Buněčná senescence a nádorová onemocnění

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Buněčná senescence a nádorová onemocnění

Brno 2011

Šárka Šimečková

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli Mgr. Karlu Součkovi, PhD. a své konzultantce Mgr. Zuzaně Pernicové za velmi vstřícný přístup a čas, který mi věnovali. Dále za ochotu, mnohé odborné rady a celkové vedení při psaní této práce.

2

Obsah Seznam použitých zkratek ............................................................................................................5 1. Úvod ............................................................................................................................................6 2. Stárnutí buněk a senescence .....................................................................................................7 2.1. Buněčný cyklus ....................................................................................................................7 2.2. Buněčný cyklus a jeho regulace ...........................................................................................7 2.2.1. Regulace buněčného cyklu pomocí komplexů CDK a cyklinů .....................................7 2.2.2. Regulace buněčného cyklu pomocí proteinů p53 a p16 INK4a ........................................9 2.3. Senescence in vivo ..............................................................................................................10 2.3.1. Stárnutí buněk ..............................................................................................................10 2.3.2. Stárnutí tkání a organismu ...........................................................................................11 3. Možnosti indukce senescence a zapojené signální dráhy .....................................................12 3.1. Senescentní buňky ..............................................................................................................12 3.1.1. Základní charakteristika senescentních buněk ............................................................12 3.1.2. Nejvýznamnější markery senescence ..........................................................................12 3.2. Typy senescence .................................................................................................................13 3.2.1. Replikativní senescence ...............................................................................................14 3.2.2. Předčasná senescence ..................................................................................................15 4. Role senescence v rozvoji a terapii nádorových onemocnění ..............................................17 4. 1. Senescence u benigních novotvarů ....................................................................................17 4. 2. Senescence u maligních nádorů .........................................................................................18 5. Sekreční činnost senescentních buněk ...................................................................................20 5. 1. Sekreční fenotyp asociovaný se senescencí (SASP) .........................................................20 5. 2. Faktory sekretované senescentními buňkami ....................................................................20 5. 3. Vliv sekreční činnosti senescentních buněk na buněčné mikroprostředí ..........................23 5. 3. 1. Účinky SASP udržující homeostázu .........................................................................23 3

5. 3. 2. Nežádoucí účinky SASP v nádorovém mikroprostředí .............................................24 6. Závěr .........................................................................................................................................27 7. Seznam použité literatury .......................................................................................................28

4

Seznam použitých zkratek BPH – benign prostatic hyperplasia, benigní hyperplazie prostaty BRAF – protoonkogen B-Raf CDK – cyclin-dependent kinase, cyklin dependentní kináza CDKI – cyclin-dependent kinase inhibitor, inhibitor cyklin dependentních kináz EMT – epithelial-to-mesenchymal transition, epiteliálně-mezenchymální přechod FGF – fibroblast growth factor, fibroblastový růstový faktor IGFBP – insulin-like growth factor binding protein, protein vázající růstový faktor podobný inzulínu IGF – insulin-like growth factor, růstový faktor podobný inzulínu IL-1, -6, -8 – interleukiny -1, -6, -8 MMP – matrix metalloproteinases, matrixové metaloproteinázy NK buňky – natural killers, přírození zabíječi OIS – oncogene-induced senescence, senescence indukovaná onkogeny SAHFs – senescence-associated heterochromatin foci, ohniska heterochromatinu asociovaná se senescencí SA-β-gal – senescence associated β-galaktosidase, β-galaktosidáza spojená se senescencí SIS – stress-induced senescence, senescence indukovaná stresem SMS – senescence-messaging secretome, faktory spojené se senescencí TERC – telomerázová RNA TERT – telomerázová reverzní transkriptáza TGF-β – transforming growth factor β, transformující růstový faktor β

5

1. Úvod Základními stavebními a funkčními jednotkami v organismu jsou buňky. Jejich schopnost správně fungovat je pro život organismu nesmírně důležitá. Vůbec poprvé byla buňka popsána a definována R. Hookem v jeho díle Micrographia z r. 1665. Představa o délce života buněk se začala výrazně měnit s objevem Hayflicka a Moorheada. Při pozorování lidských embryonálních fibroblastů zjistili, že podstupují pouze určitý počet buněčných dělení. V důsledku zkracování telomer během buněčného dělení se snižuje proliferační kapacita buňky. Pokud se již buňky nemohou dělit, jednou z jejich odpovědí může být přechod do proliferačně klidového stádia, tzv. senescence (z latinského senex – stařec). V tomto stádiu života buňky dojde ke komplexním změnám v její morfologii a fyziologii, jak bude popsáno v této bakalářské práci. Cílem této bakalářské práce je shrnout současné poznatky týkající se buněčné senescence. V první části práce jsou popsány příčiny a mechanismy jejího vzniku, charakteristika senescentních buněk na úrovni morfologické, dále také změny v sekreční činnosti a efekty, které tyto sekrety v buněčném mikroprostředí vyvolávají. Další část práce je zaměřena na úlohu senescentních buněk v organismu ve spojení se stárnutím. Výskyt senescentních buněk v organismu s sebou může přinášet v určitých případech výhody a podílí se na udržování homeostázy. Tyto buňky jsou dnes běžně považovány za bariéru bránící maligní transformaci a indukce senescence se stává součástí protinádorové terapie. Na druhou stranu výsledky současného základního výzkumu zároveň naznačují, že metabolické produkty senescentních buněk hrají roli v rozvoji některých typů nádorových onemocnění. V tomto případě je zřejmě přítomnost senescentních buněk v nádorové tkáni nežádoucí. Proto je cílem poslední části předkládané práce popsat rizika vzniku onemocnění spojených s výskytem senescentních buněk a negativní důsledky, které vyplývají z jejich přítomnosti.

6

2. Stárnutí buněk a senescence 2.1. Buněčný cyklus Buněčný cyklus je sled buněčných pochodů od jednoho dělení buňky ke druhému. Během něj dochází k předávání genetické informace, a proto zde existuje mnoho mechanismů, které zajišťují přesné přenesení nepoškozené DNA. Buněčný cyklus lze rozdělit do několika fází (Sandal, 2002). Jsou jimi G0, G1 , S, G2 a M fáze. Během fáze G1 (z angl. gap) buňka roste a připravuje se na syntézu DNA. Pokud se růst buňky zastaví v této části cyklu, přejde do klidové fáze G0. Následuje fáze S (syntetická), během které dochází k replikaci DNA. Během této části cyklu je DNA velmi citlivá na poškození. V průběhu následující fáze G2 dochází ke zdvojování organel a přípravě na další fázi cyklu. Konečná je fáze M (mitotická), kdy dochází k segregaci chromozomů a rozdělení buněčného materiálu do dvou dceřiných buněk. Každá z těchto fází má své kontrolní body, kterými musí buňka projít, aby mohla vstoupit do další fáze (Garrett, 2001). Je kontrolováno, zda je DNA nepoškozená. Dále je například sledováno, zda má buňka dostatek energie pro veškeré procesy nezbytné pro další fázi cyklu. Pokud jsou nalezeny chyby v DNA nebo je DNA poškozená nebo jsou okolní podmínky prostředí nepříznivé pro dělení, jsou spuštěny opravné mechanismy a buněčný cyklus se zpomalí, dokud se chyby neopraví. Pokud kontrolní body neplní svoji funkci správně, může dojít k nádorové transformaci a deregulaci průchodu buněk buněčným cyklem.

2.2. Buněčný cyklus a jeho regulace Proces buněčného cyklu je řízen řadou regulátorů (Malumbres and Barbacid, 2009). Jsou jimi specifické proteiny, které ovlivňují správný průchod buňky jednotlivými fázemi cyklu. Pokud dojde k mutacím v genech regulačních proteinů, nemohou svou úlohu vykonávat správně. Buňka na tuto situaci reaguje indukcí apoptózy (řízená buněčná smrt), indukcí senescence nebo dojde k chybnému dělení buněk, které může vést k rozvoji nádorového onemocnění. Kontrolní body se tedy podílí na řízení průchodu buňky buněčným cyklem, zajišťují správné dělení buňky a přenos nepoškozené DNA do dceřiných buněk. 2.2.1. Regulace buněčného cyklu pomocí komplexů CDK a cyklinů Hlavní úlohu v řízení průchodu buněčným cyklem mají komplexy cyklin-dependentních kináz (CDK; z angl. cyclin-dependent kinase) s cykliny (Obrázek 1, Fuster et al., 2010). Zatímco 7

exprese všech CDK je po celou dobu buněčného cyklu konstantní, exprese cyklinů závisí na tom, v jaké fázi cyklu se buňka právě nachází. Pro každou fázi cyklu je typický výskyt konkrétního komplexu CDK a cyklinu. Řídící funkce CDK spočívá ve fosforylaci proteinů zodpovědných za regulaci buněčného cyklu. Činnost CDK je řízena pomocí inhibitorů cyklin-dependentních kináz (CDKI; z angl. cyclin-dependent kinase inhibitor). Patří mezi ně dvě proteinové rodiny: INK4a s proteiny p15, p16, p18, p19 a rodina proteinů Cip/Kip - p21, p27, p57. Mezi nejdůležitější regulační signalizace patří regulační dráhy zahrnující proteiny p53 a p16 INK4a. Ty to dráhy mohou být propojené nebo mohou probíhat na sobě zcela nezávisle. Obrázek 1: Fáze buněčného cyklu a jejich regulace

V rané fázi G1 mají řídící úlohu zejména CDK 4 a CDK 6, které tvoří komplex cyklinem D. V této fázi může dojít k zástavě buněčného cyklu a přechodu do klidové fáze G0. V pozdní fázi G1 přebírá řídící úlohu komplex CDK2 s cyklinem E. Před vstupem do S fáze mění CDK2 svou substrátovou specifitu a váže cyklin A. Ten v následné fázi G2 tvoří komplex s CDK1. Během přechodu z fáze G2 do fáze M je důležitý komplex CDK1 s cyklinem B. Každý z komplexů CDK s cykliny má své vlastní negativní regulátory CKIs z rodin Cip/Kip a INK4a, s nimiž interagují a tím jsou inaktivovány. Inaktivace komplexů CDK s cykliny vede k zastavení buněčného cyklu. (Fuster et al., 2010, upraveno).

