Bioinformatika 2 −10.el ő ad ás Prof. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz. Bioinformatika – proteomika Elő adás és gyakorlat
2009. 04. 24.
Bioinformatika 2
Genomikavs. proteomika A genomika módszereivel nem a tényleges fehérjéket vizsgáljuk, hanem azokat az expresszálódott géneket, amelyek transzlációja az adott fehérjét eredményezi. A proteomika módszereivel a ténylegesen képző dött fehérjéket vizsgáljuk. Az elő zőábrán látható DNS chip az expresszálódott génekrő l szolgáltat információkat, így tehát csak közvetett adatokhoz juthatunk a tényleges fehérje termékekről. A genomikai megközelítés elő nye, hogy a gének kisérletileg jobban hozzáférhetőek és egyszerűbben kezelhetőek, mint a fehérjék. Ennek köszönhető en napjainkban a genomikai módszerek elterjedtebbek, mint a proteomikai eljárások. A kísérleti technikák fejlődésével párhuzamosan előre jelezhetőa proteomika egyre nagyobb térnyerése.
2
Tisztában kell lennünk azonban a genomikai megközelítés hátrányaival is. Elsőaz, hogy egy gén expressziós szintje nem feltétlenül felel meg a megfelelőprotein magas sejtbéli koncentrációjának, holott ez fontosabb ha a tényleges protein expresszió mértékére és az ezzel összefüggőbetegségre vagyunk kíváncsiak. Talán még fontosabb az, hogy a fehérjék jelentős része a transzlációt követő en módosul (posttranslational modifications). Ilyen módosulások a glikozilálások (összetett cukor egységek fehérje felszínhez kötődése) és foszforilálások (foszfát egységek kötödése a fehérjéhez). Ezek a transzlációt követőmódosulások az azonos primer aminosav szekvenciával rendelkezőproteinek számos eltérő változatához vezethetnek. A genomika nem képes ezen módosulások követésére, amelyek számos esetben fontosságűak lehetnek. 2009. 04 04alapvető . 24 24.. Bioinformatika 2
Proteomikajelent ősége A fehérjék tejes szekvenciája csak részben következtethető ki a nekik megfelelő genetikai szekvenciából. Sokszor fordulnak elő a transzlációt követően módosulások: pl. alternatív lánc összekapcsolódás, N-terminális rövidülés, poszt-transzlációs módosulások (PTM). A proteomika tehát e módosulásokat előidézőkörülmények leírását is jelenti. Mindezeken túl a fehérjék funkciója és aktivitása függ a koncentrációjuktól, még általánosabban a környezetüktől. Előfordulhat, hogy fehérjék aktiválnak másik fehérjéket, vagy az aktivitáshoz nem-fehérje kofaktorok vagy egyéb anyagok / szubsztrátok kellhetnek. Fehérjék pH-függőfolyamatokban a sejt egyik részéból a másikba transzportálódhatnak, vagy a PTM folyamata a sejt állapotától függően dinamikusan változhat, stb.
3
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika - összetettebb,mint agenomika A fehérjék igen változó koncentrációban fordulhatnak elő: a koncentráció 1012 tartományt fog át a transzkripciós faktoroktól az albuminig. Egy adott gén egy adott szövetben akár 20 feletti protein formában expresszálódhat: pl. a humán plazmában az -1-antitripszinnek legalább különbözó 22 protein formája ismert. A fehérjék fiziko-kémiai sajátságai extrém módon különbözhetnek: molekula tömegük a néhány ezertől akár egymillió Dalton-ig terjedhet. Az oldhatóságuk, izoelektromos pontjuk (pI) és PTM hajlamuk is igen eltérőlehet. Az emberi szervezetben (a becsült mintegy 40 000 gén expressziós termékeként) vélhetően előforduló fél-egy millió protein elemzése igazi kihívás mint technológiai, mind bioinformatikai szempontból. A vizsgálatok nagyfelbontású fehérjeelválasztási módszereket, a mintaelőkészítés / a kísérleti módszerek és az adatbázis kezelés nagyfokú automatizálását / parallelizációját igénylik. Igen fontosak a feljett vizualizációs technikák. 4
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – kölcsönhatások/ módszerek
Az azonosított és jellemzett fehérjék funkcióját is meg kell határozni, ami sokszor nem egyszerű. A fehérjék igen gyakran protein komplexeket képezve kölcsönhatásban állnak egymással, vagy más fontos biomolekulákkal, mint a DNS. Aktivitásuk kapcsolódhat kisebb, molekulákkal pl. kofaktorokkal, hormonokkal történőkölcsönhatásokhoz, így tehát érthető, hogy igen változatos kísérleti technikák lehetnek szükségesek az új diagnosztikus tesztek kifejlesztéséhez. A proteom amely a genom egy adott szervezet adott szövétben egy adott időben exprimálódó proteinjeinek összességeként írható le analízise számos módszer kombinációját igényli. A módszerek lehetnek kísérleti (wet-lab experiments) és bioinformatikai (dry-lab experiments) eljárások. Figyelembe véve a proteomban előforduló proteinek kémiai és fizikai komplexitását, változatos módszerek felhasználását kell megfontolni. A következő ábra lineáris ”útvonala” a proteom elemzéséhez szükséges ”nedves” és ”száraz” lépéseket tartalmazza. 5
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Aproteomika “útvonala”
Minta
Elválasztás
Folt kiválasztása
Elválasztás utáni analízis Adatbázisok 6
2009. 04 04. 24 24..
