PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Purifikasi Parsial dan Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI (Proyek PKPP 2012). Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juni 2013 Lusiana Kresnawati Hartono NIM G84090017
ABSTRAK LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Purifikasi Parsial dan Karakterisasi βGalaktosidase dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TATIK KHUSNIATI. Intoleransi laktosa merupakan salah satu kasus yang sering terjadi pada bayi, orang dewasa, maupun manula. Hal tersebut terjadi karena keterbatasan βgalaktosidase pada saluran pencernaan. Salah satu solusinya adalah konsumsi βgalaktosidase dari sumber lain. Isolat BAL strain B134 merupakan salah satu sumber yang menghasilkan β-galaktosidase. Produksi β-galaktosidase tertinggi tercapai saat inokulum 2% ditumbuhkan dalam media MRS yang mengandung 2% laktosa, pH media 5, dan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37ºC. Purifikasi parsial β-galaktosidase menghasilkan kemurnian 3.131 kali, rendemen 3.206%, dan aktivitas spesifik sebesar 45.828 U/mg. Aktivitas tertinggi β-galaktosidase tercapai pada pH 6 dan suhu 45ºC. Aktivitas β-galaktosidase stabil pada pH 4.5 dan suhu 30ºC. Kation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ pada konsentrasi 0.1 M bersifat aktivator terhadap aktivitas β-galatosidase sedangkan Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ pada konsentrasi 0.1 M menghambat aktivitas β-galaktosidase. Nilai Km dan Vmaks dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit. Kata kunci: Purifikasi parsial, β-galaktosidase, Bakteri Asam Laktat (BAL).
ABSTRACT LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Partial Purification and Characterization β-Galaktosidase from Lactic Acid Bacteria (LAB) Strain B134 Isolate. Supervised by I MADE ARTIKA and TATIK KHUSNIATI. Lactose intolerance is often occurs in baby, adult, and eldery. It could happen because of the absence of β-galactosidase in gastrointestinal tract. One of solution is β-galactosidase intake from other sources. LAB strain B134 Isolate is a source of β-galactosidase. The aim of the present study was to partial purification and characterization of β-galactosidase from LAB strain B134 isolate. Maximum production of β-galactosidase was obtained when 2% inoculums in MRS that contain 2% lactose, pH: 5, and incubation for 24 hours in 37ºC. Partial purification of β-galactosidase used dialysis. The purification factor, yield, and specific activity of β-galactosidase were found to be 3.313 times, 3.026%, and 45.828 U/mg respective. β-galaktosidase showed higest activity was at pH 6 and temperature 45ºC. Activity of β-galactosidase was stable at pH 4.5 and 30ºC. Cation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ in 0.1 M increased β-galactosidase activity. Meanwhile, Ca2+, Cu2+, and Hg2+ in 0,1 M inhibited β-galactosidase activity. Km and Vmaks of β-galactosidase were 3.934 mM and 3.278 µmol/min. Keywords: Partial purification, β-galaktosidase, Lactic Acid Bacteria (LAB)
PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Purifikasi Parsial Dan Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134 Nama : Lusiana Kresnawati Hartono NIM : G84090017
Disetujui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Pembimbing I
Dr Ir Tatik Khusniati, M.App.Sc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul Purifikasi Parsial dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134 dilakukan sejak Oktober 2012 hingga Januari 2013 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Neneng Karimayati, A.Md AL, Abdul Choliq, S.Pd, Febri, dan staf Laboratorium Biokimia Mikroba LIPI Biologi yang telah membantu selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada papa, mama, Bima, sahabat, dan teman-teman Biokimia 46 atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2013 Lusiana Kresnawati Hartono
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Percobaan
2
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pembahasan SIMPULAN DAN SARAN
6 6 11 13
Simpulan
13
Saran
14
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR GAMBAR Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134 6 2 Pengaruh pH media terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134 7 3 Pengaruh konsentrasi laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134 7 4 Kurva pertumbuhan isolat BAL strain B134 7 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase 8 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase 9 7 Pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase 9 8 Pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase 10 9 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase 10 11 10 Kurva Michaelis-Menten 11 Kurva Line-Weaverburk 11
1
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8
Kurva standar ONP Kurva standar protein Penentuan inokulum dan keadaan media MRS optimum Penentuan waktu produksi optimum Optimasi suhu dan pH β-galaktosidase Stabilitas suhu dan pH β-galaktosidase Pengaruh logam terhadap aktivitas β-galaktosidase Kinetika kimia β-galaktosidase purifikasi parsial
16 16 17 17 17 18 19 19
