (H2Odest) aangemaakt in het IRC

3.3. BUFFERS TES-buffer 5mM pH 7,0 11,46 g TES (N-tris-[hydroxymethyl]methyl-2-amino-ethaansulfonzuur) oplossen, titreren tot pH 7,0 met KOH 1N en aanlengen tot 10 L.




TES: Sigma T-1375, Lot # 67F-5611 MM = 229,20 g/mol




KOH 1N: Merck 1.09108.1000, Lot # 80326955

16

3.4. APPARATUUR EN MATERIALEN


Elektromagneet Magneet B -E 15 BRUKER




Peristaltische pompen -

Proportioning Pump Model 1512/20 Carlo Erba

-

Peristaltic pump P-3 Pharmacia fine Chemicals




Sonicator: MSE 150 watt Ultrasonic Desintegrator MSE 150 watt Ultrasonic Desintegrator




Centrifuge: Du Pont Instruments Sorvall, RC-5B refrigerated superspeed centrifuge




Spectrofotometers: -

Kontron Instruments UVIKON 933 Double beam UV/Visible – spectrophotometer

-




Ultraspec 1100 Amersham Biosciences

Thermostaat: LAUDA compact thermostats, RC 6 CP




Gaschromatograaf: -

Carlo Erba Instruments, GC 8000 series

-

ThermoQuest, AS 2000

-

CE Instruments, EL 980

-

CE Instruments, MFC 8000

17




Tubing voor magnetische proppen -

Medical Grade Tubing ID 1,98 mm (.078”) OD 2,80 mm (.125”) Silastic HH048434 Dow Corning Corporation

-

Polyethyleen tubing ID 1,77 mm (.070”) OD 2,80 mm (.110”) PE-260, Lot # 02023334 B Clay Adams




Analytische balans Sartorius 2006 MP




Dialysemembraan Dialysis tubing – Visking, Medicinell International Ltd Size 1 Inf Dia 8/32” - 6,3 mm MWCO - 12 - 14000 Daltons




Vortex Genie 2 Bender & Hobein AG Scientific Industries




VWR/375 Hotplate/Stirrer




Verwarmplaat voor proefbuizen, Gerhardt




Warmwaterbad GFL (gesellschaft für Labortechnik) G.m.b.H. & Co.




pH-meters: -

Beckman diameter 31 pH Meter

-

Knick pH-meter 766 Calimatic

18

4. METHODEN

4.1 AANMAAK VAN LIPOSOMEN DOOR MIDDEL VAN SONICATIE Principe Liposomen worden bereid door in een oplossing met de gewenste gehydrateerde fosfolipiden een grote hoeveelheid energie te brengen. De bedoeling is om hierbij zo klein mogelijke liposomen te vormen (SUV’s). Dit kan gerealiseerd worden door middel van ultrasone golven. Bij deze sonicatie wordt elektrische energie omgezet door middel van een generator en een transductor naar mechanische energie. De generator zorgt ervoor dat de frequentie van 50 Hz wordt omgezet naar 20 kHz. Deze versterkte frequentie wordt vervolgens door een piezo-elektrische transductor geleid, waardoor mechanische energie ontstaat. De vibraties, die in het transductorkristal ontstaan, worden op een titaniumprobe overgebracht, waardoor er een longitudinale trilling van de probe over een zeer kleine afstand ontstaat (enkele µm). Wanneer nu het uiteinde van deze probe in een oplossing zit, worden er vacuümbelletjes gecreëerd. Als de probe omhoog gaat, wordt vanwege de heel hoge snelheid (20 kHz) een vacuüm achtergelaten. Nog voor de vloeistofmoleculen tijd hebben gehad om het vacuüm op te vullen, daalt de probe opnieuw. Hierdoor worden de vacuümbellen uiteengeslagen en schuren deze over de fosfolipiden. De snelheid van de bellen kan oplopen tot 3000 km/s, waardoor grotere fosfolipide-lamelle structuren worden afgebroken tot kleinere vesikels . Er wordt gebruik gemaakt van een speciaal voorzien sonicatievat, dat continu gekoeld kan worden. Dit is belangrijk omdat fosfolipiden niet thermostabiel zijn en er tijdens het soniceren een grote hoeveelheid thermische energie vrijkomt. De sonicatieprobe wordt enkele mm onder het vloeistofoppervlak van de fosfolipidensuspensie gebracht. Het is belangrijk dat de probe de glaswand van het sonicatievat niet raakt, omdat door de wrijving het glas zou kapot springen. De opstelling is te zien in figuur 4.1. Een nadeel van probesonicatie is dat de oplossing gecontamineerd wordt met deeltjes titanium die losgeslagen worden uit de punt van de probe. Dit kan grotendeels opgelost worden door de oplossing nadien af te centrifugeren.

19

Figuur 4.1: Opstelling bij sonicatie

Materiaal - Fosfolipiden (DMPG, DMPC, DMPE~PEG2000 en/of DSPE~PEG5000) - CHCl3/MeOH (2:1) - 5 mM TES buffer pH 7,0 - Sonicator - 3/8’’ of exponentiële 1/8’’ probe - Centrifuge

Methode Voor de aanmaak van een oplossing met liposomen wordt altijd vertrokken vanuit een stockoplossing met 15mg/10mL fosfolipiden in een CHCl3/MeOH oplossing (2:1 verhouding). Bij de aanmaak van liposoomoplossingen die bestaan uit 2 componenten (bijvoorbeeld DMPG en DSPE~PEG5000 bij de DMPG - DSPE~PEG5000 vesikels) wordt vertrokken vanuit 2 stockoplossingen met 15mg/10mL fosfolipiden in een CHCl3/MeOH oplossing (2:1 verhouding). Van de stockoplossing(en) wordt telkens een bepaalde hoeveelheid in een sonicatievat gebracht, op die manier dat men na uitdrogen van de oplossing met stikstofgas en het heroplossen in waterige TES buffer, een reeks stalen verkrijgt met concentraties zoals aangegeven in onderstaande tabel. Bij liposomen die bestaan uit 2 soorten fosfolipiden, moet hierbij een onderlinge molaire verhouding van

20

80:20 gerespecteerd worden. Na het uitdampen van de fosfolipiden in het CHCl3/MeOH mengsel, wordt 9 mL TES buffer toegevoegd en wordt er gedurende 2 minuten gesoniceerd met een 3/8’’ probe. Deze sonicatie wordt uitgevoerd bij een peak-to-peak intensiteit van 18 µm, bij kamertemperatuur en onder continue afkoeling, aangezien de fosfolipidenoplossing anders te sterk zou opwarmen. Na de sonicatie wordt de oplossing gecentrifugeerd voor 10 minuten bij 10000 rpm, om ijzerdeeltjes die afkomstig zijn van de probe, te kunnen verwijderen. Later, bij de metingen voor de CO-activiteit, zal bij elk staal eenzelfde hoeveelheid CO toegevoegd worden. Het aantal CO moleculen per vesikel is dus omgekeerd evenredig is met de concentratie aan fosfolipiden.

Tabel 4.1: Overzicht van de verschillende samenstellingen van liposoom-CO oplossingen Staal nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentratie PL 1,5 mg/3 mL 0,5 mg/3 mL 0,4 mg/3 mL 0,3 mg/3 mL 0,2 mg/3 mL 0,1 mg/3 mL 0,05 mg/3 mL 0,025 mg/3 mL

Weight ratio PL/CO 10 3,33 2,66 2 1,33 0,66 0,33 0,167

CO/ves 1 3 3,75 5 7,5 15 30 60

Volgende vesikels worden door middel van sonicatie aangemaakt, en na toevoegen van CO verder onderzocht op hun enzymatische activiteit (zie paragraaf 4.4):

Niet-gePEGyleerde vesikels:
DMPG ves
DMPC - DMPG (80:20; m/m) ves

GePEGyleerde vesikels:
DMPG - DMPE~PEG2000 (80:20; m/m) ves
DMPG - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) ves
DMPC - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) ves

21

4.2 MAGNETOLIPOSOMEN, OPGEBOUWD UIT 1 TYPE FOSFOLIPIDEN MLs zijn Fe3O4-kernen waarrond een dubbellaag van fosfolipiden ligt. De aanmaak van deze structuren verloopt in 2 stappen: dialyse en magnetoforese.

Figuur 4.2: Elektronenmicroscopische opname van magnetoliposomen (De gemiddelde diameter bedraagt 25 nm)

4.2.1

Aanmaak

4.2.1.1. Dialyse

Principe Bij dialyse wordt gestart vanuit de magnetische vloeistof, die aangemaakt werd zoals aangegeven door Khalafalla et al. (1980). Deze magnetische vloeistof bestaat uit Fe3O4kernen (diameter: ongeveer 14 nm, dichtheid: 5,1 g/cm³), die een coating hebben van LA. Wanneer deze magnetische vloeistof bij gesoniceerde vesikels gebracht wordt, zal er een uitwisseling plaatsvinden tussen de LA-moleculen en de fosfolipiden van de vesikels.

22

Om een intacte fosfolipide-dubbellaag te vormen wordt gewerkt met een vijfvoudige gewichtsovermaat van fosfolipiden t.o.v. het ijzeroxide. Het mengsel van magnetische vloeistof en vesikels wordt daarna in een dialysemembraan gebracht. De aanwezige fosfolipiden zullen geleidelijk aan de Fe3O4 colloïden adsorberen. Doordat LA-moleculen kleiner zijn dan de ijzerkernen en fosfolipidenvesikels, zullen de LAmoleculen doorheen de poriën van het membraan in de buffer terechtkomen. De stimulerende factor is de concentratiegradiënt. De buffer wordt regelmatig ververst zodat de concentratie aan LA-moleculen in de buffer altijd kleiner is dan binnenin het dialysemembraan, zodat deze migratie continue blijft doorgaan. Het eindresultaat zijn MLs, waarbij de LA-moleculen volledig vervangen zijn door fosfolipiden.

Figuur 4.3: Principe van dialyse

Materiaal - Fosfolipiden (DMPG of DMPC) - Dialysemembraan (SpectraPor, cut-off 12-14.000) - 5 mM TES buffer pH 7,0 - Sonicator - 3/8’’ probe - Centrifuge

23

Methode Voor de aanmaak van MLs worden eerst liposomen bereid. 183 mg van de gewenste fosfolipiden (DMPG of DMPC) wordt afgewogen en opgelost in 15 mL TES buffer. Na sonicatie (10 min; peak-to-peak intensiteit: 24 µm; 3/8’’ probe), wordt de oplossing gecentrifugeerd voor 10 minuten aan 10000 rpm om eventuele ijzerdeeltjes te verwijderen. Bij de verkregen liposoomsuspensie wordt nu de magnetisch vloeistof gebracht: 0,3 mL van een stockoplossing met een concentratie van 114 mg Fe3O4 /mL.

