BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA
FERTŐZŐ KÓROKOZÓK LÉTFONTOSSÁGÚ, NUKLEOTID ÁTALAKÍTÁST VÉGZŐ ENZIMEI KATALITIKUS MECHANIZMUSÁNAK VIZSGÁLATA
Doktori értekezés
Nagy Gergely Nándor okleveles vegyészmérnök Témavezető: Prof. Vértessy G. Beáta az MTA doktora, egyetemi tanár
Készült a Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Kutatóközpont Enzimológiai Intézetében
Budapest, 2015
2
Saját szerepem a doktori dolgozat elkészítésében A doktori dolgozatomban bemutatott eredmények számos kutató közös erőfeszítésének köszönhetően születtek. Mivel meggyőződésem, hogy a tudományos kutatást csak csapatmunkában lehet eredményesen végezni, a dolgozat szövegének megfogalmazásánál többes szám első személy módot alkalmaztam. Mindezzel szeretném kifejezni hálámat azok felé, akik bármilyen módon segítettek tudományos pályafutásom során. Doktori dolgozatom a 7.1. fejezetben felsorolt első szerzős, vagy megosztott első szerzős közleményeimen alapul, melynek tervezését, a munka kivitelezését, kiértékelését és megírását én végeztem. A dolgozat tárgyának részét képező kísérletek egy részét társszerzőimnek köszönhetem; ezen kísérletek meghatározó szereppel bírnak az eredményekből levonható következtetések megalkotásában, a doktori dolgozat jelen formájának kialakulásában. Alább közlöm munkatársaim kísérletes hozzájárulását a doktori munkához. Együttműködő partner
Hozzájárulás a doktori dolgozathoz
dr. Takács Enikő dr. Tóth Judit
Részvétel az MtDUT konstruktok létrehozásában. MtDUT oldatbeli vizsgálatok: stopped-flow és quench flow aktivitás mérések, ligand kötés vizsgálatok (4.1.1. és 4.1.2. fejezetek).
dr. Harmat Veronika Leveles Ibolya
Röntgendiffrakciós kísérlet MtDUTD28N fehérjekristállyal. Diffrakciós adatfeldolgozás. Közreműködés a szerkezetmegoldásban (4.1.3. fejezet).
Krámos Balázs dr. Oláh Julianna
PfCCT homológia modellek elkészítése és validálása (4.2.3 fejezet).
Ozohanics Olivér, Rokobné dr. Révész Ágnes Dr. Vékey Károly (témavezető)
PfCCT MΔK és pontmutáns konstruktok oligomerizációs allapotának tömegspektroszkópiai jellemzése (4.2.4 és 4.3.1. fejezetek).
Laura Michaela-Ardelean Florin Dan Irimie (témavezető)
PfCCT MΔKW692Y konstrukt kinetikai jellemzése (4.3.2. fejezet).
Marton Lívia
Részvétel a következő folyamatokban: 12. ábra készítése, PfCCT MΔK fehérje pontmutáns konstruktok létrehozása, termelése, enzim aktivitás mérések (4.3. fejezet). PDB adatbázis keresés, az azonosított szerkezetek értékelése és ábrázolása (4.4. fejezet). 3
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ......................................................................................................4 A dolgozatban gyakran használt molekuláris biológiai kifejezések és ezek jelentése .................................................................................................................13 1.
Irodalmi áttekintés .............................................................................................15 1.1. A Mycobacterium tuberculosis tuberkulózis kórokozó számára létfontosságú dUTP pirofoszfatáz enzim...............................................................15 1.1.1.
A tuberkulózis ...................................................................................15
1.1.2.
A tuberkulózis elleni védőoltás .........................................................16
1.1.3.
A tuberkulózis gyógyszeres kezelése ................................................17
1.1.4. A Mycobacterium fajok timidilát bioszintézis útvonala, mint lehetséges gyógyszercélpont .............................................................................18 1.1.5.
A dUTPáz enzim szerkezete és reakciómechanizmusa .....................20
1.1.6.
A Mg2+ kofaktor szerepe a dUTPáz enzim működésében .................24
1.2. A Plasmodium falciparum malária kórokozó számára létfontosságú CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim............................................................25 1.2.1.
A malária ...........................................................................................25
1.2.2.
A fertőzést okozó Plasmodium paraziták ..........................................25
1.2.3.
Maláriaellenes vakcina fejlesztés ......................................................27
1.2.4.
A szúnyog-vektor kontrollja ..............................................................27
1.2.5.
Maláriaellenes gyógyszeres terápia ...................................................28
1.2.6. A parazita lipid metabolizmusa, mint lehetséges maláriaellenes gyógyszercélpont ...............................................................................................31 1.2.7.
A CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim fiziológiás szerepe .....33
1.2.8.
A CCT enzim reakciómechanizmusa ................................................36
1.2.9.
A CCT enzim kolin-kötő zsebének szerkezete ..................................37
1.2.10.
A Plasmodium paraziták CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzime.. ...........................................................................................................39
2.
Célkitűzések ......................................................................................................41
3.
Anyagok és módszerek ......................................................................................43 3.1.
PfCCT szerkezeti modellek létrehozása és validálása ...............................43 4
3.2.
Klónozás és mutagenezis ...........................................................................43
3.2.1.
Rekombináns fehérjék termelése és tisztítása ...................................45
3.3.
Fehérje tömegspektrometria ......................................................................47
3.4.
Differenciális pásztázó fluorimetria (Thermofluor) ..................................48
3.5.
Enzim aktivitás mérések ............................................................................48
3.5.1.
Folytonos dUTPáz steady-state enzimaktivitás mérés ......................48
3.5.2.
Megállított áramlás (stopped-flow) dUTPáz aktivitás-mérések ........49
3.5.3.
Quench flow dUTPáz aktivitás mérés ...............................................50
3.5.4. mérés
Folytonos spektrofotometriás PfCCT steady-state enzimaktivitás ...........................................................................................................50
3.6.
Izotermális titrációs kalorimetria ...............................................................53
3.7.
Egyensúlyi ligandkötés mérése fluoreszcencia spektroszkópia módszerrel .. 54
3.7.1.
dUTPáz fluoreszcencia titrálások ......................................................54
3.7.2.
CCT fluoreszcencia titrálások ...........................................................55
3.8.
Fehérje kristályosítás és krisztallográfia ...................................................56
3.8.1.
Fehérje kristályosítás .........................................................................56
3.8.2.
Krisztallográfiai adatgyűjtés és szerkezet meghatározás ...................56
3.9. Enzim és receptor típusú kvaterner-ammónium kötőhelyek keresése Protein Data Bank adatbázisban ............................................................................57 4.
Eredmények bemutatása és értékelése...............................................................59 4.1. dUTPáz Mg2+ kofaktor koordináció vizsgálata, oldatbeli és szerkezeti vizsgálatok .............................................................................................................59 4.1.1.
Az MtDUTD28N mutáció hatásának kinetikai vizsgálata ....................59
4.1.2.
MtDUTD28N, H145W szubsztrát és termék kötésének vizsgálata ............62
4.1.3. A MtDUTD28N mutáns szerkezeti vizsgálata: a pontmutáció továbbterjedő szerkezeti hatása .........................................................................64 4.1.4. Az MtDUTD28N pontmutáns fehérje oldatbeli és szerkezeti vizsgálatainak együttes értékelése .....................................................................70 4.2. A PfCCT katalitikus domént tartalmazó konstrukt létrehozása és működésének jellemzése .......................................................................................72 4.2.1.
A PfCCT rendezetlenségi vizsgálata .................................................72 5
4.2.2. Kísérleti vizsgálatokhoz alkalmas, enzimatikus aktivitással bíró PfCCT konstrukt létrehozása .............................................................................73 4.2.3.
A PfCCT katalitikus domén szerkezeti jellemzése ............................74
4.2.4.
A PfCCT MΔK tisztítása és oligomerizációs állapotának jellemzése ... ...........................................................................................................76
4.2.5.
A PfCCT reakciómechanizmusának kinetikai vizsgálata ..................78
4.2.6. A kolin csoportot tartalmazó szubsztrát és termék egyensúlyi kőtődésének vizsgálata izotermális titrációs kalorimetria (ITC) módszerrel ....81 4.2.7.
A Mg2+ jelenléte csökkenti az enzim CTP affinitását........................84
4.2.8. során
A Mg2+ szerepének értelmezése a PfCCT CTP kötése és katalízise ...........................................................................................................86
4.2.9. Az enzim saját (intrinsic) fluoreszcens jele a ChoP illetve CDPCho ligand kötött állapotok közötti különbségeket mutatja ......................................87 4.2.10. A PfCCT ChoP kölcsönhatás elemzése a kinetikai és ligand-kötési eredmények fényében ........................................................................................90 4.3.
A PfCCT kolin kötőhely kölcsönhatásainak jellemzése............................91
4.3.1.
Pontmutáns konstruktok létrehozása és oldatbeli állapotuk vizsgálata . ...........................................................................................................91
4.3.2. A kötőhely egyes kölcsöhatásainak enzim aktivitásra és ligand kötésre gyakorolt hatása ....................................................................................93 4.4.
Fehérjék kvaterner-ammónium kötőhelyének szerkezeti elemzése ..........99
4.4.1.
Általános enzim típusú kvaterner-ammónium kötőhely azonosítása .... ...........................................................................................................99
4.4.2. A kvaterner-ammónium ligandot átalakító enzimek és receptorok kötőhelyének és működésének összevetése.....................................................102 5.
Összefoglalás ...................................................................................................106
6.
Irodalomjegyzék ..............................................................................................109
7.
Közlemények listája ........................................................................................129 7.1.
A doktori értekezés témájához kapcsolódó originális közlemények .......129
7.2.
További közlemények .............................................................................130
7.3.
Konferencia előadások ............................................................................130
7.3.1.
Konferencián tartott szóbeli előadások (előadó neve aláhúzva) ......130
6
7.3.2. 8.
Konferencián tartott poszter előadások (előadó neve aláhúzva) .....131
Függelék ..........................................................................................................133 8.1. Röntgen-krisztallográfiai mérések, illetve a modellépítés és finomítás statisztikai adatai .................................................................................................133 8.2.
PfCCT konstruktok tömegspektruma ......................................................134
8.3.
Összetett aromás doboz felépítésű enzim aktív helyek ...........................136
8.4.
Aromás doboz típusú ligand felismerő helyek receptor fehérjékben ......137
8.5.
Összetett aromás doboz felépítésű enzim kötő helyek ............................139
8.6.
Aromás doboz felépítésű receptor kötő helyek .......................................140
7
Köszönetnyilvánítás
Mindenekelőtt szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Prof. Vértessy Beátának hogy befogadott kutatócsoportjába és közös munkánk során végig megtapasztalhattam
szeretetteljes
támogatását.
