Chromatografické metody základní rozdělení a instrumentace
PŘEHLED CHROMATOGRAFICKÝCH TECHNIK ============================================================== Mobilní Stacionární Chromatografická technika fáze fáze ============================================================== plyn kapalina plynová rozdělovací chromatografie (GLC) (plynová ch.) -----------------------------------------------------------------------------------GC tuhá látka plynová adsorpční chromatografie (GSC) -----------------------------------------------------------------------------------------------------------kapalina kapalina kapalinová rozdělovací chromatografie (LLC) (kapalinová ch.) gelová permeační chromatografie (GPC) LC ------------------------------------------------------------------------------------tuhá látka kapalinová adsorpční chromatografie (LSC) iontově výměnná chromatografie (IEC) ------------------------------------------------------------------------------------------------kapalina papírová rozdělovací chromatografie (PC) tenkovrstvá rozdělovací chromatografie (TLC) -----------------------------------------------------------------------------------tuhá látka tenkovrstvá adsorpční chromatografie (TLC) ==============================================================
Plynová chromatografie •separace organických látek s bodem varu do 400 °C •není vhodná k separaci biomakromolekul •detekce produktů enzymových reakcí
nosný plyn: inertní plyn – helium, argon, dusík, vodík kolony: nejčastěji kapilární – tloušťka vrstvy - 0,1 až 2,5 μm
vliv teploty na průběh GC a. při 45 °C b. při 145 °C c. od 30 °C do 180 °C
ADSORBENTY v GC aktivní uhlí, grafitizované uhlí - dělení plynů a lehkých uhlovodíků silikagel - dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin molekulová síta (krystalické hlinitokřemičitany) - dělení plynů a lehčích uhlovodíků
porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery), komerčně tzv. Porapaky dělení nízkomolekulárních uhlovodíků,anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů
KAPALNÉ STACIONÁRNÍ FÁZE v GC Carbowaxy (polyethylenglykoly) Ucony (polypropylenglykoly) - polární stacionární fáze, s rostoucí Mr klesá polarita
Polyestery
(např. polyethylenglykoladipáty, polypropylenglykoladipáty, polyethylenglykolsukcináty) - polární stacionární fáze
Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) - často používané, široký rozsah polarity
Detektory a) tepelně vodivostní detektor, TCD - univerzální, nedestruktivní, středně citlivý všechny látky lišící se tepelnou vodivostí od nosného plynu eluát
odporové vlákno
b) plamenový ionizační detektor, FID velmi citlivý, uhlovodíky
- selektivní, destruktivní
+ elektrody
zapalování
-
vzduch
vodík eluát
c) detektor elektronového záchytu, ECD - selektivní, nedestruktivní, středně citlivý, halogenderiváty (pesticidy) a nitroderiváty
+ anoda
zářič katoda
63 28 Ni
d) hmotnostní spektrometr, MS - vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý
eluát
Kapalinová chromatografie A. B. C. D.
A. sloupcová B. na tenké vrstvě
nízkotlaká střednětlaká (FPLC) vysokotlaká (HPLC) UPLC
Instrumentace • • • • • • • •
zásobník mobilní fáze pumpa mísič gradientu dávkovač kolona detektor vyhodnocování – zapisovač sběrač frakcí
1. QuadTec UV/Vis detector 2. SV5-4 select valve 3. BioLogic Maximizer mixer 4. AVR9-8 switching valves 5. BioLogic Maximizer buffer blending systém 6. pH monitor 7. F40 workstation 8. BioFrac fraction collector 9. AVR 7-3 sample inject valve 10. UNO Q1 column 11. BioLogic rack 12. BioLogic DuoFlow software 13. USB bitbus communicator 14. Dell controller