4.2.1.2. Magnetische scheiding door middel van hoog-gradiënt magnetoforese

Principe In vorige paragraaf 4.2.1.1 werd beschreven hoe MLs aangemaakt werden door op Fe3O4 colloïden een dubbellaag van fosfolipiden te coaten tijdens dialyse. Hierbij wordt echter een vijfvoudige overmaat aan fosfolipiden toegevoegd, waardoor dus, nadat het evenwicht van deze lipide-adsorptie aan de Fe3O4 kernen bereikt is, de nietgeadsorbeerde fosfolipiden nog van de geadsorbeerde lipiden gescheiden moeten worden. Dit gebeurt door gebruik te maken van de ferromagnetische eigenschappen van de ijzeroxide kernen. Fosfolipiden gedragen zich licht diamagnetisch, waardoor ze bijna geen invloed ondervinden van een uitwendig aangelegd magnetisch veld. In een uitwendig aangelegd magnetisch veld (H), wordt de magnetisatie (M) gegeven door volgende formule:

M = χV ⋅ H met χ V = de magnetische susceptibiliteit per volume-eenheid; dit is een maat voor hoe gemakkelijk de elektronenspins zich ordenen in functie van het uitwendig aangelegd magnetisch veld. Doordat de magnetietdeeltjes zo’n kleine afmetingen hebben, is het resulterend magnetisch dipoolmoment klein. Daarom moet er, om deze deeltjes tegen te houden in een magnetisch veld, gebruik gemaakt worden van een hoog-gradiënt magnetisch veld. De ijzeroxide kernen waarop fosfolipiden geadsorbeerd zijn, kunnen nu door middel van 24

magnetische scheiding in een ‘magnetische filter’ verzameld worden. Hiervoor wordt een inox staalwolmatrix in een dun darmpje gepakt en tussen de polen van een grote magneet aangebracht. Op die manier wordt een hoge veldgradiënt bekomen. Wanneer nu het uitwendig veld van de magneet aangelegd wordt en de oplossing met MLs door het darmpje wordt gepompt, zullen enkel de MLs in de staalwolmatrix achterblijven, terwijl de rest van de oplossing, waarin de niet-geadsorbeerde fosfolipiden aanwezig zijn, er gewoon zal doorstromen. Door het afleggen van het uitwendig veld kunnen de tegengehouden MLs vervolgens uitgewassen en verzameld worden door middel van een bufferstroom met relatief hoge snelheid.

Figuur 4.4: Schematische weergave van hoog-gradiënt magnetoforese (HGM)

25

Materiaal - Mengsel van MLs en niet-geadsorbeerde fosfolipiden, verkregen na dialyse (protocol 4.2.1.1) - Elektromagneet - Magnetische proppen - 5 mM TES buffer pH 7,0 - Peristaltische pompen

Methode Het mengsel dat bij dialyse verkregen wordt, waarin de gewenste MLs en de nietgeadsorbeerde fosfolipiden aanwezig zijn, wordt door middel van een peristaltische pomp door de elektromagneet gestuurd. In de tubings waarin het mengsel door de magneet gestuurd wordt, is aan beide uiteinden een staalwol prop gebracht. Deze moeten tussen de twee polen van de elektromagneet gevestigd zijn. Op die manier blijven de MLs door hun ferromagnetische eigenschappen in de proppen achter, terwijl de niet-geadsorbeerde fosfolipiden gewoon door de magneet stromen. Één magnetisch propje kan de hoeveelheid MLs tegenhouden afkomstig uit ongeveer 0,75 mL mengsel. Nadat deze 0,75 mL door de magneet gestuurd werd, worden de magnetische proppen nog eens gespoeld met elk 0,375 mL TES buffer. Hierdoor worden de niet-geadsorbeerde fosfolipiden die achterblijven door capillariteit volledig uit de proppen weggespoeld. Als alle TES buffer door de magnetische proppen gestuurd is, wordt de elektromagneet uitgeschakeld en worden de magnetische proppen aan elkaar gekoppeld. Door middel van een tweede peristaltische pomp wordt nu opnieuw TES buffer door de propjes gestuurd. Aangezien het magnetisch veld nu niet meer aanwezig is, worden de MLs niet meer in de propjes vastgehouden en – afhankelijk van de hoeveelheid elutiebuffer – geconcentreerd in de TES buffer. Per 10 tubings wordt 1,5 mL TES buffer gebruikt om de MLs uit te elueren.

26

4.2.2

Karakterisatie met behulp van spectrofotometrie

De lichtbron van de UV-VIS spectrofotometer zendt polychromatisch licht uit, dat met een monochromator verspreid wordt in bundels monochromatisch licht van verschillende golflengtes. Als monochromator wordt vaak gebruik gemaakt van een prisma. Door lichtbreking in het prisma wordt polychromatisch licht gesplitst in zijn afzonderlijke componenten en wordt monochromatisch licht verkregen. In duurdere apparaten wordt hiervoor evenwel gebruik gemaakt van roosters. De detector die het licht opvangt dat door het te meten staal gaat, zet de stralingsenergie uiteindelijk om in meetbare stroom. De verschillende onderdelen van de spectrofotometer (lichtbron, monochromator en lichtdetector) zijn weergegeven in onderstaande figuur.

Figuur 4.5: De schematische opbouw van een spectrofotometer

Het principe van UV/VIS spectrofotometrie is gebaseerd op selectieve absorptie van bepaalde golflengten uit het zichtbare deel van het elektromagnetisch spectrum, waardoor de oplossing een bepaalde kleur krijgt. De golflengten die niet zijn geabsorbeerd, worden doorgelaten en vormen de kleur die wordt waargenomen. De kleur die wel geabsorbeerd wordt, is de complementaire kleur.

27

Figuur 4.6: Voorstelling van het elektromagnetisch spectrum als een kleurencirkel (de complementaire kleuren maken een onderlinge hoek van 180°)

De optimale golflengte moet gekozen worden, zodat de golflengte van het uitgezonden monochromatisch licht zich nabij het absorptiemaximum in het spectrum van de te detecteren component bevindt. Dan wordt een referentie ingesteld (met absorbantie = 0 of transmissie = 100%), zodat de eigen absorptie en reflectie geen invloed hebben op de meting. Daarna wordt de te meten oplossing in de lichtweg gebracht. Deze zal een deel van het invallend licht absorberen, waardoor de intensiteit van het uittredend licht kleiner zal zijn dan van het invallend licht en dus kan de absorbantie gemeten worden. De concentratie van de oplossing kan nu bepaald worden door middel van de Wet van Lambert-Beer:

A = ε M ⋅l ⋅C met

A: de absorbantie C: de molaire concentratie l: de weglengte (afstand die het licht in de oplossing aflegt) εM: de molaire extinctie coëfficiënt (uitgedrukt in l . mol-1 . cm-1 )

28

Indien de wet van Lambert-Beer perfect geldig is, is de absorptiecurve rechtlijnig en gaat deze door het nulpunt. De wet van Lambert-Beer geldt enkel als aan volgende voorwaarden wordt voldaan: -

Gebruik van monochromatisch licht

-

‘Optisch lege’ vloeistoffen (geen lichtverstrooiende deeltjes aanwezig)

-

Constante temperatuur

-

Niet te geconcentreerde oplossing

Om de concentratie van een component in een onbekend staal kwantitatief te detecteren wordt gebruik gemaakt van een kalibratiereeks. Hierdoor kan een standaardcurve opgesteld worden die het verband aangeeft tussen de gekende concentraties van de ijkmengsels (x-as) en de absorbanties bekomen bij de metingen ervan (y-as). De concentratie van een onbekend staal kan dan aan de hand van de vergelijking van de ijkcurve eenvoudig berekend worden.

4.2.2.1. Fosfaatbepaling

Principe Fosfaatbepaling is gebaseerd op complexatie van orthofosfaat met molybdeenzuur. Er wordt hierbij fosfomolybdaat gevormd. H3PO4 + 12 Na2MoO4 + 21 H+  Na3PO4.12MoO3 + 21 Na+ + 12 H2O Mo (+VI), afkomstig van het fosfomolybdaat, wordt door middel van hydraziniumchloride gedeeltelijk gereduceerd tot molybdeenblauw, een complex dat zowel uit Mo(+VI) als Mo(+V) bestaat. Hierdoor treedt een blauwkleuring van de behandelde oplossing op. De intensiteit van deze blauwkleuring is recht evenredig met de concentratie aan fosfaat en wordt spectrofotometrisch opgemeten bij 820 nm.

29

Materiaal - Na2HPO4.12H2O standaard (0,700 µmol PO43-/mL) - TES buffer - HClO4 - Hydrazoniumchloride - Na2MoO4 - Geconcentreerd H2SO4 - H2SO4 1N - Verwarmplaat - Warmwaterbad - Spectrofotometer

Methode Vanuit een standaard-stockoplossing Na2HPO4.12H2O met een concentratie van 0,700 µmol PO43-/mL (=250,70 mg/L) wordt uitgegaan om een ijk- of standaarcurve op te stellen. Zowel de ijkmengsels als de stalen worden in drievoud aangemaakt en gemeten, zodat eventuele uitschieters kunnen opgespoord worden. De stalen worden eerst 20 keer verdund door 20 µL staal aan te lengen met TES buffer tot 400 µL. De kalibratiereeks wordt in drievoud aangemaakt volgens onderstaande tabel: Tabel 4.2: Aanmaak van de ijkmengsels bij PO43--bepaling

A B C D E

µmol PO43-/mL

mL PO43- standaard

mL TES buffer

0 0,175 0,350 0,525 0,700

0 2,5 5 7,5 10

10 7,5 5 2,5 0

Zowel de ijkmengsels als de onbekende stalen ondergaan volgende bewerkingen: -

Aan 100 µL staal wordt 100 µL HClO4 toegevoegd.

-

De bekomen oplossingen worden gedurende 45 minuten in de verwarmplaat gezet bij 180°C-200°C. Het organisch fosfaat in de oplossing wordt hierbij volledig omgezet tot orthofosfaat.

30

-

Na afkoelen van de oplossingen wordt 1 mL werkoplossing toegevoegd. Deze werkoplossing wordt als volgt aangemaakt: Stockoplossing: •

400 mg hydrazoniumchloride (NH2NH2.2HCl) wordt opgelost in 14 mL HCl (4M)

•

10 g Na2MoO4 wordt opgelost in 60 mL HCl (4M)

Beide worden samengevoegd en 20 minuten in het warmwaterbad gezet bij 60°C. Na afkoelen wordt 14 mL geconcentreerd H2SO4 toegevoegd onder hard roeren. De oplossing wordt hierna opnieuw op kamertemperatuur gebracht en aangelengd met H2O tot 100 mL.  5,5 mL stockoplossing + 26 mL H2SO4 1N Aanlengen tot 100 mL met H2O -

De reacties van de oplossingen met de werkoplossing laat men doorgaan gedurende 15 minuten in een kokend warmwaterbad.

-

Na afkoelen wordt aan elke oplossing 1,5 mL H2SO4 1N toegevoegd en wordt de absorbanties gemeten bij 820 nm in volgorde van toenemende blauwkleuring.

