Chip-technológia bioinformatikai szemmel I. SZE Bioinformatika

Chip-technológia bioinformatikai szemmel I. SZE Bioinformatika 2010.11.10. MTA SZBK Funkc. Genomika Laboratórium www.szbk.hu/~chiplab

Funkcionálsi Genomika Labor MTA SZBK

Kromoszómák genetikai állomány hordozói

sejt

DNS

Gének információ hordozók

mRNS AAAAAA AAAAAA AAAAAA

Fehérjék sejtfunkciók ellátása

Molekuláris kapcsolók és hálózatok: a rendszerbiológia elemei

JELÁTALAKÍTÁS

KAPCSOLÁS

RNA

JELTOVÁBBÍTÁS

Kulcsszavak: kapcsolók

Molekuláris kapcsolók és hálózatok: a rendszerbiológia elemei

Moduláris egység: együttes expresszió

Transzkripció szintű szabályozás

RNS szintű szabályozás

Kulcsszavak: kapcsolók és modulok

Génhálózatok, skála-független tulajdonság, redundancia és érzékenység

Sejthálózatok és génhálózatok, kapcsolatok és jelek

Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések

Rendszerbiológia biológia lényege szövet, szerv szint

T G

daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek

P Minőségi és mennyiségi változások

funkciók felderítése G

T P

sejt szint

sejtosztódás, differenciáció, sejthalál

Environmental stimuli, treatments, infections

P

P

G

P P

P

T AAAAA

P

P

analysis of active genes AAAAA

T

AAAAA

AAAAA

G

monitor quantitative and qualitative alterations

Funkcionális genomika lényege

Az 1990-es években egy forradalmian új technika, fejlődött ki a gén és fehérje funkciók analízisére.

Csip-technológia A biocsipek nagyszámú (több ezer) cDNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek A biocsipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Mire alkalmasak a chipek? G

AAAAA

Genom Mutációk, Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció, Genom amplifikációk

AAAAA

DNS-chipek

mRNS

T Transzkriptom Gén kifejeződés megváltozása, Splice variánsok azonosítása

miRNS

Fehérjék

Kis szabályozó RNS-ek kifejeződése

P Proteom Kifejeződés, módosítások, kölcsönhatások

Fehérje-chipek DNA-chip Lab.BRC, Szeged

AAAAA AAAAA

Minta

Microarray technológiák a funkcionális genomikában

Szubcelluláris

DNS, RNS

Sejtek

Szervek

Fehérjék

Organizmusok

Sejtek

Microarray

Célmolekula

Fragmentek

Genomika

Proteomika

Citomika

Közösségek

Szövetek

A DNS-csip technológia komplementer nukleinsavláncok hibridizációján alapul

Radioaktív génspecifikus próba

Dot-blot technika

Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve

A pozitív RNS minták jelölődnek

Hibridizáció

Teljes RNS jelölése

Reverz dot-blot technika

Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz

Hibridizáció

DNS-chip technika DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Pozitív génspecifikus minták jelölődnek

Hibridizálás

100-20,000 Génspecifikus minta

A csipek hordozó szerinti osztályozása

macroarray

microarray

chip

•nylon membránon néhány 100 génspecifikus minta (DNS darab) •radioaktív jelölés •kis minta sűrűség (100-1000 pont/cm2)

•üveglemezen több 10.000-500.000 génspecifikus minta (DNS darab) •fluoreszcens jelölés •közepes mintasűrűség (5000 pont/cm2) •üveglemezen több 500.000-2.000.000 génspecifikus minta (DNS darab) •fluoreszcens jelölés •nagy minta sűrűség (10.000pont/cm2)