Azonosítás Bioinformatika 2
Proteomikater ületei éseszk özei Gél elektroforézis 1- és 2-dimenziós elválasztások, nagy érzékenység, nagy áteresztőképesség Profilkészítés Gél-mentes elválsztás jelölésekkel Protein / peptid szinten – Többdimenziós LC – Izobár / izotóp jelölés
Azonosítás
Tömegspektrometria (MS) “Peptide mass fingerprint” – azonosítás LC-MS és LC-MS/MS – azonosítás és kvantifikálás MALDI-TOF/TOF – azonosítás és kvantifikálás Bioinformatika Differenciális proteinexpresszió azonosítása Szekvencia-analízis Biológiai funkció / relevancia elemzése
Validálás
7
2009. 04 04. 24 24..
Tesztek fejlesztése Immunoanalízis – ELISA, western blot, immunohisztokémia MS módszerek – TMT referenciaanyagok, MRM
Bioinformatika 2
Proteomika - mintaelő készítés Elsőként a megfelelőmintát és mintaelkészítési módszert kell kiválasztani. A minta lehet a nyers biológiai folyadék, egy sejt extraktum, előkezelt minta, stb. A minta megválasztása alapvetőfontosságú, mivel ez erősen függ az elválasztásra használni kívánt módszertől. A minta komplexitásának mind a komponensek számát, mind az átfogott tartományok szélességének tekintve megfelelőnek kell lennia a kiválasztott elválasztási módszerhez.
8
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika A minta fehérjéit el kell választani egymástól. A proteomika az 1D de még inkább a 2D elektroforézis technikákat preferálja (1-DE) / (2-DE).
9
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – foltokkiv álasztása A következőlépés az elválasztás eredményének analízise gél-vizualizációs / alakfelismerőszoftverek segítségével történik (megjelenítés, gélek összehasonlítása, statisztikai elemzések). Ezek segítenek a szignifikáns foltok kiválasztásában.
10
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – vizualizációsszoftver
11
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – vizualizációsszoftver
12
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – elválasztásut ánianal ízis
A további elemzésekhez a kiválasztott proteineket elválasztás utáni elemzésnek vetik alá. Ez a specifikus fehérje-sajátságok mint az aminosav-összetétel, szekvencia információ kísérleti meghatározásához endoproteázokkal végzett hasítási lépést igényel. Ezen endoproteázokkal végzett hasítások során a proteineket tipikusan olyan enzimekkel inkubálják, melyek egy adott aminosavat felismerve a polipeptid-láncot specifikusan hasítják.
13
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – MSanal ízis Ez egy rövidebb peptidekből álló ún. emésztett proteineket tartalmazó elgyet eredményez. A standard eljárás tripszint alkalmaz és a képződőtt fragmenseket gyakran LC elválasztást követően Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) vagy Electrospray Ionization (ESI) MS (TOF) módszerekkel vizsgálja.
14
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
Proteomika – (Szekvencia)adatokelemz ése A tömegspektrumból meghatározott (szekvencia)adatokat a megfelelő adatbázisokkal összevetve megtalálható a kísérletileg meghatározott és a „in-silico” emésztett protein szekvencia-adatbázis közötti legjobb egyezés, ami felhasználható a fehérje azonosítására és karakterizálására. (Ld. korábban: „mass fingerprinting”)
15
2009. 04 04. 24 24..
Bioinformatika 2
