Claudin-1 és claudin-7 expresszió növekedése cirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában Dr. Kiss András 2. Pathologia Intézet Semmelweis Egyetem, Budapest
67. Pathologus Kongresszus, Keszthely 2008 október 09.
Sejt-sejt kapcsolatok
Zonula adherens g-catenin-catenin a-catenin ZO-2 ZO-3 E-cadherin P-cadherin K-cadherin
Occludin
ZO-1
cAMP
RGS5 Ga1
Rec?
ZO-2 ZO-3
cytoskeleton
Symplekin actin
Tight Junction
ZO-1
PKC AF-6
Cingulin
JAM ZO-1 CASK
JAM
Az integráns membrán fehérjék: claudinok, occludin és a junctional adhesion molekulák (JAMs).
A claudinok • Paracelluláris diffúzió gátlása • Sejt polaritás • Sejt adhézió • • • •
Tight Junction integráns fehérjéi Claudin-1, 2, 3…24 4 transzmembrán domain, 2 extracellularis hurok, nem mutatnak homológiát az occludinnal.
•
Különböző szövetekben eltérő összetételben találhatóak meg.
•
Az integrinekhez és a cadherinekhez hasonlóan szerepet játszhatnak a sejtosztódás szabályozásában → szerep a daganatok progressziójában ?
•
A claudin 3, 4 a Clostridium perfringens enterotoxin receptora, citolízist okoz. (Kominsky és mtsai, Am. J. Path.,2004;2007, Michl és mtsai, Gastroenterology, 2001 )
A claudinok dimerizációs modelljei
A claudinok dimerizációs modelljei s Homophilic adhesion
Heterophilic adhesion
Homopolymer
14 51 + + + -
NH2 Heteropolymer
13
21-42 COOH
(Furuse et al 1999, Gonzalez-Mariscal 2003)
Claudinok patológiás elváltozásokban •
A claudin-1 fehérje csökkent expressziója colorectalis carcinomában emelkedett tumor kiújulással, magasabb tumor grade-el és általában rosszabb prognózissal jár együtt. (Resnick és mtsai., Modern Pathology, 2004)
•
A claudin-1 tútermelése és magi lokalizációja colorectalis carcinomában befolyásolhatja az E-cadherin expresszióját és a -catenin jelátviteli útvonalat (Dhawan és mtsai, J. Clin. Inv., 2005)
•
Az emelkedett claudin-10 expresszió növeli a primer hepatocellularis carcinoma helyi kiújulásának esélyét (Cheung és mtsai, Clin. Cancer Res., 2005)
•
A claudin 4 expressziója fokozott a differenciált és csökkent az invazív és differenciálatlan húgyhólyagrákokban. (Boireau és mtsai, Carcinogenesis, 2006)
•
A claudin 3 és 4 fehérjék túlexpresszáltak ovarium carcinomákban, de az ovarium cystadenomákban nem. ( Rangel és mtsai, Clin. Canc. Res., 2003)
•
Melanomában a claudin-1 fokozott expresszióját a PKC szabályozza. (Leotlela és mtsai, Oncogene, 2006)
•
A claudin-1 a HCV co-receptora. ( Evans és mtsai, Nature, 2007)
•
A claudin -3 és -7 máj progenitor sejt marker ( Yovchev és mtsai, Hepatology, 2007; Reid és mtsai, Stem Cell, 2006)
•
A claudin-6 és a claudin-9 a HCV célsejtbe való bejutását elősegítik, annak ko-receptorai, míg a claudin-2, 3, 4, 7, 11, 12, 15, 17, 23 nem ko-receptorai a HCV-nek. (Zheng a., et al., J. Virol., 2007)
•
A HCV burokfehérjéi megváltoztatják a tight junction asszociált fehérjék lokalizációját és az occludin endoplazmás reticulumban való retencióját eredményezik. (Benedicto és mtsai, Hepatology, 2008)
CÉLKITŰZÉSEK ► a claudinok expressziós
mintázatának karakterizálása hepatocelluláris
carcinomában
►a
claudin expresszió vizsgálata különös tekinettel a fibrosis/cirrhosis és a hepatitis C virus (HCV) infekció jelenlétére
● a fenti célok elérésére normal májmintájkat (10) és hepatocelluláris carcinoma
(HCC) mintékat (25) visuzgáltunk és hasonlítottunk össze a tumormentes környező Májszövettel.
Módszerek - Immunhisztokémia - Deparaffinálás - Antigén feltárás /mikrohullámú kezelés/
Szubsztrát, színreakció
- Blokkoló szérum
Peroxidáz
- Primer antitest
Biotin
- Szekunder antitest - Avidin - Biotin - komplex
Avidin
Szekunder antitest Anti-egér
- Peroxidáz reakció / DAB / - Háttérfestés / haematoxylin /
Primer antitest
Claudinok
egér
Blokkoló fehérje
Anti-nyúl
Antigén: claudin
nyúl
1, 2, 3, 4, 5, 7
Módszerek – Real Time RT-PCR •
High Pure RNA Paraffin kit (Roche) módszerrel RNS izolálás
•
Dnáz emésztés
•
RNS átírása cDNS-re random hexamerrel: 1 μg teljes RNS-ből.