Enzimológiai
érdeklődésemet
meghatározta lelkesedése, nyitottsága az új ismeretekre, valamint a közös problémamegoldás és gondolkodás folyamata. Köszönöm volt témavezetőm, Dr. Nagy József támogatását tudományos diákköri munkám során, mely nagy hatással volt szerves kémiai gondolkodásomra. Megtisztelőnek tartom, hogy kutatásom során együttműködhettem Prof. Henri Vial-lal. Tudományhoz való hozzáállása és embersége mély nyomott hagyott bennem. Hálásan köszönöm Dr. Marton Líviának, hogy az elmúlt három év termékeny közös munkáját és az inspiráló megbeszéléseket. Köszönöm Dr. Harmat Veronikának és Leveles Ibolyának, hogy bevezettek a fehérje krisztallográfia világába nagy türelemmel segítettek a fehérje szerkezetmegoldás során. Köszönettel tartozom Róna Gergelynek, akihez mindig bátran fordulhattam metodikai kérdéseimmel. Köszönöm Dr. Tóth Juditnak hasznos javaslatait, tanácsait. Köszönöm Hajdú Fanninak, hogy lendületével, pontos munkájával valamint érdeklődésével inspirált. Köszönöm továbbá a közös munkát Prof. Rachel Cerdannak, Alicia Contet-nek Laura-Michaela Ardelean-nak, Lopata Annának, Benedek Andrásnak és Varga Ágnesnek. Köszönet illeti Dr. Krámos Balázs, Dr. Oláh Julianna, Ozohanics Olivér, Rokobné Dr. Révész Ágnes és Dr. Vékey Károly együttműködő partnereimet, hogy értékes eredményeikkel emelték a dolgozat színvonalát. Köszönöm a kutatócsoport összes tagjának segítségét és észrevételeit munkám során, valamint, hogy ilyen jó közösséget alkotunk. Köszönet illeti Prof. Nyulászi Lászlót, a BME Oláh György Kémiai Doktori Iskola vezetőjét, valamint Prof. Salgó Andrást, az Alkalmazott Biokémiai és Élelmiszertudományi Tanszék tanszékvezetőjét, akik lehetővé tették PhD tanulmányaim elvégzését. Köszönöm Prof. Závodszky Péternek és Dr. Buday Lászlónak, az Enzimológiai
8
Intézet volt és jelenlegi igazgatójának, valamint Dr Keserű György Miklós kutatóintézeti főigazgatónak, hogy kutatómunkámat az MTA TTK Enzimológiai Intézetében végezhettem. Köszönöm a doktori munkám elvégzéséhez nyújtott nagylelkű támogatást Szabó Zsuzsa aranydiplomás vegyészmérnöknek. Továbbá köszönöm a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány, valamint a Varga József Alapítvány támogatását, melyek doktori munkám befejezését segítették.
Végül, de nem utolsósorban hálásan köszönöm Feleségem és Családom szeretetét, támogatását, türelmét. Köszönöm Borókának, hogy épségben megérkezett közénk.
9
A dolgozatban gyakran használt rövidítések jegyzéke BCG
Bacillus Calmette-Guérin, tuberkulózisellenes védőoltás
BER
base excision repair, báziskivágó javítómechanizmus
bp
bázispár
CCT
CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim
cDNS
mRNS reverz transzkripcióval előállított, intronokat nem tartalmazó DNS
CDPCho
CDP-kolin, citidin-difoszfát-kolin
CEPT
kolin/etanolamin foszfotranszferáz enzim
ChoP
kolin-foszfát v. foszfokolin
CK
kolin kináz enzim
C-terminális
karboxi-terminális
CTP
citidin-trifoszfát
DAG
diacilglicerin
dCTP
dezoxicitidin-trifoszfát
DDT
diklór-difenil-triklóretán
DNáz
dezoxi-ribonukleáz enzim
DNS
dezoxi-ribonukleinsav
dTMP
timidiát, timidin-monofoszfát
DTT
ditiotreitol
dTTP
timidin-trifoszfát
dUDP
2'-dezoxiuridin-difoszfát
dUMP
2'-dezoxiuridin-monofoszfát
dUPNPP
2'-dezoxiuridin 5'-(α, β-imido)-trifoszfát, lassan hidrolizálható nukleotid analóg
dUTP
2'-dezoxiuridin-trifoszfát
dUTPáz
dUTP pirofoszfatáz enzim
E. coli
Escherichia coli baktérium
ECT
CTP:etanolamin-foszfát citidililtranszferáz enzim
EDTA
etilén-diamin-tetraecetsav 10
GCT
CTP:glicerol-3-foszfát citidililtranszferáz enzim
hDUT
humán dUTPáz enzim
HEPES
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetánszulfonsav
HIGH nukleotidil-
a nukleotid kötő hurokban HIGH motívumot tartalmazó,
transzferáz enzim
azonos evolúciós klaszterbe tartozó enzimek csoportja
szupercsalád HIV
emberi immunhiány-előidéző vírus
IPTG
izopropil- β-D-1-tiogalaktopiranozid
ITC
izotermális titrációs kalorimetria
kcat
átalakítási szám
Kd
disszociációs állandó
Ki
inhibíciós állandó
KM
Michaelis kinetikai állandó
LB
Luria-Bertani baktérium tápoldat
M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis baktérium
MDR-TB
multidrug-resistant tuberculosis, több gyógyszernek ellenálló multirezisztens tuberkulózis
MES
7-metil-6-tioguanin
MESG
2-Amino-6-merkapto-7-metilpurin
MtDUT
Mycobacterium tuberculosis dUTPáz enzim
Ndk
nukleozid difoszfát kináz enzim
Ndr
nukleozid difoszfát reduktáz enzim
Ni-NTA
nikkel nitrilotriecetsav, fehérje tisztításhoz használt, szilárd hordizóhoz rögzített kelátor
NLS
magi lokalizációs szignál, nuclear localization signal
NPP
a Plasmodium paraziták hatóanyagfelvételét segítő új permeációs útvonalak a fertőzött vörösvértest membránján
N-terminális
amino-terminális
P. falciparum
Plasmodium falciparum parazita, a malária kórokozója
PAS
para-amino-szalicilsav
11
PBS
foszfáttal pufferált sóoldat, phosphate buffered saline
PC
foszfatidilkolin
PCR
polimeráz láncreakció
PDB
Protein Data Bank, Fehérje Adatbank
PE
foszfatidiletanolamin
PfCCT MΔK
a PfCCT enzim csonkított konstruktja, mely annak 528795 szakaszát tartalmazza, a lizinben gazdag 720-737 szegmens kivételével
PMDB
Protein Model Database, Fehérje homológia modell adatbázis
PMSF
fenil-metil-szulfonil-fluorid
PMT
foszfoetanolamin N-metiltranszferáz enzim
PPi
pirofoszfát
QM/MM
kvantummechanika és molekulamechanika kombinációján alapuló szimuláció
RNáz
ribonukleáz enzim
SDS-PAGE
nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis
TBC
tüdőgömőkór, tuberkulózis
TCEP
trisz-(2-karboxietil)-foszfin
ThyA, ThyX
mikobakteriális timidilát szintáz enzimek
TRIS
trisz(hidroximetil)-aminometán
UV
a látható fénynél kisebb hullámhosszú, ibolyántúli, ultraibolya sugárzás
WHO
World Health Organization, Egészségügyi Világszervezet
XDR TB
extensively drug-resistant, kitejedten gyógyszerellenálló tuberkulózis
βME
2-merkaptoetanol
γ32
γ-foszfátján 32P radioaktív jelzésű 2'-dezoxiuridin-trifoszfát
γ32
32
P-dUTP PPi
P radioaktív jelzésű pirofoszfát
12
A dolgozatban gyakran használt molekuláris biológiai kifejezések és ezek jelentése egyszeres átviteli kinetikai körülmény (single turnover): Olyan kinetikai mérés körülmény, mely során egy enzim aktív helyen csak egyetlen katalitikus átalakítás megy végbe, a szubsztráténál magasabb enzim aktív hely koncentráció miatt. fluoreszcencia kioltás (quench): a fluorofór által kibocsátott fény intenzitás csökkenése. Michaelis állandó (KM): Kinetikai állandó, a titrálás során változó koncentrációjú szubsztrát azon koncentrációjának felel meg, mely a maximális kezdeti reakciósebesség felét eredményezi, a többi szubsztrát feleslegének jelenlétében. katalitikus hatékonyság: az átalakítási szám és a Michaelis állandó hányadosa (kcat/ KM), másodrendű sebességi állandó. Az enzim katalitikusan kompetens szubsztrát komplex termék komplexszé alakulásának (ES → EP átalakulás) kezdeti sebességét jellemzi, [S]<< KM esetén. katalitikus sebességi állandó vagy átalakítási szám (kcat) Egy másodperc alatt az enzim egy aktív helyére jutó átalakított szubsztrát molekulák száma, telítési szubsztrát konncentráció megléte esetén. kinetikus mechanizmus: Az enzim katalizált reakció során a szubsztrátok bekötődésének és a termékek távozásának sorrendje. konstrukt: mesterségesen létrehozott fehérje. pontmutáns fehérje: helyspecifikus mutagenezissel létrehozott fehérje. steady state kinetikai állapot: Olyan reakciókörülmény, mely során az enzim reakció egyes intermedierjeinek keletkezése és tovább alakulása azonos sebességgel zajlik.
13
Bevezetés
Korunk két súlyos fertőző betegsége a malária és a tüdőbaj (tuberkulózis), melyek mind a mai napig komoly egészségügyi kihívást jelentenek. Jóllehet a két betegség patomechanizmusa azonosíthatók
olyan
mikroorganizmus
nagymértékben kulcsfontosságú
különbözik,
mégis
enzimek,
melyek
életképességéhez
mindkét
esetben
az
fertőző
elengedhetetlenek
adott és
lehetséges
gyógyszercélpontot jelentenek. Jelen doktori dolgozatban a két kórokozó egy-egy nélkülözhetetlen enzimének, a Mycobacterium tuberculosis dUTPáznak valamint a Plasmodium falciparum CTP:foszfokolin citidililtranszferáznak a katalitikus mechanizmusát vizsgáltuk. A vizsgált két enzim hasonló kémiai átalakítást katalizál, nevezetesen pirofoszfát lehasítást eredményező nukleotid hidrolízist illetve transzfert.
A dolgozat irodalmi áttekintés részében külön-külön tárgyalva emeljük ki a kórokozókhoz köthető betegségek elleni küzdelem fontosságát, a vizsgált enzimek jelentőségét a kórokozók számára, valamint áttekintjük az enzimek szerkezetét és működését
leíró
irodalmi
ismereteket.
A
tudományos
célkitűzéseink
megfogalmazását követően a két enzim működésének vizsgálatával kapcsolatos eredményeinket szintén külön-külön tárgyaljuk. Felismeréseink részint általános érvénnyel bírnak a vizsgált enzimcsalád esetén, részint a kórokozó enzimének jellemzését szolgálják. Eredményeink így egy kezdeti lépést jelentenek a malária kórokozó lipid bioszintézisének, valamint a mikobaktériumok DNS hibajavítás folyamatának jobb megértéséhez. Mindezek reményeink szerint hozzájárulhatnak új típusú hatásmechanizmussal rendelkező malária- és tuberkulózisellenes gyógyszerek fejlesztéséhez.