A 820 nm

3-

PO4 bepaling 09/11/2007

0,600 0,500 0,400

y = 0,7621x + 0,0088

0,300

2

R = 0,9996

0,200 0,100 0,000 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 µmol PO43-/mL Figuur 4.7: Voorbeeld van een opgestelde ijklijn bij spectrofotometrische fosfaatbepaling

31

4.2.2.2. Ijzerbepaling

Principe Net zoals bij de fosfaatbepaling wordt ook hier gebruik gemaakt van een serie ijkmengsels om een standaardcurve op te stellen, met de bedoeling om een extrapolatie uit te voeren voor het onbekende staal. Het principe van de ijzerbepaling is gebaseerd op de complexatie van Fe3+ met tiron (4,5-hydroxy-1,3-benzeendisulfonzuur, dinatriumzout monohydraat). De kleurintensiteit van het gevormde rode complex kan gemeten worden bij een golflengte van 480 nm en is recht evenredig met de concentratie van het gemeten staal. Om de kleurstabiliteit te verbeteren wordt fosfaatbuffer toegevoegd. Zoutzuur en salpeterzuur in een 3/1 verhouding vormen samen koningswater, wat een zeer sterk zuur is. Dit zuur heeft bij de ijzerbepaling als functie dat alle ijzeroxide naar Fe3+ wordt omgezet, waarna deze Fe3+-ionen gecomplexeerd worden met tiron, zoals voorgesteld op onderstaande figuur.

Figuur 4.8: Voorstelling van het rode complex dat Fe3+ vormt met tiron

Materiaal - Ijzerstandaaroplossing (1 mg Fe3+/mL) - Rokend HCl - Geconcentreerd HNO3 - Tiron

32

- KOH 4N - Na2HPO4.12H2O - H2ODest. - TES buffer - Warmwaterbad - Spectrofotometer

Methode Eerst wordt vanuit de standaardoplossing met 1 mg Fe3+/mL een reeks ijkmengsels aangemaakt, zodat de ijklijn kan opgesteld worden. Deze ijkmengsels worden in drievoud aangemaakt met rokend HCl en HNO3, zoals aangegeven in onderstaand schema. Hierbij wordt gezorgd dat er in elk ijkmengsel een totaal volume bekomen wordt van 5 mL. Zowel de ijkmengsels als de stalen worden in drievoud aangemaakt om eventuele uitschieters te kunnen elimineren. Tabel 4.3: Aanmaak van de ijkmengsels bij Fe3+-bepaling 3+

0 1 2 3 4 5 6 7

µg Fe /mL 0 10 20 30 50 70 100 150

3+

µL Fe -standaard 0 50 100 150 250 350 500 750

mL rokend HCl 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

mL HNO3conc 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

mL H2Odest 4,20 4,15 4,10 4,05 3,95 3,85 3,70 3,45

Indien het nodig is om het onbekend staal nog te verdunnen, door een te hoge concentratie aan Fe3+, dan kan onderstaande tabel met verschillende verdunningsfactoren gebruikt worden. Op de plaats waar een rode lijn staat, moet het staal gedurende 10 tot 15 minuten in het warmwaterbad geplaatst worden, bij 60°C. Hierbij moet de bruine kleur van de mengsels volledig naar geel overgegaan zijn.

33

Tabel 4.4: Praktische uitwerking van het verdunningsschema bij Fe3+-bepaling VF 2 5 10 15 20 25 30 40 50 75 100

mL staal 1,000 0,400 0,200 0,133 0,100 0,080 0,133 0,100 0,080 0,053 0,100

mL rokend HCl 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 0,48 0,48 0,48 0,48 1,20

mL HNO3conc 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,16 0,16 0,16 0,16 0,40

mL H2Odest 0,68 1,28 1,48 1,55 1,58 1,60 3,23 3,26 3,28 3,31 8,30

De ijkmengsels en de onbekende stalen ondergaan beide volgende bewerkingen. -

Aan 0,5 mL wordt 0,6 mL van een mengsel bestaande uit 100 µL tiron 0,25 M en 500 µL KOH 4N toegevoegd.

-

-

Hierbij wordt 1 mL fosfaatbuffer toegevoegd met een pH 9,5 à 10:


Weeg 71,6 g Na2HPO4.12H2O af en voeg 4 mL KOH 4N toe




Leng aan tot 1 L met H2Odest

Na ongeveer 15 minuten kunnen de absorbanties spectrofotometrisch bij een optimale golflengte van 480 nm gemeten worden. De kleur van deze eindoplossing blijft enkele uren stabiel.

Fe3+ bepaling 09/11/2007 A480 nm 3,0 2,5 2,0 y = 0,0266x + 0,1451

1,5

2

R = 0,9998

1,0 0,5 0,0 0

20

40

60

80

100

120

µg Fe3+/ml

Figuur 4.9: Voorbeeld van een opgestelde ijklijn bij spectrofotometrische ijzerbepaling

34

4.3 MAGNETOLIPOSOMEN, OPGEBOUWD UIT 2 TYPES FOSFOLIPIDEN 4.3.1

Aanmaak

Principe Na fosfaat- en ijzergehaltebepaling van de bereide MLs (bv. DMPG-ML), kunnen hierbij vesikels gevoegd worden om finaal MLs te verkrijgen die in hun dubbellaag een deel van de vesikelfosfolipiden bevatten. Het mengsel van MLs en vesikels vormt namelijk een kinetisch mengsel, waarbij uitwisseling van fosfolipiden voorkomt. Bij deze uitwisseling kunnen twee theoretische modellen opgesteld worden. Het eerste model stelt voor dat er in een fosfolipide-dubbellaag een flipflop beweging optreedt. Als gevolg hiervan zullen zowel buitenste als binnenste laag fosfolipiden in het uitwisselingsproces tussen MLs en vesikels betrokken zijn. Bij het tweede model wordt aangenomen dat flipflop niet voorkomt. Er is hier enkel transfer van buitenste laag fosfolipiden van vesikels naar MLs en omgekeerd. Op het IRC werd bij eerder onderzoek reeds aangetoond dat uitwisseling enkel optreedt tussen de buitenste helften van de respectievelijke fosfolipidenlagen, en er dus geen flipflop voorkomt. In de onderstaande figuur wordt deze uitwisseling tussen vesikels en MLs weergegeven. Als voorbeeld wordt de aanmaak van DMPG – DSPE~PEG5000 ML geïllustreerd. Er moet hierbij opgemerkt worden dat het binnenste membraan van de fosfolipidendubbellaag een derde van de fosfolipiden bevat, en dus, dat het buitenste membraan twee derden van de fosfolipiden herbergt. De toestand waarbij de vesikels en de DMPG-ML nog maar net bij elkaar zijn gevoegd, is weergegeven in het bovenste deel van de figuur. Er worden vesikels gebruikt waarbij 50% van de fosfolipiden DMPG en 50% DSPE~PEG5000 is. Van deze 50% bevindt zich telkens een derde in het binnenste membraan en twee derden in het buitenste membraan (respectievelijk 16,66% en 33,33%). De toestand waarbij de uitwisseling volledig is kunnen doorgaan, wordt weergegeven in het onderste deel van de figuur. De helft van de buitenste membranen van zowel de vesikels als de MLs zijn dan met elkaar uitgewisseld. Er zal dus 16,66% van de DSPE~PEG5000 fosfolipiden van het buitenste membraan van de vesikels naar het buitenste membraan van de MLs getransfereerd zijn. In omgekeerde richting zal dan 16,66% van het buitenste membraan van de MLs overgegaan zijn naar het buitenste membraan van de vesikels. Als resultaat worden MLs verkregen met 83,33% DMPG en 16,66% DSPE~PEG5000 fosfolipiden.

35

Figuur 4.10: Uitwisseling van fosfolipiden tussen DMPG – DSPE~PEG5000 (50/50; m/m) vesikels en DMPG MLs. Dit kinetisch mengsel wordt gebruikt voor de aanmaak van DMPG – DSPE~PEG5000 ML

In deze thesis is het telkens de bedoeling om na het uitwisselingsproces MLs te verkrijgen waarbij 20% van de fosfolipiden uit DSPE~PEG5000 bestaat. Om tot dit resultaat te komen kan met eenvoudig rekenwerk nagegaan worden dat hiervoor 100% DMPG-ML (of DMPCML) moeten samengevoegd worden met vesikels die 40% DMPG (of DMPC) en 60% DSPE~PEG5000 bevatten. Nadat de uitwisseling volledig doorgegaan is, moet de oplossing

36

nog hoog-gradiënt magnetisch gescheiden worden, aangezien enkel met de bekomen MLs verdergewerkt wordt. Na de magnetische scheiding wordt het fosfaat- en ijzergehalte van de bekomen MLs bepaald (zie protocol 4.2.2.1 en 4.2.2.2).

Materiaal - MLs met 100% DMPG (of DMPC) fosfolipiden - Vesikels met 40% DMPG (of DMPC) en 60% DSPE~PEG5000 (of DMPE~PEG2000)PL - Elektromagneet - Magnetische proppen - 5 mM TES buffer pH 7,0 - Peristaltische pompen

Methode (Figuur 4.11) Er worden eerst pure DMPG (of DMPC) MLs bereid zoals eerder aangegeven in protocol 4.2.1. Vervolgens worden equimolaire (met betrekking tot het fosfolipidengehalte) hoeveelheden van de 100% DMPG (of DMPC) ML en de vesikels met 40% DMPG (of DMPC) en 60% DSPE~PEG5000 (of DMPE~PEG2000) samengevoegd. Dit mengsel wordt gedurende 1 dag geïncubeerd bij 37°C. Na de incubatie moeten de bekomen MLs magnetisch gescheiden worden van de nog aanwezige vesikels. Dit gebeurt door middel van HGM (zie protocol 4.2.1.2). Hiervoor worden fracties van 0,75 mL door de elektromagneet gestuurd door middel van een peristaltische pomp. De magnetische proppen worden daarna nog gewassen met 0,375 mL TES buffer. Daarna wordt de magneet afgelegd, worden de magnetische proppen aan elkaar gehangen en worden de vastgehouden MLs uit de proppen geëlueerd met TES buffer aan een debiet van 500 mL/uur. De hoeveelheid TES die hierbij gebruikt wordt is gelijk aan het volume waarin de DMPG (of DMPC) MLs oorspronkelijk aanwezig waren. Volgende MLs worden aangemaakt, en na toevoegen van CO verder onderzocht op het verloop van de CO-activiteit (zie paragraaf 4.4):

37

Niet-gePEGyleerde MLs:
DMPG ML
DMPC - DMPG (80:20; m/m) MLs

GePEGyleerde fosfolipiden:
DMPG - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) MLs
DMPC - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) MLs

Figuur 4.11: Overzicht van de opeenvolgende stappen bij de aanmaak van gePEGyleerde MLs. Bemerk dat in stap 2 alleen de fosfolipiden in de buitenste monolaag in het uitwisselingsproces betrokken zijn.

