Claudin 2, 3 és 4 expressziója a coeliakiás gyermekek proximalis és distalis duodenumában Győrffy Hajnalka dr, Nagy Szakál Dorottya*, Dr. Tőkés Anna-Mária, Arató András dr*, Dezsőfi Antal dr* és Veres Gábor dr* II. sz. Pathológiai Intézet és *I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika, Semmelweis Egyetem, Budapest
Coeliakia • • • • • • • • • •
Gluténszenzitív enteropathia „koiliakoz” (Kappadokiai Aeretheus A.D. 2.sz.) Újkori első leírás: Samuel Gee (1887) Változó prevanlencia (Mo. 0:85) - emelkedő tendencia Glutén – a-gliadin (PROLAMIN) Genetikai konstelláció (HLA-DQ2, DQ8 – CELAC1) Szöveti transglutamináz Boholyatrophia Malabsorptio Egyéb tünetek, betegségek …
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/66/Claudin.png
Coeliakia • CLAUDIN-ok (CLDN), mint tight junction (TJ) molekulák szerepe coeliakiában még kevéssé vizsgált • • •
Fasano et al (2000): zonulin h Sander et al (2005): gliadin occludin, CLDN3 és 4 és E-cadherin h Drago et al (2006): ZO-1 és occludin down-regulatioja
• 3 „as”-nál nagyobb molekulák juthatnak a keringésbe, amelyek két szinten is stimulálják az immunrendszert, ami a TJ súlyos károsodására utal.
• „a2-gliadin” (33 „as” fragmentum) TG által átalakítva T-sejt kötő epitoppal mutat átfedést (főleg DQ2 isoforma esetén). Ez erősíti a helyi gyulladásos reakciót. • hordein (árpa), secalin (rozs), avenin (zab) ~
• Diagnosis: Biopsia + serologia http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/92/Tissue_transglutaminase.png
Célkitűzés • Boholyatrophia mértékének meghatározása (Marsh módszere) • A CLDN 2, 3 és 4 expresszió vizsgálata
• Intraepithelialis CD3+ lymphocyták • Összehasonlító elemzés a duodenum proximalis és distalis régiójában
Betegek, vizsgálati anyagok • 33 új coeliakiás gyermek: – 20 lány, 13 fiú – életkor: 2-17 év, átlag: 6,4 év
• Endoscopia - biopsia a duodenum bulbusából, ill. a duodeno-jejunalis átmenetből • Kontroll: 14 gyermek duodenum mintái
Módszer 1. • HE festett metszetek • Az atrophia súlyosságát a Marsh-féle módszerrel határoztuk meg: GRADE
Boholy/Crypta arány
1
2,5 - 2,0
2
1,0 - 2,0
3
1,0 - 0,5
4
< 0,5
Módszer 2. • Immunhisztokémiai vizsgálat
– monoclonalis CD3 ellenes antitest: • intraepithelialis lymphocyták (IEL) • 100 hámsejtre jutó IEL (%)
– monoclonalis CLDN 2, ill. 4 , valamint polyclonalis CLDN3 ellenes antitestekkel:
• Pontrendszer: 5=81-100%; 4=61-80%; 3=41-60%; 2=21-40%; 1=5-20%; 0=5%>
• Statisztika
– Shapiro-Wilk W-teszt – Mann-Witney U-teszt
Eredmények 1.
CD3+ IEL vizsgálata a.
CD3 pozitív intraepithelialis lymphocyták: a. coeliakia; b. kontroll (immunhisztokémiai reakció, x100 imm.)
b.
Eredmények 1.
CD3+ IEL vizsgálata %
p=0.006
p=0.026
70 60 50 40 30 20 10
Coeliakia
0
Kontroll Bulbus Distalis
Eredmények 2. CLAUDINOK
c
a
e
Kontroll
b
d
f
Coeliakia
CLDN2
CLDN3
CLDN4
Eredmények 2. CLAUDINOK
5,00 4,50 4,00 3,50 3,00
Grade 1+2+3
2,50 2,00 1,50 1,00
Grade 4
0,50 0,00 Bulbus Distalis CLDN 2 CLDN 2
Coeliakia Bulbus CLDN 3
Distalis CLDN 3
Kontroll Bulbus CLDN 4
Distalis CLDN 4
Eredmények 2.
CLAUDINOK – súlyosság szerint 6 *p=0,02 **p=0,001 ***p=0,001 #p=0,04 ##p=0,03
5
4
$p=0,01 $$p=0,001 &p=0,008 &&p=0,004
3
2
1 I: Grade1+2+3 II: Grade 4 K: kontroll
0 I. II. K. Prox. duod. CLDN2
I. II. K. Dist. duod. CLDN2
I. II. K. Prox. duod. CLDN3
I. II. K. Dist. duod. CLDN3
Eredmények összefoglalása • A CD3+ IEL száma szignifikánsan emelkedett a CD-s esetekben mindkét topográfiában a kontrollhoz képest. • A CLDN2 és 3 expressziója is emelkedett mindkét helyen, sőt a distalis duodenumban fokozottabb fehérje-expressziót találtunk. • Marsh szerint: az enyhébb (Grade1+2+3) esetekben CLDN2-nél a distalis duodenumban; súlyosabb (Grade4) atrophiában mindkét helyen statisztikai különbséget kaptunk. A súlyosabb eseteink fokozottabb fehérje-expressziót mutattak, mint az enyhébb formák. • CLDN3: hasonló összefüggéseket mutatott. • CLDN4: nincs szignifikáns különbség a beteg és egészséges csoport között.
Megbeszélés • A CLDN2 és 3 fokozott expressziója a coeliakiás betegek duodenum mintáiban a TJ súlyos strukturális változásaira utal, amely miatt maga a betegség és annak szöveti jellemzői kialkulnak. • Eredményeink az irodalmi adatok egy részével korrelálnak. • ÚJDONSÁG: CLDN2-expressziós vizsgálata.
Megbeszélés • A TJ szerkezeti változása a fokozott permeabilitás mellett a sejt-sejt kapcsolatban, ill. a proliferációban is zavarokat idézhet elő. • Számos összefüggést tártak/nak fel a sejtkapcsoló-struktúrák és a daganatképződés között, s nem kizárt, hogy a carcinogenesis egy lépcsőjével állunk szemben …
„Take home message” • A mod. Marsh beosztás (CD3+ IEL) reprodukálható. • A CLDN2 és 3 expressziója jó mutatónak tűnik a coeliakia vizsgálatában. • A mintavétel helye megbízhatóan a distalis duodenum-szakaszon jelölhető ki.
Hogyan tovább ? • Glutén-mentes étrendet követően vizsgálni szeretnénk a claudinok expreszsziójának változását, reverzibilitását.
Köszönöm a figyelmet! Külön köszönet illeti: Prof. Dr. Schaff Zsuzsa Szabó Erzsébet Azumah Francisné Dr. Sklánitzné Samodai Erika