PENDAHULUAN Kejadian intoleransi laktosa dijumpai pada bayi, orang dewasa, maupun manula. Intoleransi laktosa sering terjadi pada orang Asia, Afrika, Timur Tengah, beberapa negara Mediterania dan juga pada ras Aborigin Australia. Ras Kaukasia lebih sedikit mengalami kasus intoleransi laktosa, hanya sekitar 5% yang mengalaminya. Konsumsi laktosa penduduk dunia secara georafis yaitu Eropa Utara >90%, Eropa Selatan dan Asia Tengah 50%, Afrika 5-20%, dan Asia Tenggara 1% (Ranchiaro dan Tishkoff 2010). Penelitian pada anak usia 3-5 tahun di Jakarta menunjukkan 23% responden defisiensi β-galaktosidase (Hegar et al 1995). Penelitian lain pada anak usia 6-12 tahun 1998 di Jakarta menunjukkan sekitar 50% responden mengalami intoleransi laktosa. Kecenderungan intoleransi laktosa akan meningkat seiring pertambahan usia. Hal ini terjadi karena produksi β-galaktosidase menurun seiring pertambahan usia (Tehuteru 1999). Menurut Hegar et al. (1995), insiden terkait intoleransi laktosa di Indonesia mencapai 70%. Intoleransi laktosa merupakan kondisi saat laktosa tidak dihidrolisis oleh enzim tetapi diproses oleh bakteri melalui tahap fermentasi. Fermentasi tersebut belangsung dalam usus yang menghasilkan gas yang menyebabkan rasa sakit. Laktosa yang tidak dapat dicerna melalui fermentasi akan menghambat penyerapan air dari feses yang menyebabkan diare (BPOM 2008). Enzim yang berperan penting dalam pencernaan laktosa dalam usus halus adalah βgalaktosidase. β-galaktosidase merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-galaktosida pada ujung nonreduksi β-D-galaktosa (Gary dan Kindell 2005). Hidrolisis laktosa secara enzimatik dengan β-galaktosidase memiliki nilai energi tinggi. Solusi bagi penderita intoleransi laktosa adalah mengkonsumsi suplemen β-galaktosidase. Menurut Fox dan McSweeney (1981), konsumsi suplemen β-galaktosidase efektif untuk mengurangi gangguan penyerapan laktosa. Namun, harga suplemen ini mahal. Solusi lainnya adalah mencari sumber β-galaktosidase yang murah. Enzim ini terdapat pada hewan, tumbuhan, fungi, dan mikroorganisme. Pada bakteri dan khamir, β-galaktosidase bersifat intraseluler sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler (Mahoney 2004). Bakteri asam laktat (BAL) menghasilkan βgalaktosidase yang mampu menurunkan kadar laktosa dalam susu. Lactobacillus bulgaricus merupakan salah satu contoh BAL. Lactobacillus bulgaricus mampu mengurai 50-60% laktosa secara intraseluler (Wierzbicki dan Kosikowski 1973, Sumathy et al. 2012). Kemampuan β-galaktosidase dalam mencerna laktosa akan meningkat apabila dilakukan pemurnian. Pemurnian enzim merupakan tahapan pemisahan enzim target dengan protein lain. Pemurnian enzim meliputi pengendapan oleh garam atau pelarut organik, dialisis, dan kromatografi. Aktivitas spesifik βgalaktosidase yang tinggi menggambarkan kemampuan enzim yang tinggi dalam menghidrolisis laktosa. β-galaktosidase dari Lactobacillus bulgaricus meningkat aktivitas spesifiknya menjadi 62.80 U/mg setelah dilakukan pemurnian. Kemurniannya meningkat 1.47 kali (Mozumder et al 2012). Sayangnya, pemurnian enzim membutuhkan biaya yang tidak sedikit dan menghasilkan
2 volume enzim yang sangat sedikit. Pemurnian parsial dapat dilakukan untuk mengatasi masalah tersebut. Tahapan pemurnian parsial akan menghilangkan satu atau beberapa langkah pemurnian enzim. Hal ini dapat dilakukan apabila aktivitas awal enzim tinggi. Beberapa spesies lokal BAL yang diisolasi dari makanan tradisional asal Bogor, koleksi Puslit Biologi LIPI, memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi berdasarkan uji aktivitas awal. Salah satu strain yang memiliki aktivitas βgalaktosidase yang tinggi adalah B134. Penelitian tersebut mendasari karakterisasi β-galaktosidsase pada isolat bakteri asam laktat strain B134. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan permurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Oktober 2012 hingga Februari 2013 yang dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Mikroba Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) di Cibinong, Bogor. Bahan Bahan yang digunakan adalah biakan isolat BAL strain B134 yang merupakan koleksi biakan bakteri bidang Mikrobiologi LIPI, bahan media MRS modifikasi, akuades, buffer fosfat 0.05 M pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 6.5 dan pH 7, buffer fosfat 0.01 M pH 7, amonium sulfat, β-galaktosidase, o-nitrofenil-βD-galaktopiranosida (oNPGal), Na2CO3 1M, o-nitrofenol (oNP), reagen Bradford, NaCl 0.15 N, bovine serum albumin (BSA), reagen Bradford. Alat Alat yang digunakan adalah mikropipet, laminar air flow cabinet, autoklaf Hirayama, neraca analitik, spektrofotometer UV-VIS 1700 Shimadzu, kuvet, microwave, vorteks, cool room, penangas air Eyela, inkubator Isuzu, magnetic strirer, sentrifus, sonikator Eyela, tabung dialisis Cabinet, pH meter HM-25G TOADKK, dan stopwatch. Prosedur Percobaan Penyiapan media tumbuh isolat BAL strain B134 Bahan-bahan untuk membuat media MRS modifikasi dan 2 g CaCO3 dilarutkan dalam 200 mL akuades. Nilai pHnya diatur hingga 7.0. Selanjutnya, media dipanaskan dalam microwave sampai mendidih lalu ditambahkan 0.2 mL tween 80. Media agar MRS modifikasi di autoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Setelah itu, media dituang ke cawan petri.