Egy csipkísérlet általános lépései cDNS klón és/vagy DNS szekvencia

biológiai minta szövetből, sejtkultúrából

nyomtatás Makroarray

Mikroarray

Chip RNS, DNS, fehérje

Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás jelölt minta

néhány 100, vagy több 1.000, 100.000 gén, fehérje

X

adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó információk értékelése

DNS-chipek/DNS-microarrayek készítése

Laboratory of Functional Genomics.BRC, Szeged

Nyomtatótű a MicroArrayer robothoz

100 micron 180 micron spot 65 nL 1nL/spot

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

DNS-chipek minőségellenőrzése

Human-I Mouse-I Rat-I DNS-chip


Oligonukleotid alapú chip készítése in situ szintézis

CHIPKÉSZÍTÉS

Affymetrix


“Maskless” arrays (Nimblegen)

http://www.nimblegen.com/technology/manufacture.html

Alternative Technologies to Develop High Density Oligonucleotide Microarrays

inkjet-printed microarrays (e.g. Agilent)

maskless array synthesizer (e.g. Nimblegen)

DLP projectors *DLP technology was developed by Texas Instruments.

*The technology uses tiny micro mirrors mounted on a computer chip. *The mirrors tilt slightly at speeds as fast as 7,000 times per second, to allow varying shades of light to be reflected. *Color is generated by a color wheel divided in to the 3 primary colors spinning at ultra high speeds. www.projectionlogic.com

Pictures from Wikipedia

Probe length: range of 60mers(50 - 75mer (ChIP-chip) 60mer (CGH) Probe Tm: kept constant by modifying the lenghts

Probe density: 2.1 million probes/array (2*108bp with a 100bp resolution) Always the current annotation used!

Génkifejeződés tanulmányozása – cDNS vagy oligonukleotid chip – transzkriptom analízise – aktív-inaktív gének detektálása – bonyolult adat és statisztikai analízis aktív gének vizsgálata

Jelölt cDNS

hibridizáció

AAAAA AAAAA AAAAA

mosás

AAAAA

mRNS

biológiai anyag


detektálás

Adat analízis: •relatív aktivitás mérése •a színessel jelölt gének aktívak •a feketék nem

Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet

beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet

RNS tisztítás Cy5 dCTP

jelölt cDNS


cDNS írás RNS-ből (reverz transzkripció)

Hibridizáció, mosás Szkennelés

Cy3 dCTP

jelölt cDNS

DNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata

RNS cDNS cDNS-chip 4000 különböző Arabidopsis génmintát tartalmaz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Két színnel történő jelölési technika DNS-chip kísérletben kontrol

beteg

szövet/sejt extrakció

RNS extrakció adatanalízis jelölt cDNS szintézis hibridizálás

adatfeldolgozás

Pozitív klónok SZEKVENÁLÁSA

cDNS könyvtárak, klónok Egyedi PCR amplifikátumok

Klón név, méret, -pozíció

Expressziós KISÉRLETEK Képek, adatok

Gélelektroforézis, géldokumentáció Új klónok névjegyzéke

Átrendezés DNA-chip Laboratory, BRC., Szeged

384-es lemezek

CARP Gene database & bioinformatics tools for microarray selection acgctcgactacgactactactgactacgact acgactcacgctcgacgactacgactagcat cagcatcgactccgcgcacatcagctactatt CarpBase: over 15.000 expressed sequence tags (ESTs) ctactgacgagctacgcgcagcagcggagc atctactactctgacgagctattcagctactcta NCBI: over 10.000 uncurated sequences

Probe Design

homology search Blast

15.000 gene-specific oligonucleotide sequences

sequence comparisons

DNA-microarray construction

EST contig construction

15.000 cured ESTs, functional groups, gene families, annotation

Carp DNA-microarray format

Analysis of 8 carps in 1 microarray experiment 15.000 gene analysis each

Gene expression study of carps in response to different diets And stress conditions Hypoxia stress Selenium deficiency

Confinement stress Sample collection (gill, blood, liver) RNA preservation transportation RNA preparation cDNA conversion (banking for future studies) DNA-microarray HTS-QRT-PCR Laboratory of Functional Genomics.BRC, HAKI, Szarvas

Lézer szkenner Cy5

beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet

Cy5 dCTP

jelölt cDNS

Képanalízis

Lézer szkenner Cy3

kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet

Cy3 dCTP

jelölt cDNS

Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata Mycobacterium tuberculosis-ban cDNS-chip technikával 1. cDNS-chip készítése

2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból

Kezeletlen, kontroll baktériumok 3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a) PCR génspecifikus primerekkel, tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevont mikroszkóplemezekre robot segítségével

4. Adatfeldolgozás

Isoniaziddal kezelt baktériumok

RNS izoláció, jelölt cDNS készítése Cy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával Reverz transzkripció reakcióban.

