Co je to genová terapie?

Obsah přednášky 1. Definice genové terapie 2. Typy a strategie genové terapie 3. Principy genového přenosu

4. Základní technologie genové terapie 5. Způsoby přenosu genů 6. Příklady využití genové terapie 7. Budoucnost genové terapie

Co je to genová terapie? Léčebný postup nebo postup zmírňující projevy genetické poruchy pomocí geneticky modifikovaných buněk pacienta s terapeutickým přínosem pro pacienta

Genová terapie versus symptomatická léčba Symptomatická léčba geneticky podmíněných chorob neléčí podstatu, ačkoli je známa příčina onemocnění

Genová terapie léčí příčinu onemocnění

Symptomatická léčba  Dodání chybějícího enzymu u enzymopatií  Dodání jiných chybějících látek (substrátů, proteinů...)  Vyvarování se substrátu, který metabolizovat (speciální diety)

nelze

správně

 Chirurgické zákroky  Farmakologické ovlivnění narušených fyziologických procesů  Farmakologické zlepšení kvality života

 Jiné ovlivnění fyziologických procesů nebo kvality života (přístroje, pomůcky)  Transplantace chorobou poškozeného orgánu

Co zahrnuje genová terapie?  Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta  Do buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy  Genová terapie in vitro (ex vivo): odběr buněk, provedení genové modifikace mimo organismus, návrat buněk zpět  Genová terapie in vivo: intravenózní transformace přímo genovým konstruktem

 Genová terapie in situ: (modifikace in vivo) genový konstrukt je injikován do postižené tkáně nebo její blízkosti

Techniky genové terapie klonovaný gen

In vivo, In situ

odběr buněk

In vitro (Ex vivo) transfer genu

buňky pacienta X-

selekce a namnožení buněk X+ některé buňky X+ buňky X+

návrat geneticky modifikovaných buněk pacientovi

Co lze léčit genovou terapií?  Vrozené poruchy (genetická deficience genového produktu, nepřiměřená exprese genu)

 Nádorová onemocnění (poruchy biologické funkce protoonkogenů, nádorových supresorových, apoptotických a reparačních genů)

 Nemoci imunitního systému (alergie, záněty a autoimunní choroby)

 Infekční nemoci (virový nebo bakteriální patogen)

Projekt HUGO a genová terapie Projekt sekvenování lidského genomu 1990 - 2001 SCIENCE 291, February 2001

Kdy lze použít genovou terapii?  Musíme znát přesnou příčinu genetické choroby – tzn. gen, jeho umístění, povahu produktu a hlavně mechanizmus patologického účinku

 Správně vytvořenou strategii genové terapie  Součástí strategie je i volba vhodného vektoru a vytipování cílových buněk genové terapie  S ohledem na jistou kontroverznost této terapie je třeba provádět genovou terapii pouze pokud je úspěšně otestována a schválena k použití

Základní strategie 2x2  Reparace genů in situ - terapie genů

 GT somatická

 Ektopická reparace – terapie geny

 GT germinální

Strategie genové terapie KLASICKÁ  Optimální exprese vloženého genu  Tvorba chybějícího produktu  Přímá likvidace nemocných buněk  Aktivace imunitního systému

NEKLASICKÁ  Inhibice exprese patogenního genu  Restaurace normální exprese  siRNA

Genová terapie „klasická“ Jejím cílem je dopravit geny do vhodných cílových buněk tak, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů a  Zajistit produkci látky, která chybí  Aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky

Genová terapie „neklasická“  Inhibice exprese s patogenezou

genů

asociovaných

 Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese

Genová terapie podle typu buněk 1) Zárodečných buněk

2) Somatických buněk

GT zárodečných buněk  Do oplodněného vajíčka se dodá kopie správné verze příslušného genu a vajíčko se implantuje zpět do těla matky  Gen je zpravidla přítomný ve všech buňkách nového jedince  Provádí se mikroinjekcí DNA do vajíčka  Teoreticky použitelná k léčení jakékoli dědičné choroby

GT somatických buněk  Manipulace s buňkami, které lze z těla odebrat, transfekovat a vrátit zpět do těla  Nadějná pro léčbu krevních buněk

dědičných

onemocnění

 Vnášejí se geny do kmenových buněk kostní dřeně  Jako vektory slouží viry – retroviry, adenoviry

Jak se vypořádat s dominantními defekty?