•
Claudin 1, 2, 3, 4, 5, 7 mRNS expressziójának relatív kvantifikációja a GAPDHhoz és ß-actinhoz képest
- 25 μl 1x BIO-RAD Sybr Green PCR Mix 300 nM primerrel - Denaturálás 2 percig 95°C - 95°C, 20 másodperc - 63°C, 30 másodperc / 40 ciklus / - 72°C, 30 másodperc - Detektálás BIO-RAD real time PCR-rel Claudin 1 = 112 bp
100 bp
CLDN expresszió hepatocelluláris carcinomában (HCC) és cirrhosisban STATISZTIKAI ANALÍZIS: M. Pfaffl, G. W. Horgan and L. Dempfle. Realtive expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR Nucl. A.Res., 2002, 30:9 Institute of Physiology, Center of Life and Food Sciences, Technical University, Munich
CSOPORTOK Környező máj (HCC)
HCC cirrhosis HCV positivitás
Normál máj
CLDN-1 Normál máj
CLDN-1 cirrhosis
CLDN-1 HCC
CLDN-7 Normál máj
CLDN-7 cirrhosis
CLDN-7 HCC
A claudin fehérje expresszió kvantitatív vizsgálata
SL KM
NM NL
nem cirrhotikus non-cirrhotic a
a
HCC HCC
cirrhotikus cirrhotic
nem cirrhotikus w non-cirrhotic SL wcirrhotikus cirrhotic SL a
CLDN-1
0.402 ± 0.151 b 0.375 ± 0.135
0.516 ± 0.126 b 0.408 ± 0.107
1.478 ± 0.240 b 1.064 ± 0.191
a
a
CLDN-2
3.096 ± 0.547 b 3.089 ± 0.547
3.429 ± 0.238 b 3.422 ± 0.237
3.767 ± 0.169 b 3.755 ± 0.169
a
0.251 ± 0.072 b 0.239 ± 0.067
a
CLDN-3
0.271 ± 0.045 b 0.253 ± 0.042
0.393 ± 0.069 b 0.364 ± 0.063
a
a
CLDN-4
0.011 ± 0.003 b 0.000 ± 0.000
0.017 ± 0.003 b 0.000 ± 0.000
0.033 ± 0.004 b 0.000 ± 0.000
a
a
CLDN-7
0.108 ± 0.046 b 0.086 ± 0.040
0.228 ± 0.047 b 0.163 ± 0.027
0.999 ± 0.177 b 0.727 ± 0.192
1.220 ± 0.359
2.540 ± 0.500
1.406 ± 0.289
1.796 ± 0.334
0.275 ± 0.069
0.413 ± 0.094
0.005 ± 0.005
0.000 ± 0.000
0.239 ± 0.056
0.541 ± 0.147
a
a
a
a
A claudinok immunhisztokémiai reakcióit a normál és a tumormentes környező májszövetben mind az epeutakkal együtt, mind pedig nélkülük kvantitatív kiértékeltük. A százalékos értékeket a középérték ± standard hiba formájában fejeztük ki. CLDN=claudin; NM = normál máj; KM = a HCC körüli környező máj, HCC=hepatocellularis carcinoma. a=portális területekkel együtt; b=portális területek kivételével
A claudin-1 fehérje expresszió kvantitatív és összehasonlító elemzése 3.0
*
*
2.5
2.0
*
w/o portal tract portal tract
*
% 1.5
HCC 1.0
0.5
0.0
NL
ncSL ncHCC
cSL cHCC
A jelölt területet a normál májban és a tumormentes környező májban a portális traktusokkal és anélkül is lemértük. A csoportok jelölt területeinek százalékban kifejezett értékeinek statisztikai összehasonlítását a (a portális területeket is beleértve ott, ahol ez alkalmazható) a Mann-Whitney teszt segítségével végeztük. A csillagok szignifikáns különbséget jeleznek a két csoport között (p≤0.05). CLDN=claudin; NL=normál máj; ncKM= non-cirrhotikus környező máj; ncHCC= hepatocellularis carcinoma non-cirrhotikus KM-al; cKM= cirrhotikus környező máj; cHCC=hepatocellular carcinoma cirrhotikus KM-al, w/o= nélkül
A claudin-7 fehérje expresszió expresszió kvantitatív és összehasonlító elemzése 1.50
*
*
*
1.25
*
*
1.00 w/o portal tract portal tract
% 0.75
HCC
0.50
0.25
0.00
NL
ncSL ncHCC
cSL
cHCC
