Celtesten voor de risicobeoordeling van giftige stoffen in water
Sander van der Linden Biodetection Systems
Waarom biologische testen?
• Huidige monitoring strategie bijna volledig gebaseerd of chemische analyse • Chemische analyse heeft bepaalde beperkingen – Te veel stoffen om allemaal te meten – Te weinig informatie beschikbaar of effecten van individuele stoffen – Houdt geen rekening met mengseleffecten – Houdt bijna tot geen rekening met afbraakproducten
Behoefte aan aanvullende informatie omtrent aanwezigheid van schadelijke stoffen
Chemisch versus biologisch?
Toxiciteits testen
• Detectie van effecten in plaats van individuele stoffen of structuren – Niet-gereguleerde stoffen – Afbraakproducten – Mengsels
• Testen kunnen generiek zijn of specifiek – Generieke testen geven “totaal toxiciteit”, maar reden van toxiciteit (mechanisme) is slecht gedefinieerd (vaak in vivo) – Specifieke testen richten zich op enkele effecten, maar mechanisme is goed gedefinieerd (vaak in vitro) Genomic tools voor screenen activiteit meerdere genen
Adverse outcome pathway Initiërende effecten op moleculair niveau kunnen leiden tot ongewenste effecten op organisme- en populatieniveau
Ankley et al (2008) Environ Toxicol Chem 29(3): 730-741
Effecten mengsels
Individuele stoffen
Gemeten activiteit in bioassay
Voorspelde activiteit op basis van Concentratie Additie
Holistische versus mechanistische analyse
• Monitoren activiteit diverse toxicologisch relevante mechanismen – Wat wil je beschermen (humaan, ecologie)? – Hoeveel assays heb je daarvoor nodig?
Single organism toxicity testing
Population decline
External exposure
Ecosystem integrity
Toxicokintetics
Toxicodynamics
Organ response
Organism response
Population response
Escher and Leusch (2012) Bioanalytical tools in water quality assessment
CALUX bioassay panel Eindpunt
Mechanisme
Actieve stoffen
Assay
Hormonaal
Estrogene receptor (alpha)
(xeno)hormonen, medicijnen, pesticiden, weekmakers
ER (alpha) CALUX
Androgene receptor
(xeno)hormonen, medicijnen, pesticiden, ?
AR CALUX
Progesteron receptor
(xeno)hormonen, ?
PR CALUX
Glucocorticoid receptor
(xeno)hormonen, medicijnen, ?
GR CALUX
Thyroid receptor (beta)
(xeno)hormonen, medicijnen,?
TRbeta CALUX
RAR receptor (alpha)
Retinoiden, medicijnen, ?
RAR CALUX
Peroxisome proliferator receptor alpha
Medicijnen, ?
PPARalpha CALUX
Peroxisome proliferator receptor gamma
Medicijnen, TBT, ?
PPARgamma CALUX
Dioxine receptor
PCBs, dioxines
DR CALUX
Dioxine receptor
PAKs
PAH CALUX
Genotoxiciteit
p53 pathway
Nitro-PAKs, medicijnen, zware metalen, ?
P53 CALUX
Oxidatieve stress
Nrf2 pathway
Zware metalen, ?
Nrf2 CALUX
Controle specificiteit response overige assays
Control CALUX
Transcriptiefactoren
Algemene response
CALUX panel watermonsters
High throughput aanpak • Meer en kleinere wells (384), meer gegevens van zelfde extract • Efficient gebruik extract • Snellere analyse (>200 extracten per week op 4 assays)
Alternatieve aanpak
• Huidige in vitro assays – Gevoelig, specifiek, snel (?) – Maar ook… • één voor één (weliswaar parallel) -> hoeveel mechanismen is genoeg? • elke assay heeft extract nodig -> wanneer limiterend?
• Is het mogelijk om meerdere effecten tegelijkertijd meten met microarrays? – “Totale toxiciteit” als in holistische aanpak – Mechanistische informatie van assay aanpak – Op basis van één extract
Dus van....
Eén assay per plaat ....
..... >20.000 “assays per plaat”
Voorwaarden screenen met microarrays
• Op basis van in vitro celkweek – – – – – –
Onbeperkt beschikbaar Ethisch verantwoord Reproduceerbaar Controleerbaar Retrospectief onderzoek mogelijk Additionele experimenten mogelijk
• Additionele testen los te interpreteren
• Weinig tot geen storende effecten Cel nodig die reageert op veel verschillende (groepen) stoffen
Experimentele set-up Seeding of T47D cells (in hormone stripped culture medium)
Control (DMSO)
24 hours
Pure compounds
….
….
Exposure 16 hours
Exposed T47D cells
….
….
….
Total RNA isolation
….
….
Quantification of gene expression (relative to DMSO)
Water extracts
Microarray resultaten watermonsters
• Vaak goede voorspelling • Slechts kwalitatieve uitspraak mogelijk • Storende interactie tussen effecten
Gebruik bioassays
• Mechanistische assays – – – – – –
goed bruikbaar voor bepaalde aspecten waterkwaliteit specifiek kwantitatief “nieuwe” effecten gevonden in de toekomst assay gebaseerde kwaliteitscriteria? rol naast chemische analyse!
• Microarray analyse – – – – –
kwalitatief geschikt voor mechanisme bepalen pure stoffen gevoelig voor “storende” interacties patroon afhankelijk van verdunningsfactor (nog) niet geschikt als standaard screeningstool