GT kmenových buněk nový gen

implantace

transfekce kmenová buňka

diferenciace

B-lymfocyt makrofág

eozinofil T-lymfocyt

bazofil

neutrofil

Všechny zralé buňky obsahují nový gen

Somatické nebo zárodečné buňky?  Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací

 Etické problémy s zárodečných mutací

potenciální

terapií

Provedení genové terapie zahrnuje  Vytvoření genetické rekombinantní DNA), transport do buněk

informace (metodami která je určená pro

 Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace vnesena (in vivo, in vitro)

 Výběr vhodného vektoru  Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat si jak zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací

Důsledky genové terapie 1) Zvýšení genové exprese – efekt genové dávky

2) Usmrcení „nemocných“ buněk 3) Usmrcení buněk za asistence imunitního systému 4) Cílená inhibice genové exprese 5) Cílená oprava mutace

Zvýšení exprese genu gen X

Zvýšená tvorba produktu genu X

buňky s deficiencí

normální fenotyp

X-

X

Příklad

Usmrcení „nemocných“ buněk gen T pro toxin

Buňky zabité exprimovaným toxinem P T

P T P T

buňky s deficiencí

gen P pro prodrug

Buňky zabité léčivem

Usmrcení buněk za účasti imunitního systému vystavení antigenu

gen pro antigen

produkce cytokinů

buňky s deficiencí

buňky imunitního systému

gen pro cytokin

likvidace buněk

Cílená inhibice genové exprese antimediátorový gen

Inhibice genové exprese A

A A

buňky s deficiencí

Zablokování produkce „patologického“ proteinu

Cílená oprava mutace gen X+ gen X+ gen X-

Genová konverze X+X buňky s deficiencí

X-

X+X

X+X

Normální fenotyp

Transfer genů do buněk 1) Pomocí virů 2) Nevirový transfer

Transfer genů do buněk pomocí virů Savčí virové vektory  Retrovirové vektory  Adenovirové vektory  Vektory viru herpes simplex  Vektory adenoasociovaného viru

Retrovirus Replikace/integrace

Signál obalování

5LTR y

Gag

Proteiny core

Pol

Env Obalové proteiny

3LTR

Vektor na bázi retroviru

Signál obalování

5LTR y Marker

Exprese genu

Promotor

Identifikace/separace

Cizorodý gen Opravný gen

3LTR

Postup při genové terapii retrovirem

Genová terapie s adenovirovým vektorem

Vstup adenoviru endocytózou vazba na receptor plasmatická membrána

invaginace rozpad vesikulu

endosom

jaderná membrána

vstup do jádra

Transfer genů do buněk nevirový  Endocytóza navozená receptory  Transfer prostřednictvím lipozómů  Přímý přenos DNA  Bombardování částicemi

In vivo transfer lipozómy voda

lipid

fosfát

voda

lipidová dvojvrstva

směs

aniontové lipozómy kationtové lipozómy

fůze

transfer cílová buňka

jádro

Příklady GT dědičných onemocnění Onemocnění ADA deficience

Buňky

Strategie

genu ADA T buňky, HSC ex vivo transfer retrovirem

Cystická fibróza

Respirační epitel

Familiální hypercholest erolémie

Ledviny

Gaucherova choroba

HSC

transfer genu CFTR retrovirem nebo in vivo lipozómy transfer genu pro receptor LDL ex vivo retrovirem genu GBA ex vivo transfer retrovirem

Příklady GT nádorů

Schválené postupy  Deficience adenosindeaminázy – první historicky úspěšný postup GT  Familiální hypercholesterolemie, deficience LDLR – retrovirový transfer do hepatocytů  Cystická fibróza – adenovirový transfer genu CFTR do epiteliálních buněk – aerosol  DMD – chybí vhodný vektor