8

2.2.2. Regulace buněčného cyklu pomocí proteinů p53 a p16 INK4a Pro svou ochrannou funkci bývá p53 označován jako strážce genomu. Podílí se na řízení přenosu nepoškozené genetické informace během buněčného cyklu. V rámci vývoje organismu má tedy nepostradatelnou úlohu a jeho správná funkčnost je velice důležitá. Protein p53 je za běžných podmínek v buňce neaktivní a je vázán svým negativním regulátorem ubiquitin-ligázou MDM2 (z angl. murine double minute) (Lou and Chen, 2006). Pokud dojde ke vzniku dvouřetězcových zlomů na DNA působením exogenních nebo endogenních vlivů, je p53 aktivován. Stabilizace p53 je zajištěna jeho fosforylací a uvolněním z vazby s MDM2. Jakmile v buňce vzroste koncentrace p53, je spuštěna exprese jeho cílových genů, mezi něž patří protein p21Cip1/Waf, který funguje jako inhibitor komplexů CDK a cyklinů. To znemožňuje buňce pokračovat v průchodu buněčným cyklem a vede k jeho zástavě. Tím získá buňka čas na spuštění mechanismů na opravu poškozené DNA. U mnoha typů rakovinných bujení byla pozorována delece genu pro p53 nebo jeho poškození (Petitjean et al., 2010). Znovuobnovení funkce p53 v nádorech vyvolává různou buněčnou odpověď v závislosti na typu nádoru (Ventura et al., 2007). Např. v sarkomech (nádorech kostí) vede k zastavení buněčného růstu a projevují se znaky senescence, u lymfomů vede obnovení aktivity p53 k rozsáhlé apoptóze. Další signální dráha, která vede k zastavení buněčného cyklu, zahrnuje regulátory p16INK4a a pRb (Sandal, 2002). Aktivita pRb je řízena inhibitorem p16INK4a, který ho udržuje během G1 fáze v nefosforylovaném stavu. Nefosforylovaná forma pRb potlačuje aktivitu transkripčních faktorů z rodiny E2F, které mají výrazný vliv na řízení buněčného cyklu při přechodu buňky z fáze G1 do fáze S. Pokud je pRb fosforylován, uvolní z vazby transkripční faktor E2F a buňka pokračuje v buněčném cyklu. Mutantní formy pRb nemohou vázat E2F, což vede k nadměrné proliferaci. Zvýšená hladina p16INK4a vede k inaktivaci pRb a zástavě buněčného cyklu. Hladina p16 INK4a v buňce však není ovlivněna poškozením DNA jako p53, je řízena například nadměrnou expresí Ras proteinu (Lou and Chen, 2006). Signální dráhy zahrnující zvýšenou aktivitu těchto regulátorů vedou k zastavení buněčného cyklu. Buňky tak získávají čas např. k opravě poškozené DNA, po opravě následně pokračují dál v průchodu buněčným cyklem. V případě rozsáhlých poškození je indukována buněčná smrt. Tyto procesy mají zásadní význam pro udržení homeostázy a chrání organizmus před případným přenosem poškozené DNA do dceřiných buněk.

9

2.3. Senescence in vivo 2.3.1. Stárnutí buněk V roce 1961 Leonard Hayflick a Paul Moorhead svými pokusy na lidských embryonálních fibroblastech potvrdili, že somatické nenádorové buňky mohou projít jen určitým definovaným počtem buněčných dělení (Hayflick and Moorhead, 1961). Tento jev je dnes znám jako Hayflickův limit. Tento limit v počtu dělení je dán délkou telomer, repetitivních sekvencí, vyskytujících se v koncových oblastech chromozomů. Telomery tvoří přesahující 3´konce vlákna DNA. Nenesou informaci pro vznik proteinů nebo funkčních RNA a jsou bohaté na guanosinové nukleotidy. U člověka jsou tvořeny repetitivní sekvencí TTAGGG. Tyto struktury jsou typické pro lineární dsDNA u eukaryotních organismů. Enzym DNA polymeráza, který odpovídá za replikaci chromozomů, není schopen tyto konce replikovat. Při každém dělení buňky tedy dochází k jejich zkrácení o několik nukleotidů (Martens et al., 2000). Byla pozorována úzká souvislost mezi replikativní kapacitou buňky a délkou telomer (Allsopp et al., 1992). Délka telomer může být udržována přítomností aktivního enzymu telomerázy (Collins, 2006). Telomeráza je ribonukleoprotein, který se váže na tandemové hexametrické repetice TTAGGG na telomerách a umožňuje jejich prodloužení. Skládá se ze dvou podjednotek telomerázové reverzní transkriptázy (TERT), která má katalytickou funkci a telomerázové RNA (TERC), která slouží jako matrice pro dokončení replikace 3´konců DNA. Díky činnosti telomerázy nedochází ke zkracování telomer, a teoreticky je tak umožněno neomezené dělení buněk. Lidské somatické nenádorové buňky obsahují pouze malé množství enzymu telomerázy. (Martens et al., 2000). Při jejich každém dělení dochází ke zkracování telomer, po dosažení určité limitní délky telomer se buňky přestávají dělit a dochází k indukci tzv. replikativní senescence (Campisi, 1997). Stále aktivní telomeráza se nachází v lidských embryonálních buňkách, hematopoetických kmenových buňkách, keratinocytech v bazální lamině a v pohlavních buňkách (Cukusic et al., 2008). Buňky jsou během života vystaveny působení mnoha mutagenních vlivů, v jejichž důsledku dochází k poškozování DNA. Buňka má mechanismy, díky kterým může vzniklé chyby opravit. Přesto vzniká mnoho změn na DNA, které opravě uniknou. Z tohoto důvodu je výskyt telomerázy ve všech buňkách, a tím i „nesmrtelnost“ buněk a rozšiřování vzniklých chyb, nežádoucí.

10

2.3.2. Stárnutí tkání a organismu Organismus je tvořen pestrou mozaikou mnoha druhů buněk. Z nich se vytváří jednotlivé tkáně, orgány a orgánové soustavy. Během prenatálního a postnatálního vývoje organismu dochází k proliferaci a diferenciaci buněk. V dospělém organismu je zastoupena již celá řada plně diferencovaných buněk, které se nedělí. Proliferační schopnost si zachovávají buňky kmenové, epiteliální a buňky v obnovitelných tkáních a pojivech – např. buňky krevní a vazivové. S přibývajícím stářím v těchto tkáních narůstá počet senescentních buněk, což může hrát roli v rozvoji některých onemocnění. Bylo prokázáno, že senescentní endoteliální buňky mají vliv na zúžení arterií, tzv. atherogenezi (Minamino et al., 2002). Dalším příkladem onemocnění, v jehož rozvoji mají úlohu senescentní buňky, je benigní hyperplazie prostaty (Castro et al., 2003), o čemž bude konkrétněji pojednáno v kapitole 4. Také senescentní chondrocyty zřejmě přispívají k rozvoji osteoarthritidy (Martin and Buckwalter, 2003). Některá onemocnění jsou přímo spojena se zrychleným stárnutím buněk. Známým příkladem poruchy stárnutí je Hutchinson-Gilfordova progerie (Allsopp et al., 1992). U pacientů s touto chorobou byla pozorována značně zkrácená délka telomer a snížená proliferační kapacita buněk oproti buňkám zdravých jedinců stejného věku. Samotná otázka stárnutí organismu a jeho příčiny jsou předmětem diskuze mnoha vědců. Existuje několik možných teorií, přesto však důvod a podstata stárnutí organismu není doposud uspokojivě objasněna.

11

3. Možnosti indukce senescence a zapojené signální dráhy 3.1. Senescentní buňky 3.1.1. Základní charakteristika senescentních buněk Indukce senescence není spojena jen se zástavou buněčného cyklu, ale s celou řadou změn, které se projeví ve fenotypu a morfologii buněk. Senescentní buňky jsou protáhlé, zploštěné, obsahují více granulí a mají velké jádro (Chang et al., 1999). I když je zastavena proliferace buněk, nedochází k indukci programované buněčné smrti a buňky dále zůstávají metabolicky aktivní. V důsledku změn, které nastanou přechodem buňky do senescentního stavu, dojde ke změnám v expresi celé řady genů. Některé změny jsou specifické pro senescenci a budou podrobněji probrány v kapitole 5. Některé změny obecně souvisí se zástavou buněčného cyklu – např. exprese inhibitorů buněčného cyklu. Senescentní buňky jsou navíc rezistentní vůči apoptóze, což souvisí s udržováním vysoké hladiny anti-apoptotického proteinu Bcl-2 v buňce (Wang, 1995). Tato rezistence může částečně vysvětlovat vysokou stabilitou senescentních buněk a jejich zvýšený výskyt v organismu s přibývajícím stářím (Campisi and d'Adda di Fagagna, 2007). 3.1.2. Nejvýznamnější markery senescence Mezi typické znaky senescence se řadí aktivita enzymu β-galaktosidázy spojené se senescencí (SA-β-gal; z angl. senescence-associated β-galactosidase). Většina buněk produkuje enzym β-galaktosidázu, který se vyskytuje v lysozomech a jeho reakční optimum je pH 4 (Dimri et al., 1995). Pro senescentní buňky je charakteristické reakční optimum tohoto enzymu při pH 6 a tento enzym se označuje SA-β-gal. Byl detekován u starších lidských fibroblastů ve větším množství než u mladších buněk. SA-β-gal byla také detekována u senescentních keratinocytů, její výskyt nebyl naopak zjištěn u imortalizovaných buněk, tedy takových, které překonaly senescenci a nemají omezenou proliferační kapacitu (Hatina J., 2001). Přesto není SA-β-gal univerzálním znakem replikativní senescence. Její produkce musí mít buněčně specifickou funkci a její indukce v senescenci je zřejmě omezena na určité druhy buněčných linií. Dalším charakteristickým znakem senescentních buněk je změna ve struktuře chromatinu (Narita et al., 2003). Dochází ke vzniku útvarů zvaných ohniska heterochromatinu asociovaná se senescencí (SAHFs; z angl. senescence-associated heterochromatin foci). Tyto útvary připomínají klasický heterochromatin, tedy DNA kondenzovanou s proteiny. Vzniklá ohniska 12