3 Peremajaan isolat BAL strain B134 Sebanyak 1 ose isolat BAL strain B134 dipindahkan ke cawan petri berisi MRS modifikasi dengan metode cawan gores. Kemudian, cawan petri diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian, 1 ose bakteri diambil dan diremajakan kembali dalam agar miring selama 24 jam untuk dijadikan stok. Stok pada media agar miring ini menjadi biakan yang akan digunakan untuk total bakteri dan produksi awal β-galaktosidase. Total Bakteri per mL Sel Sebanyak 0.1 mL bakteri dimasukkan dalam tabung berisi 0.9 mL media MRS modifikasi cair (merupakan pengenceran 10-4). Pengenceran dilakukan secara berseri hingga 10-7. Masing-masing pengenceran diambil 100 µL dan disebar menggunakan batang kaca penyebar pada media agar MRS modifikasi dalam cawan petri. Setelah itu, cawan petri diinkubasi pada 37ºC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada masing-masing pengenceran dihitung. Produksi Awal Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari stok agar miring dipindahkan ke dalam 200 mL MRS modifikasi cair. Kemudian, media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit. Pelet yang diperoleh dicuci sebanyak 2 kali dengan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 (1 g/5 mL). Pelet hasil pencucian buffer yang kedua ditambahkan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 dan glass bead. Suspensi sel divorteks selama 5 menit. Suspensi sel disentrifus kembali pada kecepatan 9.500 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase kasar. Volume enzim yang diperoleh diukur kemudian uji aktivitas dan uji kadar protein dilakukan untuk mengetahui aktivitas spesifik awal. Optimasi Pertumbuhan Penentuan Konsentrasi Inokulum. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan pH 7. Variasi inokulum bakteri yang digunakan adalah 1%, 2%, dan 5%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan inokulum optimum Isolat BAL strain B134. Penentuan pH Media. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan inokulum hasil optimasi. Variasi pH media yang digunakan adalah 5, 6, 7, dan 8. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan pH media optimum isolat BAL strain B134. Penentuan pengaruh kadar laktosa. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan inokulum dan media hasil optimasi. Variasi kadar laktosa yang digunakan adalah 1%, 2%, dan 3%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas βgalaktosidase dan kadar protein menunjukkan kadar laktosa optimum isolat BAL strain B134. Penentuan waktu pertumbuhan. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan inokulum bakteri, pH media, dan kadar laktosa hasil optimasi. Variasi waktu inkubasi yang digunakan adalah 0, 6, 12, 18,
4 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, dan 72 jam. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan waktu inkubasi optimum isolat BAL strain B134. Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997) Inokulum isolat BAL strain B134 diambil sebanyak inokulum hasil optimasi dengan kerapatan optik 0.7 yang diinokulasikan dalam 2.400 mL media MRS modifikasi cair steril dan diinkubasi pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi selama waktu pertumbuhan optimum, sel dipanen. Media berisi bakteri yang telah dipanen kemudian disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 9500 rpm pada suhu 4ºC. Pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5 sebanyak dua kali. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5. Kemudian, pemecahan sel dilakukan dengan sonikator pada 50 kHz selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar β-galaktosidase. Pengendapan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1987) Sebanyak 10 mL β-galaktosidase kasar diendapkan dalam amonium sulfat. Penambahan amonium sulfat dilakukan secara bertahap. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan yaitu 0-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, dan 60-70%. Larutan kemudian diaduk dengan magnetic stirrer secara perlahan selama 20 menit kemudian diinkubasi dalam cool room selama 1 jam. Setelah 1 jam, larutan disentrifus dengan kecepatan 9.500 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam 1 mL buffer PO4 0.05 M pH 6.5. Kejenuhan amonium sulfat yang optimum akan ditunjukkan oleh aktivitas spesifik yang tinggi. Jumlah amonium sulfat (gram/liter) =
(
)
Keterangan: S1 : Konsentrasi awal amonium sulfat S2 : Konsentrasi akhir amonium sulfat NB: Nilai 533 menunjukkan bahwa dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per liter untuk membuat larutan jenuh 100%. Pemurnian dengan Dialisis Tabung dialisis diisi 2 mL β-galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat. Tabung kemudian direndam dalam 2 liter buffer PO4 0.01 M pH 6.5 yang diletakkan diatas stirer dan disimpan dalam cool room bersuhu 4ºC selama 15 jam. Uji Aktivitas β-Galaktosidase (modifikasi Liu et al. 2009) Pengukuran Sampel. Uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-D-galaktosida (oNPGal) 2 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada menit ke-5 ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis dengan mengukur absorban pada λ=420 nm. Pengukuran Kurva Standar. Berbagai konsentrasi oNP dari 0-2.5 mM yang dilarutkan dalam buffer PO4 0.01 M pH 7. Sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1 M
5 pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 200 µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Selanjutnya campuran ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M. Larutan di vortex dan intensitas warna kuning yang terbentuk diukur absorbansinya pada λ=420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari substrat oNPGal per menit pada kondisi percobaan. Karakterisasi β-Galaktosidase Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Optimasi pH dilakukan dengan menggunakan buffer asetat, fosfat dan tris-HCl pada variasi pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0. Pengujian aktivitas dilakukan pada suhu 37ºC selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase menunjukkan pH optimum β-galaktosidase. Stabilitas βgalaktosidase terhadap pH diuji dengan menginkubasikan β-galaktosidase pada larutan buffer pada berbagai pH (5-8 dengan selang 0.5) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, larutan β-galaktosidase dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada pH optimum. Nilai aktivitas β-galaktosidase tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (β-galaktosidase tanpa perlakuan). Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Uji aktivitas β-galaktosidase dengan variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, 50, dan 55 ºC dilakukan untuk penentuan suhu optimum. Pengujian aktivitas dilakukan berdasarkan pH optimum selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase menunjukkan suhu optimum β-galaktosidase. Stabilitas β-galaktosidase terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan β-galaktosidase pada berbagai suhu (25-55oC dengan selang 5oC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, β-galaktosidase dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada pH dan suhu optimum. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Pengaruh kation terhadap aktivitas β-galaktosidase. Logam yang digunakan untuk pengujian pengaruh kation adalah Hg+, Cu2+, Ca2+, Co2+, Mg2+, Mn2+, dan Zn2+ dengan konsentrasi 0.1 M. Sebanyak 100 µL kation dengan konsentrasi 0.1 M ditambahkan dalam campuran substrat-buffer-enzim, dan diinkubasikan pada kondisi optimal reaksi enzimatis β-galaktosidase. Penghambatan atau peningkatan aktivitas β-galaktosidase oleh kation dinyatakan dalam persentase aktivitas β-galaktosidase dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa penambahan kation logam). Penentuan Kinetika Enzim. Analisis KM dan Vmaks dilakukan pada enzim kasar dan enzim hasil dialisis. Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 pada pH optimum, 100 µl enzim, dan 200 µl substrat oNPGal yang diujikan pada konsentrasi 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, dan 5 mg/ml diinkubasi selama 5-30 menit. Setiap 5 menit, sebanyak 1000 µl Na2CO3 1 M ditambahkan agar reaksi berhenti kemudian larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada λ=420 nm. Grafik dibuat dengan memplotkan hubungan antara waktu (sumbu X) dan
6 kadar oNP yang terbentuk (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk menentukan nilai KM dan Vmaks. Grafik Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan produk persatuan waktu. Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976) Pengukuran Kurva Standar. Standar protein yang digunakan adalah bovine serum albumin (BSA) pada berbagai konsentrasi dari 0.005-1.00 mg/mL menggunakan pelarut NaCl 0.15 M. Sebanyak 20 µl BSA ditambahkan dalam 1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm. Pengukuran Sampel. Sebanyak 20 µl β-galaktosidase ditambahkan dalam 1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm. Pembuatan Blanko. Sebanyak 40 µl NaCl 0.15 M ditambahkan dalam 1 mL lautan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil
Aktivitas spesifik βgalaktosidase (U/mg)
Keadaan Optimum Pertumbuhan Isolat BAL strain B134 Inokulum isolat BAL strain B134 yang ditumbuhkan dalam MRS modifikasi paling optimum adalah 2% dengan aktivitas spesifik β-galaktosidase sebesar 8.265 U/mg (Gambar 1). Keadaan pH MRS modifikasi juga mempengaruhi aktivitas spesifik dari β-galaktosidase. Nilai pH 5 memiliki aktivitas spesifik sebesar 75.074 U/mg (Gambar 2). Konsentrasi laktosa 2% dalam MRS modifikasi menghasilkan aktivitas spesifik β-galaktosidase tertinggi sebesar 20.468 U/mg (Gambar 3). 1.976 ± 0.044
2.5 2.0
1.556 ± 0.041
1.5 1.0
0.540 ± 0.014
0.5 0.0 1%
2%
5%
[Inokulum B134] (%)
Gambar 1 Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134
Aktivitas spesifik βgalaktosidase (U/mg)
7 80 70 60 50 40 30 20 10 0
70.644 ± 3.036
58.466 ± 11.914
43.040 ± 9.555
5
29.636 ± 8.278
6
7
8
pH media
Gambar 2 Pengaruh pH media terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134 20.631 ± 2.785
Aktivitas spesifik β-galaktosidase (U/mg)
25 20 15 10 5
2.533 ± 0.993
2.687 ± 0.212
0 1%
2% [Laktosa]
3%
Gambar 3 Pengaruh laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134
2.5 2.25 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0
6
12
18
24
30
36
42
Jam ke-
Gambar 4 Kurva pertumbuhan isolat BAL strain B134 Keterangan
: Jumlah sel
: Aktivitas β-galaktosidase (U)
Aktivitas β-galaktosidase (U)
Jumlah Sel (104)
Waktu Inkubasi Optimum Produksi β-Galaktosidase Aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan hingga jam ke 24. Aktivitas tertinggi sebesar 17.333 U/mL diperoleh pada jam ke 24 dengan OD sebesar 1.989 yang setara dengan 7.615 10-8 sel.
8 Purifikasi Parsial β-Galaktosidase dari Isolat BAL Strain B134 Enzim kasar memiliki aktivitas spesifik sebesar 14.638 U/mg dengan rendemen sebesar 100%. Pengendapan amonium sulfat dioptimasi secara bertingkat sehingga diperoleh fraksi dengan aktivitas tertinggi adalah fraksi 4050% dengan aktivitas spesifik sebesar 18.656 U/mg. β-galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat 50% jenuh memiliki aktivitas spesifik sebesar 28.170 U/mg dengan rendemen sebesar 19.576%. Kemurnian β-galaktosidase setelah pengendapan dengan amonium sulfat 50% jenuh sebesar 1.924 kali. βgalaktosidase setelah perlakuan dialisis memiliki aktivitas spesifik sebesar 45.828 U/mg dengan rendemen sebesar 3.206%. Kemurnian setelah dialisis adalah 3.131 kali. Tabel 1 Aktivitas β-galaktosidase pada tahapan purifikasi parsial Tahapan Enzim Kasar1 Pengendapan amonium sulfat 50% jenuh Dialisis 1
Volume enzim (mL) 40
Total aktivitas (U) 1530.543
Total protein (mg) 104.562
Aktivitas spesifik (U/mg) 14.638
Rendemen (%)
Kemurnian (kali)
100
1.000
3.26
299.617
10.636
28.170
19.576
1.924
1.32
49.075
1.071
45.828
3.206
3.131
Berasal dari 8 gram bobot basah pelet Isolat BAL strain B134
Karakterisasi β-Galaktosidase Pengaruh Suhu Gambar 5 menunjukkan bahwa aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu 25ºC hingga 45ºC, aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan tetapi aktivitas menurun pada suhu 50-55ºC. Aktivitas β-galaktosidase (U/mL)
30 21.403 ± 0.27
25
15.899 ± 16.907 ± 0.27 0.38
20 15
25.667 ± 23.729 ± 0.27 1.04 20.977 ± 0.11
9.465 ± 0.27
10 5 0 25
30
35
40
45
50
55
Suhu (ºC)
Gambar 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase Pengaruh pH Aktivitas β-galaktosidase meningkat pada pH 4.5 hingga 6 lalu mengalami penurunan pada pH 6.5 hingga 8.5 (Gambar 6). Aktivitas tertingginya berada pada pH 6 dengan nilai aktivitas sebesar 19.814 U/mL.
9
Aktivitas β-galaktosidase (U/mL)
25 18.961 ± 0.55
20
19.814 ± 0.66 18.496 ± 0.55 17.853 ± 0.27 12.140 ± 0.10
15
10
5.550 ± 1.32
6.093 ± 0.11
1.829 ± 0.12
5 0.400 ± 0.004 0 4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
pH
Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase Stabilitas β-Galaktosidase Kestabilan β-galaktosidase terhadap suhu ditunjukkan pada Gambar 7. Setelah inkubasi 1 jam, aktivitas β-galaktosidase tersisa pada suhu 30ºC sebesar 49.70%. Kestabilan β-galaktosidase terhadap pH ditunjukkan pada gambar 8. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa setelah 1 jam inkubasi berkisar antara 50.98%. Kestabilan aktivitasnya berada pada pH 4.5.