38

4.3.2

Karakterisatie met behulp van gaschromatografie

Principe Chromatografie is één van de meest gebruikte analytische scheidingsmethoden. Het doel is om verschillende componenten van een complex mengsel van elkaar te scheiden zodat karakterisatie mogelijk wordt. Een typisch kenmerk bij chromatografie is de aanwezigheid van een stationaire en een mobiele fase. Gaschromatografie is een techniek die gebruikt wordt om vluchtige componenten van een mengsel te identificeren. Een belangrijke voorwaarde hierbij is dat de componenten vluchtig moeten zijn, met een kookpunt dat lager ligt dan de decompositie temperatuur van de stationaire fase, die de kolom bedekt. Hieronder is de voorstelling weergegeven van een gaschromatograaf.

Figuur 4.12: Schematische voorstelling van de gaschromatograaf

(Bron: http://web.markenhage.nl/vakken/edu_scheikunde/scheikunde%20bovenbouw)

Voor de keuze van de injectiemethode wordt gesteund op de hoeveelheid (kwantiteit) en de soort (kwaliteit) van de analytische stalen. In deze thesis wordt gebruik gemaakt van ‘fatty acid methyl esters’ (FAME), waardoor gewerkt wordt met een cold-on-column injector. Dit betekent dat het staal door middel van het draaggas onmiddellijk op de

39

kolom wordt gebracht, zonder dat het eerst in de gasfase gebracht wordt. Deze techniek heeft verschillende voordelen:




De injectie vindt plaats bij kamertemperatuur waardoor er geen gevaar is dat het staal thermische degradatie zal ondervinden.




Discriminatie van de vluchtige componenten wordt verhinderd door een secundaire koeling bij de ingang van de kolom.




De ingang heeft geen septum nodig zodat contaminatie minimaal wordt. Door de zeer kleine diameter van de kolom is een spuitnaald nodig met zeer kleine afmetingen. Deze naald kan niet door een septum prikken, waardoor een alternatief gebruikt wordt: een flexibele afsluiting in een metalen schroefdop.

De kolom bevindt zich in een oven, waarin de temperatuur zeer nauwkeurig gecontroleerd wordt (op enkele tienden van een graad). De snelheid waarmee de temperatuur opgedreven kan worden is heel belangrijk en heeft een grote invloed op de scheiding van de

componenten.

De

temperatuurveranderingen

worden

gestuurd

door

een

computerprogramma. Er kunnen twee types kolommen gebruikt worden: gepakte kolommen en open tubulaire kolommen (capillaire kolommen). Het grootste verschil tussen deze types zijn de afmetingen. Een capillaire kolom heeft een zeer kleine interne diameter van ongeveer 0,2 tot 0,5 mm. In deze thesis wordt gebruik gemaakt van een middelmatige diameter van 0,32 mm. Hierdoor is de noodzakelijke hoeveelheid geïnjecteerd staal zeer klein: ongeveer 1 µL. De stationaire fase in de gebruikte capillaire kolom (wall coated open tubular - WCOT) is polyethyleenglycol, die zich als een dunne vloeistoflaag op de binnenste zijde van de kolom bevindt. Een WCOT is een lange kolom (tot 100 m), waardoor er een zeer goede scheiding bekomen wordt. Tussen de injector en de kolom is een prekolom gevestigd. Dit is een naakte kolom zonder stationaire fase, die de kolom beschermd door mogelijke contaminaties tegen te houden. De functie van het volgende onderdeel van de gaschromatograaf, de detector, is het aantonen van de afzonderlijke componenten in de gasstroom. Deze detectie is gebaseerd op veranderingen van fysische eigenschappen van het effluent dat uit de kolom komt. Hiervoor worden de verschillende organische moleculen, die de kolom verlaten, verbrand

40

in de vlamionisatiedetector (FID, figuur 4.13) na toevoegen van een mengsel van waterstof en lucht. Gedurende dit proces worden geladen deeltjes geproduceerd die een elektrische stroom veroorzaken tussen de twee elektroden van de FID. Het elektrische signaal is recht evenredig met de hoeveelheid moleculen, en geeft dus kwantitieve informatie.

Deze

kwantitatieve

informatie

wordt

uiteindelijk

uitgedrukt

in

een

chromatogram.

Figuur 4.13: De vlamionisatiedetector bij gaschromatografie

(http://www.chem.unl.edu/uic/gc-fid.html)

Een directe analyse van MLs en liposomen is niet mogelijk, aangezien deze niet vluchtig zijn. Daarom moeten ze eerst gehydrolyseerd worden in een zuur milieu, waarna hun vrije vetzuren veresterd moeten worden naar de methylesters (fatty acid methyl esters – FAME), die veel vluchtiger zijn. HCl dat zorgt voor het zuur milieu waarin de esterificatie doorgaat, wordt verkregen door in droge methanol CH3COCl te druppelen. Hierbij geldt de onderstaande reactie vergelijking. Het gevormde methylacetaat is een bijproduct dat niet interfereert bij de gaschromatografie. CH3COCl + CH3OH  CH3CO2CH3 + HCl

41

Materiaal - Heptadecaanzuur - Chloroform - N2 gas - Verwarmplaat - HCl 5N - Diethylether - Acetylchloride - Droge methanol - Petroleumether - Gaschromatograaf

Methode Voor de derivatisatie van vetzuren wordt onderstaand protocol gevolgd. Er wordt gewerkt in buisjes die vrij zijn van alle ionen (werden in chroomvocht gelegd en gedroogd in de droogstoof). -

50 µL van de interne standaard, heptadecaanzuur (0,4 mg/mL chloroform), wordt in elk reactiebuisje gebracht.

-

Hydrolyse:


Voorzichtig droogdampen met N2 gas




100 µL van de te onderzoeken stalen en 4 mL HCl 5N worden in de buisjes gebracht. Eventueel worden de stalen verdund als er teveel fosfolipiden in aanwezig zijn.


-

Incubatie gedurende 1 uur bij 90°C

Na afkoeling wordt een vloeistof-vloeistof extractie uitgevoerd door 5 keer 1 mL diethylether toe te voegen, goed te schudden en de ether fase (bovenste) telkens over te brengen in een ander buisje. Hierbij is het belangrijk dat er niets van de onderste fase mee overgebracht wordt.

-

De overgebrachte ether fases worden drooggedampt met N2 gas.

-

Een mengsel van 10% acetylchloride wordt aangemaakt in droge methanol door druppelsgewijs het acetylchloride bij de methanol te voegen, terwijl op ijs gewerkt wordt. Alle manipulaties worden uitgevoerd onder de trekkast.

42

-

Bereiding van methylesters:


1,5 mL van het 10% acetylchloride-methanol mengsel wordt toegevoegd aan de drooggedampte stalen.


-

Incubatie gedurende 2 uur bij 70-90°C

Opnieuw wordt een vloeistof-vloeistof extractie uitgevoerd. 1,5 mL petroleumether wordt 4 keer toegevoegd aan de reactiebuisjes, waarna telkens geschud wordt en de bovenste fase overgebracht wordt in andere buisjes.

-

Opnieuw wordt drooggedampt met N2 gas.

-

De drooggedampte stalen worden opgelost in een chloroform-methanol mengsel (4:1)

-

Als laatste kan 1 µL van elk bekomen staal in de gaschromatograaf geïnjecteerd worden.

Volgende parameters zijn van toepassing bij het gebruikte gaschromatografie proces: - Kolom:

DB-wax Lengte: 30 m Interne diameter: 0,32 mm Film: 0,5 µm

- Injectiemethode:

Cold-on-column Hoeveelheid: 1 µL

- Methode:

FAME.MTH

- Programma:

P9

- Injector:

Kamertemperatuur

- Detector:

FID Temperatuur: 275°C

- Oven:

ISO 1 Temperatuur: 125°C

- Secundaire koeling:

25 seconden, door middel van lucht

- Temperatuur gradiënt: 125°C

2 minuten

125-245°C 8°C/min 245°C

7 minuten

- Draaggas:

Helium (50 kPa)

- Vlamgas:

Perslucht (100 kPa) H2 (80  50 kPa)

43

- Ijkmengsel: Tabel 4.5:

Samenstelling van het ijkmengsel bij GLC

FAME standard Solvent: Methyl Chloride

C10:0 C12:0 C14:0 C15:0 C16:0 C16:1 C17:0 C18:0 C18:1 c18:2 C20:0

Lot# A038774 30H8458 17312BB A032894 03922BA 19213PA A034721 1084095 13710TA 08830EA A036282

Target: 2-3 mg/ml Final Volume: 50 ml conc purity (mg/ml) 0,99 2,50 0,99 2,50 0,99 2,50 0,99 2,50 0,99 3,00 0,99 2,00 0,99 3,00 0,99 3,00 0,99 2,50 0,99 2,00 0,99 2,00

4.4 ONDERZOEK NAAR DE ACTIVITEIT VAN CO IN AANWEZIGHEID VAN VERSCHILLENDE SOORTEN MAGNETOLIPOSOMEN EN LIPOSOMEN OP VERSCHILLENDE TIJDSTIPPEN Cytochroom c oxidase (CO) is een enzym dat inwerkt op het substraat cytochroom c (cyt c). Zoals reeds vermeld in de literatuurstudie (2.3.1 Fysiologische functie), katalyseert CO het elektronentransport van cyt c naar moleculaire zuurstof. Hierbij zet CO de gereduceerde vorm van cyt c (Fe2+) om naar de geoxideerde vorm (Fe3+), wat gepaard gaat met spectrale veranderingen. Het absorptiespectrum van het geoxideerd en gereduceerd cyt c is weergegeven in figuur 4.14. Het maximale verschil in absorptie wordt teruggevonden bij 550 nm; dit is dan ook de meest geschikte golflengte om de reactie te volgen. Het is de bedoeling om verschillen in activiteit van CO na te gaan wanneer het enzym ingebed is in het membraan van (magneto)liposomen, en welke invloed de samenstelling van de membraan heeft op de activiteit. Daarom worden de experimenten uitgevoerd met (magneto)liposomen die opgebouwd werden met DMPG, DMPC, DSPE~PEG5000 en/of DMPE~PEG2000. DSPE~PEG5000 en DMPE~PEG2000 zijn fosfolipiden waarbij de polaire kop is verlengd met een lange PEG-keten.

44

Figuur 4.14: Absorptiespectrum van cytochroom c (Bron: M. De Cuyper, 1996) Cyt c in de volledig geoxideerde vorm (_.._.._), voor 27% gereduceerd (_._._._), voor 47% gereduceerd (………...), voor 70% gereduceerd (_ _ _ _) en in de volledig gereduceerde vorm (_____). De pijl duidt het isosbestisch punt aan bij 556,3 nm.

4.4.1

Aanmaak van de (magneto)proteoliposomen

Principe Door een grote hoeveelheid energie in een suspensie van liposomen of ML met CO te brengen, bijvoorbeeld met behulp van sonicatie, wordt CO in de fosfolipidendubbellaag van de reeds aangemaakte (magneto)liposomen geïncorporeerd. Omdat CO een zeer temperatuursgevoelig eiwit is, wordt tijdens het soniceren gekoeld en worden de (magneto)liposoom-CO partikels na sonicatie op ijs geplaatst.