SAHFs inaktivují transkripční faktory E2F, které se podílejí na řízení buněčného cyklu. Pokud je znemožněna jejich exprese, je zastavena buněčná proliferace. Kondenzaci SAHFs způsobuje metylace histonu H3 a heterochromatinový protein 1. Tyto změny ve struktuře DNA jsou typické také pro heterochromatin (Funayama et al., 2006). Funayama et al. pozorovali SAHFs u lidských senescentních fibroblastů. Byly rozmístěné po celém jádře a každé ohnisko SAHF představovalo části jednotlivých chromozomů, které přešly do stavu heterochromatinu. U těchto buněk byla také pozorována ztráta histonu H1, který se podílí na stavbě nukleosomu při kondenzaci DNA. Ztráta nebo značné snížení exprese histonu H1 byla pozorována u buněk, kde byla senescence indukována různými způsoby. Ve spojení s přechodem buněk do senescentního stavu byla v lidských fibroblastech kultivovaných in vitro pozorována zvýšená hladina p16INK4a (Alcorta et al., 1996, Hara et al., 1996). Tento fakt souvisí s tím, že p16INK4a působí jako inhibitor buněčného cyklu, jehož zastavení je charakteristickým znakem senescentních buněk. Dalším inhibitorem buněčného cyklu, který působí na komplexy CDK s cykliny, je p21Cip1/Waf. Jeho zvýšená hladina v buňkách byla také pozorována v souvislosti s přechodem lidských fibroblastů do senescentního stavu (Alcorta et al., 1996).

3.2. Typy senescence Indukce senescence (Obrázek 2; Lleonart et al., 2009, upraveno) je běžným procesem během vývoje, růstu a stárnutí organismu. Výrazný podíl na tom mají telomery, které fungují jako buněčné hodiny. Jejich délka předurčuje, kolikrát se bude moci buňka během svého života rozdělit. Když je tento limit vyčerpán, dojde u buněk k indukci replikativní senescence (viz kapitola 3.2.1). Buněčná senescence však může být vyvolána dříve, než by k ní za normálních okolností došlo. Jedná se pak o senescenci předčasnou. Ta je zpravidla vyvolána poškozením DNA nebo vystavením buněk určité formě stresu, na což buňka reaguje spuštěním obranných mechanismů. Ty vedou k zastavení proliferace, aby nedošlo k předávání poškozeného genetického materiálu do dceřiných buněk.

13

Obrázek 2: Indukce senescence

Senescence může být indukovaná zkrácením telomer (replikativní senescence) nebo předčasně vlivem stresových faktorů (OIS, SIS, poškozením DNA). OIS – senescence indukovaná onkogeny (z angl. oncogene induced senescence), SIS – senescence indukovaná stresem (z angl. stress-induced senescence); (Lleonart et al., 2009, upraveno). 3.2.1. Replikativní senescence Replikativní senescenci indukuje zkrácení telomer na kritickou hodnotu. Jak již bylo zmíněno, dojde k nevratnému zastavení růstu buňky ve fázi G1 buněčného cyklu a projeví se řada dalších změn ve struktuře buňky, její sekreční činnosti a funkci. Počet dělení buňky je druhově a tkáňově specifický. Pokud není v buňce funkční mechanismus, který by zajišťoval obnovu telomer, dojde po určitém počtu dělení buněk ke zkrácení telomer na kritickou hodnotu, zastavení buněčného cyklu a k indukci senescence. U člověka a dalších organismů mohou buňky využít k obnově a prodloužení telomer enzym telomerázu. Telomeráza se vyskytuje v zárodečných nebo kmenových buňkách, u kterých je potřeba udržovat neustálou proliferační aktivitu. Telomeráza se také vyskytuje u nádorových buněk (Meyerson et al., 1997), kde je naopak nežádoucí. U některých typů rakoviny nebyla v buňkách telomeráza detekována. Přesto měly buňky mechanismus, který umožňuje udržovat délku telomer. Tento mechanismus je znám jako alternativní prodlužování telomer (ALT; z angl. alternative lenghtening of telomeres) (Bryan and Reddel, 1997) a je založen na rekombinaci (Dunham et al., 2000). Rekombinace jako mechanismus sloužící k udržování délky telomer byla pozorována také u hmyzu, konkrétně u Anopheles gambie (Roth et al., 1997).

14

3.2.2. Předčasná senescence Indukce senescence není způsobena pouze zkrácením telomer na kritickou délku, ale také působením dalších vlivů. Tyto vlivy mají za následek převážně změny ve struktuře DNA nebo její poškození, na něž buňka může reagovat spuštěním opravných mechanismů. Pokud jsou poškození rozsáhlá a buňka již není schopna zajistit jejich opravu, dojde k indukci apoptózy. Další možnou odpovědí buňky je indukce senescence. Tento druh senescence se označuje jako předčasná senescence indukovaná stresem (SIPS; z angl. stress-induced premature senescence) (Toussaint et al., 2000). Mezi další faktory, které mohou vyvolat předčasnou senescenci, patří např. mutace v protoonkogenech, působení chemoterapeutik a oxidativní stres. Protoonkogeny kódují klíčové regulátory buněčného cyklu. Pokud dojde k mutaci v těchto genech, jsou exprimovány v nepřiměřeném množství nebo dojde k narušení jejich funkce. Tyto změny naruší proliferaci a mohou vyvolat přeměnu zdravých buněk na buňky nádorové. Pokud jsou buňky takto narušené, snaží se zabránit dalšímu dělení zástavou buněčného cyklu. Proto lze u buněk, kde byla senescence indukovaná protoonkogeny, pozorovat zvýšenou hladinu p16INK4a (Serrano et al., 1997). Typickým příkladem protoonkogenu, který se podílí na regulaci buněčné proliferace, je protein Ras. Na jeho zvýšenou expresi reaguje buňka obrannými mechanismy. Aktivuje p16INK4a, což vede k zastavení proliferace a k indukci senescence (Serrano et al., 1997). Projeví se také fenotypové změny, jako je protažení a zploštění buněk a zvýšená aktivita SA-β-gal. Dalšími příklady protoonkogenů, jejichž zvýšená exprese vede k indukci senescence, jsou Cdc6 (z angl. cell division cycle 6) a cyklin E (Bartkova et al., 2006). Jejich zvýšenou expresí může dojít k tvorbě dvouřetězcových zlomů na DNA a k indukci senescence (cyklin E). Senescence byla indukována v případě zvýšené exprese Cdc6 dokonce i u buněk, které exprimovaly enzym telomerázu. Senescenci lze také navodit působením některých chemoterapeutik, např. doxorubicinem, hydroxymočovinou nebo cisplatinou. Tato chemoterapeutika vyvolávají poškození DNA a indukují tak zastavení proliferace. Doxorubicin je léčebný preparát, který se využívá v protinádorové terapii. Na buňky působí cytotoxicky (indukuje buněčnou smrt) a cytostaticky (indukuje zastavení buněčného dělení) (Chang et al., 1999). Buňky z fibrosarkomu (nádoru pojivové tkáně) kultivované in vitro vykazovaly po ovlivnění doxorubicinem znaky, jaké mají senescentní fibroblasty. Byly to prodloužení a zploštění buněk a zvýšená granularita. Oproti buňkám, které nebyly ošetřeny doxorubicinem, významně vzrostla aktivita enzymu SA-β-gal. Senescence byla také vyvolána působením doxorubicinu na prsní nádorové buňky (Elmore et al., 2002). 15

Dalším cytostatikum, které se používá se při léčbě některých nádorových onemocnění (např. nádorů hlavy, krku a gastrointestinálního ústrojí), je hydroxymočovina (Kovacic, 2011). Po působení hydroxymočoviny na erytromyeloidní buňky (Park et al., 2000) a lidské fibroblasty z předkožky (Yeo et al., 2000) byla pozorována indukce senescence. Došlo k zástavě růstu buněk, ke změně jejich morfologie a byla detekována SA-β-gal. U fibroblastů byl také detekován výskyt tumor supresorových proteinů p21Cip1/Waf, p16INK4a a p53. Cisplatina je dalším běžným chemoterapeutikem, které se využívá k léčbě rakovinných onemocnění. Buněčná reakce na cisplatinu je různá. U B lymfoblastoidní buněčné linie imortalizované virem Epstain-Barrové indukuje cisplatina apoptózu (Allday et al., 1995), u buněk z rakoviny nosohltanu indukuje senescenci (Wang et al., 1998). Mnoho experimentálních studií provedených in vitro ukázalo, že subletální oxidativní stres indukuje předčasnou senescenci (Toussaint et al., 2000). Reaktivní formy kyslíku mohou být exogenního i endogenního původu a způsobují v buňkách oxidativní poškození. Dochází k oxidaci proteinů, lipidů a bází v DNA, čímž se poruší integrita buněk. Důsledky oxidativního stresu závisí na antioxidační kapacitě buněk, míře stresového faktoru a typu tkáně, ze které buňky pochází. Senescenci spojenou s oxidativním stresem lze navodit také u buněk v podmínkách in vitro. Po působení nízkých koncentrací H2O2 na lidské embryonální fibroblasty byly detekovány znaky typické pro senescentní buňky (Duan et al., 2005). Jedná se o zástavu proliferace ve fázi G1 buněčného cyklu, pozměněnou morfologií buněk a aktivitu SA-β-gal.