1. QuadTec UV/Vis detector 2. SV5-4 select valve 3. BioLogic Maximizer mixer 4. AVR9-8 switching valves 5. BioLogic Maximizer buffer blending systém 6. pH monitor 7. F40 workstation 8. BioFrac fraction collector 9. AVR 7-3 sample inject valve 10. UNO Q1 column 11. BioLogic rack 12. BioLogic DuoFlow software 13. USB bitbus communicator 14. Dell controller
Mobilní fáze
požadavky na mobilní fázi: •vhodné složení •čistota •odvzdušnění ¾zahřátím ¾vakuové odsátí ¾ultrazvuk ¾inertní plyn (Ar, He)
Čerpadla •gravitace, spojené nádoby •pneumatická čerpadla •peristaltická čerpadla •pístová čerpadla
UPLC • tlak ~100 MPa • složitější pístová čerpadla HPLC • tlak ~40 MPa • složitější pístová čerpadla FPLC • tlak až 25 MPa • peristaltická nebo pístová čerpadla nízkotlaká chromatografie • tlak menší než 0,1 MPa • peristaltická čerpadla • gravitační tok
pneumatické čerpadlo výhody:
jednoduchá a levná konstrukce
nevýhoda:
může docházet k rozpuštění plynu v kapalině nízký tlak – 0,1 – 8 ml/min
peristaltické čerpadlo výhody:
jednoduchá konstrukce možnost pracovat sterilně nedochází ke styku MF s kovem
nevýhoda:
nízký tlak – 0,1 – 8 ml/min tlakové rázy
pístové čerpadlo
dvojpístové čerpadlo
dva ventily – sací, výtlačný výhody:
malý vnitřní objem dávkovače vyšší pracovní tlak
nevýhoda:
tlakové rázy
Tlumení tlakových pulsů •zařazení dalšího čerpadla pracujícího v opačné fázi •možnost použití více čerpacích hlav s koordinovaným sáním a výtlakem •často se používají čerpadla s programovaným pohybem pístu
Gradientový mixér skokový spojitý
vodivost
vodivost 0
0
0
0 0
vodivost
lineární konvexní konkávní
vodivost
gradient
V [ml]
možno kombinovat obecně: nejdříve lineární
0
0
0 V [ml]
V [ml]
V [ml]
gradientové mixery
!!! u gradientu pH – smíchat 2 pufry – není lineární závislost !!!
Dávkovače přímo na kolonu = pipeta, stříkačka pomocí pumpy nástřikový ventil
Kolony •analytické •preparativní
•připravené •komerční
materiál – inertní, nereaguje se složkami vzorku (skleněné, kovové, plastové)
Nosič •nerozpustný v H2O •pórovitý •minimální nespecifická sorpce •pevnost, vhodný tvar částic •chemicky a mechanicky stabilní •levný
•celulosa + její deriváty •polyakrylamid •agarosa •dextrany •silikagely
•objem kolony •rozměry •vazebná kapacita – kolik mg proteinu se naváže na ml kolony •velikost částic •maximální tlak a průtok •chemická stabilita •pH stabilita •teplotní stabilita •skladovací podmínky
Chromatografické metody pro separaci proteinů
+ -
+
+
+
+
+ +
+
-
-
+ +
+
+ Ion exchange
Reverse phase / hydrophobic interaction
Size exclusion
Affinity
HPLC 1 2 3 4 5 6
kovový plášť porézní kovová frita stacionární fáze převlečný ochranný kroužek koncová hlavice vstup pro kapiláru se šroubem
www.hplc.cz, www.waters.com
Silikagely •nejrozšířenější polární sorbent •široké komerční využití •lze připravit ve velmi čisté formě •velkým specifický povrch (100 až 150 m2/g) •velkým objemem pórů (0,7 ml/g) •střední průměr pórů je asi 8-15 nm •nejčastější velikost náplně 3, 5 a 10 µm
www.hplc.cz, www.waters.com
Oxid hlinitý •specifický povrch 100 až 200 m2/g •objemem pórů 0,2 až 0,3 ml/g •průměr pórů 10 až 20 nm •aktivuje se při teplotě mezi 500 a 800 °C •interakce s molekulami bohatými na elektrony
Aminopropyl •vyšší retence •lze dobře substituovat •retence látek kyselé povahy •vysoká reaktivita
www.hplc.cz, www.waters.com
Chemicky vázané nepolární stacionární fáze •vhodné pro separaci nasycených a nenasycených sloučenin
www.hplc.cz, www.waters.com
UPLC technologie "Hybrid (Silicon-Carbon) Particle Technology"
www.hplc.cz, www.waters.com
UPLC kolony
UPLC x HPLC •kratší doba analýzy = vyšší průchodnost vzorků (vyšší produktivita) •snížení nákladů (menší spotřeba HPLC rozpouštědel) •zvýšení separační účinnosti •snížení meze detekce - zvýšení citlivosti •více kvalitativních informací