45

Materiaal - Sonicator - Exponentiële 1/8” probe - Aangemaakte (magneto)liposoomoplossingen - CO [11,4 mg eiwit/mL fosfaatbuffer (67 mM, pH 7,4, 0,25 M sucrose, 1,5% cholaat)]. Deze stockoplossing wordt bewaard bij -70°C.

Methode Aan 3 mL van de aangemaakte (magneto)liposoomoplossingen (met variabele fosfolipidenconcentraties, volgens tabel 4.1 op pagina 21) wordt 13,15 µL CO toegevoegd (11,4 mg/mL). Dit mengsel wordt bij kamertemperatuur 3 keer gedurende 30 seconden gesoniceerd met een exponentiële probe, bij een peak-to-peak intensiteit van 6 µm. Elke sonicatie wordt afgewisseld met een rustpauze van 30 seconden.

4.4.2

Kinetische analyse

Principe Het cyt c dat in deze thesis gebruikt wordt, bevindt zich oorspronkelijk in de volledig geoxideerde vorm. Door middel van dithioniet kan dit cyt c gereduceerd worden, terwijl het met K3Fe(CN)6 opnieuw kan geoxideerd worden. Volledig geoxideerd cyt c heeft bij de gebruikte concentratie van de substraatoplossing een absorbantiewaarde van 0,340 bij 550 nm; volledig gereduceerd heeft het een absorptiewaarde van 1,186. Cyt c - Fe2+ heeft dus een veel hogere absorbantiewaarde dan cyt c - Fe3+. Hoe meer activiteit CO heeft, en dus hoe meer cyt c - Fe2+ wordt omgezet naar cyt c - Fe3+, hoe groter de helling is van de kinetica-grafiek waarbij de absorbantie uitgezet wordt ten opzichte van de tijd.

Materiaal - Aangemaakte (magneto)liposomen met CO in het membraan ingebed (protocol 4.4.1)

46

- Cytochroom c (Bron: Horse heart, Sigma) - Dithioniet (S2O42-) - K3Fe(CN)6 - Pederson pipet 60 µL - Roerstaaf - Cuvetten - Thermostaat - Thermometer - Dubbelstraal spectrofotometer - TES buffer

Methode Er wordt in dit experiment telkens bij een optimale golflengte van 550 nm gemeten (tenzij anders vermeld) en ten opzichte van TES buffer als blanco. Een oplossing van iets meer dan 0,6 mg/mL cyt c wordt gemaakt in TES buffer. Bij 3 mL van deze oplossing wordt een overmaat dithioniet gevoegd, waardoor het cyt c volledig gereduceerd wordt. De bekomen absorbantiewaarde voor het mengsel zou in theorie 1,186 moeten zijn, maar aangezien meer afgewogen werd, zal deze waarde iets hoger liggen. Met een eenvoudige regel van drie kan uit deze waarde berekend worden hoeveel TES buffer moet toegevoegd worden om exact 1,186 te verkrijgen als absorbantie, indien de oplossing volledig zou gereduceerd zijn. De bekomen stockoplossing van cyt c heeft nu nog een absorbantie van 0,340. In dit experiment wordt echter verdergewerkt met cyt c dat een absorbantiewaarde heeft van 0,950, of met andere woorden cyt c dat voor ongeveer 72% gereduceerd is. Dit kan bekomen worden door druppelsgewijs een dithionietoplossing toe te voegen en herhaaldelijk de absorbantie van de oplossing te meten tot men de waarde 0,950 zo goed mogelijk benadert. Praktische uitvoering van de kinetica: In een cuvet wordt 3 mL van de cyt c-oplossing gepipetteerd die door middel van dithioniet naar een absorbantiewaarde van 0,950 werd gebracht. Deze oplossing wordt gethermostatiseerd bij 25°C. Daarna wordt 60 µL van het te meten staal (waarin CO aanwezig is, ingebed in de (magneto)liposomen) bij het cyt c toegevoegd, terwijl

47

tegelijkertijd de meting gestart wordt (= tijd 0 van de kinetica). Er wordt nog eens goed gemengd en de absorbantiewaarden wordt gedurende 5 minuten gemeten. Daarna wordt een korrel K3Fe(CN)6 toegevoegd om de eindwaarde te bepalen. Dit is een overmaat K3Fe(CN)6, waardoor er onmiddellijk een volledige oxidatie gebeurd naar cyt c - Fe3+. Bij de metingen is het van belang dat op reproduceerbare wijze gewerkt wordt. Dit om de resultaten met elkaar te kunnen vergelijken. De metingen met de spectrofotometer gebeuren voor elk staal op de tijdstippen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 24 uur na bereiding van de (magneto)liposoom-CO partikels. Voor onderstaande soorten liposomen/MLs wordt de CO-activiteit onderzocht:

LIPOSOMEN

Niet-gePEGyleerde fosfolipiden:
DMPG ves
DMPC - DMPG (80:20; m/m) ves

GePEGyleerde fosfolipiden:
DMPG - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) ves
DMPC - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) ves

MAGNETOLIPOSOMEN

Niet-gePEGyleerde fosfolipiden:
DMPG MLs
DMPC - DMPG (80:20; m/m) MLs

GePEGyleerde fosfolipiden:
DMPG - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) MLs
DMPC - DSPE~PEG5000 (80:20; m/m) MLs

48

Er worden (magneto)liposomen aangemaakt met een verschillende bezetting met CO. In de kinetische experimenten wordt er wel voor gezorgd dat telkens eenzelfde hoeveelheid enzym wordt toegevoegd aan het substraat, cyt c. Per type (magneto)liposoom worden 8 verschillende stalen aangemaakt. Voor de liposomen zijn de verschillende concentraties en aantal CO/ves weergegeven in tabel 4.1. Voor de MLs gelden dezelfde condities, zodat de resultaten met elkaar vergeleken kunnen worden. Bij de kinetische absorptiemetingen met MLs moet opgemerkt worden dat men rekening moet houden met lichtverstrooiing als gevolg van clustering. Het positief geladen cyt c en de anionische MLs trekken elkaar immers aan en vormen zo aggregaten, die de meetresultaten beïnvloeden. Om te corrigeren voor dit effect, worden de metingen op exact dezelfde manier nog eens herhaald bij 556,3 nm. Zoals te zien is op figuur 4.14, vertonen zowel de geoxideerde vorm als de gereduceerde vorm van cyt c bij 556,3 nm dezelfde absorbantiewaarde. Dit snijpunt is op de figuur aangeduid met een pijl en wordt het isosbestisch punt genoemd. Bij deze golflengte worden de absorbantiewaarden dus niet beïnvloed door de oxidatietoestand van het cytochroom c. De tijdsafhankelijke waarden die bekomen worden voor clustering moeten dan afgetrokken worden van de waarden gemeten bij 550 nm. (Appendix C)

49

5. RESULTATEN

De numerieke waarden van de grafieken zijn terug te vinden in Appendix D.

5.1. IMPACT VAN SONICATIE OP DE ACTIVITEIT VAN CYTOCHROOM C OXIDASE IN AAN- EN AFWEZIGHEID VAN FOSFOLIPIDE VESIKELS Het kinetisch verloop van de oxidatie van cytochroom c door inwerking van het (fosfo)lipide-arme cytochroom c oxidase wordt voorgesteld in figuur 5.1 (●). In de gebruikte experimentele omstandigheden werd het enzym, na verdunning vanuit de stockoplossing tot de gewenste concentratie (0,05 mg/mL1), nog 2 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd vooraleer de kinetica te starten. Linearisatie van de gegevens (figuur 5.2), gebruik makend van eerste orde reactie mathematica (Appendix A), laat ons toe een k1 = 0,00045 s-1 te berekenen.

K3Fe(CN)6

A550nm 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

100

200

∞

300

Tijd (s) Figuur 5.1: Oxidatie van cyt c door CO in afwezigheid van vesikels (●) en in aanwezigheid van asolectine vesikels (■). Na 300 seconden reactietijd wordt het eindpunt van de reactie bekomen door toevoeging van K3Fe(CN)6. 1

Verdunning: 13,15 µl CO-stockoplossing met conc 11,4 mg/ml wordt aangelengd tot 3 mL met TES buffer (5mM, pH 7,0) zodat de CO-concentratie 0,05 mg/ml bedraagt.

50

Indien aan het enzym asolectinevesikels2 toegevoegd worden, worden grotere ∆A550nm decrementen waargenomen [Figuur 5.1 (■)]. Deze aanzienlijke activiteitsverhoging wordt meer dan waarschijnlijk veroorzaakt door inbouw van het (amfifiele) enzym in de lipidedubbellaag van de vesikels. Uit de helling van de gelineariseerde eerste-orde reactieprofiel wordt een k1 = 0,00132 s-1 berekend. In een poging om de inbouw – en dus de enzymatische kwaliteit – verder op te drijven werd het vesikel-enzym incubatiemengsel gesoniceerd gedurende opeenvolgende tijdsintervallen. We stellen een verdere, zij het lichte toename van de activiteit vast (Figuur 5.2). De k1-waarden na 0, 60, 90 en 150 seconden sonicatie zijn respectievelijk: 0,00132; 0,00139; 0,00140 en 0,00145 s-1.

Tijd (s) -0,1 0 -0,2

100

200

300

400

in afwezigheid van vesikels

y = -0,00045x - 0,53961 R2 = 0,99932

-0,3

t=0"

y = -0,00132x - 0,54599 R2 = 0,99982

t=60"

y = -0,00139x - 0,54917 R2 = 0,99999

t=90"

y = -0,00140x - 0,56277 R2 = 0,99999

t=150"

y = -0,00145x - 0,56155 R2 = 0,99998

ln(At - A∝ )

-0,4 -0,5 -0,6 -0,7 -0,8 -0,9 -1 -1,1

Figuur 5.2: Oxidatie van cyt c door CO in aanwezigheid van asolectine vesikels in functie van de sonicatietijd

Voor de verdere experimenten worden de fosfolipide-CO mengsels telkens gedurende 90” gesoniceerd (3 perioden van 30’’, telkens gescheiden door een 30”-durende ‘rust’periode).

2

Asolectine is een fosfolipide-extract uit sojabonen. De fosfolipidensamenstelling is 22% PC, 40% PE, 20% fosfatidylserine, 5% fosfatidinezuur, 2-3% andere anionische fosfolipiden en 11% lysofosfolipiden [Casey et al., 1982].