A jelölt területet a normál májban és a tumormentes környező májban a portális traktusokkal és anélkül is lemértük. A csoportok jelölt területeinek százalékban kifejezett értékeinek statisztikai összehasonlítását a (a portális területeket is beleértve ott, ahol ez alkalmazható) a Mann-Whitney teszt segítségével végeztük. A csillagok szignifikáns különbséget jeleznek a két csoport között (p≤0.05). CLDN=claudin; NL=normál máj; ncKM= non-cirrhotikus környező máj; ncHCC= hepatocellularis carcinoma non-cirrhotikus KM-al; cKM= cirrhotikus környező máj; cHCC=hepatocellularis carcinoma cirrhotikus KM-al, w/o= nélkül
A claudin-1, -2, -3, -4 és -7. fehérje expresszió Western blot analízise HCC-ben és a környező tumormentes májban NK
NM
KM1
KM2
HCC1 HCC2
CLDN-1
24 kDa
CLDN-2
25 kDa
CLDN-3
23 kDa
CLDN-4
CLDN-7
22 kDa
24 kDa
CLDN: claudin, NK: negatív kontroll, NM: normál máj, KM1: nem cirrhotikus környező máj, SL2: cirrhotikus környező máj, HCC1-2: hepatocellularis carcinoma
Claudin mRNS expresszió KM NM
nemcirrhotikus KM
HCC
cirrhotikus KM
nemcirrhotikus KM
cirrhotikus KM
CLDN-1
0.522 ± 0.174
0.561 ± 0.070
5.798 ± 4.023
0.373 ± 0.084
0.738 ± 0.123
CLDN-2
0.071 ± 0.029
0.057 ± 0.013
0.141 ± 0.064
0.030 ± 0.016
0.025 ± 0.010
CLDN-3
0.059 ± 0.016
0.082 ± 0.012
0.501 ± 0.283
0.093 ± 0.033
0.078 ± 0.012
CLDN-4
0.014 ± 0.007
0.003 ± 0.001
0.340 ± 0.230
0.011 ± 0.005
0.007 ± 0.003
CLDN-7
0.009 ± 0.004
0.011 ± 0.002
0.028 ± 0.006
0.015 ± 0.005
0.039 ± 0.011
A relatív gén expressziót a középérték ± standard hiba értékekkel jelöltük. A caludinok relatív expresszióit a 2-ΔCt (ΔCt=a célgén Ct értéke mínusz a GAPDH és beta-actin Ct értékeinek átlaga) képlettel számoltuk minden mintára. CLDN=claudin; NM=normál máj; KM= HCC körüli tumormentes máj; HCC=hepatocellularis carcinoma.
A claudin mRNS expresszió összehasonlító elemzése mRNS expresszió a normál májhoz viszonyítva
12 10
Fold change
8 6 claudin-1
4
claudin-7
2 0 1
2
3
4
-2 -4
ncKM
cKM
ncHCC
cHCC
HCV fertőzés és claudin fehérje expresszió
NM - HCV neg KM
NM - HCV pos KM
HCV neg. KM - HCV pos KM
NM - HCV neg HCC
Nincs a vírusinfekció jelenlétével összefüggő nagy változás !
HCV neg KM - HCV neg HCC
NM - HCV pos HCC
HCV pos KM - HCV pos HCC
HCV neg HCC - HCV pos HCC
CLDN-1
CLDN-2
CLDN-3
CLDN-4
CLDN-7
1.93
1.07
1.20
1.64
3.49
NS
NS
NS
NS
NS
2.34*
1.21
1.30
2.36
5.69*
p=0.042
NS
NS
NS
p=0.0087
1.21
1.13
1.08
2.36
1.63
NS
NS
NS
NS
NS
4.52
-2.21*
1.35
-1.38*
2.93
NS
p=0.013
NS
p=0.004
NS
2.35
-2.36*
1.12
-2.25*
-1.19
NS
p=0.0009
NS
p=0.0023
NS
4.02*
-1.86*
1.25
NA
3.48
p=0.033
p=0.023
NS
1.72
-2.25*
-1.04
NS
p<0.0001
NS
-1.13
1.19
-1.08
NS
NS
NS
NS
NA
-1.63 NS
NA
1.19
NS
Következtetések Adataink arra utalnak, hogy a cirrhosis kialakulása során és a cirrhotikus májakban kifejlődő HCC-kben egyaránt megemelkedik a claudin-1 és -7 expressziója. A claudin expressziós mintázatnak a cirrhosis progressziójában
talált jellemző változása ellenére a HCV fertőzés nem gyakorolt direkt, szignifikáns hatást a claudin expresszióra. Mivel a HCV fertőzés nem változtatja meg nagymértékben a claudin expressziót, adataink szerint a HCV fertőzés indirekt módon, a cirrhosis indukcióján át vezet a claudin-1 és a claudin-7 emelkedett expressziójához. Ez a HCV fertőzés új hatásmechanizmusát veti fel, amennyiben a fertőzés következtében kialakuló cirrhosis a vírus hepatocytákba való bejutását hatékonyabbá teszi és ezáltal a fertőzés krónikussá válását segíti elő és egyben befolyásolhatja a carcinogenesist.