www.hplc.cz, www.waters.com
Detektory monitoruje složení eluátu, zaznamenává ho graficky - gromatogram •detektor musí poskytovat odezvu dostatečně rychle •detektor může být univerzální nebo selektivní •univerzální detektor reaguje na vlastnosti systému jako celku (refraktometrický) •selektivní detektor reaguje na určitou selektivní vlastnost analytu (fluorescenční) •detektor může být destruktivní (AAS, AES) nebo nedestruktivní (UV/VIS) •detektory lze vhodně kombinovat (vícenásobná detekce) •detektor by měl mít co nejmenší vnitřní objem
Charekteristiky detektoru vysokofrekvenční šum (krátkodobý) – náhlá změna signálu nízkofrekvenční šum (dlouhodobý) – chvění kolem nulové linie (baseline) posun nulové (základní) linie (drift) – kontinuální stoupání nebo klesání „baseline“ detekční limit – nejmenší pás (pík), který může být ještě považován za pás S/N≥3 limit kvantifikace – nejmenší pás, jehož plocha může být změřena s požadovanou přesností S/N≥10 S šum (N)
drift
0 0
reprodukovatelnost odezvy detektoru – směrodatná odchylka odezvy na stále stejnou koncentraci analytu při opakovaném měření linearita odezvy detektoru – oblast koncentrací, kdy je odezva přímo úměrná koncentraci analytu ještě použitelná odezva
oblast lineární oblast
0 0
předávkování
ΔR = citlivost detektoru ΔC
koncentrace analytu
UV/Vis detekce • pevná vlnová délka - standardní monochromatický spektrofotometr, vlnová délka se mění otočením hranolu nebo mřížky, v daném okamžiku pouze jedna vlnová délka, deuteriová lampa
• měnitelná vlnová délka • kontinuální sledování celého spektra UV i Vis: a) několik standardních spektrofotometrů za sebou b) DAD - Diode Array detektor – simultánní měření celé oblasti, data okamžitě, možnost tvorby 3D chromatogramu
Fluorescenční detektor •velice citlivý selektivní detektor •použitelný pouze pro látky přímo floreskující nebo fluoreskující po derivatizaci •mobilní fáze nesmí obsahovat zhášeč fluorescence •zdroj excitace prochází průtokovou celou do fotodetektoru, měříme vlnovou délku emitovaného světla ve směru kolmém k paprsku primárního záření •citlivost 10-9 až 10-11 g/ml Využití fluorescenční detekce
•DNA/RNA •fluoreskující látky – drogy, hormony, vitamíny, …
Refraktometr •měření indexu lomu – diferencíální – porovnání analytu a rozpouštědla •nelze použít při gradientové eluci •spolehlivý, málo ovlivnitelný průtokem mobilní fáze •použitelný na téměř všechna rozpouštědla •málo citlivý k nečistotám a vzduchovým bublinám •citlivý na teplotu – mění se index lomu + termostat +/- 0,001 °C •citlivost detektoru je až o tři řády nižší než UV/Vis •drahý
výchylkový refraktometr
Konduktometr •měření vodivosti •jednoduchý, neselektivní a universální •ionexová chromatografie •při analýzách v průběhu zpracování vody
Ampérometrický detektor •nejobvyklejší druh elektrochemického detektoru •měření limitních proudů •velmi citlivý
Odpařovací „light-scattering“ detector (ELSD)
•nespecifický •kompatibilní s gradientem •teplotně nezávislý
Hmotnostní spektrometr •spojení MS s HPLC •HPLC separace se provádí za vysokých tlaků, MS měření v hlubokém vakuu – nutný převodník
Derivatizace •zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec •zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec •zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně
Požadavky na deriváty chemické individuum stabilní reakce kvantitativní rychlá selektivní bez vedlejších produktů za mírných reakčních podmínek (pH, teplota) činidlo musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně jiné fyzikálně-chemické vlastnosti