Etické aspekty genových terapií  Bezpečnost manipulací  Ověření na savčích modelech  Hierarchické schvalování protokolu

 Nebezpečí vedlejších účinků  GT zárodečných buněk

 Perspektivy GT

Nevýhody genové terapie  Velmi vysoká finanční náročnost  Technická a technologická náročnost  Nízká úspěšnost terapie, pokud jsou problémy s "uchycením" vnášené genetické informace  Náhodnost vložení genetické informace = narušení protoonkogenu, tumorsupresorového genu = maligní transformace buňky

 Genová terapie je eticky problematická

Znovuzrození v roce 2009? Září Přenos genů pro pigmenty vedl k restauraci barevného vidění u opic

Říjen Přenos genů pro tvorbu protizánětlivých proteinů podpořil uchycení transplantovaných plic

Listopad Léčba adrenoleukodystrofie HIV terapií u lidí Přenos genu blokujícího rozpad svalové hmoty u opic – v budoucnosti léčba degenerativních svalových onemocnění?

Terapie adrenoleukodystrofie poškození lignoceroyl-CoA-ligázy

HSC s opraveným genem ABCD1

vektor na bázi HIV s genem ABCD1

odbourávání tukových zásob

potomstvo HSC se šíří po celém těle

HSC = kmenové buňky L. Naldini Science 326, 805-806 (2009)

Více svalové hmoty?  Myostatin brzdí růst svalové hmoty  Do svalových buněk makaka byl vnesen negativní regulátor myostatinu, lidský follistatin

 Jako vektor použit adenoasociovaný virus  Důsledkem bylo ovlivnění svalové hmoty a malý vliv na jiné buňky

Využití při léčbě svalových onemocnění? Kota J. et al. (2009): Follistatin Gene Delivery Enhances Muscle Growth and Strength in Nonhuman Primates. Sci Transl Med 11 November 2009

Více svalové hmoty?

www.colorado.edu/intphys/Class/IPHY3730/image/myostatin

Schválena v červenci 2012 Určena k léčbě familiárního deficitu lipoprotein lipázy

 onemocnění se projevuje zvýšenými hladinami chilomikronů, částic (komplexů protein-lipid) přenášejících v krvi některé tuky  je způsobeno defekty v genu pro lipoprotein lipázu, který zpracovává tuky z potravy  pokud enzymu není v těle dost, nebo když nepracuje správně, dochází k dramatickému zvýšení hladin tuku v krvi

 vnáší do těla nemocného funkční kopii genu pro lipoprotein lipázu  gen je přenášen vektorem na bázi adenoasociovaného viru serotypu 1, který se váže na receptory svalových buněk

odstraňování chylomikronů

 Glybera je aplikována jednorázovou sérií intramuskulárních injekcí do nohy

FFA = free fatty acids

Budoucnost genové terapie Záchrana života pacientů s těžkými genetickými chorobami či rakovinou Zpříjemnění života mnoha dalším lidem, jejichž choroba sice není natolik závažná, ale stejně jsou odkázáni na podpůrnou terapii Nutné vymezení hranice mezi tím, na co je ještě etické genovou terapii použít a na co už ne Budou v budoucnosti "děti na objednávku"? Budeme si moc určit barvu očí, vlasů či výšku našich dětí? Dočkáme se éry superlidí? Stane se z genové terapie takový obchod, jakým je dnes třeba plastická chirurgie? Vylepšení genomu na objednávku a jen pro majetné by bylo vyložené pošlapání současných nadějí

Kde se dozvím více? European society of gene and cell therapy

http://www.esgct.eu/ American society of gene and cell therapy

http://www.asgct.org/ Stránky HUGO

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Huma n_Genome/medicine/genetherapy.shtml

Shrnutí přednášky 1. Definice genové terapie 2. Typy a strategie genové terapie 3. Principy genového přenosu

4. Základní technologie genové terapie 5. Způsoby přenosu genů 6. Příklady využití genové terapie 7. Budoucnost genové terapie