Köszönetnyilvánítás: Prof. Dr. Schaff Zsuzsa
Dr. Lotz Gabor Dr. Holczbauer Agnes Dr. Tátrai Péter
Dr. Kaposi-Novák Pál Dr. Batmunkh Enkhjargal Prof. Dr. Kupcsulik Péter Dr. Szíjártó Attila
A claudin fehérje expresszió expresszió kvantitatív és összehasonlító elemzése CLDN-1
CLDN-2
CLDN-3
CLDN-4
CLDN-7
w
1.28
1.11
1.08
1.55
2.11
w/o
1.09
1.11
1.06
NA
1.90
w
3.68*
1.22
1.57
3.00**
9.25**
w/o
2.84*
1.22
1.52
NA
8.45**
ncKM – cKM
w
2.86**
1.10
1.45
1.94*
4.38**
w/o
2.61**
1.10
1.44
NA
4.46*
NM – ncHCC
w
3.03
-2.20**
1.10
-2.20**
2.21
w/o
3.25
-2.20**
1.15
NA
2.78
ncKM – ncHCC
w
2.36
-2.44**
1.01
-3.40**
1.05
w/o
2.99
-2.43
1.09
NA
1.47
NM – cHCC
w
6.32**
-1.72*
1.65
NA
5.01**
w/o
6.77**
-1.72*
1.73
NA
6.29**
cKMcHCC
w
1.72
-2.10*
1.05
NA
-1.85*
w/o
2.39*
-2.09**
1.13
NA
-1.34
2.08*
1.28
1.50
NA
2.26*
NM – ncSL
NM – cSL
ncHCC cHCC
Immunostainings for claudins in normal and non-tumorous surrounding liver were quantified including and excluding portal tracts. Values represent the fold difference of stained area percentage in the underlined group compared to the other group. Negative values indicate decreased area positivity percentage in the underlined group. Groupwise comparison of stained area percentage was made by Mann-Whitney test. CLDN=claudin; w=calculated with portal tracts; w/o=calculated without portal tracts; NL=normal liver; ncSL= non-cirrhotic HCC surrounding liver; cSL=cirrhotic HCC surrounding liver; ncHCC=hepatocellular carcinoma with non-cirrhotic SL; cHCC=hepatocellular carcinoma with cirrhotic SL; NA=not applicable (due to no expression of CLDN-4 in NL and SL w/o portal tract and in cHCC); NS=not significant; *significant difference at the 0.05 level; **significant difference at the 0.01 level.
A claudin mRNS expresszió kvantitatív elemzése Values represent the fold change ratios of relative claudin gene expression in the underlined group compared to the other group. Relative gene expressions were calculated as 2-ΔCt (ΔCt=Ct of target gene minus the average Ct of GAPDH and beta-actin). Negative values indicate decreased claudin gene expression in the underlined group. Groupwise comparison of relative gene expression was made by MannWhitney test. CLDN=claudin; NL=normal liver; ncSL= non-cirrhotic HCC surrounding liver; cSL=cirrhotic HCC surrounding liver; ncHCC=hepatocellular carcinoma with noncirrhotic SL; cHCC=hepatocellular carcinoma with cirrhotic SL; p = significance; NS = not significant; *significant difference, p≤0.05.
NM – ncKM NM – cKM
ncKM – cKM NM – ncHCC
ncKMncHCC NM – cHCC
cKM- cHCC
ncHCC cHCC
CLDN-1
CLDN-2
CLDN3
CLDN-4
CLDN-7
1.07
-1.25
1.39
-4.67
1.22
NS
NS
NS
NS
NS
11.11
1.99
8.49
24.29*
3.11*
NS (0.059)!!
NS
NS
p=0.045
p=0.034
10.34*
2.47
6.11
113.33*
2.55*
p=0.020
NS
NS
p=0.004
p=0.012
-1.40
-2.37*
1.58
-1.27
1.67
NS
p=0.032
NS
NS
NS
-1.50
-1.90*
1.13
3.67
1.36
NS
p=0.002
NS
NS
NS
1.41
-2.84
1.32
-2.00
4.33*
NS
NS
NS
NS
p=0.018
-7.86
-5.64*
-6.42
-48.57*
1.39
NS
p=0.005
NS
p=0.013
NS
1.98*
-1.20
-1.19
-1.57
2.60*
p=0.027
NS
NS
NS
p=0.027