3. Hibridizáció

EREDMÉNYEK:

- Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt. - további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt - egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték

PNAS (1999) 96, 12833-12838

Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel.

N-3 politelítetlen zsírsavakat tartalmazó diéta hatásának vizsgálata cDNS-chip technológiával halolajjal etetett

kontroll

Génexpressziós változások szinaptikus plaszticitás citoszkeleton

jelátviteli folyamatok energia metabolizmus membrán asszociáció ioncsatorna képzés

RNS cDNS

patkány cDNS-chip 3200 génspecifikus minta 6400 mintapont

transzkripciós faktorok Pozitív hatás a mentális funkciókra, Tanulás, memória

in old rat hippocampus

there are a few clones exhibiting changes one clone induced dramatically Puskás, L.G., Kitajka, K., et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1580-1585.

Laboratory of Functional Genomics.BRC, Szeged

DNS-chipek képelemzése

Ábrázolási módszerek 2. log2 arány

B

4 transthyretin

log2(ratio)

3 2 1 0 -1 -2 0

500

1000

1500

2000

Spot label

2500

3000

3500

Adatfeldolgozás, statisztikai analízis R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk) R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1))) R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF) R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x, IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2, (RMN1Rep+RMN1x)/2,"")))) R1 0.9296 1.035 1.574 1.21 0.5451 1.049 0.9534 1.1457 0.9712 1.3814 1.1676 1.1205 1.1963 0.8856 1.1279 1.352 0.953 1.2679 1.1082

R1M R1MN R1MNA MRATM MRATMNMRATMNA Plate code Clone name Accesion No 0.9296 0.6942 1.038 0.7769 0.75441617 MO7/2 W36984 MO7/3 W36520 1.574 1.1755 1.2588 1.357 1.0157 1.12949102 MO7/5 Mouse s-adenosylmethionine synthetase W29782 mRNA 1.21 0.9037 0.927 1.227 0.9184 0.93787425 MO7/6 W14960 0.5451 0.4071 0.4337 0.5814 0.4352 0.47144461 MO7/7 W17570 1.049 0.7834 0.7928 1.107 0.8286 0.82148204 MO7/8 W14332 0.9534 0.712 0.866 0.9839 0.7365 0.86148952 MO7/11 W07874 1.1457 0.8557 0.8842 1.163 0.8705 0.87050898 MO7/13 W08720 0.9712 0.7253 0.7543 0.969 0.7253 0.75449102 MO7/14 EST W18366 1.3814 1.0317 0.921 1.409 1.0546 0.95247006 MO7/15 W07997 MO7/16 W18521 1.1205 0.8369 0.8544 1.098 0.8219 0.84618263 MO7/17 ESTs, Highly similar to GLYCOGEN PHOSPHORYL W18457 1.1963 0.8935 0.8628 1.199 0.8975 0.88398204 MO7/18 W15566 0.8856 0.6614 0.7541 0.8721 0.6528 0.73731287 MO7/19 W33809 1.1279 0.8423 0.7949 1.163 0.8705 0.83083832 MO7/20 W16187 1.352 1.0097 0.9327 1.329 0.9948 0.93263473 MO7/21 AA052395 0.953 0.7117 0.7797 1.004 0.7515 0.79491018 MO7/22 TALIN W17813 1.2679 0.9469 0.9844 1.246 0.9326 0.95583832 MO7/23 Pale ear W29855 1.1082 0.8276 0.806 1.163 0.8705 0.80827096 MO7/24 W17959

Génexpressziós arányok Corynebacterium glutamicum-ban aerob és anaerob körülmények között Malate/lactate Phosphoenolpyruvate Corrected (1000) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase carboxylase permease transcriptional dehydrogenase Methionine Starvation-inducible regulator synthase_II DNA-binding_protein