16

4. Role senescence v rozvoji a terapii nádorových onemocnění 4. 1. Senescence u benigních novotvarů Jak již bylo zmíněno v předchozích kapitolách, senescentní buňky byly pozorovány v in vitro kulturách i v podmínkách in vivo. Typický je také výskyt senescentních buněk v organismu u benigních (nezhoubných) novotvarů. Jedním z příkladů benigních novotvarů je benigní hyperplazie prostaty (BPH; z angl. benign prostatic hyperplasia). Toto onemocnění je velice časté u starších mužů a jeho výskyt se zvyšuje s přibývajícím věkem. Vyskytuje se u 20 % mužů ve věku 40-50 let, u 40 % mužů ve věku 50-60 let, u 55 % mužů ve věku 60-70 let, u 80 % mužů ve věku 70-80 let a u 90 % mužů ve věku 80-90 let (Jarolím, 2008). Typické projevy tohoto onemocnění jsou problémy s močením, poškození ledvin a infekce močových cest. Hlavní příčinou patogeneze BPH je deregulace buněčného dělení a následně nadměrná proliferace pozměněných epiteliálních a stromálních buněk prostaty, což vede k jejímu zbytnění (Choi et al., 2000). Navíc přítomné fibroblasty produkují fibroblastové růstové faktory FGFs (z angl. fibroblast growth factors), jejichž zvýšená exprese zřejmě hraje důležitou roli v abnormální proliferaci buněk v rámci BPH (Ropiquet et al., 1999). Senescence je spojena s buněčným stárnutím podobně jako je výskyt BPH spojen se stárnutím u mužů. Tyto dva jevy tedy spolu zjevně souvisí. Spojitost prokazují výsledky práce Castro et al., kde byla u mnohých epiteliálních buněk izolovaných od pacientů s BPH detekována vyšší aktivita enzymu SA-β-gal a také u nich byla pozorována výrazně vyšší exprese cytokinu IL-1α v in vitro kulturách i v podmínkách in vivo (Castro et al., 2003). Dalším cytokinem, který podporuje zbytnění prostaty, je IL-8. Působí jednak přímo na proliferaci epiteliálních buněk, jednak parakrinně indukuje expresi fibroblastového růstového faktoru FGF2. Exprese cytokinu IL-8 ve tkáni pozitivně koreluje se zvětšením prostaty (Castro et al., 2004). Tyto výsledky naznačují, že akumulace senescentních epiteliálních buněk, které svými sekrety parakrinně ovlivňují proliferaci nesenescentních buněk, má vliv na rozvoj BPH u starších mužů (Castro et al., 2003). Senescentní buňky přispívají k BPH také dalším způsobem. Protože jsou rezistentní vůči apoptóze (Wang, 1995), hromadí se ve tkáni, což vede k nárůstu buněčné hmoty a zbytnění prostaty (Castro et al., 2004). I když senescentní buňky v tomto případě neindukují nádorové onemocnění, výskyt těchto buněk není žádoucí. Dalším příkladem benigních novotvarů vyskytujících se u člověka jsou mateřská znaménka. Jsou to shluky kožních pigmentových buněk melanocytů. Tyto buňky často obsahují 17

mutace v genu pro protein kinázu BRAF (Pollock et al., 2003). Trvalá exprese této mutantní formy kinázy v lidských melanocytech indukuje zástavu buněčného cyklu, která je doprovázená expresí p16INK4a a zvýšenou aktivitou SA-β-gal (Michaloglou et al., 2005). Tyto charakteristické znaky senescence byly pozorovány u buněk in vivo a v in vitro kulturách. V obou případech nebyla přítomnost p16INK4a detekována u všech buněk znaménka, výskyt p16INK4a byl v rámci celého znaménka heterogenní. Mutantní forma kinázy BRAFV600E mírně stimuluje proliferaci melanocytů, může tedy přispívat k rozvoji melanogeneze. I když onkogenní BRAF iniciuje v podmínkách in vitro i in vivo senescenci, hlavním faktorem, který u znamének indukuje zastavení buněčného cyklu, je zkrácení telomer. (Bastian, 2003). Tato pozorování podporují hypotézu, že senescence indukovaná expresí BRAF v mateřských znaménkách působí jako tumor supresivní mechanismus.

4. 2. Senescence u maligních nádorů V současné době představují rakovinná bujení druhou nejčastější příčinu úmrtí u lidí (Kenneth, 2011). Proto je nádorové biologii věnována velká pozornost. Vědci se snaží problematice nádorových onemocnění co nejvíce porozumět, aby mohli přispět k vývoji účinných léčiv a terapeutických postupů v boji s těmito onemocněními. Jako jedna z možných cest protinádorové terapie, o které se v posledních letech diskutuje, je indukce senescence. Mnohá léčiva, která způsobují u buněk jednořetězcové nebo dvouřetězcové zlomy na DNA nebo vyvolávají změny ve struktuře DNA a v její funkci, mohou také indukovat senescenci. Pokud nejde nádorové buňky zničit přímo, je indukce senescence možnou výhodou při léčbě nádorových onemocnění. Dochází tak k zastavení růstu nádorových buněk, nedochází však k indukci apoptózy a eliminaci celého nádoru (Ewald et al., 2010). Příkladem používaných chemoterapeutik, která u nádorových buněk indukující senescenci, jsou doxorubicin, hydroxymočovina nebo cisplatina, jak bylo již zmíněno v kapitole 3. 2. 2. Dalším příkladem používaných léčiv jsou camptothecin (Han et al., 2002) a bromodeoxyuridin (Michishita et al., 1999, Suzuki et al., 2001). Indukci senescence lze pozorovat u nádorových buněčných linií in vitro. Příkladem může být indukce senescence u buněčných linií DU145 and LNCaP odvozených od karcinomu prostaty, u kterých byla senescence indukována použitím chemoterapeutik 5-Aza-2´deoxycytidinu, doxorubicinu a docotaxelu (Schwarze et al., 2005). U další buněčné linie HT1080 z fibrosarkomu byl testován účinek různých cytostatik a sledovalo se, jaký efekt u buněk vyvolají (Chang et al., 1999). Nejvýraznější vliv na produkci SA-β-gal a zastavení buněčného cyklu měly doxorubicin, amphidicolin a cisplatina. 18

Senescenci lze také indukovat u nádorových buněk in vivo. Vzniká však heterogenní odpověď a senescence je indukována pouze u části buněk. Roberson et al. ve své práci srovnávali výskyt SA-β-gal pozitivních buněk v nádorech plic a prsu u pacientů a pacientek, z nichž někteří užívali před operací nádoru chemoterapeutika. Výsledky ukázaly, že u těch pacientů a pacientek, kteří chemoterapeutika neužívali, byla exprese SA-β-gal téměř nulová. U těch, kteří léky užívali, byla v rámci nádoru zaznamenána zvýšená distribuce tohoto markeru (Roberson et al., 2005). Te Poele et al. provedli obdobný experiment u pacientek s nádorem prsu, z nichž některým byla před operací podávána chemoterapeutika. U takto ovlivněných nádorů byla detekována SA-β-gal v mnohem větší míře než u nádorů pacientek, které chemoterapeutika neužívaly. Tyto výsledky naznačují, že senescence může být přirozenou odpovědí nádorových buněk na poškození DNA způsobené účinkem chemoterapeutik (te Poele et al., 2002). Dalším možným způsobem, jak využít indukci senescence v rámci léčby rakovinných onemocnění, je léčba premaligních nebo raných stádií rakoviny (Majumder et al., 2008). Z pozorování senescentních markerů v rámci nádoru lze odvodit výskyt senescentních buněk, což indikuje zpomalení růstu nádoru nebo snížení metastatického potenciálu. To bylo ukázáno např. u benigních znamének plicního adenomu (Ewald et al., 2010). Působením mnoha různých chemoterapeutik na nádorové buňky nebo přímo na nádorovou tkáň dochází k indukci senescence. I když nejsou buňky nádoru přímo zničeny a odstraněny, je zpomalen růst nádoru a dochází k jeho stabilizaci. Indukce senescence se tak může zdát výhodná, protože působí zastavení rozvoje nádoru. Ve světle nových výsledků týkajících se sekreční činnosti senescentních buněk (viz následující kapitola) však není jejich vliv na zastavení rozvoje nádoru tak jednoznačný.

19

5. Sekreční činnost senescentních buněk 5. 1. Sekreční fenotyp asociovaný se senescencí (SASP) Buňky v organismu neexistují izolovaně, ale komunikují spolu a ovlivňují se navzájem. Svými sekrečními produkty mohou ovlivňovat sami sebe (autokrinně), dále mohou působit na buňky v těsné blízkosti (parakrinně) nebo na buňky vzdálené, kde je přenos látek zajištěn tělními tekutinami (endokrinně). V těsném okolí buněk se vytváří mikroprostředí, které je dáno fyzikálními a chemickými faktory jako jsou teplota, obsah kyslíku, přítomnost růstových faktorů, cytokinů apod. (Coppé et al., 2010). Buňky sekretují charakteristické látky v závislosti na své funkci. Pokud dojde k patologické přeměně buněk např. na buňky nádorové, změní se i jejich sekreční činnost a povrchové antigeny. Díky tomu mohou být nádorové buňky rozpoznávány složkami imunitního systému a mohou být odstraňovány (Abul K. Abbas, 2005). Komplexní změna sekreční činnosti je spojena i se senescencí buněk. Jedná se o tzv. sekreční fenotyp asociovaný se senescencí (SASP; z angl. senescence-associated secretory phenotype), známý také jako SMS (z angl. senescence-messaging secretome) (Kuilman and Peeper, 2009). Ačkoliv je obecně senescence považována za bariéru bránící vzniku nádorů, faktory sekretované senescentními buňkami mohou působit na rozvoj nádorů pozitivně (Krtolica et al., 2001), a jsou tak stinnou stránkou senescence. Buňky mohou přispívat produkcí mnoha různých faktorů, které regulují některé fyziologické děje - např. rozvoj chronického zánětu apod.