Derivatizační činidla •5-N,N´-dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid (Dns-Cl) •ninhydrin •enacylbromid •naftacylbromid •acylchloridy •reakce s fenyisothiokyanátem •2,4-dinitrofenylhydrazin(DNPH) •p-nitrobenzylhydroxylamin (NBHA) O OH
2
OH
COOH R CH NH2
+
O
Ruhemannuv purpur O
O
+
N ONH4
O
R
CHO
+
CO2
Vznik elučního pásu (píku) kolona
příčina: •thermodynamická – porušování a ustanovování rovnováhy •kinetická – všechny ostatní děje (průtok MF, difuse…) KOLONA
Teoretické patro
teoretické patro
2
počet teoretických pater výška teoretického patra
2 ⎛ Vr ⎞ Vr ⎞ ⎛ ⎟ = 16.⎜ ⎟ N = 5,55.⎜⎜ ⎟ ⎝w⎠ ⎝ w0,5 ⎠ H=L/N
Difusní teorie 1. difuse molekul mezi mobilní a stacionární fází - přenos hmot
H
velikost částic náplně kolony
velké
molekulová hmotnost
vysoká nízká
malé
průtok
2. difuse molekul podél kolony – malé molekuly difundují rychleji než velké
H malé molekuly velké molekuly
průtok
3. vířivá difuse – závisí na velikosti a homogenitě náplně kolony
H nehomogenní homogenní
průtok
•čím je větší molekulová hmotnost, tím nižší je optimální průtok •čím menší jsou částice náplně, tím ostřejší jsou píky
van Deemterova rovnice
H=A+B/μ+ C.μ
A – vířivá difuse A=λ.dp B – podélná difuse B=γ.DM C – odpor vůči přenosu hmoty ~dp2, 1/DM μ – lineární rychlost
Dělení více látek Vr2 − Vr1 R1, 2 = 0,5.(wb 2 + wb1 )
Co ovlivňuje rozlišení? faktor selektivity
R1,2 = Fselektivity . Fkapacity . Fúčinnosti
lze ovlivnit: změnou stacionární fáze, změnou mobilní fáze, současnou změnou obou fází, změnou rychlosti toku mobilní fáze
faktor kapacity - hodnota retence separované složky k = KD . Vs/Vm
lze ovlivnit: množstvím stacionární fáze v koloně, změnou stacionární nebo mobilní fáze změnou teploty kolony faktor účinnosti - ~ N lze ovlivnit: délkou kolony, rychlostí průtoku mobilní fáze, velikostí částic sorbentu, teplotou, viskozitou mobilní i stacionární fáze apod.
Rs<1- nedokonalá separace, Rs = 1- u sebe, Rs >1- dobrá separace
cS KD = cM cs – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi
Distribuční koeficient
Vyhodnocování chromatogramu 1. MANUÁLNÍ
•stříhání a vážení – co nejmenší chyba – co největší chromatogram (chyba 2 %) •planimetrie – plocha pásu je úměrná obrysu (chyba 4 %) •čtvercová síť – plocha plných čtverců + odhad zbytku (chyba 3 %) 2. INTEGRÁTORY (integrační software)
------------------------------------------------------------Peak RT(min) Height Area W1/2 -----------------------------------------------------------1 5.723 1.957 8.827 0.023 2 12.561 5.457 96.121 0.048 3 15.887 2.827 73.266 0.073 4 22.975 0.773 6.001 0.102 -----------------------------------------------------------
•vzorek je rozpuštěn v prostředí o vyšší iontové síle než mobilní fáze •špatná rozpustnost v mobilní fázi •kanálky ve stacionární fázi •sedlá náplň kolony •nespecifické interakce •silná retence vzorku •přetížení kolony •snížit nástřik •poškozená kolona •nečistoty v koloně
•nerozdělené píky •kanálky v koloně •nečistoty na koloně •nástřik ve dvou podílech
Pufry ~ pH pufru se po přidání silné kyseliny nebo zásady mění jen málo ~ směsi slabých kyselin a jejich solí nebo směsi slabých bazí a jejich solí pufrační kapacita - množství jednosytné silné kyseliny, kterou je třeba přidat k roztoku, aby pH kleslo o jednotku
pro slabou kyselinu platí:
pH ≈
pro slabou zásadu platí:
pH ≈ pK W − 1 2 pK B + 1 2 log c
1
2
pK A − 1 2 log c
Jak vypočítat pH pufru??? Přídavek silné kyseliny do pufru (A- + HA)
A − + H3O + ⇔ HA + H2O Přídavek silné zásady do pufru (A- + HA)
HA + OH− ⇔ A - + H2O Hendersonova-Hasselbalchova rovnice [A − ] pH = pK A + log [HA ]
Výpocet pH slabé kyseliny Jaké je pH 0,1 M CH3COOH (KA=1,8.10-5)?