51

5.2. INVLOED VAN DE MEMBRAANLADING OP DE GRAAD VAN ENZYM REACTIVATIE 5.2.1

Reactivatie van CO met vesikels

De reactivatie van cytochroom c oxidase werd bestudeerd in vesikels, opgebouwd uit ofwel uitsluitend het anionische DMPG, ofwel DMPC gemengd met DMPG (80/20 molaire verhouding). In eerste instantie werden de condities zodanig gekozen dat gemiddeld slechts 1 molecule CO per vesikel werd ingebouwd. De metingen werden uitgevoerd onmiddellijk na inbouw van het CO in de respectievelijke vesikels en na 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 24u (Figuur 5.3A). We stellen vast dat de k1-waarden bekomen met de matig negatief geladen (DMPCDMPG; 80/20; m/m) proteovesikels 2 tot 3 maal groter zijn dan deze bekomen met de puur anionische (100% DMPG) vesikels. Kinetische metingen (niet getoond), bekomen met hogere beladingen van CO (3; 3,75; 5; 7,5; 15; 30 en 60 CO/vesikel) met de twee verschillende types vesikels (20 en 100% DMPG), geven eenzelfde trend aan.

5.2.2

Reactivatie van CO met MLs

Een analoge weg werd gevolgd om de reactivatie-capaciteit van DMPG (100%) en DMPCDMPG (80/20; m/m) MLs te bestuderen. De berekende k1-waarden worden uitgezet in figuur 5.3B. Hierbij kan opnieuw vastgesteld worden dat structuren waarbij het mol% DMPG slechts 20% bedraagt, de beste reactivatie vertoont. In absolute waarden liggen de grafieken die betrekking hebben op MLs lager dan de overeenkomende grafieken geconstrueerd met de vesikels. (Vergelijk figuur 5.3A met 5.3B).

52

k1

DMPC-DMPG (80/20) ves /

DMPG ves

0,0035

0,003

0,0025

0,002

0,0015

0,001

0,0005

Tijd (min)

0 0

300

600

k1

900

1200

DMPC-DMPG (80/20) MLs /

1500

DMPG MLs

0,0035

0,003

0,0025

0,002

0,0015

0,001

0,0005

Tijd (min)

0 0

300

600

900

1200

1500

Figuur 5.3: Activiteit van CO na inbouw in DMPC-DMPG (80/20; m/m) en DMPG vesikels (A) en MLs (B). De ‘bewaartijd in ijs’ van de katalytische partikels wordt weergegeven in de x-as.

53

5.3. KINETICA’S

IN

FUNCTIE

VAN

DE

CO-DENSITEIT

OP

HET

MEMBRAANOPPERVLAK Om vesikels of MLs aan te maken met een verschillend gehalte aan CO wordt als volgt gewerkt. Voor wat de aanmaak van proteovesikels betreft, wordt vertrokken vanuit een stockoplossing van 15 mg fosfolipide [DMPG of DMPC-DMPG; (80/20; m/m)] in 10 mL CHCl3/MeOH (2/1; v/v). In verschillende sonicatievatjes wordt van deze oplossing 3; 1; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; 0,1 en 0,05 mL gepipetteerd en uitgedampt met behulp van N2 gas. Bij het gedroogde residu werd telkens 9 mL TES buffer (5 mM; pH 7,0) gevoegd en dit werd gesoniceerd (2 min, 3/8” probe) en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt bij 3 mL van de gesoniceerde vesikels 13,15 µL CO stockoplossing gevoegd (11,4 mg/ml) en gesoniceerd (3 x 30”; exponentiële probe). In deze omstandigheden worden volgende aantal moleculen CO/vesikel verhoudingen bekomen: 1; 3; 3,75; 5; 7,5; 15; 30 en 60. Bovenstaande werkwijze wordt in onderstaande tabel schematisch weergegeven. Tabel 5.1: Schematische weergave van de werkwijze bij de aanmaak van proteovesikels met een verschillend aantal moleculen CO/vesikel

mL stockoplossing PL in organisch solvent + uitdampen

mL TES

µL CO stockoplossing

CO/vesikel

3

9

13,15

1

1

9

13,15

3

0,8

9

13,15

3,75

0,6

9

13,15

5

0,4

9

13,15

7,5

0,2

9

13,15

15

0,1

9

13,15

30

0,05

9

13,15

60

3 ml

Voor de studie met proteoMLs wordt vertrokken van een batch MLs (zowel DMPG als DMPC-DMPG MLs) (5 µmol P/ml) waaruit verschillende volumes genomen worden, waaraan vervolgens 13,15 µL van de CO-stockoplossing (11,4 mg/ml) wordt gevoegd. Finaal wordt gewerkt met dezelfde PL concentratie als CO/vesikel verhouding als bij de vesikels.

54

Voor het volgen van de kinetica’s wordt telkens 60 µl van de enzympreparaten genomen. Hierdoor wordt ervoor gezorgd dat in elk bestudeerd kinetisch mengsel eenzelfde hoeveelheid enzym aanwezig is. Zowel bij DMPC-DMPG (80/20; m/m) en DMPG (100%) vesikels, als bij de analoge MLs wordt vastgesteld dat de k1-waarden dalen naarmate de CO-belading in de lipidedubbellaag toeneemt. Representatieve curven, geconstrueerd met stalen die onmiddellijk na sonicatie werden gebruikt, worden weergegeven in figuur 5.4.

k1

DMPG ves

DMPC-DMPG ves

DMPG ML

DMPC-DMPG ML

0,003

0,0025

0,002

0,0015

0,001

0,0005

CO/ves

0 0

10

20

30

40

50

60

Figuur 5.4: Grafische voorstelling van de relatie tussen de k1-waarden en de CO-densiteit op het membraanoppervlak. Elk kinetisch mengsel bevat eenzelfde hoeveelheid enzym.

55

5.4. STEALTH-(MAGNETO)LIPOSOMEN 5.4.1

Controle van de lipide-coating van DMPC - DSPE~PEG5000 MLs

Zoals aangegeven in de ‘METHODEN’ (protocol 4.3.1) worden DMPC - DSPE~PEG5000 MLs bereid door incubatie van DMPC MLs met DMPC - DSPE~PEG5000 vesikels. Wanneer de incubatie beëindigd wordt, wordt het mengsel gescheiden in een hoog-gradiënt magnetisch veld. Er wordt verondersteld dat tijdens deze incubatieperiode fosfolipiden uitwisselen tussen de ML- en de vesikelpopulatie. Om dit te bewijzen wordt de vetzuursamenstelling van de vesikel en ML preparaten die gebruikt werden tijdens het experiment, bepaald met behulp van gaschromatografie. Volgende preparaten worden geanalyseerd:

staal 1 DMPC - DMPG (80/20; m/m) MLs 2 DMPC MLs 3 DMPC - DSPE~PEG5000 (40/60; m/m) vesikels 4 Het incubatiemengsel van DMPC MLs en DMPC - DSPE~PEG5000 vesikels 5 DMPC - DSPE~PEG5000 (80/20; m/m) MLs bekomen uit het incubatiemengsel beschreven in staal 4 en gefractioneerd d.m.v. HGM

De GLC chromatogrammen worden weergegeven in figuur 5.5. Het elutiepatroon van het ijkmengsel,

gebruikt

in dezelfde experimentele omstandigheden om de exacte

retentietijden te determineren, wordt eveneens weergegeven. De percentages, afgeleid uit de chromatogrammen, hebben betrekking op de geïntegreerde piekoppervlakken.

56

Figuur 5.5: GLC chromatogrammen na analyse van bovenstaande stalen

De pieken die weergegeven worden bij C17:0, zijn te wijten aan de aanwezigheid van de interne standaard heptadecaanzuur. Afgezien van de aanwezigheid van restanten van C12:0 vetzuren (afkomstig van het laurinezuur) in sommige stalen (2, 4 en 5), worden onderstaande C14:0 en C18:0 waarden gemeten.

57

Tabel 5.2: Resultaten GLC analyse van bovenstaande stalen Staal nr. 1 2 3 4 5

DMPC - DMPG MLs DMPC MLs DMPC - DSPE~PEG5000 ves DMPC MLs + DMPC - DSPE~PEG5000 ves DMPC - DSPE~PEG5000 MLs

% C14:0 afgeleid uit GLC 97,4 100 30,6

% C18:0 afgeleid uit GLC 2,6 0 69,4

54,1 77,1

45,9 22,9

% C14:0 % C18:0 Beoogde herrekend herrekend C14/C18 naar mol naar mol (m/m) 97,9 2,1 100/0 100 0 100/0 36,2 63,8 40/60 60,2 81,3

39,8 18,7

70/30 80/20

We stellen vast dat de experimenteel bekomen resultaten volledig in overeenstemming zijn met de theoretische berekeningen zoals aangegeven in 4.2.4. Er kan inderdaad besloten worden dat enkel de fosfolipiden in de buitenste laag fosfolipiden participeren in het transfergebeuren.

5.4.2

Enzymatische activiteit van Stealth (magneto)proteoliposomen

Zoals beschreven in de ‘METHODEN’ (protocol 4.1) kunnen gePEGyleerde vesikels met ingebouwd enzym vlot verkregen worden door sonicatie van de gewenste fosfolipiden (DMPC, DSPE~PEG5000), gevolgd door een kortdurende sonicatie (90 seconden, zie protocol 4.4.1) in aanwezigheid van CO. Concreet wordt voor de aanmaak van Stealth liposomen met stijgende CO bezetting de procedure gevolgd zoals beschreven op pagina 54. In figuur 5.6A worden de resultaten, bekomen met DMPC - DSPE~PEG5000 vesikels (80/20; m/m) onmiddellijk na sonicatie, afgebeeld (□). Om het verschil in kinetisch gedrag met de niet-gePEGyleerde DMPC – DMPG (80/20) vesikels te illustreren worden de resultaten met deze laatste structuren eveneens weergegeven (○). In tegenstelling tot de resultaten, bekomen met niet-gePEGyleerde proteovesikels, wordt vastgesteld dat: 1. bij lage CO-bezetting (1 CO/vesikel) de gemeten activiteit duidelijk lager ligt bij gePEGyleerde

structuren;

bij

hogere

bezetting

daarentegen

blijken

de

gePEGyleerde structuren ietwat actiever te zijn. 2. met gePEGyleerde proteovesikels de k1-waarden nagenoeg onafhankelijk zijn van de enzymbezetting van de vesikels.