5. 2. Faktory sekretované senescentními buňkami Produkty sekreční činnosti senescentních buněk lze rozdělit do několika skupin podle jejich vlastností. Jsou to rozpustné faktory - mezi které patří interleukiny (IL), chemokiny a růstové faktory. Další skupinou jsou nerozpustné komponenty a sekretované proteázy (Davalos et al., 2010), dále pak extracelulární nerozpustné molekuly a látky neproteinové povahy (Tabulka 1).

20

Tabulka 1: Některé nejvýznamnější složky SASP složky SASP

reference

rozpustné faktory interleukiny IL-1α, IL-6, IL-8 růstový faktor TGF-β IGFBP nerozpustné komponenty a sekretované proteázy MMP tPA uPAI -1 a -2 uPAR kalikrein extracelulární nerozpustné molekuly fibronektin látky neproteinové povahy NO reaktivní formy kyslíku

(Prencipe et al., 2009) (Tremain et al., 2000) (Kuilman and Peeper, 2009) (Liu and Hornsby, 2007) (Davalos et al., 2010) (Chang et al., 2002) (Davalos et al., 2010) (Chang et al., 2002) (Kumazaki et al., 1993) (Sato et al., 1993) (Xin et al., 2003)

Hlavní složku rozpustných sekretovaných faktorů buněk tvoří prozánětlivé cytokiny (Coppe et al., 2010). Cytokiny byly poprvé popsány na konci padesátých let, dnes jich je známo několik desítek. Jsou to nízkomolekulární proteiny, které se účastní mezibuněčné komunikace, podílí se na regulaci imunitní odpovědi a stimulují buňky imunitního systému. IL-6 patří mezi prozánětlivé cytokiny a podílí se na regulaci imunitní odpovědi organismu. Vyvolává akutní i chronický zánět, podporuje hematopoézu a diferenciaci B lymfocytů. Je přirozeně produkován v rámci imunitní odpovědi buňkami imunitního systému, jako jsou makrofágy, T lymfocyty, dendritické buňky apod. Exprese interleukinů byla také pozorována u buněk in vitro ve spojení se senescencí. Např. Prencipe et al. detekovali zvýšenou expresi IL-6 a IL-8 u senescentních buněk z rakoviny prsu (Prencipe et al., 2009). IL-6 může působit autokrinně i parakrinně jako tumorgenní faktor a senescentní buňky mohou sloužit jako zdroj tohoto promitogenního IL-6. Kuilman et al. pozorovali, že přítomnost IL-6 slouží také jako nástroj k realizaci senescence indukované onkogeny (Kuilman et al., 2008). Dalším faktorem, který je součástí sekretomu senescentních buněk, je transformující růstový faktor β (TGF-β; z angl. transforming growth factor β), který hraje významnou roli v mnoha buněčných procesech. Podílí se např. na regulaci diferenciace a proliferace buněk (Massague, 2008). Role TGF-β u senescentních buněk byla poprvé popsána u myších keratinocytů (Tremain et al., 2000). Na příkladu buněk histiocytického lymfomu in vitro bylo pozorováno, že TGF-β potlačuje vznik nádorů (Wu et al., 2009). TGF-β se podílí na regulaci 21

genové exprese a buněčné proliferace pomocí intracelulárních proteinů SMAD2/3 a SMAD4 (Zawel et al., 1998), které zprostředkovávají zástavu buněčného cyklu (Kuilman and Peeper, 2009). Působení TGF-β na epiteliální buňky navíc inhibuje fosforylaci pRb a zároveň také přispívá k jeho udržování v hypofosforylovaném stavu, což opět vede k zastavení buněčného cyklu (Laiho et al., 1990). U senescentních buněk byla pozorována zvýšená exprese rodiny proteinů vázajících růstový faktor podobný inzulínu (IGFBP; z angl. insulin-like growth factor binding protein) (Kuilman and Peeper, 2009). Členové rodiny IGFBP na sebe váží růstový faktor podobný inzulínu (IGF; z angl. insulin-like growth factor) a tím ho inaktivují (Firth and Baxter, 2002). Signální dráha zahrnující proteiny z rodiny IGF je evolučně konzervovaná a ovlivňuje některé fyziologické a patologické procesy, např. délku života buněk a rozvoj rakoviny. Na příkladu svalových satelitních buněk kultivovaných in vitro bylo zjištěno, že IGF oddaluje indukci replikativní senescence (Chakravarthy et al., 2000). U senescentních buněk WI-38 kultivovaných in vitro nebyla produkce mRNA pro IGF pozorována (Ferber et al., 1993). Přesto se však receptor pro IGF vyskytuje v ekvivalentním množství u presenescentních i u senescentních WI-38 buněk (Sell et al., 1993). U lidských kožních fibroblastů byla pozorována spojitost mezi zvýšenou expresí IGFBP3 a senescencí (Goldstein et al., 1991). Zvýšená exprese dalšího člena rodiny IGFBP7 má také vliv na indukci senescence in vitro u nádorových epiteliálních buněk prostaty (linie M12) (Sprenger et al., 2002). U prsních nádorových buněk (linie MCF-7), které běžně IGFBP7 neexprimují, byla po transdukci cDNA pro IGFBP7 pozorována jeho exprese, která vedla k indukci senescence (Wilson et al., 2002). Mezi nerozpustné komponenty sekretomu senescentních buněk patří proteázy z rodiny MMP (z angl. matrix metalloproteinases), jejichž zvýšená exprese byla pozorována např. u předčasně senescentních fibroblastů (Liu and Hornsby, 2007). Dalšími komponentami, které jsou součástí SASP a které mají vliv na karcinogenezi, jsou serinové proteinázy a regulátory plasminové aktivační dráhy uPA, tPA (z angl. urokinase plasminogen activators; tissue-type plasminogen activators), uPA receptor a inhibitor těchto proteáz, uPAI-1 a -2 (Davalos et al., 2010). Po indukci senescencence u linie HCT116 byla také pozorována zvýšená produkce proteáz kallikreinu-7 a uPA, které podporují růst metastáz (Chang et al., 2002). Mezi extracelulární nerozpustné molekuly produkované senescentními buňkami patří například fibronektin. Je to protein, který je významnou složkou extracelulární matrix a ovlivňuje adhezi buněk, jejich růst a migraci. Zvýšená exprese fibronektinu byla pozorována u senescentních buněk získaných in vivo i u buněk kultivovaných in vitro (Kumazaki et al., 1993).

22

Buňky produkují kromě látek proteinové povahy také řadu dalších faktorů, které ovlivňují buněčné mikroprostředí. Mezi ně patří oxid dusnatý (NO), jehož přítomnost indukuje u buněk senescenci (Sato et al., 1993), a reaktivní formy kyslíku, jejichž produkce je během senescence zvýšena (Xin et al., 2003). Také tyto molekuly se podílí na stárnutí buněk a indukci senescence (Finkel and Holbrook, 2000).

5. 3. Vliv sekreční činnosti senescentních buněk na buněčné mikroprostředí 5. 3. 1. Účinky SASP udržující homeostázu Sekreční produkty senescentních buněk uvolněné do okolního mikroprostředí ovlivňují buňky v jejich bezprostředním okolí a mohou u nich indukovat senescenci (Kuilman and Peeper, 2009). To může být výhodné v případě, kdy je tkáň poškozena např. UV zářením (Obrázek 3a). Výskyt senescentních buněk vyvolá útlum proliferace okolních buněk a potlačuje vznik a rozvoj zhoubných nádorů. Sekrety senescentních buněk mohou ovlivňovat také buňky stromatu (Obrázek 3b). Ty následně přestanou produkovat růstové faktory, které působí na proliferaci sousedních preneoplastických buněk. Navíc mohou začít produkovat inhibiční faktory, které způsobí zástavu buněčné proliferace. Mohou inhibovat signální dráhy růstových faktorů na úrovni buněčných receptorů, čímž dojde u buněk k indukci senescence. Senescentní buňky produkují také prozánětlivé faktory. Ty působí jako chemoatraktanty pro buňky imunitního systému (Obrázek 3c). Zvláště působí na NK buňky, jak bylo ukázáno na příkladu jaterních hvězdicovitých buněk (HSC; z angl. hepatic stellate cell) (Krizhanovsky et al., 2008). U jaterních buněk z fibrózní tkáně byla pozorována senescence v in vivo i v in vitro podmínkách. U HSC a IMR-90 (diploidní fibroblasty) buněk byla senescence provázena zvýšenou expresí ligandů, které byly rozeznávány receptory NK buněk a následně byly senescentní buňky odstraněny. U těchto buněk byla také pozorována zvýšená exprese cytokinu IL-8 a adhesivních molekul CD58. Senescentní buňky mohou dle výše uvedených studií in vitro a in vivo ovlivňovat buněčné mikroprostředí a přispívají k udržení homeostázy. Indukce senescence je výhodná u poškozených buněk, protože u nich dojde k zastavení buněčného cyklu a vzniklé chyby se nepřenáší do nově vznikajících buněk. Navíc jsou pomocí SASP aktivovány buňky imunitního systému, které mohou poškozené buňky odstranit.