14
1. Irodalmi áttekintés 1.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó számára létfontosságú dUTP pirofoszfatáz enzim A dolgozat 1.1 fejezete során felhasználtuk a dUTPázok működését is ismertető Nagy és munkatársai összefoglaló (review) közleményben (FEBS J. 2014 Sep;281(18):4207-23,
a
továbbiakban
7.2.
fejezet,
1.
közlemény)
tett
megállapításokat.
1.1.1. A tuberkulózis A tuberkulózis (TBC) vagy gümőkór az elmúlt száz év kutatási eredményei ellenére továbbra is a legtöbb halálesetet okozó fertőző betegség [1]. Jelenleg a világ népességének mintegy harmada fertőződött a tuberkulózist okozó Mycobacterium tuberculosis (MTB) baktériummal (1. ábra/A). A kórokozók leggyakrabban a tüdőt támadják meg (pulmonáris TBC), de a test egyéb szervei is, köztük az agy, a gerincvelő, a vesék is érintettek lehetnek a fertőzésben. A fertőzés első, látens szakaszában a kötőszövet és az immunsejtek körülveszik a tüdőben a kórokozókat, a fertőzés jellemző tüneteit, gümőket (lat.: tuberculum) képezve (1. ábra/B). A kórokozók hosszú ideig maradhatnak ebben az ún. dormáns állapotban, anélkül, hogy betegséget okoznának vagy fertőzésveszélyt jelentenének. A betegség aktív szakaszát véres köhögés és mellkasi fájdalom kíséri. A tuberkulózis baktériumai légi úton terjednek tovább, köhögés, orrfújás, nevetés vagy éneklés során a levegőbe jutva.
15
1. ábra A tuberkulózis kórokozója, a Mycobacterium tuberculosis. A) A baktérium pásztázó elektronmikroszkópiás képe. Forrás: http://textbookofbacteriology.net/ tuberculosis.html. B) A tüdőben megjelenő, fehér nyíllal jelölt tuberkulózis gümő mellkasi röntgen felvételen, Bomanji és munkatársai közleménye alapján [2].
Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) adatai szerint 2013-ban 9 millió új aktív tuberkulózis megbetegedést regisztráltak, továbbá 1,5 millió ember halt meg a betegség következtében [1]. A HIV fertőzés az immunrendszer legyengülése miatt súlyos veszélyeztető tényező tuberkulózis fertőzés esetén, a halálos esetek negyedét a tuberkulózis és a vírus közös fertőzése okozta. Az aktív betegség kialakulásában közre játszhat az elégtelen higiénés környezet, illetve a helytelen táplálkozás.
1.1.2. A tuberkulózis elleni védőoltás Az 1906-ban Albert Calmette és Camille Guerin által kifejlesztett, máig egyetlen elfogadott védőoltás fertőzésképtelenné tett Mycobacterium bovis baktériumot tartalmaz (Bacillus Calmette-Guérin, BCG). Az újszülött csecsemők BCG oltása kötelező a világ több, mint hatvannégy országában, így Magyarországon is. Ez az oltás elismerten képes hatékony védelmet nyújtani gyermekkorban a tuberkulózis súlyos formáival, az agyhártyagyulladással (tuberculosis meningitis) és a miliáris tuberkulózissal szemben [3]. Az oltás hatásának időtartamára azonban a földrajzi elhelyezkedéstől függően eltérő adatok állnak rendelkezésre [4]. Általánosságban igaz, hogy a fejlődő országokban az újabb vizsgálatok a hatásosság csökkenését
16
írták le. Mindezt részben a helyi természetes mikobaktérium flórával való érintkezés során már korábban kialakuló immunválasz okozhatja [5].
1.1.3. A tuberkulózis gyógyszeres kezelése A tuberkulózis megelőzését segítő vakcina mellett nagy előrelépést jelentett a betegség elleni küzdelemben a gyógyszeres terápia lehetősége. A XX. század második felében sorra azonosított antibiotikumok, (a teljesség igénye nélkül: sztreptomicin, izoniazid, etámbutol, pirazinamid, rifamipicin, para-amino-szalicilsav (PAS)) megteremtették a reményt a betegség hatékony visszaszorítására. Az elérhető tuberkulózisellenes kemoterápiás kezelést nehezíti a kórokozó Mycobaterium tuberculosis baktérium lassú fejlődése. Tizenhat órát kitevő osztódási ideje jelentősen meghaladja az egyéb baktériumokét: összehasonlításképpen, az Escherichia coli baktérium húsz percenként képes osztódásra. Ez hozzájárul ahhoz, hogy a hatékony gyógyszer-kombináción alapuló kezelés hosszan, akár fél évig is elnyúlik megszakítás nélkül, mely megköveteli a betegek nyomon követését és a terápiás tevékenység ellenőrzését [6]. Mindez számottevő problémát eredményez a nehezen együttműködő vagy a társadalom által megbélyegzett betegek esetén [7]. A gyakran nem megfelelően vezetett tuberkulózisellenes terápia hozzájárult a gyógyszer rezisztens baktérium törzsek megjelenéséhez az 1980-as években, melyek a jelenkor egy újabb súlyos egészségügyi kihívását jelentik [8]. Közülük a több gyógyszernek ellenálló multirezisztens (multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB) baktérium törzsek a betegség két hatékony első vonalbeli gyógyszerével, az izoniaziddal és a rifampicinnel szemben váltak rezisztenssé. A kiterjedten gyógyszer-rezisztens (extensively drug-resistant, XDR-TB) törzsek ezeken felül legalább további három második vonalbeli tuberkulózisellenes gyógyszerrel szemben is rezisztenciát mutatnak. Az ilyen típusú megbetegedések esetén alkalmazott terápia jelentősen hosszabb időre, akár másfél évre nyúlhat. Mindezek a megfontolások és
a jelenleg használatos
gyógyszerek elleni rezisztencia
nagymértékű terjedése a kórokozó molekuláris szintű biológiájának jobb megértését, valamint újabb lehetséges gyógyszercélpontok azonosítását sürgeti.
17
1.1.4. A Mycobacterium fajok timidilát bioszintézis útvonala, mint lehetséges gyógyszercélpont A timidilát (timidin-monofoszfát, dTMP) bioszintézis egy lehetséges antibakteriális gyógyszercélpontként ismert [9]. A timidilát dUMPből kiinduló előállítását a Mycobacterium fajokban két, különböző szerkezettel és katalitikus mechanizmussal rendelkező timidilát szintáz, a ThyX és a ThyA katalizálja (2. ábra). Közülük a mikobakteriális
ThyA
humán
homológ
enzime
fontos
rákellenes
gyógyszercélpontként számos gyógyszer támadáspontja (5-fluorouracil, raltitrexed). Az enzim részleges gátlása a nélkülözhetetlen DNS prekurzor timidin trifoszfát (dTTP) alacsony szintjét okozza, ami timinmentes sejthalálhoz vezet [10]. Mindez számos antibiotikum és rákellenes szer, köztük a trimetoprim, az 5-fluorouracil és a metotrexát működésének alapját jelenti [9]. A tuberkulózisellenes gyógyszer PAS hatását a folát útvonal gátlásával fejti ki [11]. PAS gyógyszerrezisztencia során a timidilát szintázt valamint a dihidrofolát reduktázt kódoló gén mutációját azonosították [12,13]. Mivel azonban a flavin-függő ThyX enzim homológja az emberben nincs jelen, és az enzim a mikobaktériumok életképességéhez elengedhetetlen
[14],
ez
az
enzim
kiemelten
fontos
tuberkulózisellenes
gyógyszercélpontnak számít [15]. A timidilát szintézis egy másik útvonala a pirimidin mentő (salvage) útvonal, mely során a timidin foszforilációját a timidin kináz enzim végzi. Mivel ez az enzim a Mycobacterium fajok esetén nincs jelen, a dUMP timidilát prekurzor különös jelentőséggel bír a bioszintézis útvonalban [16]. A mikobaktériumok a dUMP-t dCTP és dUTP nukleotidok átalakításával képesek előállítani. Mivel ezek a baktériumok nem rendelkeznek a dCMP dezamináz enzimmel, a dCTP →dUMP konverzió során a dezamináció a nukleotid-trifoszfát szinten valósul meg. Az átalakítást végző bifunkciós dCTP dezamináz/dUTPáz enzim fő feladata a megfelelő sejtbeli pirimidin dezoxinukleotid arány fenntartása [17]. Ezen enzim működését a bioszintézis útvonal dTTP végterméke negatív visszacsatolásos gátlási mechanizmus révén szabályozza [17]. Az enzim a dezamináció és a pirofoszforolízis együttes katalízisével a dUTP káros felhalmozódásának elkerülését teszi lehetővé. A sejtben 18
egyéb útvonalakon, a nukleozid-difoszfát reduktáz (Nrd) és nukleozid-difoszfát kináz (Ndk) enzimek közreműködésével keletkező dUTP hidrolízisét az élővilágban általánosan elterjedt dUTPáz enzim végzi. A dUTPáz a dUTP pirofoszforolízisével kettős módon járul hozzá az alacsony sejtbeli dUTP/dTTP szint biztosításához: a dUTP hidrolízise során ugyanis a dTTP prekurzorát állítja elő. Mindez a genomi integritás preventív védelmét szolgálja. A DNS polimerázok ugyanis nem képesek a dTTP és a nemkanonikus dezoxinukleotid dUTP hatékony megkülönböztetésére, így a timin helyére uracilt építhetnek be a DNS-be. Mindez a báziskivágó javítómechanizmus (base excision repair, BER) fokozott működésén keresztül timinmentes sejthalálhoz vezethet [18].
2. ábra A Mycobacterium fajok timidilát bioszintéziséhez kapcsolódó útvonalai. A mikobaktériumok nem rendelkeznek timidin kináz enzimmel, így a dTTP alapvető DNS prekurzor csak dUMP metabolitból képződhet. A dUTPáz egyrészt a dUMP előállításával, másrészt a dUTP/dTTP szint alacsonyan tartásával biztosítja a timin jelenlétét a DNS-ben. Ndk: nukleozid-difoszfát kináz, Nrd: B12 vitamin-függő ribonukleotid-difoszfát reduktáz, ThyA és ThyX: timidilát szintáz enzimek. Az ábra Pécsi és munkatársai közleményében bemutatott ábra módosításával készült [19].