Aktivitas β-galaktosidase tersisa (%)
60
47.90 ± 0.43
50
44.88 ± 4.70 37.03 ± 2.14
40 26.46 ± 0.00
30 20
12.87 ± 3.84
8.94 ± 0.00
10
-0.72 ± 0.00
0 25 -10
30
35
40
45
50
55
Suhu (˚C)
Gambar 7 Pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase
Aktivitas β-galaktosidase tersisa (%)
10 60 50.98 ± 42.49 ± 0.28 37.79 ± 39.75 ± 0.55 42.88 ± 50 36.23 ± 2.77 35.05 ± 1.11 1.11 33.49 ± 32.71 ± 2.77 3.32 5.53 40 2.21 30 20 10 0 4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
pH
Gambar 8 Pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase Pengaruh Logam Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase ditunjukkan pada Gambar 9. Penambahan kation Co2+, Zn2+, Mn2+, dan Mg2+ meningkatkan aktivitas β-galaktosidase sedangkan kation Ca2+,Cu2+, dan Hg2+ menghambat aktivitas β-galaktosidase. 156.30 ± 1.27
Aktivitas β-galaktosidase relatif (%)
180 160 140 120
100.00 ± 0.00
100
118.40 ± 120.19 ± 1.79 0.35
114.14 ± 2.89
85.44 ± 0.42
80 60 40
1.65 ± 0.06
3.09 ± 0.12
20 0 Kontrol
Ca2+
Co2+
Zn2+
Cu2+
Mn2+
Hg2+
Mg2+
Kation
Gambar 9 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase
Parameter Kinetik Kurva Michaelis-Menten menunjukkan hubungan antara konsentrasi oNPGal dengan kecepatan β-galaktosidase hasil purifikasi parsial (Gambar 8). Nilai Km dan Vmaks ditentukan dari kurva Line-Weaverburk (Gambar 9). Persamaan Line-Weaverburk yang diperoleh adalah y=1.200x+0.305 dengan nilai r2 sebesar 0.963. Dari persamaan tersebut, nilai Km diketahui sebesar 3.934 mM dengan Vmaks sebesar 3.278 µmol/menit.
11 4
V (µmol/menit)
3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
5
10
[Substrat] (mM)
Gambar 8 Kurva Michaelis Menten 4.5 y = 1.2007x + 0.3058 R² = 0.9637
4 3.5
1/V
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1/S
Gambar 9 Kurva Lineweaver-burk Pembahasan Keadaan Optimum Pertumbuhan Isolat BAL Strain B134 Konsentrasi inokulum mempengaruhi aktivitas spesifik β-galaktosidase. Semakin tinggi konsentrasi inokulum yang digunakan akan melipatgandakan jumlah bakteri sehingga meningkatkan hidrolisis laktosa. Namun, konsentrasi inokulum yang terlalu tinggi akan menyebabkan bakteri berkompetisi untuk memperoleh nutrisi yang terkandung dalam media. Akibatnya aktivitas βgalaktosidase mengalami penurunan. Nilai pH media dan konsentrasi laktosa juga berpengaruh terhadap aktivitas β-galaktosidase (Hsu et al 2007). Bakteri Asam Laktat (BAL) strain B134 ditumbuhkan dalam media MRS modifikasi (de Man Rogrosa Sharpe) (de Man et al 1960). Glukosa pada MRS digantikan oleh laktosa. Laktosa merupakan sumber karbon terbaik untuk menginduksi produksi β-galaktosidase. Rendahnya laktosa dalam media kultur menurunkan aktivitas β-galaktosidase (Hsu et al 2005).
12 Waktu inkubasi B134 terbaik ditentukan berdasarkan aktivitas tertinggi βgalaktosidase. Saat fase eksponensial, sel akan melakukan penggandaan minimal dua kali lipat dari jumlah sel sebelumnya. Kebutuhan nutrisi meningkat selama fase ini. Laju hidrolisis laktosa pun mengalami peningkatan. Pada akhir fase eksponensial, pertumbuhan bakteri mulai melambat akibat ketersediaan nutrisi yang menurun (Yuwono 2006). Gambar 4 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase tertinggi tercapai saat fase eksponensial. Produksi dan Purifikasi Parsial β-Galaktosidase Isolat BAL strain B134 ditumbuhkan dalam MRS modifikasi yang telah dioptimasi. B134 diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Pemanenan sel dilakukan menggunakan sentrifus pada kecepatan 9500 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase. β-galaktosidase selanjutnya dimurnikan dengan amonium sulfat. Pemisahan protein saat pengendapan dengan amonium sulfat berdasarkan sifat ioniknya selain itu enzim juga akan mengalami pemekatan (Yuanita et al. 2010). Tahap akhir dari purifikasi parsial adalah dialisis. Tabung dialisis memiliki membran semipermeabel yang memungkinkan senyawa berukuran lebih kecil dari 10 kDA (kilo Dalton) dapat keluar dari membran, sedangkan β-galaktosidase yang berukuran 432 kDA akan tertahan dalam tabung. Senyawa yang keluar dari tabung dialisis seperti ion logam, inhibitor, peptida kecil. Enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari berbagai tahapan purifikasi parsial diuji aktivitasnya dan diukur pada λ= 420 nm. Prinsip pengujiannya adalah reaksi antara β-galaktosidase dengan substrat oNPG (o-nitofenil-β-D-galaktosida) akan memutus ikatan 1,4-β-D galaktosa yang akan menghasilkan produk oNP (onitrofenil) yang berwarna kuning dan galaktosa. Reaksi dihentikan menggunakan Na2CO3 setelah inkubasi 5 menit pada suhu 37ºC. Produk oNP yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer λ=420 nm. Aktivitas spesifik merupakan unit enzim yang terkandung dalam miligram protein. Aktivitas spesifik β-galaktosidase B134 sebesar 45.828 U/mg setelah pemurnian dialisis. Sebagai perbandingan, aktivitas spesifik β-galaktosidase dari Lactobacillus lactis pada pemurnian yang sama sebesar 55.62 U/mg (Mozumder et al. 2012). Karakterisasi β-Galaktosidase Kerja β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 3 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu. Aktivitas βgalaktosidase mengalami peningkatan seiring naiknya suhu karena energi kinetik yang dihasilkan enzim semakin meningkat. Gerak vibrasi, translasi, serta rotasi enzim semakin cepat. Peningkatan gerak enzim meningkatkan terjadinya tumbukan antara enzim dengan substrat. Sebaliknya, suhu tinggi menyebabkan enzim mengalami perubahan konformasi sisi aktif sehingga aktivitasnya mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000). Perubahan konformasi tersebut menyebabkan rusaknya interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi elektrostatik) yang menjaga strutur 3D enzim. Akibatnya enzim mengalami denaturasi yang merubah struktur lipatan enzim. Stuktur enzim akan terbuka dibagian permukaan sehingga sisi aktifnya berubah dan aktivitas enzim mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000).