23

Obrázek 3: Vliv senescentních buněk na okolní buňky

(a) SMS faktory produkované senescentními buňkami (modré) mohou zvýšit citlivost normálních sousedících buněk (béžové) k indukci senescence. To může zvýšit pravděpodobnost, že u buněk, u kterých došlo k indukci poškození např. UV zářením, nedojde k neoplastické transformaci a nadměrné proliferaci, ale je indukována senescence. (b) Senescentní buňky ovlivňují pomocí SMS buňky stromatu, které přestanou podporovat růst vznikajících neoplastických buněk tak, že u nich vyvolají senescenci. Tyto senescentní stromální buňky také mohou začít sekretovat inhibitory proliferace. (c) Chemoatrakce buněk imunitního systému (IS), které likvidují senescentní buňky (Kuilman and Peeper, 2009, upraveno). 5. 3. 2. Nežádoucí účinky SASP v nádorovém mikroprostředí Výskyt senescentních buněk ve tkáni však nepřináší pouze výhody, ale může podporovat mnoho nežádoucích fyziologických procesů. Buňky svými sekrety ovlivňují okolní mikroprostředí a mohou indukovat buněčnou proliferaci, migraci, epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT; z angl. epitelial-mesenchymal transition), invazivitu buněk, buněčnou diferenciaci nebo chronický zánět (Davalos et al., 2010) (Obrázek 4). Mnoho z těchto dějů vede ke vzniku a rozvoji nádorů. Jak již bylo zmíněno v kapitole 5. 3. 1., senescentní buňky mohou vyvolávat akutní zánět. Tím jsou aktivovány buňky imunitního systému, které odstraňují jeho příčiny. Senescentní buňky svou neustálou sekreční činností mohou ale vyvolat také zánět chronický, což je pro organismus patologický stav. Chronický zánět souvisí s některými patofyziologickými onemocněními, která jsou spojena také se stárnutím. Jsou jimi např. Alzheimerova choroba, diabetes, ateroskleróza, osteoartritida, rakovina a další (Freund et al., 2010). Faktory, které jsou produkovány senescentními fibroblasty, mohou přispívat k stimulaci růstu preneoplastických epiteliálních buněk (Krtolica et al., 2001). Fibroblasty stimulují jejich růst prostřednictvím rozpustných faktorů, převážně však produkcí extracelulární matrix. Krtolica et al. pozorovali, že senescentní fibroblasty stimulují hyperproliferaci a nárůst počtu 24

neoplastický buněk HaCaT a SCp2 in vivo. Navíc byl po současné injikaci senescentních fibroblastů spolu se slabě tumorigenními buňkami u myší pozorován zrychlený vývoj nádorů. Výskyt senescentních fibroblastů tedy zrychlil a usnadnil tumorigenezi. Přítomnost senescentních fibroblastů podporuje indukci EMT (Coppe et al., 2008). To je proces, během kterého dochází ke komplexní přeměně epiteliálních buněk, jejich uvolnění a migraci. Buňky během EMT ztrácí svůj původní buněčný fenotyp a nově získávají vlastnosti mezenchymálních

buněk.

Bylo

pozorováno,

že

senescentní

fibroblasty

indukovaly

prostřednictvím sekretovaných faktorů EMT in vitro u dvou neagresivních buněčných linií (T47D a ZR75.1) odvozených z karcinomu prsu. Došlo ke snížení exprese epiteliálních markerů E-cadherinu, β-kateninu a cytokeratinu, naopak byla zjištěna zvýšená exprese mezenchymálního markeru vimentinu. Všechny tyto popsané změny jsou charakteristické pro EMT. Po použití protilátek bylo navíc zjištěno, že vliv na invazivitu buněk měly sekretované faktory senescentních buněk, IL-6 a IL-8. Parakrinní účinky SASP tedy mohou podporovat maligní fenotyp u blízkých nemaligních a maligních buněk. Pro zjištění, zda má SASP vliv na migraci buněk, byla použita kondiciovaná média z presenescentních a senescentních fibroblastů WI-38 jako atraktanty pro endoteliální buňky z pupečníkové žíly (HUVEC; z angl. human umbilical vein endothelial cells) (Coppe et al., 2006). Médium ze senescentních fibroblastů indukovalo několikanásobně vyšší migraci a invazivitu buněk HUVEC. Vliv na zvýšenou migraci endoteliálních buněk měla přítomnost cévního endoteliálního růstového faktoru (VEGF, z angl. vascular endothelial growth factor). VEGF také patří mezi faktory SASP, avšak jeho zvýšená exprese není charakteristickým znakem všech senescentních fibroblastů. Důvod, proč tomu tak je, není zatím znám. Přítomnost senescentních stromálních buněk usnadňuje růst nádorů díky podpoře tvorby cév, tzv. angiogenezi. Již výše zmíněný faktor VEGF má výrazný vliv na tvorbu, množství a velikost nových cév, díky čemuž je potom zajištěno dobré prokrvování. Tím je umožněno dostatečné zásobení živinami a kyslíkem, což je nezbytné pro růst a rozvoj nádoru. Na angiogenezi mají vliv také další faktory SASP (Coppe et al., 2006), např. CXC chemokiny (Strieter et al., 2006) a IL-6, jejichž proangiogenní účinky byly pozorovány u nádorů myší in vivo (Ancrile et al., 2007). Faktory sekretované senescentními buňkami ovlivňují také buněčnou proliferaci. U lidských buněčných linií z prsního epitelu MCF-10A byla v podmínkách in vitro pozorována zvýšená proliferace díky přítomnosti senescentních fibroblastů (Parrinello et al., 2005). Podobně byl zaznamenán vliv senescentních fibroblastů na imortalizovanou, nenádorovou myší buněčnou linii EpH4 z prsního epitelu. Buňky pod vlivem fibroblastů tvořily alveoly, které byly větší, 25

nebyly uniformní a byly méně organizované než ty, které vznikaly v přítomnosti presenescentních fibroblastů. Proliferaci epiteliálních buněk stimulovala přítomnost faktorů sekretovaných senscentními fibroblasty, konkrétně MMP-3. Senescentní fibroblasty mohou tedy změnit funkci a morfologickou diferenciaci prsních epiteliálních buněk. Tyto změny jsou pravděpodobně způsobeny zvýšenou proliferací, migrací a invazí epiteliálních buněk. Ačkoliv je indukce senescence považována za bariéru bránící vzniku a rozvoji nádorů, recentní studie ukazují, že senescentní buňky svými faktory mohou podporovat fyziologické procesy, které jsou naopak pro tumorigenezi nezbytné. Obrázek 4: Vliv senescentních buněk na okolní buňky

Vliv senescentní buňky (šedá) na buňky okolní tkáně. Odpověď okolních buněk na faktory vylučované senescentními buňkami (SASP faktory) závisí na buněčném typu a okolní tkáni. Senescentní buňka stimuluje buňky imunitního systému (IS), které senescentní buňky odstraní. Také silně působí na zastavení vlastního růstu. SASP faktory mohou také podporovat proliferaci blízkých epiteliálních a stromálních buněk a podporují invazivitu preneoplastických nebo neoplastických buněk prostřednictvím indukce EMT. Dále podporují angiogenezi a narušují strukturu a funkci normálních tkání (Freund et al., 2000, upraveno).

26

6. Závěr Proces buněčné senescence je přirozeným důsledkem vývoje a stárnutí organismu. Senescence může být indukována přirozeně u starých buněk, v tomto případě je proces řízen zkracováním telomer. Senescence však může být indukována v důsledku působení stresu, vedoucího převážně k poškození DNA. Jak bylo shrnuto v této práci, senescentní buňky mohou ovlivňovat buněčné mikroprostředí a v určitých případech přispívají k udržení homeostázy. Indukce senescence je výhodná u poškozených buněk. Jedná se o obranný mechanismus, kterým se buňky snaží zabránit šíření poškozeného genetického materiálu. Navíc jsou pomocí SASP aktivovány buňky imunitního systému, které mohou poškozené buňky odstranit. Protože jsou v dnešní době rakovinná onemocnění jednou z nejčastějších příčin lidských úmrtí, je nádorová biologie předmětem zájmu mnoha vědců, kteří se snaží této problematice co nejvíce porozumět a následně vyvinout účinné léky pro léčbu rakoviny. Indukce senescence se v současné době považuje za jednu z možných cest při protinádorové terapii. Výhodou indukce senescence je zástava růstu buněk, proto je senescence považována za bariéru bránící vzniku a rozvoji nádorů. Při léčbě však nikdy nebývá dosaženo 100% úspěšnosti v indukci senescence nebo zničení nádorových buněk. Avšak je zde i druhá stránka indukce senescence. Podle současných studií produkují senescentní buňky celou řadu faktorů, které podporují fyziologické procesy proliferace, invazivity nebo migrace. To vše naopak může vést ke stimulaci dalšího růstu nádoru a rozvoji nádorového onemocnění. Otázka senescence v rámci nádorových onemocnění tedy zůstává rozporuplná. Výskyt senescentních buněk je na jednu stranu výhodný a indukce senescence lze využít při léčbě rakoviny, na druhou stranu se senescentní buňky mohou sami podílet na rozvoji rakoviny. Otázkou dalšího výzkumu by tedy mělo být důkladnější objasnění důsledků indukce senescence a její role jednak ve vzniku a rozvoji nádorových onemocnění, jednak v protinádorové léčbě.

27

7. Seznam použité literatury

ABUL K. ABBAS, A. H. L. (2005) Chapter 17 Immunity to Tumors, p.391. Cellular and Molecular Immunology. 5th Edition, Saunders.Philadelphia, PA. ALCORTA, D. A., XIONG, Y., PHELPS, D., HANNON, G., BEACH, D. & BARRETT, J. C. (1996) Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 13742-7. ALLDAY, M. J., INMAN, G. J., CRAWFORD, D. H. & FARRELL, P. J. (1995) DNA damage in human B cells can induce apoptosis, proceeding from G1/S when p53 is transactivation competent and G2/M when it is transactivation defective. Embo J, 14, 4994-5005. ALLSOPP, R. C., VAZIRI, H., PATTERSON, C., GOLDSTEIN, S., YOUNGLAI, E. V., FUTCHER, A. B., GREIDER, C. W. & HARLEY, C. B. (1992) Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 10114-8. ANCRILE, B., LIM, K. H. & COUNTER, C. M. (2007) Oncogenic Ras-induced secretion of IL6 is required for tumorigenesis. Genes Dev, 21, 1714-9. BARTKOVA, J., REZAEI, N., LIONTOS, M., KARAKAIDOS, P., KLETSAS, D., ISSAEVA, N., VASSILIOU, L. V., KOLETTAS, E., NIFOROU, K., ZOUMPOURLIS, V. C., TAKAOKA, M., NAKAGAWA, H., TORT, F., FUGGER, K., JOHANSSON, F., SEHESTED, M., ANDERSEN, C. L., DYRSKJOT, L., ORNTOFT, T., LUKAS, J., KITTAS, C., HELLEDAY, T., HALAZONETIS, T. D., BARTEK, J. & GORGOULIS, V. G. (2006) Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature, 444, 633-7. BASTIAN, B. C. (2003) Understanding the progression of melanocytic neoplasia using genomic analysis: from fields to cancer. Oncogene, 22, 3081-6. BRYAN, T. M. & REDDEL, R. R. (1997) Telomere dynamics and telomerase activity in in vitro immortalised human cells. Eur J Cancer, 33, 767-73. CAMPISI, J. (1997) The biology of replicative senescence. Eur J Cancer, 33, 703-9. CAMPISI, J. & D'ADDA DI FAGAGNA, F. (2007) Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol, 8, 729-40. CASTRO, P., GIRI, D., LAMB, D. & ITTMANN, M. (2003) Cellular senescence in the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia. Prostate, 55, 30-8.