A dUTPáz számos fertőző betegség [20–22] illetve rákos elváltozás [23–26] lehetséges gyógyszercélpontja. A mikobakteriális dUTPázok nagymértékű hasonlóságot mutatnak, például a letális dut kiütést Mycobacterium smegmatis nem fertőző modellben munkatársaim menekíteni tudták a Mycobacterium tuberculosis dUTPázával (MtDUT). Csak abban az esetben tudtak izolálni dut kiütött baktérium 19
törzset, ha egy másik funkcionális dut kópiát juttattak a genomba, így igazolták, hogy az enzim a mikobaktériumok életképességéhez elengedhetetlen [19]. Az MtDUT szerkezete nem különbözik alapvetően a humán enzimétől, azonban néhány eltérés azonosítható. Az MtDUT központi csatornája jelentősen keskenyebb, mint a humán dUTPázé és a csatornát szegélyező oldalláncok polaritása eltér a két fajhoz tartozó enzim esetén [27]. Az MtDUT egy nemzetség-specifikus felszíni hurkot is tartalmaz. Ennek eltörlése nem volt hatással az enzimaktivitásra, ugyanakkor letális hatással bírt a Mycobaterium smegmatisra [19]. Elképzelhető, hogy ez a szakasz egy eddig ismeretlen mikobakteriális partnerrel való kölcsönhatást tesz lehetővé. Egy ilyen feltételezett, újabb típusú funkció (ún. moonlighting) megléte nem ismeretlen a dUTPáz enzimek esetén. A bakteriofág eredetű dUTPáz nemrégiben azonosított fehérje-fehérje kölcsönhatása egy Staphylococcus aureus represszor fehérjével a kórokozó virulencia faktorainak továbbterjedését szabályozza [28,29]. Mindezek alapján az MtDUT maga is egy lehetséges antimikobakteriális gyógyszercélpont [19,27,30]. Racionális gyógyszertervezés során az enzim ellen hatásos és alacsony toxicitással rendelkező kismolekulás inhibitorokat azonosítottak [31].
1.1.5. A dUTPáz enzim szerkezete és reakciómechanizmusa A dUTPázok két nagy családját az α-hélixekből felépülő dimer, valamint a β-redős szerkezetű, trimer vagy monomer fehérjék alkotják [16]. A különböző szerkezetű enzimek eltérő katalitikus mechanizmus szerint működnek (3. ábra) [32,33]. A dolgozatban a továbbiakban a β-redős feltekeredést mutató trimer dUTPázok szerkezetét és működését elemezzük.
20
3. ábra A trimer és dimer szerveződésű dUTPázok felépítése és az általuk katalizált reakció. Míg a trimer és monomer dUTPázoknál a nukleofil támadás a szubsztrát α-foszfátján, addig a dimer dUTPázoknál a támadás a β-foszfáton történik. Az ábra a 7.2 fejezet 2. közleménye alapján készült.
A trimer szerveződésű dUTPázok szerkezetét nyolc β-szál építi fel, melyek egymással antiparallel módon kapcsolódva egy lekvárostekercs (jelly-roll) motívumot képeznek (ún. dUTPase-fold). Az egyes alegységek C-terminális β-szála a szomszéd alegység szerkezetét erősíti, ami meghatározza a trimer szerkezet stabilitását [34]. A homotrimer három aktív helyét felépítő öt konzervált motívum különböző alegységekből érkezik: az 1., 2. és 4. motívumot az első alegység, a 3. motívumot a második alegység, míg az 5. motívumot a harmadik alegység szolgáltatja (4. ábra). Az egyes konzervált motívumok meghatározó szereppel bírnak a ligand kötésben és a katalízisben [35], továbbá kölcsönhatásaik fontosak a fehérjeszerkezet összetartásának szempontjából [36]. A szubsztrát nukleozid részének specifikus felismerését a 3. motívum határozza meg. Ennek β-hajtű szerkezete egy szűk kötőzsebet formál, mely nem képes befogadni purin, timin illetve ribóz szerkezeti elemekkel rendelkező nukleotidokat [16] [37]. A motívum főlánc és oldallánc atomjainak kölcsönhatásai a dUTP bázis és cukor szerkezeti elemeivel az enzim magas szubsztrát specificitását biztosítják [38].
21
4. ábra A Mycobaterium tuberculosis dUTPáz aktív centruma szubsztrát kötött állapotban (PDB kód: 2PY4). A különböző alegységekből származó konzervált motívumokat eltérő színnel jelenítettük meg. A katalitikus víz (Wcat) nukleofil támadásának irányát nyíl mutatja.
Az enzim reakciómechanizmusával számos részletes tanulmányban foglalkoztak. A dUTPáz katalízise során a szubsztrát-termék átalakulás folyamatának részletes követését az oldatbeli kísérletes eredmények mellett a katalitikus átalakítás különböző fázisait reprezentáló röntgenkrisztallográfiai felvételek tették lehetővé [33]. A nukleotid hidrolízist a 3. motívumban található aszpartát általános bázisként segíti, a támadó partner vízmolekula koordinálását és deprotonálását végezve a katalitikus reakció során [30,36,39,40]. Az enzim katalízist egy Mg2+ ion kofaktorként segíti, mely tridentát módon koordinálja a szubsztrát nukleotid három foszfát csoportját. Az átmeneti állapot stabilizálásában fontos szerepet játszik egy, a második konzervált motívumhoz tartozó szerin oldallánc [41]. Az all-β dUTPázok katalíziséhez elengedhetetlen az enzim 5. motívumában található glicinben gazdag P-hurok-szerű (ún. P-loop-like motívum) szerkezeti elem. Ez a flexibilis szakasz kulcsfontosságú kölcsönhatásokat létesít a dUTP γ-foszfát csoportjával, ami az 22
enzim dUTP/dUDP szubsztrát szelektivitását biztosítja [42]. Az 5. konzervált motívum egy további konzervált aromás jellegű oldalláncot is tartalmaz, amely az uracil pirimidin gyűrűjével kialakított π-π kölcsönhatásával járul hozzá a ligandkötéshez és katalízishez [43]. Érdekes módon a Bacillus subtilis dUTPáz enzim esetén a hasonló szereppel bíró aromás oldallánc az enzim egy ettől eltérő pozícióján, a harmadik motívum mellett található, ami eltérő konformációs mozgásokat eredményez a katalitikus mechanizmus során [39]. A trimer szerveződésű humán dUTPáz esetén a reakciómechanizmus kinetikai vizsgálata lehetővé tette az enzim működési modelljének létrehozását (5. ábra) [44]. Eszerint a szubsztrát dUTP gyors, feltehetően diffúzió limitált aktív helyre kötődését egy konformációs változás követi, amely során kialakul a katalízisre alkalmas enzim:szubsztrát komplex konformáció. Az enzim által koordinált katalitikus víz a dUTP α-foszfátra történő nukleofil támadásával a szubsztrát β,γ-pirofoszfát hidrolízisét okozza, ez az enzimműködés leglassabb lépése. Az enzimatikus ciklust a dUMP és PPi reakciótermékek gyors távozása zárja.
5. ábra A dUTPáz enzim mechanizmus kinetikai lépései. Az ábra Tóth és munkatársai közleményében jelent meg [44].
Mivel KM, dUTP a fiziológiás dUTP sejtbeli koncentrációnak felel meg, az enzim aktivitásával érzékenyen követi a dezoxinukleotid szubsztrát mennyiségének változását [44].
23
1.1.6. A Mg2+ kofaktor szerepe a dUTPáz enzim működésében A Mg2+ ion a dUTPáz enzimek kofaktoraként ismert, de fontos megjegyezni, hogy az enzim Mg2+ távollétében is megőrzi a katalitikus aktivitás mintegy felét [45–49]. Kovári és munkatársai megmutatták, hogy a fémion jelenléte a nukleotid trifoszfát láncát a katalízisnek megfelelő konformációs állapotban stabilizálja [45]. Az enzim szerkezetét megvizsgálva szembetűnő, hogy a Mg2+ kofaktor nem vesz részt a nukleofil támadást végző vízmolekula koordinálásában és deprotonálásában, ami ellentétes a szintén nukleotid pirofoszforolízist végző Nudix enzimek és a dimer dUTPázok mechanizmusával [20,50]. A dUTPázok katalízist megelőző állapotában a Mg2+ az aktív-helyen kötött szubsztrát három foszfát csoportját tridentát módon koordinálja (4. ábra). A fémion hidrátburkához tartozó további három víz egészíti ki a Mg2+ számára kedvező hatos ligand koordinációs szférát. A Mg2+ ion foszfátcsoport és vízmolekula ligandjai oktaéderes elrendeződésben helyezkednek el. A Mg2+ ionra általánosan jellemző, hogy a hidrátburkához tartozó vizek lassú kicserélődési sebességgel rendelkeznek, ami arra utal, hogy ezeket a fémion rögzíti pozíciójukban [51]. A dUTPáz enzim reakciómechanizmusának QM/MM vizsgálata rávilágított, hogy a Mg2+ nukleotid-foszfát és vízmolekula kölcsönható partnereinek elrendezése a katalitikus komplex átmeneti állapotában a fémion körüli szimmetrikus oktaédernek felel meg [40]. A hidrolízis lejátszódása után a Mg2+ a pirofoszfáttal együtt távozik az aktív-helyről. A nukleotidhoz kötött Mg2+ ion egyedüli enzim oldallánc kölcsönható partnere az 1. konzervált motívum aszpartátja [36]. Ez az oldallánc a fémion hidrátburkához tartozó két vízmolekula koordinációját végzi a katalitikus reakció során, így hozzájárul a katalitikusan kompetens enzim:szubsztrát:Mg2+ komplex kialakulásához [33,45]. Az oldallánc továbbá hidrogénhidas kölcsönhatást alakít ki a 4. motívum arginin oldalláncával. Az első motívumban található aszpartát szerepének vizsgálata hozzájárulhat a dUTPáz enzimaktivitás szokatlan fémion függésének valamint az aktív helyet felépítő kölcsönhatások jelentőségének értelmezéséhez.
24
1.2. A Plasmodium falciparum malária kórokozó számára létfontosságú CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim 1.2.1. A malária A malária napjainkban is az egyik legsúlyosabb fertőző betegség. A világon 3,2 milliárd embert veszélyeztet malária fertőzés, közülük 1,2 milliárdan fokozottan veszélyeztetett területen élnek (6. ábra). A malária jellemzően trópusi betegség, a halálesetek 90 %-a Afrikában történik. A terhes nők valamint az 5 év alatti gyermekek kiemelten veszélyeztetettek, utóbbiak teszik ki a malária áldozatainak mintegy háromnegyedét [52]. Az Egészségügyi Világszervezet erőfeszítéseinek köszönhetően a malária által okozott halálozások száma 47 %-kal csökkent 2000 és 2013 között. 2013-ban azonban így is mintegy 200 millió új malária fertőzést és 584 000 halálesetet észleltek [52]. Ezzel a malária több emberéletet követel, mint az összes többi eukarióta eredetű fertőzés együttesen.
6. ábra A malária fertőzések által legsúlyosabban érintett országok 2010-ben. A térképet Gething és munkatársai publikálták [53].
1.2.2. A fertőzést okozó Plasmodium paraziták A maláriát az Apicomplexa törzsbe tartozó egysejtű Plasmodium paraziták okozzák. A számos, embert is fertőző Plasmodium faj (P. falciparum, P. vivax, P malariae, P ovale, P. knowlesi) közül a halálesetek döntő többségét a Plasmodium falciparum parazita okozza. A betegség elleni hatékony küzdelemhez elengedhetetlenül fontos a kórokozó paraziták komplex életciklusának megismerése (7. ábra). A parazita sporozoita formája a fertőzött nőstény Anopheles szúnyog csípésével kerül az 25
emberi gazdaszervezetbe. Ezek a véráramon keresztül eljutnak a májba és megfertőzik a hepatocitákat, ahol hat-tíz nap alatt merozoitákká fejlődnek. A májból kiszabaduló merozoiták a véráramba kerülve a vörösvértesteket fertőzik. Az itt tartózkodás 36-48 órája alatt a véráramból felvett tápanyagok mellett a gazdasejt hemoglobinját használják fel, miközben trofozoita, skizont és merozoita fejlődési stádiumokon mennek keresztül. A folyamat végén a vörösvértestek felrepednek és a merozoiták véráramba kerülő generációja újabb fertőzést okoz. Mindez a malária ismert váltóláz tüneteit okozza. A leírt aszexuális sokszorozódás mellett a vörösvértestekben a paraziták gametocita ivaros formái is fejlődhetnek. Ezek egy újabb szúnyogcsípés révén kerülnek a szúnyog hordozóba, ahol a szexuális reprodukciójuk is megtörténik [54].