13 Aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh pH. Peningkatan aktivitas βgalaktosidase sebelum mencapai aktivitas optimum disebabkan adanya interaksi antara H+ dari lingkungan dengan residu asam amino yang terletak pada sisi aktif enzim. Interaksi tersebut menyebabkan peningkatan keadaan ionisasi sisi aktif enzim. Hal ini menyebabkan sifat katalitik enzim untuk mengikat substrat meningkat. Ketika mencapai pH optimum, keadaan ionisasi berada pada keadaan yang tepat sehingga aktivitas enzim mencapai nilai tertinggi. Aktivitas enzim pada pH yang basa mengalami penurunan karena interaksi antara OH- dari lingkungan dengan residu asam amino akan menurunkan sifat katalitik enzim dan menyebabkan enzim terdenaturasi (Nelson dan Cox 2008). Kestabilan enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 7 dan 8 menunjukkan kestabilan β-galaktosidase pada suhu 30ºC dan pH 4.5. Faktor yang mempengaruhi kestabilan enzim seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, interaksi ion, dan jembatan sulfida. Stabilnya enzim terhadap panas karena terbentuknya konformasi terntentu yang tahan terhadap denaturasi. Konformasi tersebut terbentuk karena pelipatan asam amino (Yuningtyas 2011). Enzim membutuhkan koenzim dan aktivator untuk meningkatkan sifat katalitiknya. Ion logam merupakan aktivator yang dibutuhkan enzim untuk mengaktivasi kompleks substrat-enzim (Bintang 2010). Ion logam akan mengikat substrat pada sisi pemotongan. Ion logam juga dapat menstabilkan konformasi aktif enzim (Baehaki et al. 2008). Peningkatan aktivitas enzim terjadi karena ion logam menjadi bagian integral dari sisi aktif enzim, merubah konstanta keseimbangan reaksi enzimatis, merubah muatan listrik, menghambat ion inhibitor, dan menukar ion yang kurang efektif pada sisi aktif enzim atau substrat (Richardson dan Hyslop 1985). Natarajan et al (2012) menunjukkan bahwa Mg2+ dan Mn2+ meningkatkan aktivitas β-galaktosidase dari Bacillus sp. Penurunan aktivitas enzim terjadi karena ion logam bertindak sebagai inhibitor. Kekuatan ion logam akan mempengaruhi konformasi dari enzim. Ion Cu2+ dan Hg2+ bertindak sebagai inhibitor irreversibel yang membentuk ikatan kovalen dengan gugus prostetik di sisi aktif enzim (Bintang 2010). Faktor lain yang mempengaruhi kerja enzim adalah konsentrasi substrat. Peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan kerja enzim hingga mencapai titik steady state yaitu saat kecepatan enzim tetap meskipun konsentrasi substrat bertambah (Nelson dan Cox 2008). Nilai Km dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dengan Vmaks sebesar 3.278 µmol/menit. Sebagai perbandingan, nilai Km dan Vmaks β-galaktosidase dari Lactobacillus plantarum NCIMB sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit (Kara 2004).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pertumbuhan terbaik isolat BAL strain B134 tercapai pada inokulum 2% yang ditumbuhkan pada media MRS yang mengandung 2% laktosa, pH media 5, dan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37ºC. β-galaktosidase dari Isolat BAL strain B134 berhasil dimurnikan secara parsial. Aktivitas spesifik β-galaktosidase setelah purifikasi parsial sebesar 45.828 U/mg dengan kemurnian sebesar 3.131
14 kali. Aktivitas β-galaktosidase optimum pada suhu 45ºC dan pH 6. Aktivitas βgalaktosidase stabil pada pH 5.5 dan suhu 30ºC. Pengaruh kation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ pada konsentrasi 0.1 M terhadap aktivitas β-galatosidase bersifat aktivator sedangkan Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ pada konsentrasi 0.1M menghambat aktivitas βgalaktosidase. Nilai Km dan Vmaks dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit. Saran Penelitian lebih lanjut mengenai β-galaktosidase dapat dilakukan pemurnian β-galaktosidase menggunakan kromatografi filtrasi gel, amobilisasi βgalaktosidase, dan potensi β-galaktosidase dapat diaplikasikan untuk menghasilkan produk susu rendah laktosa.
DAFTAR PUSTAKA [BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 2008. Kenali Intoleransi Lebih Lanjut. InfoPOM Vol 9 No.1:1-3. Baehaki Ace, Maggy T. Suhartono, Nurheni Sri Palupi, dan Tati Nurhayati. 2008. Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas aeruginosa. Jurnal. Teknol Dan Industri Pangan 19(1):80-87. Bintang, Maria. 2010. Biokimia: Teknik penelitian. Jakarta: EGC. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding . Anal Biochem 72:248-254. Chooklin Supasit, Lupong Kaewsichan, Jasade Kaewsrichan. 2011. Potential use of Lactobacillus casei TISTR 1500 for the bioconversion from palmyra sap and oil palm sap to lactic acid. Electronical Journal of Biotechnology 14 (5). De Man, J. C, Rogosa M, Sharpe Elisabeth. 1960. A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. J.Appl.Bact. 23:130-135. Fox PF, McSweeney PLH. 1981. Dairy Chemistry and Biochemistry. London: Blackie Academic and Professional. Gary RK, Kindell SM. 2005. Quantitative assay of senescence-associated betagalactosidase activity in mammalian cell extracts. Anal Biochem. 343 (3):32934. Hames B.D. dan Hoper N.M. 2000. Biochemistry: The instant notes. 2nd Ed. Hongkong: SpringerVerlag. Hsu CA, Yu RC, Lee SL, Chou CC. 2005. Production of β-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions. International Journal of Food Microbiology 104:197-206. Hegar B, Buller H.A. 1995. Breath hydrogen test in lactose malabsorption. Pediatric Indonesia 35: 161-171. Hsu CA, Yu RC, Lee SL, Chou CC. 2007. Cultural condition affecting the growth and production of β-galactosidaseby Bifidobacterium longum CCRC 15708 in a jar fermenter. Intenational Journal of Food Microbiolgy 116:186-189. Kara Firat. 2004. Release and characterization of beta-galactosidase from Lactobacillus plantarum [tesis]. Turki (TR): Middle East Technical University.