7

5,6

log2 ratio

4,2 2,8 1,4 0

-1,4 -2,8 -4,2 0 NADH dehydrogenase

500

1000

1500

2000

2500

F0F1-type_ATP sensory histidine synthase ribosomal protein kinase Myo-inositol-1L16, S19 -phosphate synthase

3000 ABC-type transporter

3500

4000

Acetyl-CoA hydrolase


-4x

-4x +4x

-4x -4x

-2x


Génexpressziós változások Ac915-tel kezelt KO-egér májkarcinómában

Tumorigenesis: DEN, 15 naposan egyszeri 50 ul-es kezelés, 4 hónap normál táp

Kezeletlen kontroll

Kezeletlen

Egészséges szövet izolálás

Ac915 kezelés: Tumor izolálás

Egészséges szövet izolálás

Funkcionális elemzés Ac-915 tumor / induced tumor

•DAVID bioinformatics •WEB alapú rendszer •Input: gén lista •Funkcionális “csoportok” (GO terms, pathways, tissue expression pattern etc.) •Géncsoportosítás azonos funkció szerint •Szingnifikancia analízis, p-value

Overexpresszált gének. Ac-915 tumor / induced tumor

Cyp2c54 Cyp2j9 Cyp2e1 Cyp2c55 Cyp2c37 Ptgs1 Cyp4a12b

cytochrome p450 cytochrome p450, family 2, subfamily j, polypeptide 9 cytochrome p450, family 2, subfamily e, polypeptide 1 cytochrome p450, family 2, subfamily c, polypeptide 55 cytochrome p450, family 2. subfamily c, polypeptide 37 prostaglandin-endoperoxide synthase 1 cdna sequence bc060945

Represszált gének. Ac-915 tumor / induced tumor

Term GO:0007010~cytoskeleton organization and biogenesis

28

Genes Myh11, Arhgef11, Myo7a, Epb4.1l2, Dlg1, Arpc2, Tagln, Trpm7, Tubd1, Snap23, Rdx, Ndel1, Birc5, Actg2, Krt1, Ppp4c, Pfn2, Tbce, 7.31% 1.17E-05 Wasl, Lcp1, Tubb4, Cenpj, Vill, Tuba1a, Fmn1, Capn3, Dnaic1, Rhoq,

GO:0015630~microtubule cytoskeleton

16

4.18%

GO:0007049~cell cycle

29

Gadd45a, Rras, Dlg1, Ncapd2, Cdca3, Anxa1, Cdc2a, Birc5, Brca1, Psmd13, Npm1, Tgfa, Rbm7, Jun, Pcnp, Btg3, Cetn3, Tsc2, Mns1, 7.57% 9.93E-04 Ccna2, Maff, Nek2, Cdkn2c, Cenpf, Ddit3 (DNA-damage inducible transcript 3), Txnip, Ccnb1, Ube2c, Pttg1,

GO:0000278~mitotic cell cycle

14

3.66%

Btg3, Cetn3, Dlg1, Ccna2, Nek2, Ncapd2, Cenpf, Cdca3, Cdc2a, Birc5, 0.00237 Ccnb1, Ube2c, Tgfa, Pttg1,

GO:0051301~cell division

11

2.87%

Arhgef11, Cetn3, Birc5, Ccnb1, Ccna2, Nek2, Ube2c, Ncapd2, Cdca3 0.02743 (cell division cycle associated 3), Pttg1, Cdc2a,

5.48%

Arhgef11, Ing2, Tsc2, Wasl, Tubb4, Myo7a, Egfr, Epb4.1l2, Dlg1, 0.00541 Igfbp4, Ctnna1, Rdx, Ndel1, Alcam, Brms1l, Igfbp7, Rhoq, Cdc42se1, Tbce, Btg1, Pak2,

GO:0000902~cell morphogenesis

Count

21

%

PValue

Cetn3, Dynlt3, Tubb4, Cenpj, Nek2, Akap9, Cenpf, Tubd1, Tuba1a, 0.00664 Cdc2a, Ndel1, Birc5, Brca1, Npm1, Dnaic1, Ppp4c,