58

Figuur 5.6B toont de resultaten van metingen uitgevoerd na bewaring op ijs van de COvesikel complexen gedurende 4 uur vooraleer de kinetische metingen uit te voeren. Eenzelfde verloop van k1 in functie van de CO-belading wordt vastgesteld. Dit duidt erop dat relatief stabiele structuren werden gevormd, tenminste als ze op ijs bewaard worden. Bovengenoemde experimenten werden ook herhaald met de volledig anionische DMPG (●) en DMPG - DSPE~PEG5000 (80/20; m/m) MLs (■). Ook hier wordt vastgesteld (figuur 5.6, C en D) dat het aanbrengen van PEG polymeren op het ML oppervlak de enzymatische activiteit drastisch doet dalen bij constructies met lage CO densiteit.

k1

DMPC-DMPG ves

DMPC-DSPE~PEG5000 ves

0,0035

0,003

0,0025

0,002

0,0015

0,001

0,0005

0 0

10

20

30

40

50

60

CO/ves

k1

DMPC-DMPG ves

DMPC-DSPE~PEG5000 ves

0,0035

0,003

0,0025

0,002

0,0015

0,001

0,0005

0 0

10

20

30

40

50

60

CO/ves

59

k1

DMPG MLs

DMPG-DSPE~PEG5000 MLs

0,0015

0,001

0,0005

0 0

10

20

30

40

50

60

CO/ves

k1

DMPG MLs

DMPG-DSPE~PEG5000 MLs

0,0015

0,001

0,0005

0 0

10

20

30

40

50

60

CO/ves

Figuur 5.6: Grafische voorstelling van de relatie tussen de k1-waarden en de CO-densiteit op het membraanoppervlak van Stealth (magneto)liposomen vesikels A – na t=0 (DMPC-DMPG / DMPC-DSPE~PEG5000) B – na t=4 (

“

/

“

)

MLs C – na t=0 (DMPG MLs / DMPG-DSPE~PEG5000 MLs) D – na t=4 (

“

/

“

)

60

6. DISCUSSIE

Cytochroom c oxidase is een membraangebonden enzym dat dankzij de aanwezigheid van het cholaat detergent in de stockoplossing in oplossing blijft. De enzymatische kwaliteit van het enzym kan drastisch verhoogd worden door toevoeging van gesoniceerde asolectine vesikels (figuur 5.2). Hierbij ontdoet het enzym zich van de detergent moleculen en bouwt zich spontaan in in de fosfolipide-dubbellaag wat een meer natuurlijke omgeving is [De Cuyper en Joniau, 1980]. Een verdere, eerder lichte activiteitsstijging kon bekomen worden door sonicatie van het vesikel-CO mengsel onder welbepaalde condities van temperatuur en tijd. De wijze waarop het enzym zich heel precies in de lipidenmembraan inbouwt (uni- of bidirectioneel) werd in dit werk niet bestudeerd. Er werd verder vastgesteld dat de enzymatische activiteit drastisch bepaald wordt door de lading van de vesikelpopulatie.

Dit is duidelijk te begrijpen aangezien cyt c een

kationisch eiwit is [isoëlektrisch punt = 10 (Kim et al., 1980); aantal netto positieve ladingen bij neutrale pH = +9 (Muga et al., 1991)], waarvan verwacht mag worden dat het door negatief geladen oppervlakken aangetrokken wordt. Binnen deze context is het – op het eerste zicht althans – dan wel eigenaardig dat een grotere activiteit wordt bekomen met proteovesikels die slechts 20 mol % van het negatief geladen DMPG bevatten en niet met deze die uitsluitend uit DMPG zijn opgebouwd. Grosso modo verloopt een enzymatisch proces echter volgens volgende consecutieve stappen : (i) aantrekking van het substraat naar de actieve plaats op het enzymmolecule, (ii) omvorming van het substraat tot produkt en (iii) verwijdering van het gevormde produkt zodat een nieuw substraatmolecule kan binden. Met dit beeld voor ogen kan de hogere activiteit bekomen met 20 mol % DMPG ten opzichte van de 100 mol % DMPG verklaard worden door het feit dat een delicate balans bestaat tussen enerzijds, de snelheid van substraat aantrekking (die bevorderd wordt door een negatief geladen vesikeloppervlak) en anderzijds, de snelheid van productverwijdering (die afgeremd wordt door het anionisch oppervlak) [zie ook Cortese et al., 1995; Subramanian, 1998]. Uit de resultaten kan afgeleid worden dat voor het CO-cyt c systeem een grotere turnover wordt bekomen met matig negatief geladen vesikels.

61

Een andere opmerkelijke waarneming is dat de activiteit van het enzym sterk afhankelijk is van de enzymdensiteit per partikel : naarmate de enzymbelading van de vesikels toeneemt, daalt het rendement per CO molecule. Een verklaring hiervoor kan gezocht worden in het feit dat na adsorptie van cyt c aan het membraanoppervlak, al dan niet na een conformatieverandering [Bernad, 2004; Cortese et al., 1995; Pinheiro et al., 1997; Subramanian, 1998], een laterale diffusie van het substraat naar het enzym toe plaatsgrijpt zoals aangegeven in onderstaande figuur [Fulbright et al., 1993].

Figuur 6.1: Weergave van de 2 mogelijk te volgen wegen van het substraat cyt c om zich naar het enzym CO te begeven [Peitzsch & McLaughlin, 1993]

Bij lage CO-bezetting is het ‘rekruteringsgebied’ per CO groter, wat – conform onze waarnemingen – resulteert in grotere k1-waarden. Normaliter mag verwacht worden dat de migratie van de geadsorbeerde cyt c moleculen naar het enzym toe volgens een kwadratische functie verloopt. Pogingen om onze resultaten op deze wijze te fitten [k1 in functie van (CO/vesikel)2] gaven echter geen lineair verloop wat er op duidt dat het werkelijke substraat-enzym interactiemechanisme nog door andere factoren bepaald wordt [zie ook McCloskey et al., 1986; Peitzsch et al., 1993]. Het hierboven beschreven beeld met proteovesikels wordt kwalitatief ook teruggevonden met MLs. De activiteiten zijn lager dan deze bekomen met vesikels met dezelfde fosfolipidensamenstelling.

De

reden

hiervoor

is

vermoedelijk

de

ietwat

andere

inbeddingswijze van het enzym in de lipidenmatrix. CO is namelijk een enzym dat de membraan penetreert. Een dergelijke positionering is – net als in de mitochondriale membraan – perfect mogelijk in vesikels; bij MLs daarentegen is de interne caviteit volledig opgevuld met een Fe3O4 nanocolloïde zodat hier niet langer ruimte is om het 62

watergeëxposeerd, intramitochondriaal enzymgedeelte te huisvesten. Een gewijzigde vectoriële oriëntatie van het enzym in de membraan, zoals eerder gesuggereerd in vesikels die opgebouwd werden met verzadigde PCs [Singer et al., 1986] of in een alkylsiloxaan monolaag geadsorbeerd op een vaste drager [Edwards et al., 1997] ligt mogelijk aan de basis van de ietwat lagere activiteit. Het effect van inbouw van het enzym in zogenaamde Stealth-(magneto)liposomen werd eveneens bestudeerd. Zoals beschreven in de ‘Materialen en Methoden’ sectie verloopt de aanmaak van Stealth-MLs volgens twee stappen waarbij eerst ‘klassieke’ DMPG of DMPC MLs worden bereid en die vervolgens worden geïncubeerd met DMPC - of DMPG - DSPE~PEG5000 vesikels. Met behulp van gaschromatografie konden we op een ondubbelzinnige wijze aantonen dat, om thermodynamische redenen, enkel de fosfolipiden aanwezig in de buitenste laag van de donorvesikels participeren in het uitwisselingsproces. In vergelijking met de niet-gePEGyleerde vesikels valt op dat bij een CO/Stealthvesikel = 1 of CO/Stealth-ML = 1, de enzymatische activiteit nagenoeg gehalveerd is (Fig. 5.6). Bovendien zijn de k1-waarden veel minder afhankelijk van de bezettingsgraad van de Stealth-vesikels of Stealth-MLs met CO. Deze waarneming is perfect te verklaren door het feit dat het dichte netwerk van PEG5000-ketens aan het membraanoppervlak een laterale beweging van geadsorbeerde cyt c moleculen (diameter 3 nm; Wahlgren et al., 1993) aanzienlijk bemoeilijkt. Een bijkomende, eerder onverwachte waarneming is dat bij hogere CO-belading gePEGyleerde structuren (zowel vesikels als MLs) telkens een ietwat hogere activiteit wordt gevonden dan voor de niet gePEGyleerde structuren met hetzelfde gehalte aan anionische lipiden (Fig 5.6). Yoshida et al. (1999) geven echter aan dat geëxposeerde PEG ketens het negatieve ladingsveld van de membranen gedeeltelijk afschermen zodat de absolute waarde vermindert van de ζ-potentiaal (d.i. de potentiaal ter hoogte van de grens tussen mobiele en geïmmobiliseerde vloeistof rond een partikel). Aangezien de ladingsdensiteit op een subtiele wijze de cyt c(Fe2+) aantrekking en de cyt c(Fe3+) verwijdering ter hoogte van de membraan regelt, kan een verlaging van de oppervlakteladingsdensiteit bij de gePEGyleerde structuren het verschil in waargenomen enzymatische activiteit verklaren.

63

Afgaand op literatuurgegevens in verband met dimensies van de betrokken molecules, kan het enigszins verwonderlijk zijn dat nog enzymatische activiteit wordt waargenomen met Stealth (magneto)proteoliposomen (Appendix B). De PEG5000 ketens bevatten ongeveer 112 ethyleenoxide monomeer residu’s en vormen (in een zogenaamd overlappend ‘brush-regime’) een PEG calyx met een dikte van 7,5 à 9 nm [Kuhl et al., 1994]. Theoretisch althans is het hierdoor best mogelijk dat de substraatbindingsplaats op het enzym afgedekt wordt door de PEG ketens waardoor enzym-substraat interactie verhinderd wordt [zie ook bijvoorbeeld Harris et al., 2004]. In onze studie hebben we echter gebruik gemaakt van een sterk kationisch eiwit en sterk negatief geladen membraanstructuren zodat terwille van elektrostatische attractiekrachten redelijkerwijze mag verwacht worden dat cyt c-membraanbinding drastisch gefaciliteerd wordt. Bovendien is cyt c een relatief klein eiwit (zie hierboven) waardoor het waarschijnlijk nog vlot door de weinig gestructureerde PEG coating kan dringen om het extra-membranaire gedeelte van CO te bereiken, dat enkele nm boven het fosfolipide-oppervlak uitsteekt en dat de substraat-bindingsplaats bevat.3 In Figuur 6.2 wordt een schema gegeven van het CO-cyt c complex dat ingebed is in Stealth structuren. Het schema is gebaseerd op literatuurgegevens en is conform met onze waarnemingen.

Figuur 6.2: Het CO-cyt c complex, ingebed in een Stealth membraanstructuur

3

Door Malatesta et al. (1995) wordt aangegeven dat ca 70% van de eiwitmassa (11 nm lang) zich aan de cytoplasmatische kant van de membraan uitstrekt. Centraal in dit gedeelte zou zich de bindingsplaats voor cyt c bevinden. Op basis van een gedetailleerde X-stralen diffractiestudie op eiwitkristallen van CO besloten Tsukihara et al. (1995) dat de lengte van dit gedeelte slechts 3,7 nm bedraagt. Door Burgess et al. (1998) wordt voor dit gedeelte een diameter van ca 8 nm aangegeven.