15 Liu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating βgalaktosidase from Enterobacter cloaceae B5. Process Biochemistry 44:232236. Mahoney R.R. 2004. Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chem 63:147-154. Mozumder N H M R, Akhtaruzzaman M, Bakr M A, Zohra Fatema Tuj. 2012. Study on isolation and partial purification of lactase (β-Galactosidase) enzyme from Lactobacillus bacteria isolated from yogurt. J. Sci. Res. 4(1):239-249. Natarajan Jayashree et al. 2012. Isolation and Characterization of β-Galactosidase Producing Bacillus sp. from Diary Effluent. World Appl. Sci. J. 17(11):14661474. Nelson, David L dan Cox Michael M. 2008. Lehninger: Principles of Biochemistry. New York: W.H Freeman and Company. Ranciaro Alessia, Tishkoff Sarah A. 2010. Population Genetic: Evolutionary history of lactose tolerance in Africa. NIH Consensus Development Conference: 2010 Feb 22-24; Maryland. Maryland (US). Richardson T dan DB Hyslop. 1985. Enzim dalam O.R. New York: Bekker Inc. Rusynyk AR, Still CD. 2001. Lactose intolerance. JAOA 101:10-12. Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York: RR Doneley and Sons. Sumathy R, Vijayalakshmi M, Deecaraman M. 2012. A study on β-galaktosidase of Lactobacillus sp. from milk product and its applications. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 3:138-148. Tehuteru Edi Setiawan. 1999. Malabsorpsi laktosa pada anak. J. Kedokter Trisakti 18(3):139-144. Tossaveinen O. 2003. Losing the lactose. Dairy Industries International 68:23-26. Wang D, Sakakibara M. 1997. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem 4:255261. Wierzbicki LE, Kosikowski FV. 1973. Lactase potential of various microorganism grown in whey. J Dairy Sci 56:26-29. Yuanita Leny, Aline Puspita, Suzana Surodjo, Sri Handayati , Farid Al Amin, Arif Budiman. 2005. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Fitase Bacillus subtilis dari Holiwood Gresik. Berk Penel Hayati 12:113-119. Yuningtyas, Sitaresmi. 2011. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi βGalaktosidase dari Enterobacter cloaceae serta Potensinya terhadap Susu UHT [tesis]. Indonesia (ID): Institut Pertanian Bogor. Yuwono, T. 2006. Biokimia Molekuler. Jakarta: Erlangga.
16
LAMPIRAN Lampiran 1 Kurva Standar oNP
Absorban
µmol oNP 0.000 0.115 0.230 0.460 0.690 0.920 1.150 2.300 2.875 4.600 5.750
A 0.000 0.013 0.018 0.058 0.087 0.101 0.154 0.306 0.436 0.583 0.721
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
y = 0.1290x + 0.0012 R² = 0.9915 0
2
4 6 µmol ONP
8
Lampiran 2 Kurva standar protein
Absorban
[BSA] (mg/mL) 0.000 0.005 0.010 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.000 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
Absorban 0.000 0.002 0.012 0.055 0.123 0.189 0.399 0.763 0.891
y = 0.9097x + 0.0112 R² = 0.9969
0
0.5 1 [BSA] (mg/mL)
1.5
17 Lampiran 3 Penentuan inokulum dan keadaan media MRS optimum Penentuan Konsentrasi Inokulum Isolat BAL strain B134 Inokulum 1% 2% 5%
Aktivitas (U) 1 1.609 1.243 1.142
2 1.552 1.273 1.142
Total protein (mg) 1 3.038 0.639 0.720
2 2.824 0.635 0.747
Aktivitas spesifik (U/mg) 1 2 0.530 0.550 1.945 2.006 1.585 1.528
Aktivitas spesifik rerata ± SD 0.540 ± 0.014 1.976 ± 0.044 1.556 ± 0.041
Penentuan pH Media MRS pH
Aktivitas (U) 1 2.241 1.009 1.373 1.280
5 6 7 8
2 2.227 1.009 1.336 1.261
Total protein (mg) 1 0.031 0.028 0.027 0.054
2 0.033 0.020 0.020 0.036
Aktivitas spesifik Aktivitas (U/mg) spesifik rerata ± SD 1 2 72.791 68.497 70.644 ± 3.036 36.283 49.797 43.040 ± 9.555 50.042 66.891 58.466 ± 11.914 23.783 35.489 29.636 ± 8.278
Penentuan Konsentrasi Laktosa dalam Media MRS [Laktosa] 1% 2% 3%
Aktivitas (U) 1 1.609 1.243 1.142
2 1.552 1.273 1.142
Total protein (mg) 1 3.038 0.639 0.720
2 2.824 0.635 0.747
Aktivitas spesifik (U/mg) 1 2 0.530 0.550 1.945 2.006 1.585 1.528
Aktivitas spesifik rerata ± SD 0.540 ± 0.014 1.976 ± 0.044 1.556 ± 0.041
Lampiran 4 Penentuan waktu produksi optimum Jam ke-
OD
Jumlah Sel (sel/mL)
0 6 12 18 24 30 36 42
0.016 0.327 1.900 1.974 1.989 2.016 1.984 1.950
6.1257 10-10 1.2519 10-8 7.2743 10-8 7.5576 10-8 7.615 10-8 7.7184 10-8 7.5959 10-8 7.4657 10-8
[ONP] µmol 0.000 0.452 2.960 4.902 8.667 7.271 5.262 4.510
Aktivitas (U/mL) 0.000 0.904 5.919 9.803 17.333 14.543 10.524 9.020
Aktivitas (U) 0.000 0.832 6.630 9.999 16.467 12.652 9.472 8.930