Pla2g4a, Snapin, Myo7a, Egfr, Snap23, Tff3, Pdpk1, Rab7, Sec23ip,

Genomi átrendeződések és változások vizsgálata csiptechnikával

-16 02 q13

06 q27

Xp11.3-p11.23

22 q13.1

21 q22.1

20 q13.33

20 q11.22

19 q13.43

19 q13.4

19 q13.4

19 q13.12

19 p13.2

19 p13.2

18 q21.3

18 p11.1-q11.2

17 p13

17 p13

16 q23.1

14 q24-q31

13 q32.2

12 q

12 p13

11q23

10 p11.2

09 q32-q33.3

09 q21.2

09 p13

09 p12-13.3

08 q21.2-q21.3

08 p23

07 p21.3

07 p15.3-7p14

Tüdő génarány

06 p21.31

06 p21.3

04 p16.3

03 q21.1-q21.2

03 q

03 p21.3

03 p21.1-9

02 q34-q35

normál

02 p13-p12

01 q31-q32

01 q24-q25

-11

01 q21.3

01 q21.2-22

01 q21.1

01 q21

01 p36.31

01 p34.2

01 p33-34.2

01 p13-p21

01 p12-13.3

Genomszintű változások, kromoszóma rendellenességek, amplifikációk, deléciók detektálása

Paraffinba ágyazott minták daganat

DNS

PCR

Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása

9

Génátrendeződési arányok

4

-1

-6

agy génarány

Log2 ratio

CGH nagyfelbontású (385K) teljes genom array-vel

Nő vs. férfi gDNS Chromosomes 1-22, X, Y

Log2 ratio

1 and 2 copy gains

Pajzsmirigy tumor

Szabályozóelemek, transzkripciós kötőhelyek azonosítása ChIP (kromatin immunprecipitációval) és DNS-chip hibridizációval

DNS-fehérje kölcsönhatás igazolása

DNS-chip hibridizálás

Pontmutációk (SNP) detektálása

hibridizáció mosás

CCATGG GCTACC Vad típus

Vad típus DNS

2. SNP 2 pozíció

Jelölt DNS

1. SNP 3 pozíció

•Oligonukleotid alapú chipek •egy nukleotid eltérés azonosítása

A G T C A G T C

CCCTGG GTTACC


Mutáns

Mutáns

1. SNP

2. SNP

detektálás

Adat analízis 1. SNP: 3. pozíció A-C 2. SNP: 2. pozíció C-T

Mutációk, SNP-k detektálása oligonukleotid chipekkel Vad típus, teljes komplementer

Mutáns, nukleotid eltérés

mosás

Detektálás

+ DNA-chip Lab.BRC, Szeged

-


1 mutáció 2 mutáció

CypTC CypHH19 CypHH17 CypSS

CypTC CypHH19 CypHH17 CypSS

CypHH19b CypHH17b CypSSb

CypTCb CypHH19b CypHH17b CypSSb

Komplementer

CypTCb

Mutációk detektálásának specificitása 3 mutáció

Nagysűrűségű oligonukleotid alapú DNS-chipek


DNS-chip technika korlátai Oligonukleotid chipek, mutáció, SNP analízis: - minta felsokszorozása, multiplex PCR - kis mintaszámnál költségek - csak ismert szekvenciákra alkalmazható cDNS-chipek, génexpresszió-vizsgálatok:

- eredmények megbízhatósága kb. 60-80% homológ szakaszok kereszthibridizációja, torz normalizáció, jelölési technikák hibája, szélsőségesen kis és nagy intenzitású adatok (háttér-telítődés) miatt.

DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

Egyedi genomi eltérések detektálása?