28

CASTRO, P., XIA, C., GOMEZ, L., LAMB, D. J. & ITTMANN, M. (2004) Interleukin-8 expression is increased in senescent prostatic epithelial cells and promotes the development of benign prostatic hyperplasia. Prostate, 60, 153-9. COLLINS, K. (2006) The biogenesis and regulation of telomerase holoenzymes. Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 484-94. COPPE, J. P., DESPREZ, P. Y., KRTOLICA, A. & CAMPISI, J. (2010) The senescenceassociated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol, 5, 99-118. COPPE, J. P., KAUSER, K., CAMPISI, J. & BEAUSEJOUR, C. M. (2006) Secretion of vascular endothelial growth factor by primary human fibroblasts at senescence. J Biol Chem, 281, 29568-74. COPPE, J. P., PATIL, C. K., RODIER, F., SUN, Y., MUNOZ, D. P., GOLDSTEIN, J., NELSON, P. S., DESPREZ, P. Y. & CAMPISI, J. (2008) Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol, 6, 2853-68. CUKUSIC, A., SKROBOT VIDACEK, N., SOPTA, M. & RUBELJ, I. (2008) Telomerase regulation at the crossroads of cell fate. Cytogenet Genome Res, 122, 263-72. DAVALOS, A. R., COPPE, J. P., CAMPISI, J. & DESPREZ, P. Y. (2010) Senescent cells as a source of inflammatory factors for tumor progression. Cancer Metastasis Rev, 29, 27383. DIMRI, G. P., LEE, X., BASILE, G., ACOSTA, M., SCOTT, G., ROSKELLEY, C., MEDRANO, E. E., LINSKENS, M., RUBELJ, I., PEREIRA-SMITH, O. & ET AL. (1995) A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 9363-7. DUAN, J., DUAN, J., ZHANG, Z. & TONG, T. (2005) Irreversible cellular senescence induced by prolonged exposure to H2O2 involves DNA-damage-and-repair genes and telomere shortening. Int J Biochem Cell Biol, 37, 1407-20. DUNHAM, M. A., NEUMANN, A. A., FASCHING, C. L. & REDDEL, R. R. (2000) Telomere maintenance by recombination in human cells. Nat Genet, 26, 447-50. ELMORE, L. W., REHDER, C. W., DI, X., MCCHESNEY, P. A., JACKSON-COOK, C. K., GEWIRTZ, D. A. & HOLT, S. E. (2002) Adriamycin-induced senescence in breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction. J Biol Chem, 277, 3550915.

29

EWALD, J. A., DESOTELLE, J. A., WILDING, G. & JARRARD, D. F. (2010) Therapyinduced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst, 102, 1536-46. FERBER, A., CHANG, C., SELL, C., PTASZNIK, A., CRISTOFALO, V. J., HUBBARD, K., OZER, H. L., ADAMO, M., ROBERTS, C. T., JR., LEROITH, D. & ET AL. (1993) Failure of senescent human fibroblasts to express the insulin-like growth factor-1 gene. J Biol Chem, 268, 17883-8. FINKEL, T. & HOLBROOK, N. J. (2000) Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, 408, 239-47. FIRTH, S. M. & BAXTER, R. C. (2002) Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins. Endocr Rev, 23, 824-54. FREUND, A., ORJALO, A. V., DESPREZ, P. Y. & CAMPISI, J. (2010) Inflammatory networks during cellular senescence: causes and consequences. Trends Mol Med, 16, 238-46. FUNAYAMA, R., SAITO, M., TANOBE, H. & ISHIKAWA, F. (2006) Loss of linker histone H1 in cellular senescence. J Cell Biol, 175, 869-80. FUSTER, J. J., FERNANDEZ, P., GONZALEZ-NAVARRO, H., SILVESTRE, C., NABAH, Y. N. & ANDRES, V. (2010) Control of cell proliferation in atherosclerosis: insights from animal models and human studies. Cardiovasc Res, 86, 254-64. GARRETT, M. D. (2001) Cell cycle control and cancer. CURRENT SCIENCE, 81, 515-522. GOLDSTEIN, S., MOERMAN, E. J., JONES, R. A. & BAXTER, R. C. (1991) Insulin-like growth factor binding protein 3 accumulates to high levels in culture medium of senescent and quiescent human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 88, 9680-4. HAN, Z., WEI, W., DUNAWAY, S., DARNOWSKI, J. W., CALABRESI, P., SEDIVY, J., HENDRICKSON, E. A., BALAN, K. V., PANTAZIS, P. & WYCHE, J. H. (2002) Role of p21 in apoptosis and senescence of human colon cancer cells treated with camptothecin. J Biol Chem, 277, 17154-60. HARA, E., SMITH, R., PARRY, D., TAHARA, H., STONE, S. & PETERS, G. (1996) Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol, 16, 859-67. HATINA J., R. J. (2001) Molekulární biologie buněčné imortalizace a její vztah ke karcinogenezi. Klinická onkologie, 14, 145-153 HAYFLICK, L. & MOORHEAD, P. S. (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res, 25, 585-621. CHAKRAVARTHY, M. V., ABRAHA, T. W., SCHWARTZ, R. J., FIOROTTO, M. L. & BOOTH, F. W. (2000) Insulin-like growth factor-I extends in vitro replicative life span 30

of skeletal muscle satellite cells by enhancing G1/S cell cycle progression via the activation of phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signaling pathway. J Biol Chem, 275, 35942-52. CHANG, B. D., BROUDE, E. V., DOKMANOVIC, M., ZHU, H., RUTH, A., XUAN, Y., KANDEL, E. S., LAUSCH, E., CHRISTOV, K. & RONINSON, I. B. (1999) A senescence-like phenotype distinguishes tumor cells that undergo terminal proliferation arrest after exposure to anticancer agents. Cancer Res, 59, 3761-7. CHANG, B. D., SWIFT, M. E., SHEN, M., FANG, J., BROUDE, E. V. & RONINSON, I. B. (2002) Molecular determinants of terminal growth arrest induced in tumor cells by a chemotherapeutic agent. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 389-94. CHOI, J., SHENDRIK, I., PEACOCKE, M., PEEHL, D., BUTTYAN, R., IKEGUCHI, E. F., KATZ, A. E. & BENSON, M. C. (2000) Expression of senescence-associated betagalactosidase in enlarged prostates from men with benign prostatic hyperplasia. Urology, 56, 160-6. JAROLÍM, L. (2008) Benigní hyperplazie prostaty: rady pacientům, p.11. 1st Ed., Triton, Praha. KENNETH, D. K., M.A.; JIAQUAN XU, M.D.; SHERRY L. MURPHY, B.S.; ARIALDI M. MINIÑO, MPH, AND HSIANG-CHING KUNG, PH.D (2011) Deaths: Preliminary Data for 2009. National Vital Statistics Reports. Atlanta, Centers for Disease Control and Prevention KOVACIC, P. (2011) Hydroxyurea (therapeutics and mechanism): metabolism, carbamoyl nitroso, nitroxyl, radicals, cell signaling and clinical applications. Med Hypotheses, 76, 24-31. KRIZHANOVSKY, V., YON, M., DICKINS, R. A., HEARN, S., SIMON, J., MIETHING, C., YEE, H., ZENDER, L. & LOWE, S. W. (2008) Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell, 134, 657-67. KRTOLICA, A., PARRINELLO, S., LOCKETT, S., DESPREZ, P. Y. & CAMPISI, J. (2001) Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 12072-7. KUILMAN, T., MICHALOGLOU, C., VREDEVELD, L. C., DOUMA, S., VAN DOORN, R., DESMET, C. J., AARDEN, L. A., MOOI, W. J. & PEEPER, D. S. (2008) Oncogeneinduced senescence relayed by an interleukin-dependent inflammatory network. Cell, 133, 1019-31. KUILMAN, T. & PEEPER, D. S. (2009) Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer, 9, 81-94. 31