7. ábra A Plasmodium paraziták életciklusa, Klein közleménye alapján [54].
26
1.2.3. Maláriaellenes vakcina fejlesztés A Plasmodium falciparum illetőleg a Plasmodium vivax fajokra specifikus maláriaellenes vakcinák kifejlesztése egy költséghatékony malária prevenciós lehetőséget jelenthet. A parazita életciklusának különböző állapotai egyaránt lehetnek a vakcina fejlesztés célpontjai, mivel az ezekre kifejlesztendő specifikus vakcinák eltérő hatással rendelkezhetnek [55]. A vakcina célpont antigének alapjául a különböző parazita életciklus-szakaszokban termelődő fehérjék szolgálnak. Jelenleg 15 vakcina-jelölt antigén van a gyógyszerfejlesztés klinikai fázisában, melyek közül nemrég a RTS,S átment a humán 3. fázis vizsgálatokon, így a közeljövőben elérhetővé válhat [56]. A vakcina reményeink szerint a maláriaellenes védekezés további irányzataival együttesen hozzájárulhat a malária kontrolljához. A betegség elleni védekezés jelenlegi három fő formáját a szúnyog vektor kontrollálása, a szúnyog-ember kontakt csökkentése, valamint a maláriaellenes gyógyszeres terápia jelentik.
1.2.4. A szúnyog-vektor kontrollja A második világháború után kiterjedten használták a diklór-difenil-triklóretán (DDT) inszekticidet a malária és más, rovarok által terjesztett betegségek visszaszorítására. Alkalmazása hozzájárult a malária jelenlétének drasztikus csökkenéséhez a világ számos országában. A DDT élővilágot súlyosan károsító hatása, továbbá az inszekticid rezisztencia megjelenése miatt azonban a szer használatát a ’70-es évektől kezdve jelentősen korlátozták [57]. A DDT-t illetve másod- és harmadgenerációs inszekticideket jelenleg beltéri szúnyogirtásra használják a lakóházak permetezésével [58]. Az eljárás eredményei mellett azonban kihívást jelenthet, hogy a lakóházakban tartózkodó szúnyogok ellenállóvá válnak az alkalmazott inszekticidekkel szemben. A repellens hatású szerekkel érintkező szúnyogok a házakat elhagyva továbbá hozzájárulhatnak az inszekticid elleni rezisztencia
elterjedéséhez
[59].
A
maláriát
terjesztő
szúnyogok
elleni
védekezésképpen már 1910-ben javasolták az ágyat védő háló alkalmazását, melynek célszerűségét az Anopheles szúnyogok jellemző késő éjszakai aktivitása 27
adja [60]. A szúnyogcsípés megelőzésére továbbá a védőhálók polietilén szálain különböző emberre kevéssé ártalmas inszekticideket kötnek meg (α-cipermetrin, deltametrin, permetrin), melyek hatásukat a háló sokszoros kimosása után is megőrzik. A védőhálók alkalmazása a WHO malária megelőzési stratégiájának egyik sarokkövét jelenti. A szervezet jelenlegi célja, hogy minden egyes, malária által veszélyeztetett háztartás rendelkezzen legalább egy védőhálóval [52]. A hosszan
tartó
hatású
inszekticiddel
kezelt
háló
hatékonyságát
növelheti
használatának kombinációja a beltéri inszekticid permetezéssel [61].
1.2.5. Maláriaellenes gyógyszeres terápia A malária első orvosi kezelése az 1630-as évektől vált lehetségessé, a Peruban őshonos kínafa (Cinchona officinalis) kéreg maláriaellenes hatásának felismerése révén. A kéregből 1820-ban sikerült izolálni a kinin alkaloidot, mely így tisztított formájában szolgálta a következő mintegy száz évben a maláriaellenes gyógyászatot [62]. Noha a kinint még jelenleg is használják a malária kezelésére, alacsony terápiás indexe és számos mellékhatása miatt használatát az 1940-es évektől kezdve részben kiváltották szintetikus származékai, melyek közül a klorokin vált a legszélesebb körben használatossá. Ezek a kininhez hasonló módon a hemoglobin lebontásából származó hem biokristályosodását akadályozzák meg. Hatékonysága révén jelenleg is első vonalbeli gyógyszernek számít Afrikában a szulfadoxin és pirimetamin kombinációja (Fansidar), amely a folát metabolizmusba beavatkozva gátolja a nukleobázisok szintézisét és így a paraziták osztódását [63]. A maláriaellenes gyógyszeres kezelések hatékonyságát azonban visszavetette a velük szemben kialakuló és elterjedő parazita rezisztencia, amelyben közrejátszott a paraziták genetikai mutációi mellett a nem megfelelő gyógyszeres kezelés, valamint a hatóanyagok farmakokinetikája is (1. táblázat) [64]. Az antimaláriás gyógyszeres kezeléseknek új lendületet adott az artemizinin kivételes hatásának felismerése az 1970-es években, amit a kínai népi gyógyászatban már régóta használt egynyári ürömből (Artemisia annua) vontak ki. Az elmúlt évtizedben azonban ennek származékaival szemben is megjelent Thaiföld és Kambodzsa határvidékén a
28
parazita gyógyszerrezisztencia [65,66]. Emiatt a malária jelenlegi gyógyszeres kezelése jellemzően a kombinációs terápiákon alapul, melyek az egyedi gyógyszeres kezeléseknél hatásosabbak, késleltetik a gyógyszer rezisztencia kialakulását, valamint
mérsékeltebb
mellékhatásokkal
járnak
együtt.
Az
Egészségügyi
Világszervezet emellett sürgeti a gyógyszeres kezelést megelőzően a diagnózis felállítását, mivel a különböző típusú, esetlegesen gyógyszer-rezisztens parazita fertőzések eltérő kezelési módot igényelnek [67]. Jelenleg az artemizinin-alapú kombinációs
terápia
a
szervezet
által
ajánlott
gyógyszeres
terápia
komplikációmentes falciparum-típusú malária esetén. Ez a kezelési mód hatásosnak bizonyult minden maláriát okozó Plasmodium parazita vörösvértesten belüli formájával szemben [68,69]. Az artemizinin rezisztencia kialakulása mindazonáltal sürgőssé teszi az új maláriaellenes gyógyszeres kezelések fejlesztését. Különösen fontos olyan vegyületek azonosítása, melyek újszerű hatásmechanizmussal rendelkeznek, és nem mutatnak szerkezeti hasonlóságot a jelenlegi antimaláriás szerekkel [70].
29
Hatóanyag kinin
Jelentősebb forgalomban lévő maláriaellenes szerek Szerkezeti képlet Hatásmechanizmus hemozoin biokristályosodás gátlása
Rezisztencia éve 1910
Referencia [62]
klorokin
hemozoin biokristályosodás gátlása
1957
[71]
proguanil
folát metabolizmus gátlása, DNS bázisok szintézisének megakadályozása
1949
[63]
szulfadoxin és pirimetamin
folát metabolizmus gátlása, DNS bázisok szintézisének megakadályozása
1967
[63]
meflokin
hemozoin biokristályosodás gátlása
1982
[72]
atovaquon
elektron transzportlánc gátlása
1996
[73]
artemizinin
membrán glutation-S-transzferáz gátlás, oxidatív stressz
2009
[65,74]
1. táblázat Maláriaellenes szerek hatásmechanizmusa és a megjelenő parazita rezisztencia. A táblázat Wongsrichanalai és munkatársai közleménye [64] alapján készült.
30
1.2.6. A parazita lipid metabolizmusa, mint lehetséges maláriaellenes gyógyszercélpont A
vörösvértest
Plasmodiummal
fertőződése
jelentős
mértékű
membrán
termelődéssel jár együtt, melynek során döntően foszfolipidek, neutrális lipidek és zsírsavak szintetizálódnak, míg a parazita membrán koleszterin és szfingomielin tartalma elhanyagolható [75]. A fertőzött vörösvértest membrán frakciójában a legnagyobb mennyiségben a foszfatidilkolin (PC) és a foszfatidiletanolamin (PE) vannak jelen. A de novo PC bioszintézishez szükséges prekurzor alkotók aktív transzport révén érkeznek a vörösvértest citoplazmájából [76]. A Plasmodium parazitákban a PC egyrészt képződhet kolinból a Kennedy útvonalon keresztül, illetve etanolaminból foszfoetanolamin N-metiltranszferáz (PMT) enzim aktivitás révén. A PC metabolizmusra útvonalainak jellemzésére radioaktív kolin és etanolamin
metabolitok
foszfatidilkolinba
beépülését
vizsgálták
fertőzött
vörösvértestekben [77]. Növekvő radioaktív kolin koncentráció hatására fokozatosan nőtt a foszfatidilkolinná alakuló jelzett kolin mennyisége, ezzel párhuzamosan az etanolamin kisebb mértékben járult hozzá a PC előállításhoz. A Plasmodium knowlesi foszfolipid bioszintézis folyamatainak in silico kinetikus modellezése megerősítette, hogy a foszfatidilkolin fő forrása a citidin-difoszfát-kolin (CDP-kolin, CDPCho) köztiterméken át történő de novo foszfatidilkolin bioszintézis útvonal (ún. Kennedy-útvonal), amelynek végső lépésében aktivált lipid fejcsoport és diacilglicerin (DAG) kapcsolása megy végbe (8. ábra) [78]. Az ehhez szükséges kolin egyrészt a vörösvértest specifikus kolin karrier fehérjék révén jut a parazitához, másrészt a parazita által létrehozott ún. új permeációs útvonalakon (new permeation pathways, NPPs) keresztül [79].
31
8. ábra A Plasmodium paraziták foszfatidilkolin bioszintézise és az egyes metabolikus folyamatok sejten belüli elhelyezkedése. Jelmagyarázat: RBC: vörösvértest, Cho: kolin, Cho carrier: kolin karrier fehérje, CK: kolin kináz, CCT: CTP: foszfokolin citidililtranszferáz, NPP: új permeációs útvonalak, P-Cho: foszfokolin, P-Etn: foszfoetanolamin, PMT: foszfoetanolamin N-metiltranszferáz, CEPT: kolin/etanolamin foszfotranszferáz. Az ábra Contet és munkatársai közleménye alapján készült [80].
A kolin analóg vegyületek in vitro és in vivo antimaláriás hatása a parazita Kennedy útvonalát, mint lehetséges gyógyszercélpontot jelölte ki [81]. A bisz-kvaternerammónium só szerkezetű molekulacsaládot, melyet Henri Vial és kutatócsoportja azonosított és fejlesztett tovább, az egyik legígéretesebb fejlesztés alatt álló, újszerű hatásmechanizmú
maláriaellenes
vegyületcsaládként
jellemezték
[82].