Příklady:
Jaké je pH roztoku, který je připraven z 250 ml 1 M kys. octové a z 250 ml 1,6 M octanu sodného? Hodnota KA kyseliny octové je 1,8.10-5.
Jaký poměr mravenčanu sodného a kyseliny mravenčí je nutný pro přípravu pufru o pH 3,85? Hodnota KA pro kyselinu mravenčí je 1,8.10-4.
Příklady pufrů Nejpoužívanější pufry: acetátový, fosfátový, citrátový, Tris (tris(hydroxymethyl)methylamin) Název
pH rozsah
pKA(25oC)
Acetátový MES fosfátový Bis-Tris PIPES MOPS TES HEPES Trizma TEA EPPS Tricine Gly-Gly Tris/HCl Bicine CHES
3,8-5,8 5,5-6,7 5,7-8,0 5,8-7,2 6,1-7,5 6,5-7,9 6,8-8,2 6,8-8,2 7,0-9,0 7,3-8,3 7,3-8,7 7,4-8,8 7,5-8,9 7,5-9,0 7,6-9,0 8,6-10,0
4,76 6,10 7,20 6,50 6,76 7,20 7,40 7,48 8,06 7,80 8,00 8,05 8,20 8,06 8,26 9,49
0,2 M fosfátový pufr Na2HPO4
NaH2PO4.7H2O
Na2HPO4
NaH2PO4.7H2O
g/l
23°C
g/l
23°C
22,4
3,49
5,7
10,80
29,51
6,9
22,08
4,29
5,8
9,36
32,73
7,0
21,60
5,37
5,9
7,92
35,95
7,1
21,05
6,60
6,0
6,72
38,63
7,2
20,40
8,05
6,1
5,52
41,31
7,3
19,56
9,93
6,2
4,56
43,46
7,4
18,60
12,07
6,3
3,84
45,07
7,5
17,64
14,22
6,4
3,12
46,68
7,6
16,44
16,90
6,5
2,52
48,55
7,7
15,00
20,12
6,6
2,04
49,09
7,8
13,56
23,34
6,7
1,68
49,89
7,9
12,24
26,29
6,8
1,27
50,81
8,0
g/l
pH
g/l
pH
Britton-Robinsonův pufr pH 2 až pH 12
0,04 M H3BO3 0,04 M H3PO4 0,04 M CH3COOH 1:1:1 na požadované pH upraveno pomocí NaOH Složení:
Britton-Robinson McIlvain fosfátový pufr Tris/HCl
0,5
A 420 nm
0,4 0,3 0,2 0,1 0 2
3
4
5
6
pH
7
8
9
10
Co je obsahem statní zkoušky “Biochemické techniky“? 1. 2. 3. 4. 5.
Enzymy jako analytická činidla ve volné a imobilizované formě. Enzymové metody stanovení analytů. Metody stanovení substrátů, aktivátorů a inhibitorů enzymových reakcí. Enzymové a buněčné biosenzory. Protilátkové elektrody. Využití enzymových metod v klinických laboratořích, při hodnocení potravin a potravinářských surovin a jako obecných analytických metod. 6. Bioanalytické metody využívající radionuklidy. 7. Princip imunochemických metod, protilátky, antigeny, imunoprecipitační metody a jejich využití v praxi. 8. Citlivé imunochemické techniky (ELISA, RIA). 9. PCR techniky, Biočipy 10. Další techniky využívající afinitních vztahů: afinitní precipitace, afinitní ultrafiltrace, afinitní eluce, afinitní elektroforesa, dělení mezi dvě fáze za přítomnosti afinitního ligandu. 11. Elektroforetické metody: PAGE, SDS, imunoelektroforesa. Princip kapilární elektroforesy. 12. MALDI 13. Bioluminiscenční metody. 14. Biologické a mikrobiologické metody v analytice. 15. Chromatografické metody 16. Membránové procesy 17. Hydrofobní chromatografie a chromatografie na reversní fázi 18. Bioafinitní chromatografie. Princip, teorie, experimentální technika. Nespecifická afinitní chromatografie a možnosti jejího využití.