KUMAZAKI, T., KOBAYASHI, M. & MITSUI, Y. (1993) Enhanced expression of fibronectin during in vivo cellular aging of human vascular endothelial cells and skin fibroblasts. Exp Cell Res, 205, 396-402. LAIHO, M., DECAPRIO, J. A., LUDLOW, J. W., LIVINGSTON, D. M. & MASSAGUE, J. (1990) Growth inhibition by TGF-beta linked to suppression of retinoblastoma protein phosphorylation. Cell, 62, 175-85. LIU, D. & HORNSBY, P. J. (2007) Senescent human fibroblasts increase the early growth of xenograft tumors via matrix metalloproteinase secretion. Cancer Res, 67, 3117-26. LLEONART, M. E., ARTERO-CASTRO, A. & KONDOH, H. (2009) Senescence induction; a possible cancer therapy. Mol Cancer, 8, 3. LOU, Z. & CHEN, J. (2006) Cellular senescence and DNA repair. Exp Cell Res, 312, 2641-6. MAJUMDER, P. K., GRISANZIO, C., O'CONNELL, F., BARRY, M., BRITO, J. M., XU, Q., GUNEY, I., BERGER, R., HERMAN, P., BIKOFF, R., FEDELE, G., BAEK, W. K., WANG, S., ELLWOOD-YEN, K., WU, H., SAWYERS, C. L., SIGNORETTI, S., HAHN, W. C., LODA, M. & SELLERS, W. R. (2008) A prostatic intraepithelial neoplasia-dependent p27 Kip1 checkpoint induces senescence and inhibits cell proliferation and cancer progression. Cancer Cell, 14, 146-55. MALUMBRES, M. & BARBACID, M. (2009) Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nat Rev Cancer, 9, 153-66. MARTENS, U. M., CHAVEZ, E. A., POON, S. S., SCHMOOR, C. & LANSDORP, P. M. (2000) Accumulation of short telomeres in human fibroblasts prior to replicative senescence. Exp Cell Res, 256, 291-9. MARTIN, J. A. & BUCKWALTER, J. A. (2003) The role of chondrocyte senescence in the pathogenesis of osteoarthritis and in limiting cartilage repair. J Bone Joint Surg Am, 85-A Suppl 2, 106-10. MASSAGUE, J. (2008) TGFbeta in Cancer. Cell, 134, 215-30. MEYERSON, M., COUNTER, C. M., EATON, E. N., ELLISEN, L. W., STEINER, P., CADDLE, S. D., ZIAUGRA, L., BEIJERSBERGEN, R. L., DAVIDOFF, M. J., LIU, Q., BACCHETTI, S., HABER, D. A. & WEINBERG, R. A. (1997) hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell, 90, 785-95. MICHALOGLOU, C., VREDEVELD, L. C., SOENGAS, M. S., DENOYELLE, C., KUILMAN, T., VAN DER HORST, C. M., MAJOOR, D. M., SHAY, J. W., MOOI, W.

32

J. & PEEPER, D. S. (2005) BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature, 436, 720-4. MICHISHITA, E., NAKABAYASHI, K., SUZUKI, T., KAUL, S. C., OGINO, H., FUJII, M., MITSUI, Y. & AYUSAWA, D. (1999) 5-Bromodeoxyuridine induces senescence-like phenomena in mammalian cells regardless of cell type or species. J Biochem, 126, 10529. MINAMINO, T., MIYAUCHI, H., YOSHIDA, T., ISHIDA, Y., YOSHIDA, H. & KOMURO, I. (2002) Endothelial cell senescence in human atherosclerosis: role of telomere in endothelial dysfunction. Circulation, 105, 1541-4. NARITA, M., NUNEZ, S., HEARD, E., NARITA, M., LIN, A. W., HEARN, S. A., SPECTOR, D. L., HANNON, G. J. & LOWE, S. W. (2003) Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell, 113, 703-16. PARK, J. I., JEONG, J. S., HAN, J. Y., KIM, D. I., GAO, Y. H., PARK, S. C., RODGERS, G. P. & KIM, I. H. (2000) Hydroxyurea induces a senescence-like change of K562 human erythroleukemia cell. J Cancer Res Clin Oncol, 126, 455-60. PARRINELLO, S., COPPE, J. P., KRTOLICA, A. & CAMPISI, J. (2005) Stromal-epithelial interactions in aging and cancer: senescent fibroblasts alter epithelial cell differentiation. J Cell Sci, 118, 485-96. PETITJEAN A., MATHE E., KATO S., ISHIOKA C., TAVTIGIAN S.V., HAINAUT P., OLIVIER M. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database. Hum Mutat. 2007 Jun;28(6):622-9. (R15, November 2010 is the latest) POLLOCK, P. M., HARPER, U. L., HANSEN, K. S., YUDT, L. M., STARK, M., ROBBINS, C. M., MOSES, T. Y., HOSTETTER, G., WAGNER, U., KAKAREKA, J., SALEM, G., POHIDA, T., HEENAN, P., DURAY, P., KALLIONIEMI, O., HAYWARD, N. K., TRENT, J. M. & MELTZER, P. S. (2003) High frequency of BRAF mutations in nevi. Nat Genet, 33, 19-20. PRENCIPE, M., FITZPATRICK, P., GORMAN, S., TOSETTO, M., KLINGER, R., FURLONG, F., HARRISON, M., O'CONNOR, D., RONINSON, I. B., O'SULLIVAN, J. & MCCANN, A. (2009) Cellular senescence induced by aberrant MAD2 levels impacts on paclitaxel responsiveness in vitro. Br J Cancer, 101, 1900-8. ROBERSON, R. S., KUSSICK, S. J., VALLIERES, E., CHEN, S. Y. & WU, D. Y. (2005) Escape from therapy-induced accelerated cellular senescence in p53-null lung cancer cells and in human lung cancers. Cancer Res, 65, 2795-803. 33

ROPIQUET, F., GIRI, D., LAMB, D. J. & ITTMANN, M. (1999) FGF7 and FGF2 are increased in benign prostatic hyperplasia and are associated with increased proliferation. J Urol, 162, 595-9. ROTH, C. W., KOBESKI, F., WALTER, M. F. & BIESSMANN, H. (1997) Chromosome end elongation by recombination in the mosquito Anopheles gambiae. Mol Cell Biol, 17, 5176-83. SANDAL, T. (2002) Molecular aspects of the mammalian cell cycle and cancer. Oncologist, 7, 73-81. SATO, I., MORITA, I., KAJI, K., IKEDA, M., NAGAO, M. & MUROTA, S. (1993) Reduction of nitric oxide producing activity associated with in vitro aging in cultured human umbilical vein endothelial cell. Biochem Biophys Res Commun, 195, 1070-6. SELL, C., PTASZNIK, A., CHANG, C. D., SWANTEK, J., CRISTOFALO, V. J. & BASERGA, R. (1993) IGF-1 receptor levels and the proliferation of young and senescent human fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun, 194, 259-65. SERRANO, M., LIN, A. W., MCCURRACH, M. E., BEACH, D. & LOWE, S. W. (1997) Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell, 88, 593-602. SCHWARZE, S. R., FU, V. X., DESOTELLE, J. A., KENOWSKI, M. L. & JARRARD, D. F. (2005) The identification of senescence-specific genes during the induction of senescence in prostate cancer cells. Neoplasia, 7, 816-23. SPRENGER, C. C., VAIL, M. E., EVANS, K., SIMURDAK, J. & PLYMATE, S. R. (2002) Over-expression of insulin-like growth factor binding protein-related protein-1(IGFBPrP1/mac25) in the M12 prostate cancer cell line alters tumor growth by a delay in G1 and cyclin A associated apoptosis. Oncogene, 21, 140-7. STRIETER, R. M., BURDICK, M. D., MESTAS, J., GOMPERTS, B., KEANE, M. P. & BELPERIO, J. A. (2006) Cancer CXC chemokine networks and tumour angiogenesis. Eur J Cancer, 42, 768-78. SUZUKI, T., MINAGAWA, S., MICHISHITA, E., OGINO, H., FUJII, M., MITSUI, Y. & AYUSAWA,

D.

(2001)

Induction

of

senescence-associated

genes

by

5-

bromodeoxyuridine in HeLa cells. Exp Gerontol, 36, 465-74. TE POELE, R. H., OKOROKOV, A. L., JARDINE, L., CUMMINGS, J. & JOEL, S. P. (2002) DNA damage is able to induce senescence in tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Res, 62, 1876-83.

34

TOUSSAINT, O., MEDRANO, E. E. & VON ZGLINICKI, T. (2000) Cellular and molecular mechanisms of stress-induced premature senescence (SIPS) of human diploid fibroblasts and melanocytes. Exp Gerontol, 35, 927-45. TREMAIN, R., MARKO, M., KINNIMULKI, V., UENO, H., BOTTINGER, E. & GLICK, A. (2000) Defects in TGF-beta signaling overcome senescence of mouse keratinocytes expressing v-Ha-ras. Oncogene, 19, 1698-709. VENTURA, A., KIRSCH, D. G., MCLAUGHLIN, M. E., TUVESON, D. A., GRIMM, J., LINTAULT, L., NEWMAN, J., RECZEK, E. E., WEISSLEDER, R. & JACKS, T. (2007) Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature, 445, 6615. WANG, E. (1995) Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res, 55, 2284-92. WANG, X., WONG, S. C., PAN, J., TSAO, S. W., FUNG, K. H., KWONG, D. L., SHAM, J. S. & NICHOLLS, J. M. (1998) Evidence of cisplatin-induced senescent-like growth arrest in nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Res, 58, 5019-22. WILSON, H. M., BIRNBAUM, R. S., POOT, M., QUINN, L. S. & SWISSHELM, K. (2002) Insulin-like growth factor binding protein-related protein 1 inhibits proliferation of MCF7 breast cancer cells via a senescence-like mechanism. Cell Growth Differ, 13, 205-13. WU, S., HULTQUIST, A., HYDBRING, P., CETINKAYA, C., OBERG, F. & LARSSON, L. G. (2009) TGF-beta enforces senescence in Myc-transformed hematopoietic tumor cells through induction of Mad1 and repression of Myc activity. Exp Cell Res, 315, 3099-111. XIN, M. G., ZHANG, J., BLOCK, E. R. & PATEL, J. M. (2003) Senescence-enhanced oxidative stress is associated with deficiency of mitochondrial cytochrome c oxidase in vascular endothelial cells. Mech Ageing Dev, 124, 911-9. YEO, E. J., HWANG, Y. C., KANG, C. M., KIM, I. H., KIM, D. I., PARKA, J. S., CHOY, H. E., PARK, W. Y. & PARK, S. C. (2000) Senescence-like changes induced by hydroxyurea in human diploid fibroblasts. Exp Gerontol, 35, 553-71. ZAWEL, L., DAI, J. L., BUCKHAULTS, P., ZHOU, S., KINZLER, K. W., VOGELSTEIN, B. & KERN, S. E. (1998) Human Smad3 and Smad4 are sequence-specific transcription activators. Mol Cell, 1, 611-7.

35