A gyógyszercsalád klinikai fázisban lévő jelöltje, az albitiazolium (9. ábra) fejlesztése a Sanofi gyógyszercég bevonásával jelenleg a második humán klinikai fázisban tart [83].
9. ábra A foszfolipid metabolizmus útvonalon ható maláriaellenes klinikai jelölt albitiazolium szerkezete. Az albitiazolium kolin analóg antimaláriás szer farmakológiai vizsgálata megmutatta, hogy a gyógyszerjelölt fő támadáspontja a parazita kolin karrier fehérjéje,
melynek
gátlása
révén
a
hatóanyag
képes
teljes
mértékben
megakadályozni a kolin parazitába jutását [83]. Emellett 100 nM szérum hatóanyag koncentrációval számolva a hatóanyag parazitán belüli jelentős felhalmozódása 32
révén képes a foszfatidilkolin bioszintézis Kennedy-útvonalát alkotó három enzimének - kolin kináz (CK), CTP:foszfokolin citidililtranszferáz (CCT), kolin/etanolamin foszfotranszferáz (CEPT) - részleges gátlására is [83]. A bisztiazólium-szerkezetű kolin analógok jelen tudásunk szerint egyrészt gátolják a Plasmodium-fertőzött vörösvértestek kolin transzportját, ezáltal megakadályozva a foszfatidilkolin bioszintézist, másrészt hatással vannak a parazita emésztő szervecskéjében (food vacuole) a hemoglobin degradációs folyamatra [84]. A maláriaellenes hatóanyagcsalád ezen kettős hatásmódja hozzájárulhat a parazitarezisztencia kifejlődésének lassításához. A gyógyszerfejlesztés jelenlegi célkitűzése a hatóanyag megfelelő szájon át történő felszívódását biztosító prodrog analógjának létrehozása [84]. Az
eddigi
kutatások
alapján
a
kolin
analóg
szerkezetű
maláriaellenes
hatóanyagcsalád egyik lehetséges gyógyszercélpontját a Plasmodium paraziták CCT enzime jelentheti. Az enzim gyógyszer-kölcsönhatásának jellemezéséhez ismernünk kell az enzim szerkezeti felépítését és működésének jellegzetességeit.
1.2.7. A CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim fiziológiás szerepe A CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzim (CCT) (EC-szám: 2.7.7.15) a de novo foszfatidilkolin bioszintézis kulcsfontosságú enzime. Az enzim a bioszintetikus útvonal második, sebességmeghatározó lépését katalizálja [85]. Ennek során a kolinfoszfát (ChoP) és citidin-trifoszfát (CTP) reakciójából CDPCho nagyenergiájú metabolikus köztiterméket állít elő, pirofoszfát (PPi) melléktermék keletkezése mellett (10. ábra).
10. ábra A CCT enzim által katalizált reakció. 33
A CCT a HIGH nukleotidiltranszferáz enzim-családba tartozik, amely az ide tartozó enzimek nukleotid kötő hurkának jellegzetes motívumáról kapta a nevét [86]. Rossmann-fold szerkezetű katalitikus doménje α/β szuper-másodlagos szerkezettel rendelkezik, melyet öt β-redő és az azokat körülvevő hat α-hélix alkot (11. ábra) [87]. A CCT enzimek dimer oldatbeli szerkezettel rendelkeznek [88,89], melyet R(Y/W)VD konzervált dimerizációs motívum stabilizál [90]. Élesztő két-hibrid próba és kémiai keresztkötés-tömegspektrometria kísérletek alapján a dimer összetartáshoz patkány CCT esetén hozzájárul továbbá egy, a katalitikus domént megélesztő ún. prekatalitikus szakasz (40-75. aminosavak) [89]. Ez a különböző fajok esetén alacsony szekvencia konzerváltsággal rendelkező régió a fehérje kristályszerkezete alapján alegységen belüli és alaegységek közti kölcsönhatásokat létesít a katalitikus domén szerkezetével [90]. A fehérje C-terminális szakaszán egy regulációs régió található, amely membránkötő szegmenst és foszforilációs szakaszt foglal magába. A CCT a membránok lipid összetételének homeosztázisán keresztül meghatározó szabályzó szerepet tölt be számos fiziológiás folyamatban, a vezikuláris transzportban [91], az adiposzómák méretének kialakításában [92], a plazma lipoprotein egyensúly beállításában [93], valamint a tüdőben történő felületaktív anyag képződésben [94]. Mindennek az alapját az enzim reverzibilis membrán kölcsönhatása adja, amely az inaktív, citoszólos és az aktív, membrán-kötött állapota közötti átmenetet biztosítja. Az enzim membrán kötő szegmense (M) kettős módon járul hozzá az enzimaktivitás szabályzáshoz [95]. Egyfelől lipid vezikulák távollétében a szegmens ún. csendesítő (silencing) kölcsönhatása a katalitikus doménnel a domén saját aktivitásának csökkenéséhez vezet. Ennek szerkezeti alapja az M-szegmens amfipatikus hélix szakaszának (αAI) kölcsönhatása a katalitikus domén C-terminálisán található αE-hélixszel, mely befolyásolja az enzim aktív centrumának konformációs dinamikáját (11. ábra) [96,97].
34
11. ábra A patkány CCT kristályszerkezete (PDB kód: 4MVC). A) A katalitikus domén dimer alegységei haványrózsaszín és szürke színnel vannak jelölve. A CCT membrán kötésében szerepet játszó, az ábrán sárga illetve zöld színnel jelölt két ún. autoinhibítoros hélix (αAI) a katalitikus domén C-terminálisán elhelyezkedő két αE hélixszel alakít ki kölcsönhatásokat. B) A 4MVC kristályszerkezetben látható szakaszok (fent) és a teljes hosszú patkány CCT felépítése (lent). Az ábra Lee és munkatársai közleménye alapján készült [97].
Másfelől az enzim membrán-asszociációja az enzimaktivitás további növekedését valamint a KM, CTP csökkenését eredményezi [98]. Ennek során az M-szegmensben található αAI hélix szelektíven kötődik az anionos lipidekhez, valamint a foszfatidilkolintól eltérő neutrális lipidekhez (12. ábra). Mindez stabilizálja a részben rendezetlen szegmens α-helikális szerkezetét [99]. Ebben, az enzim működést alapvetően meghatározó mechanizmusban szerepet játszik az emlős CCT esetén a fehérje N-terminális szakaszán elhelyezkedő pozitív töltésű magi lokalizációs szignál (NLS), valamint C-terminális végének foszforilációja is [99,100]. A kölcsönhatás alapját a lipid összetételtől függő, membrán-görbületben rugalmasan tárolt energia [101], valamint a fehérje és a membrán közötti elektrosztatikus kölcsönhatások adják [102]. Mivel a CCT kisebb affinitással 35
kötődik a foszfatidilkolinban gazdag membránokhoz, ezzel az enzim a saját bioszintézis útvonalának szabályzásában is részt vesz [103].
12. ábra A CCT membrán kölcsönhatásának sematikus ábrája. Lipidek távollétében (fent) a fehér hengerrel jelölt membrán-kötő szegmens kapcsolata a katalitikus doménnel (narancssárga kör) az enzim a katalitikus hatékonyságát csökkenti, míg a szegmens membrán kötött formája (lent) a katalitikus hatékonyság növekedését eredményezi. A patkány CCT feltételezett működését leíró ábrát Marton Lívia készítette Cornell és munkatársa közleménye alapján [104].
1.2.8. A CCT enzim reakciómechanizmusa A CCT membrán-kötő doménjének eltávolítása lipid jelenléttől független ún konstitutív aktivitású fehérje konstruktot eredményezett [88], ami további részletes enzim mechanizmus vizsgálatokat tett lehetővé. Az enzim által katalizált reakció során a ChoP foszfát csoportja nukleofil támadást intéz a CTP α-foszfát csoportjára. A katalízisben kulcsszerepet játszanak az enzim RTxG(V/I)ST(T/S) és HxGH konzervált szekvencia motívumai, melyek a CTP kötésben, valamint az átmeneti 36
állapot stabilizálásban vesznek részt [90,96,105,106]. A ChoP nukleofil támadást intéző foszfátjának koordinálását lizin, hisztidin és tirozin oldalláncok együttesen végzik (H168, Y173, K122, patkány CCT szekvencia számozás szerint) [90,106]. A különböző fajok CCT enzimeinek aktivitását a Mg2+ ion kofaktorként segíti [107– 111]. A patkány CCT enzim működésére CDPCho és PPi termék-gátlás kinetikai vizsgálatai alapján random szubsztrát bekötődést és termék eltávozást feltételező mechanizmust javasoltak, a CTP és ChoP szubsztrátokra 10 mM és 0,3 mM K M értékeket állapítva meg [105].
1.2.9. A CCT enzim kolin-kötő zsebének szerkezete A CCT enzim kolin-fejcsoport szubsztrát-specificitást mutatott, az etanolaminfoszfáttól a kolin-foszfátig a szubsztrát ammónium csoport fokozatos metilációja az enzim ligand kötő képességének és katalitikus hatékonyságának növekedését eredményezte [112]. Az enzim kolin-kötő zsebe nem mutat szekvenciális és szerkezeti
hasonlóságot
az
evolúciósan
rokon
CTP:glicerol-3-foszfát
citidililtranszferáz (GCT) és CTP:etanolamin-foszfát citidililtranszferáz (ECT) enzimekkel, melyek eltérő szubsztrátokat alakítanak át. A patkány CCT enzim kristályszerkezetéből megismert kolin-kötő zseb a CCT enzim aktív helyének egy részben hidrofób ürege, melyet a β4 szál és az L5 hurok határol. A zseb alakja és 5 Å átmérője ideális a kolin csoport befogadására. A kolin kvaterner-ammónium csoportjával a V182 oldallánc van der Waals kölcsönhatást létesít, a W151 és Y173 oldalláncok kation-π kölcsönhatást alakítanak ki, míg a D82 aszpartát karboxilát csoportja, valamint a Y182 tirozin oldallánca elektrosztatikus kölcsönhatásokat létesítenek vele (13. ábra) [90].
37
13. ábra A patkány CCT aktív helyének kolin kötő zsebe. A CDPCho ligand gömb és pálcamodellel, míg a kötőhelyet alkotó oldalláncok pálcamodellel vannak megjelenítve. Az oldalláncok számozása a patkány CCT szekvencia alapján történt. Az ábra Lee és munkatársai közleményéből származik [90].
A kolin kötőzsebben azonosított kation-π kölcsönhatás a molekuláris felismerés egyik
alapvető
eleme,
melyben
ion-kvadrupol
és
ion-indukált-dipólus
kölcsönhatások vesznek részt [113]. Kvaterner-ammónium csoportot tartalmazó ligandumok esetén a kölcsönhatást elősegíti, hogy a ligandum alacsony töltéssűrűséggel rendelkezik, mivel a pozitív töltés eloszlik a funciós csoport felszínén [114]. A megfelelő felismerő fehérjék ligandum-kötőzsebe gyakran egy olyan, aromás oldalláncok által körülhatárolt térrész, ahova a megfelelő ligandum a saját szolvátburka nélkül kötődik be, a fehérjével kation-π kölcsönhatásokat kialakítva [115]. Az ilyen típusú csoportok koordinálása a megfelelő metabolitok kötését, szállítását, valamint enzim-katalizált átalakítását szolgálhatja.