Újgenerációs szekvenálási stratégiák

Szekvenálás DNS-chip technológiával

NNNNNNNNNN 4N variáció

8nt: 65.536 12nt: 16.777.216

Problémák

- Kódvisszafejtés nem mindig egyértelmű - Ismétlődő szakaszok problematikája - Hibridizáció miatti hibák

Új generációs szekvenálási módszerek SOLID (Applera) Sequencing by oligonucleotide ligation detection

70.000.000 adatpont/reakció Egyedi molekulák felsokszorozása gyöngyökön, emulziós PCR-ral LIGÁLÁS - HIBRIDIZÁLÁS CGTCGCGCACTGTGCAA GCAGCGCG GACACGTT

Átfogó fehérjekifejeződés és fehérjemódosítások vizsgálata fehérjecsip technikával

Protein microarrays on epoxide surfaces

for direct labeling and analysis of total protein extracts on traditional epoxide glass surface resulted in high background, low specificity, low sensitivity

Solution: use of secondary antibodies and strong blocking buffers

HAS, BRC, Laboratory of Functional Genomics

Fehérje-chipek - eltérően kifejeződő vagy módosított fehérjék azonosítására Kezeletlen, kontroll

Kezelt

„bár ígéretes technológia, mégsem annyira megalapozott, mint a DNS-csip módszer” Antitestek, amelyek a jelátviteli és egyéb folyamatokban résztvevő fehérjéket ismeri fel Signal transduction

Ca associated Cell stress Cell cycle/nuclear Cell cycle

Apoptosis Cytoskeleton Neurobiology

Egyes fehérjékre, fehérjecsaládokra összpontosít MTA SZBK, Funkcionális Genomika Laboratórium

Tüdőtumor fehérjecsipes vizsgálata cdk5 Caspase 7 chk1

HSP90 Adaptin

3

cdc26 CyclinE

2.5 2

Synaptotagmin

1.5

Caspase11

1 Nicastrin

0.5 0

100

200

300

400

500

MTA SZBK, Funkcionális Genomika Laboratórium

Reproducibility and sensitivity of DNA and protein microarrays DNA microarray

2.0 1.0

-1.0 -2.0 -3.0 8

Protein microarray

9

10

11

12

13

14

15

0.6 0.4

M

0.2 0

-0.2 -0.4 -0.6 Laboratory of Functional Genomics.BRC, Szeged

10

11

12

13

A

14

15

16

Specificitás és érzékenység meghatározása Caspase 9 100ng/ml

30ng/ml

3ng/ml High level

buffer Low level

alacsonyabb kifejeződés

Magas koleszterin tartalmú diéta hatása agyi fehérjekifejeződési mintázatra Cy5

Normál Cy3

magas koleszterin

Cy3

átlag, normalizált értékek

Cy5


Magas koleszterin tartalmú diéta hatása agyi fehérjekifejeződési mintázatra 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1 -1 -1.1 -1.2 -1.3 -1.4 -1.5

Phospolipase c gamma 1 PKC beta, gamma NAK synuclein

-1.6 -1.7 0

50

100

150

200

250

300

Confirmation DNA and protein microarray results Norm.Fluoro.

DNA microarray

10-0.5 10-1

cyt C

farnesyl F farnesyl C

cyt F 10-1.5 clathrin F clathrin C

10-2 10-2.5

actin C, F

synuclein F synuclein C

Quantitative real-time PCR Protein microarray

a-synuclein


Ponceau Western-blot

Flow of genetic information

Secretion from cell

Cytoplasm

transcription

translation

Cell nucleus Degradation

Internal stimuli

Degradation

Activity

Modification

Cell membrane

Transcriptional stimuli DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

Genomikai kutatások eszközei DNS-chipek, microarrayek

valós-idejű PCR

Új generációs szekvenátorok

SOLID/454

Nanokapilláris valós-idejű PCR

3.072 reakciótér 48x64 almátrix

Adott projektre tervezett gének vizsgálata nanokapilláris QRT-PCR-vel

48 almátrix 64 esszé almátrixonként 48 minta QRT-PCR microarray lemezenként

AVIDIN Kft

„AViBioT” program az adatok normalizálása belső kontrollok alapján

480 vizsgált, citotoxikus anyag szűrése toxikológiai panelen

A normalizált génexpressziós értekeket hierarchikus klaszterezési eljárásnak vetettük alá. A referencia-minták közös klaszterben mutatkoztak, amely hasonló hatásmechanizmusra utal

480 minta (52 gén/minta) 10 lemezen: 1 koncentrációban (EC10) 1 időpontban (24 h) máj sejteken Összesen 24.960 QRT-PCR Vass L, et al. (2009) Toxicogenomics screening of small molecules using high-density, nanocapillary real-time PCR. Int J Mol Med.23:65-74.