64

Samenvattend kan gesteld worden dat we in dit eindwerk via spectrofotometrische weg het oxiderend vermogen hebben geanalyseerd van CO, geïncorporeerd in verschillende types van membranen, inclusief deze gebonden op een vaste ijzerkern. Indien we er in zouden

slagen

de

enzym-membraan

complexen

op

een

elektrodeoppervlak

te

immobiliseren moet het mogelijk zijn via detectie van het elektronentransport dat tijdens de reactie plaatsgrijpt, in real-time eiwitbinding te meten. Op die manier zou een biosensor kunnen ontworpen worden. Ofschoon we ons hier focusseerden op het cyt c-CO systeem zijn er ongetwijfeld mogelijkheden aanwezig om ook andere membraanenzymsubstraat interacties te volgen [Torchut et al., 1994].

65

Literatuurlijst

Allen, T.M. and Chonn A., Large unilamellar liposomes with low uptake by the reticuloendothelial system. FEBS Lett. 223, 1987, 42-46. Bernad, S., Oellerich, S., Soulimane, T., Noinville, S., Baron, M.H., Paternostre, M., Lecomte, S., Interaction of horse heart and Thermus thermophilus type c cytochromes

with phospholipid vesicles and hydrophobic surfaces. Biophysical Journal, Vol. 86, Juni 2004, 3863-3872. Bouckaert, J., Ontwikkeling van CT- en MRI- contraststoffen voor medische beeldvorming, Kortrijk, Hogeschool West-Vlaanderen, departement Provinciale Industriële Hogeschool, 2007, Eindwerk tot het behalen van de graad van industrieel ingenieur chemie, optie biochemie Bulte, J.W.M., De Cuyper, M., Despres, D., Frank, J.A., Short- vs. long-circulating

magnetoliposomes as bone marrow-seeking MR contrast agents. Journal of magnetic resonance imaging 9: 329-335, 1999. Burgess, J.D., Jones, V.W., Porter, M.D., Scanning force microscopy images of cytochrome c oxidase immobilized in an electrode-supported lipid bilayer membrane. Langmuir, Vol.14, No.23, 1998, 6628-6631. Casey, R.P., Ariano, B.H., Azzi, A., Studies on the transmembrane orientation of

cytochrome c oxidase in phospholipids vesicles. Eur. J. Biochem. 122, 313-318, 1982. Cortese, J.D., Voglino, A.L., Hackenbrock, C.R., Persistence of cytochrome c binding to

membranes at physiological mitochondrial intermembrane space ionic strength. Biochimica et biophysica Acta 1228 (1995) 216-228. De Cuyper, M., & Joniau, M., Behaviour of beef-heart cytochrome c oxidase in

reconstituted proteovesicles, a systematic evaluation of the influence of phospholipids polar headgroup and fatty-acyl side chains. Eur. J. Biochem. 104, 397-405 (1980).

X

De Cuyper, M., et al., Modelmembranen: van fundamentele studie tot medische

toepassing. Chemie Magazine, 1981; p. 397-405 De

Cuyper,

M.

and

Joniau,

M.,

Magnetoliposomes. Formation and structural

characterisation. Eur Bio phys J, 1988; 15 (5):311-319 De Cuyper, M., Applications of magnetoproteoliposomes in bioreactors operating in high-

gradient magnetic fields. In: Barenholz Y., Lasic D.D., editors. Handbook of Nonmedical applications of liposomes. 3rd edition Boca Raton: CRP press; 1996. p. 325-342 De Smet, J., Inleiding tot de biochemie, cursus gedoceerd in kader van het vak ‘Inleiding tot de biochemie’, Hogeschool West-Vlaanderen, departement Provinciale Industriële Hogeschool, Kortrijk, Cursoa, academiejaar 2005-2006 Declercq, C., Studie van de activiteit van membraanenzymen geïmmobiliseerd op

magnetoliposomen, Oostende, Katholieke Industriële Hogeschool West-Vlaanderen, 1988, Eindwerk tot het behalen van de graad van industrieel ingenieur chemie, optie biochemie Defour, L., Production of cationic magnetoliposomes and their uptake by 3T3 fibroblasts, Kortrijk, Hogeschool West-Vlaanderen, departement Provinciale Industriële Hogeschool, 2006, Eindwerk tot het behalen van de graad van industrieel ingenieur chemie, optie biochemie Edwards, A.M., Chupa, J.A., Strongin, R.M., Smith, A.B., Blasie, J.K., Vectorially-oriented

monolayers of cytochrome oxidase: fabrication and profile structures. Langmuir, Vol.13, No.6, 1997. Fulbright, R.M., & Axelrod, D., Dynamics of non-specific adsorption of insulin to

erythrocyte membranes. Journal of Fluorescence, Vol.3, No.1, 1993. Harris, T.J., von Maltzahn, G., Derfus, A.M., Ruoslahti, E., Bhatia, S.N., Proteolytic

actuation of nanopartible self-assembly. Angewandte chemie Int. Ed. 2006; 45; 31613165.

XI

Holvoet, K., Optimalisatie van magnetolipsoom-opname in 3T3 fibroblasten, Kortrijk, Hogeschool West-Vlaanderen, departement Provinciale Industriële Hogeschool, 2007, Eindwerk tot het behalen van de graad van industrieel ingenieur chemie, optie biochemie Huang,

L.,

Incorporation

of

acylated

antibody

into

planar

lipid

multilayers:

characterization and cell binding. Biochemistry, Vol. 24, No. 1, 1985. Kamps, J.A.A.M. and Scherphof, G.L., Liposomes in biological systems. In: Torchilin VP, Weissig V, editors. Liposomes. 2nd ed. New York: Oxford University press; 2003. p. 269 Khalafalla, S.E. and Reimers, G.W, Preparation of dilution-stable aqueous magnetic fluids. IEEE Trans Magn 1980; 16 (2):178-183 Kim, H.K., Kim, K. and Byun, Y., Preparation of a chemically anchored phospholipids

monolayer on a acrylated polymer substrate. Biomaterials 2005; 26 (17):3435-3444 Kuhl, T.L., Leckband, D.E., Lasic, D.D., Israelachvili, J.N., Modulation of interaction forces

between bilayers exposing short-chained ethylene oxide headgroups. Biophysical journal, Vol.66, May 1994, 1479-1488. Lacava, Z.G.M., Garcia, V.A.P., Lacava, L.M., Azevedo, R.B., Silva, O., Pelegrini, F., De Cuyper, M. and Morais, P.C., Biodistribution and biocompatibility investigation in

magnetoliposome treated mice. Spectroscopy 2004; 18:597-603 Lynch, I., & Dawson, K.A., Protein-nanoparticle interactions. Nano-today, Vol.3, Number 1-2, 2008. Malatesta, F., Antonini, G., Sarti, P., Brunori, M., Structure and function of a molecular

machine : cytochrome c oxidase. Biophysical chemistry 54 (1995) 1-33. McCloskey, M.A., & Poo, M.M., Rates of membrane-associated reactions: reduction of

dimensionality revisited. The Journal Of Cell Biology, Vol. 102, 1986. Muga, A., Mantsch, H.H., Surewicz, W.K., Membrane binding induces destabilization of

cytochrome c structure. Biochemistry, Vol.30, No.29, 1991.

XII

Rosensweig, R.E., Magnetic fluids. International Science and Technology, 1966; p. 48-55 Peitzsch, R.M., & McLaughlin, S., Binding of acylated peptides and fatty acids to

phospholipids vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry, Vol.32, No. 39, 1993. Pinheiro, T.J.T., Elöve, G.A., Watts, A., Roder, H., Structural and kinetic description of

cytochrome c unfolding induced by the interaction with lipid vesicles. Biochemistry, Vol.36, No.42, 1997, 13122-13132. Romberg, B., Hennink, W.E., Storm, G., Sheddable coatings for long-circulating

nanoparticles. Pharmaceutical Research, 2007. DOI: 10.1007/S11095-007-9348-7. Soenen, S., Ontwikkeling van een dubbel label MRI contraststof op basis van gadolinium-

gecoate

magnetoliposomen,

Kortrijk,

Hogeschool

West-Vlaanderen,

departement

Provinciale Industriële Hogeschool, 2005, Eindwerk tot het behalen van de graad van industrieel ingenieur chemie, optie biochemie Soenen, S.J.H., Cocquyt, J., Defour, L., Saveyn, P., Van der Meeren, P., De Cuyper, M.,

Design and development of magnetoliposome-based theranostics. Materials and manufacturing process 23(6), 2008 (In Press). Subramanian, M., Jutila, A., Kinnunen, P.K.J., Binding and dissociation of cytochrome c to and from membranes containing acidic phospholipids. Biochemistry, Vol.37, No.5, 1998, 1394-1402. Torchilin, V.P., Recent approaches to intracellular delivery of drugs and DNA and

organelle targeting. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2006. 8:343-75. Torchut, E., Bourdillon, C., Laval, J.M., Reconstitution of functional electron transfer between membrane biological elements in a two-dimensional lipidic structure at the electrode interface. Biosensors and bioelectronics 9 (1994) 719-723.

XIII

Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono, R., Yoshikawa, S., Structures of metal sites of oxidized bovine

heart cytochrome c oxidase at 2.8Å. Science, Vol. 269, 1017-1188, 1995. Van den Bos, E.J., Wagner, A., Mahrholdt, H., Thompson, R.B., Morimoto, Y., Sutton, B.S., Judd, R.M. and Taylor, D.A., Improved efficacy of stem cell labelling for magnetic

resonance imaging studies by the use of cationic liposomes. Cell Transplant 2003; 12:743756 VOET, D. and VOET, J.G., In: Biochemistry, second edition, John Wiley and Sons, New York, USA, 1995, ISBN 0-471-58651-X Wahlgren, M.C., Paulsson, M.A., Arnebrant, T., Adsorption of globular model proteins to

silica and methylated silica surfaces and their elutability by dodecyltrimethylammonium bromide. Colloids surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 70 (1993) 139-149. Yoshida, A., Hashizaki, K., Yamauchi, H., Sakai, H., Yokoyama, S., Abe, M, Effect of lipid with covalently attached poly(ethylene glycol) on the surface properties of liposomal bilayer membranes. Langmuir, Vol. 15, No. 7, 1999.

XIV

ELEKTRONISCHE BRONNEN Algemene structuur van een fosfolipide, beschikbaar op het world wide web: http://www.mediterroma.com/EMULSIOLIPOLISI%20ULTRASONICA.htm

Algemene structuur van een liposoom (met PEG-ketens), beschikbaar op het world wide web: http://www.nowhow.nl/nederlands/Portfolio/liposoom.htm

Cytochrome c oxidase, from Wikipedia, the free encyclopedia, beschikbaar op het world wide web: http://en.wikipedia.org/wiki/Cytochrome_c_oxidase

Oxidatieve fosforylering, from wikipedia, the free encyclopedia, beschikbaar op het world wide web: http://nl.wikipedia.org/wiki/oxidatieve_fosforylering

Schematische voorstelling van de gaschromatograaf, beschikbaar op het world wide web: Bron: http://web.markenhage.nl/vakken/edu_scheikunde/scheikunde%20bovenbouw

Vlamionisatiedetector bij gaschromatografie, beschikbaar op het world wide web: http://www.chem.unl.edu/uic/gc-fid.html

XV