38
1.2.10. A Plasmodium paraziták CTP:foszfokolin citidililtranszferáz enzime A CDPCho köztiterméken keresztül végbemenő de novo PC bioszintézis kulcsfontosságú P. falciparum és annak rágcsálókat fertőző parazita modellje, a P. berghei
esetén
[116].
A
bioszintézis
útvonalon
belül
a
CCT
egy
sebességmeghatározó lépést katalizál [78]. A CCT fehérje a Plasmodium paraziták minden életszakaszában termelődik. A PlasmoDB adatbázisban közölt microarray adatok a fehérje transzkripciójának növekedését mutatják a késői skizont fázisban, emellett a PfCCT génje számottevő mértékben íródik át a parazita gametocita és a sporozoita formáiban is [117,118]. A Plasmodium genomokban egyetlen annotált CCT gén kópia található. Meglepő módon ezek a gének két, feltehetően duplikálódott ún. CMP szegmenst kódolnak [76], melyek a citidililtranszferáz katalitikus domént (C1/C2), a membrán- vagy lipidkötő domént (M1/M2) és valószínűsített foszforilációs domént (P1/P2) tartalmaznak (14. ábra). A duplikálódott szegmenseket egy mintegy 240-278 aminosav hosszúságú, részben konzervált, Plasmodium specifikus szakasz köti össze. A Plasmodium CCT fehérjékkel szemben a többi CCT fehérje csupán egyetlen katalitikus, membrán kötő és foszforilációs domént tartalmaz, mely homodimer oldatbeli szerkezetet vesz fel. Ennek alapján valószínűsíthető, hogy a Plasmodium CCT fehérjék egy intramolekuláris ‘pszeudo-heterodimer’ szerkezettel rendelkeznek, noha ezt a feltételezést korábban még nem igazolták kísérletes módon. A PfCCT egy rekombinánsan termeltetett, a második katalitikus (C2) és membrán-kötő (M2) domént tartalmazó konstruktja (PfCCT528-896) lipid jelenléttől függő enzimatikus aktivitással rendelkezett [111]. A CCT enzim aktivitását szabályzó membrán kötő szegmens két amfipatikus hélixet tartalmaz és alacsony szekvencia azonosságot mutat az emlős CCT megfelelő szakaszához képest [95,119].
39
14. ábra A Plasmodium falciparum CCT illetve a patkány CCTα izoforma szerkezeti felépítése. Az ábra Déchamps és munkatársai közleménye alapján készült [76]. A Plasmodium CCT enzimek térszerkezetét jelenleg még nem ismerjük. Az enzim CDPCho
termék
kölcsönhatásáról
a
patkány
CCT:CDPCho
komplex
kristályszerkezetek [90,97] nyújtanak közelítő információt. Mivel nincs elérhető CCT:szubsztrát komplex szerkezet, az enzim-CTP kölcsönhatás becsléséhez a homológ GCT enzim CTP komplex szerkezete szolgálhat alapul [120]. A szerkezeti információk hiánya így nem teszi lehetővé az enzimreakció során a konformációs változások azonosítását, az egyes szubsztrát(ok) és termék(ek) enzim komplexe közötti különbségek jellemzését.
40
2. Célkitűzések
A jelen dolgozatban két lehetséges gyógyszercélpontként azonosított enzim, a Mycobacterium tuberculosis dUTPáz (MtDUT) valamint a Plasmodium falciparum CTP:foszfokolin citidililtranszferáz (PfCCT) katalitikus mechanizmusát vizsgáltuk. Mindkét enzim nukleotid szubsztrátot alakít át, pirofoszfát lehasadása mellett. A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz (MtDUT) működésének vizsgálata során fő célkitűzésünk az enzim Mg2+ kofaktorának fehérje koordinációjának vizsgálata volt. A dUTPáz enzimek működésének és szerkezetének megismerése jó ideje a Vértessy labor tudományos érdeklődésének középpontjában áll. A
Plasmodium
falciparum
citidililtranszferáz
CTP:foszfokolin
(PfCCT)
vizsgálatának két fő célja volt. Egyrészt az enzim katalitikus doménjének alapvető biokémiai
jellemzésére
szempontjából
fontos
irányult.
Másrészt
ligandum-kölcsönható
az
enzim
zsebének
gyógyszerfejlesztés kölcsönhatásait
és
felépítésének általános szerkezeti sajátságait kívántuk feltárni. A fenti témákkal kapcsolatban az alábbi kérdésekre kerestük a választ. 1. Mi a szerepe az MtDUT enzim aktív-helyén található Mg2+ kofaktor hidrátburkának koordinációját végző aszpartát oldalláncnak az enzimatikus katalízisben, valamint az aktív hely szerkezeti összetartásában? A vonatkozó aminosav
pontmutációjával
létrehozott
fehérje
oldatbeli
és
szerkezeti
vizsgálatával kívántunk választ adni erre a kérdésre. 2. Milyen kinetikai mechanizmussal írható le a PfCCT enzim működése? Mik az enzim egyes szubsztrát és termék kölcsönhatásainak jellegzetességei? Az enzim katalitikus domént tartalmazó konstruktjának alapvető működését kinetikai és ligand-kötési vizsgálatokkal tártuk fel. 3.
Mi a szerepe a PfCCT kolin-kötőhelyét felépítő aminosavaknak a ligandumkötésben és az enzimatikus katalízisben? A kérdés megválaszolásához a 41
vonatkozó aminosavakra pontmutáns fehérjék kinetikai és ligandum-kötődési vizsgálatát végeztük el. 4. Léteznek-e általános törvényszerűségek enzimek kvaterner-ammónium funkciós csoportot tartalmazó ligandjainak felismerésében? E kérdésre a megfelelő funkciós csoportot tartalmazó ligandumot-kötő fehérjék ismert háromdimenziós szerkezeteinek átfogó elemzésével kerestük a választ.
42
3. Anyagok és módszerek 3.1. PfCCT szerkezeti modellek létrehozása és validálása A PfCCT két katalitikus doménjét tartalmazó homológia-modell építéséhez a patkány CCT CDPCho komplex kristályszerkezetet használtuk templátként (Protein Data Bank adatbázis, PDB kód: 3HL4) [90]. A PfCCT528-795 valamint a PfCCT528-795, Δ720-737 (PfCCT MΔK) konstruktok modelljei a templát kisebb mérete miatt rendre a PfCCT (581-775), illetve (581-775, Δ720-737) szegmenseit jelenítik meg. Ezen a szakaszon a PfCCT és a patkány CCT 42,2% szekvencia-azonossággal rendelkezik. A MODELLER 9v8 [121] program segítségével mindkét PfCCT konstruktnak száz homológia modelljét hoztuk létre. Közülük öt-öt alacsony energiájú konformáció szerkezetét megvizsgáltuk és egy-egy, a CDPCho ligandot megfelelően kötő szerkezetet választottunk a két fehérje-konstrukt esetén. A kiválasztott szerkezeteket a CHARMM27 erőtér [122] és a CHARMM program [123] alkalmazásával optimalizáltuk, GBSW implicit oldószer modell használatával. A két konstrukt homológia modellje jelentős különbséget csupán a PfCCT Plasmodium-specifikus lizin gazdag régiójának (720-737 aminosavak) környezetben mutatott, mely csupán a PfCCT528-795 szerkezeti modell részét képezi. A homológia modellek validálását a PROCHECK [124], WHAT_CHECK [125], és ERRAT [126] programokkal végeztük. A PfCCT528-795, valamint a PfCCT528-795, Δ720-737 modelleket feltöltöttük a fehérje modell adatbázisba (Protein Model DataBase, PMDB), ahol rendre a PM0078718 és PM0078719 kódokat kapták.
3.2. Klónozás és mutagenezis A teljes hosszú PfCCT cDNS szekvencia (PlasmoDB kód: PF3D7_131660) [117] E. coli gazdaszervezet számára kodon optimalizált változatát a GenScript cég szintetizálta. Ebből a fehérje 528-795 aminosav régiójának megfelelő DNS szakaszt pET15b expressziós vektorba klónoztuk NheI/BamHI restrikciós endonukleáz hasítási helyekkel az N-terminális 6xHis epitóp címkével rendelkező fehérje termeltetéséhez. A lizin-gazdag Plasmodium-specifikus szegmens (720-737. 43
aminosavak) eltávolítását, a különféle PfCCT MΔK pontmutánsok, valamint az M. tuberculosis dUTPáz MtDUTD28N, MtDUTH145W, MtDUTD28N,
H145W
pontmutánsok
előállítását a Quikchange módszerrel végeztük (Agilent), a felhasznált primereket a 2. táblázat tartalmazza. Az összes létrehozott DNS konstrukt szekvenciáját az MWG Eurofins Genomics cégnél végzett szekvenálással ellenőriztük. Primer oligonukleotid szekvencia 5’ → 3’
Konstrukt PfCCT MΔK for PfCCT MΔKWT rev WT
GCTAACAATCAGAAAGAAGATATTTATGCTTGGCTG AGCCAAGCATAAATATCTTCTTTCTGATTGTTAGC CAGAAAGAAGATATTTATGCTCACCTGAAACGTGCTGG
PfCCT MΔKW743H for CAAATTC
GAATTTGCCAGCACGTTTCAGGTGAGCATAAATATCTT
PfCCT MΔKW743H rev CTTTCTG
GAAATCATTTCTCCGTGTCCGTATGTGGTGACGCCGGA
PfCCT MΔKW692Y for ATTTC
GAAATTCCGGCGTCACCACATACGGACACGGAGAAAT
PfCCT MΔKW692Y rev GATTTC PfCCT MΔKW692F for
CATTTCTCCGTGTCCGTTCGTGGTGACGCCGG
PfCCT MΔKW692F rev CCGGCGTCACCACGAACGGACACGGAGAAATG PfCCT MΔKY714F for
CATGATGACATCCCGTTTGCTAACAATCAGAAAGAAG
PfCCT MΔK
Y714F
rev
CTTCTTTCTGATTGTTAGCAAACGGGATGTCATCATG
PfCCT MΔK
D623N
for
CGTGGTGATTTACGCCAATGGTGTTTACGACATGC
PfCCT MΔKD623N rev
GCATGTCGTAAACACCATTGGCGTAAATCACCACG
PfCCT MΔKY741F for
CAATCAGAAAGAAGATATTTTTGCTTGGCTGAAAC
PfCCT MΔKY741F rev
GTTTCAGCCAAGCAAAAATATCTTCTTTCTGATTG
PfCCT MΔK
W692A
for CATTTCTCCGTGTCCGGCGGTGGTGACGCCG
PfCCT MΔKW692A rev CGGCGTCACCACCGCCGGACACGGAGAAATG MtDUTD28N for
CGCCGGCGTTAATCTCTACAGC
MtDUTD28N rev
GCTGTAGAGATTAACGCCGGCG
2. táblázat A jelen doktori dolgozat során helyspecifikus mutagenezishez felhasznált primerek. For: forward, rev: reverse irány. A QuikChange mutagenezis esetén a módosított bázistriplettet aláhúzással jelöltük. Az MtDUTD28N primer párt használtuk a MtDUTD28N ,H145W mutáció létrehozásához is.