Kooperáció: MTA SZBK, Comgenex zRT., Targetex Kft.

miRNS expresszió globális és közepes áteresztőképességű szűrése miRNS microarray (Agilent)

Patkány szív, Humán vastagbélrák Humán gliómák Taqman miRNS assay (Avidin)

miRNS QRT-PCR (Rotorgene)

mir mir-21 -21

P1 P2

P1 P1 mir-9 mir-9

P2

P2 mir-23b 23b

MIRNA-ID hsa-let-7a hsa-let-7b hsa-let-7c hsa-let-7d hsa-let-7e hsa-let-7f hsa-let-7g hsa-miR-1 hsa-miR-9 hsa-miR-10a hsa-miR-10b hsa-miR-15a hsa-miR-15b hsa-miR-16 hsa-miR-17 hsa-miR-18a hsa-miR-19a hsa-miR-19b hsa-miR-20a hsa-miR-20b hsa-miR-21 hsa-miR-22 hsa-miR-23a hsa-miR-23b hsa-miR-24 hsa-miR-25 hsa-miR-26a hsa-miR-27a hsa-miR-27b hsa-miR-29a hsa-miR-29b hsa-miR-29c hsa-miR-30b hsa-miR-30c

HUMAN y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y

MOUSE y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y

RAT y y y y y y n n y y n n y y y y y y y n y y y y y y y y y y y y y y

DROSOPHILA n n n n n n n n y n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n

CENORHABDITIS DANIO y n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n

hsa-miR-31 y hsa-miR-32 y hsa-miR-34a y hsa-miR-92a y mmu-miR-93 y mmu-miR-96 y hsa-miR-98 y hsa-miR-100 y hsa-miR-101 y hsa-miR-103 y hsa-miR-105 y hsa-miR106a y hsa-miR106b y hsa-miR107 y hsa-miR-122 y mmu-miR-124ay hsa-miR-125b y hsa-miR-126 y hsa-miR-127 y hsa-miR-128a y hsa-miR-129 y hsa-miR-130a y hsa-miR-130b y hsa-miR-132 y hsa-miR-133a y hsa-miR-133b y mmu-miR-134 y hsa-miR-135a y hsa-miR-136 y mmu-miR-137 y hsa-miR-138 y hsa-miR-140-3py hsa-miR-141 y hsa-miR-143 y

n y y n y y y y y y n n y y y y y y y y y y y y y y y y n y y y y y

n y y n y y y y y y n n y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y n

DNS-chipek diagnosztikai lehetőségei Új megoldások, tervek, ötletek I. (Új) alkalmazási területek

– Prenatális diagnosztika (multigénes betegségek azonosítása, kockázati tényezők, genetikai betegségek felfedése) – Orvosi mikrobiológia (multidrog, antibiotikum rezisztencia kimutatása) – Onkológia (kemoterápia kimenetelének jóslása, alosztályok meghatározása, tipizálás) – Igazságügy (DNS-ujjlenyomat és embertípusok anozosítása) – Alapkutatás (diagnosztikai jelentőséggel bíró, új genetikai markerek felfedezése) – Pszichiátria (elmebetegségek, hajlamok, személyiségi jegyek megállapítása) – Farmakogenetika (egyénre szabott gyógyszerek) – Egy sejt monitorozása, új amplifikációs módszerek

DNS-chip Labor, SZBK

Hagyományos és chip adatok egy adott klinikai kórképre


Gén expresszió globális szűrése néhány sejtből QRT-PCR

DNA-microarray

Avicor - the chemical microarray company

Kémiai könyvtár

robotika

Kémiai-csip

Szabadalmaztatott felület

application – hit identification target

Avicor ChemArray 18K

labeled target

application comparative hit identification target 1

labeled targets

target 2

Avicor ChemixArray 18K

Chip-technológia bioinformatikai szemmel I. SZE Bioinformatika

Recommend Documents