Lampiran 5 Optimasi suhu dan pH β-galaktosidase Optimasi suhu β-galaktosidase Suhu 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0
[oNP] (µmol) 1 4.636 7.814 8.357 10.605 12.930 12.233 10.527
2 4.829 8.085 8.550 10.798 Suhu 10.450
Aktivitas (U/mL) 1 2 9.271 9.659 15.628 16.171 16.713 17.101 21.209 21.597 25.860 25.473 24.465 22.992 21.054 20.899
Aktivitas rerata ± SD 9.465 ± 0.27 15.899 ± 0.38 16.907 ± 0.27 21.403 ± 0.27 25.667 ± 0.27 23.729 ± 1.04 20.977 ± 0.11
18 Optimasi pH β-galaktosidase pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
[oNP] (µmol) 1 2 4.636 4.829 7.814 8.085 8.357 8.550 10.605 10.798 12.930 12.736 12.233 11.496 10.527 10.450 4.636 4.829 7.814 8.085
Aktivitas (U/mL) 1 2 9.271 9.659 15.628 16.171 16.713 17.101 21.209 21.597 25.860 25.473 24.465 22.992 21.054 20.899 9.271 9.659 15.628 16.171
Aktivitas rerata ± SD 9.465 ± 0.27 15.899 ± 0.38 16.907 ± 0.27 21.403 ± 0.27 25.667 ± 0.27 23.729 ± 1.04 20.977 ± 0.11 9.465 ± 0.27 15.899 ± 0.38
Lampiran 6 Stabilitas suhu dan pH β-galaktosidase Stabilitas suhu β-galaktosidase Aktivitas (U/mL) 1 2 25.0 2.605 4.000 30.0 12.372 12.217 35.0 12.372 10.667 40.0 9.116 9.891 45.0 6.791 6.791 50.0 2.295 2.295 55.0 -0.186 -0.186 Aktivitas kontrol : 25.667 U/mL Suhu
Aktivitas tersisa (U/mL) 1 2 10.15 15.58 48.20 47.60 48.20 41.56 35.52 38.54 26.46 26.46 8.94 8.94 -0.72 -0.72
Aktivitas tersisa ± SD 12.87 ± 3.84 47.90 ± 0.43 44.88 ± 4.70 37.03 ± 2.14 26.46 ± 0.00 8.94 ± 0.00 -0.72 ± 0.00
Aktivitas tersisa (%) 1 2 51.17 50.78 31.14 34.27 34.27 38.18 35.84 39.75 32.71 37.40 38.97 40.53 42.88 42.10 43.66 42.10 29.58 37.40
Aktivitas tersisa rerata ± SD 50.98 ± 0.28 32.71 ± 2.21 36.23 ± 2.77 37.79 ± 2.77 35.05 ± 3.32 39.75 ± 1.11 42.49 ± 0.55 42.88 ±1.11 33.49 ± 5.53
Stabilitas pH β-galaktosidase Aktivitas (U/mL) 1 2 4.5 10.140 10.062 5.0 6.171 6.791 5.5 6.791 7.566 6.0 7.101 7.876 6.5 6.481 7.411 7.0 7.721 8.031 7.5 8.496 8.341 8.0 8.651 8.341 8.5 5.860 7.411 Aktivitas kontrol : 25.667 U/mL pH
Lampiran 7 Pengaruh Logam terhadap aktivitas enzim kasar Kation Kontrol Ca2+ Co2+ Zn2+ Cu2+ Mn2+ Hg2+ Mg2+
Aktivitas β-galaktosidase (U/mL) 1 2 28.341 28.186 24.465 24.000 33.767 33.302 32.992 34.233 0.803 0.896 43.535 44.310 0.431 0.478 34.078 31.597
Aktivitas β-galaktosidase tersisa (%) 1 2 100.000 100.000 85.738 85.149 118.651 118.152 118.925 121.452 3.006 3.179 155.403 157.206 1.607 1.694 116.182 112.101
Aktivitas βgalaktosidase tersisa rerata ± SD 100.00 ± 0.00 85.44 ± 0.42 118.40 ± 0.35 120.19 ± 1.79 3.09 ± 0.12 156.30 ± 1.27 1.65 ± 0.06 114.14 ± 2.89
19 Lampiran 8 Kinetika Kimia Enzim Purifikasi parsial Dari persamaan y=1.200x+0.305 diperoleh nilai 1/Vmaks = 0.305 dan nilai Km/Vmaks = 1.200. Maka nilai Vmaks = 3.278 µmol/menit dan Km sebesar 3.934 mM. [S] (mg/mL) 0.100 0.500 1.000 2.000 4.000
[S] (mM) 0.332 1.660 3.320 6.639 13.278
1/S 3.012 0.602 0.301 0.151 0.075
120
1/V 3.846 1.541 0.531 0.310 0.275
y = 3.633x - 0.8127 y = 3.2307x + 10.055 R² = 0.9943 oNPGal 0.1 mg/mL R² = 0.9441
100
y = 1.8443x + 14.47 R² = 0.8305
80 [oNP] (µmol)
V (µmol/menit) 0.26 0.649 1.884 3.23 3.633
60
oNPGal 0.5 mg/mL oNPGal 1 mg/mL oNPGal 2 mg/mL
40
y = 0.6494x + 1.6956 R² = 0.9689
20
oNPGal 4 mg/mL
y = 0.2601x + 1.2664 R² = 0.9203
0 0
5
10
-20
15
20
25
30
Waktu (menit)
Kurva linier oNP vs waktu Lampiran 9 Hasil pemurnian β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat Fraksi
0-10% 10-20% 20-30% 30-40% 40-50% 50-60% 60-70%
[ONP] µmol 1.060 2.138 2.247 2.479 18.744 39.597 6.946
Aktivitas (U/mL)
Aktivitas (U)
[Protein] mg/mL
2.121 4.276 4.493 4.958 37.488 79.194 13.891
2.121 4.148 5.841 5.652 37.488 79.194 13.891
0.179 0.283 0.294 0.298 2.009 5.978 3.074
Total Protein (mg) 0.179 0.275 0.383 0.339 2.009 5.978 3.074
Aktivitas Spesifik (U/mg) 11.851 15.089 15.263 16.656 18.656 13.248 4.520
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Klaten, 7 Januari 1992 dari ayah Lusi Hartono dan Ibu Eny Suwartiningsih. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 1 Tambun Selatan tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Selama masa perkuliahan, penulis mengikuti organisasi kampus sebagai bendahara umum 1 UKM Gentra Kaheman tahun 2011-2012 dan 2012-2013, dan staff biologi molekuler CREBS (Community of Reasearch and Education in Biochemistry) tahun 2011-2012. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum biokimia umum tahun ajaran 2012-2013 dan asisten praktikum pengantar penelitian biokimia tahun ajaran 2013.