44
3.2.1. Rekombináns fehérjék termelése és tisztítása A rekombináns 6x hisztidin epitóp címkével (His-tag) rendelkező MtDUT és PfCCT fehérje konstruktokat BL21 (DE3) Rosetta E. coli gazdatörzsben termeltettük. A termeléshez 500 ml Luria-Bertani (LB) tápoldatot tartalmazó flaskát 500 µl egy éjszakán át 200 rpm rázatás mellett 37°C-on növesztett előkultúrával inokuláltuk, majd rázótermosztátban 37°C-on 200 rpm-mel rázattuk, amíg az oldat 600 nm-en mért fényelnyelése el nem érte a 0,4 értéket. Ekkor a termosztát hőmérsékletét 20°C -ra
állítottuk,
majd
fél
óra
elteltével
0,5
mM
izopropil- β-D-1-
tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk a fehérje kifejeztetést. A fehérje termeltetést MtDUT konstruktok esetén négy órán keresztül, 37°C-on, míg PfCCT konstruktok esetén húsz órán keresztül 20°C-on végeztük. Ennek végén a tápoldatot centrifugáltuk (4000 rpm, 4°C, 30 perc), majd a felülúszót leöntöttük. A leülepedett sejteket jéghideg sós foszfát puffer (phosphate buffer saline, PBS) oldatban szuszpendáltuk, majd ismét centrifugáltuk (4000 rpm, 4°C, 30 perc). Az így kapott sejt pelletet folyékony nitrogénben fagyasztottuk és a feltárási lépésig 80°C-os hűtőben tároltuk. A felolvasztott sejteket 100 ml 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl oldatban szuszpendáltuk, mely az alábbi feltárást elősegítő reagenseket tartalmazta: 1 mM fenilmetil-szulfónium-fluorid (PMSF) proteáz gátló, 10 mM béta-merkaptoetanol (βME) redukálószer, 1% Triton X-100 detergens, 3 μg/ml RNáz, 3 μg/ml DNáz, 0,5 mM etilén-diamin tetraecetsav (EDTA) kelátor, Complete proteáz gátló tabletta (Roche), illetve 1 mM benzamidin. A sejt szuszpenziót Potter-Elvehjem homogenizáttoral homogenizáltuk, majd ultrahangos szonikáló segítségével biztosítottuk a sejt további feltárását és a genomi DNS molekulák töredezését. Az így kapott hígan folyó oldatot 11 000 g centripetális erővel 4°C-on 30 percig centrifugáltuk, majd a felülúszóhoz 1,5 mM-nak megfelelő mennyiségű MgCl2-ot adtunk az EDTA komplex létrehozásához. Az ezt követő nikkel affinitás kromatográfiás lépéshez a 3. táblázatban feltüntetett oldatokat használtuk. A sejtextraktot az előzetesen alacsony sótartalmú oldattal mosott nikkelnitrilotriecetsav (Ni-NTA) affinitás oszlopra vittük fel (Qiagen), amely szelektíven képes komplexálni a hisztidinben gazdag fehérjéket. 45
Fehérje tisztításhoz használt oldatok alacsony sótartalmú oldat magas sótartalmú oldat imidazolos mosóoldat imidazolos elúciós oldat dialízis puffer
MtDUT 20 mM HEPES pH 7,5 150 mM NaCl, 10 mM ßME, 5 mM MgCl2 (a továbbiakban MtDUT puffer) 20 mM HEPES pH 7,5 300 mM NaCl, 10 mM ßME, 5 mM MgCl2 MtDUT puffer + 75 mM imidazol MtDUT puffer + 500 mM imidazol MtDUT puffer
PfCCT 20 mM HEPES pH 7,5 100 mM NaCl, 10 mM ßME (a továbbiakban CCT puffer) 20 mM HEPES pH 7,5 1 M NaCl, 10 mM ßME CCT puffer + 50 mM imidazol CCT puffer + 1 mM PMSF, 250 mM imidazol CCT puffer
3. táblázat A PfCCT és MtDUT fehérjék tisztításához használt oldatok. Az oszlopon megkötődő fehérje frakciót négy oszloptérfogatnyi alacsony sótartalmú oldattal, két oszloptérfogatnyi magas sótartalmú oldattal, majd ismét négy oszloptérfogatnyi alacsony sótartalmú oldattal mostuk a nem specifikusan kötődő fehérjék eltávolításához. A His epitóp címkét nem tartalmazó, egyéb His tartalmú fehérjéktől két oszloptérfogatnyi imidazolos mosóoldat segítségével szabadultunk meg, majd a fehérjéket az imidazolos elúciós oldattal eluáltuk az oszlopról. A feltárás és tisztítás sikerességét a folyamat különböző pontjaiban vett minták denaturáló SDS-poliakrilamid gélelektroforézisével (SDS-PAGE) ellenőriztük. A célfehérjét megfelelő tisztaságban tartalmazó elúciós frakciókat egyesítettük, majd 4°C-on egy éjszakán dializáltuk a 3. táblázatban feltüntetett dialízis pufferben, 10 kDa pórusméretű dialízist membránt használva. A fehérje oldatokat Amicon 10 kDa pórusméretű centrifugális töményítő oszlopon töményítettük, majd méretkizárásos kromatográfiával tovább tisztítottuk HiLoad XK-16 Superdex 200 oszlopon (GE Healthcare), ezután felhasználtuk vagy későbbi kísérletekhez 100 μl frakciókban folyékony nitrogénben fagyasztottuk. A fehérjék koncentrációját a 280 nm-en mért UV abszorbanciájuk (A) alapján határoztuk meg, a Lambert-Beer törvény alapján (1. egyenlet) a fehérjék aminosav összetétele alapján számolt extinkciós koefficiensek (ε280) ismeretében (4. táblázat). 46
A280 280 c l
1. egyenlet ε280, M-1·cm-1 31400 25900 27390 25900 25900 31400 29910 29910 2980 8480 8480
Konstrukt PfCCT MΔKWT PfCCT MΔKW743H PfCCT MΔKW692Y PfCCT MΔKW692A PfCCT MΔKW692F PfCCT MΔKD623N PfCCT MΔKY714F PfCCT MΔKY741F MtDUTD28N MtDUTD28N, H145W MtDUTH145W
4. táblázat A használt fehérje-konstruktok aminosav összetétel alapján számolt, monomer-egységre vonatkozó extinkciós koefficiensei.
3.3. Fehérje tömegspektrometria A fehérje komplexek tömegspektrometriai vizsgálatát elektrospray ionizációs forrással felszerelt Waters QTOF Premier (Waters, Milford, MA, USA) tömegspektrométerrel végeztük, pozitív-ion mérési módban. A tömegspektrumok felvétele során a méretkizárásos kromatográfiával tisztított, 0,4 µM monomer koncentrációjú PfCCT M∆K konstruktok ionizációja 10 mM NH4HCO3 puffer oldatból (pH 7,15) történt. Ez a körülmény megengedi a natív fehérje-komplexek gázfázisba jutását. A mérésekhez az alábbi beállított értékeket használtuk: kapilláris feszültség 3600 V, mintavevő kúp feszültség 125 V, ion forrás hőmérséklet 80°C, ütközési cella nyomás 3,38·10-3 mbar, ion vezető gáz térfogatáram: 35,00 ml/perc. A tömegspektrumokat MassLynx 4.1 (Waters, Milford, MA, USA) szoftver használatával vettük fel az 1000–5000 tömeg/töltés (m/z) tartományban. 5000 m/z felett nem találtunk azonosítható ion csúcsokat.
47
3.4. Differenciális pásztázó fluorimetria (Thermofluor) A mérés során 1 μl negyvenszeresen higított Sypro Orange festék (Sigma) és 0,5 mg/ml fehérjeoldatot mértünk össze 25 µl össztérfogatban ligand jelenlétében vagy távollétében 96 lyukú PCR tálcán. A tálcát optikailag áttetsző PCR filmmel (Thermo Scientific) zártuk le, majd egy Stratagene Mx3000P kvantitatív PCR készülékben fokozatosan melegítettük 25°C-ról 85°C-ra 2°C/perc fűtési sebességgel. A hőmérséklet
emelése
során
a
készülék
segítségével
követtük
a
fehérje
denaturációjával egyre erősödő fluoreszcens jelet. Minden egyes körülmény méréséhez három párhuzamos mérést végeztünk. A fehérje hődenaturációs görbe olvadási vagy letekeredési hőmérsékletet (Tm) jelentő inflexiós pontját Boltzmann függvény illesztéssel határoztuk meg (2. egyenlet), melyhez OriginPro 8 (OriginLab Corp, Northampton, MA, USA) programot használtunk.
FT F0
F1 F0 1 e(Tm T)/dT
2. egyenlet
ahol FT a T hőmérséklethez tartozó fluoreszcencia intenzitást, Tm az olvadási hőmérsékletet, F0 és F1 a hődenaturációs átmenet előtti és utáni fluoreszcencia értékeket jelentik.
3.5. Enzim aktivitás mérések 3.5.1. Folytonos dUTPáz steady-state enzimaktivitás mérés A dUTPáz enzim aktivitás-méréshez egy folytonos spektrofotometriás pH-indikátor módszert használtunk, az irodalomban leírtaknak megfelelően [127]. A mérés során az enzimreakciót kísérő proton felszabadulást követtük, melynek mértéke arányos a dUTP hidrolízissel (3. egyenlet).
dUTP dUMP PPi nH (ahol „n” a pH függvénye)
3. egyenlet
A méréseket Specord 200 spektrofotométer használatával végeztük, az 1000 μl össztérfogatú reakcióelegyet a mérés során 10 mm úthosszú 20°C-ra termosztált 48
küvettákban tartva. A reakcióoldat 1 mM HEPES pH 7,5 puffert, 100 mM KCl-ot, 40 μM fenolvörös indikátort és 5 mM MgCl2 -ot, valamint 100 nM MtDUTH145W, illetve 4 μM MtDUTD28N,
H145W
enzimet tartalmazott. A mérést a dUTP gyors
bekeverésével indítottuk, majd az 559 nm hullámhosszon követett abszorbanciacsökkenés kezdeti szakaszának (10%) meredekségét határoztuk meg. A reakció teljes lejátszódásakor tapasztalt abszorbancia változás (ΔAtotal) ismeretében a reakciósebességet és a katalitikus sebességi állandót (kcat) a 4. és 5. egyenletek szerint számoltuk.
A dUTP dUTPtotal t t Atotal
k cat
dUTP t [dUTPáz]
4. egyenlet
5. egyenlet
Minden egyes adatpontot háromszor mértünk meg. A szubsztrát dUTP koncentrációk függvényében ábrázolt kezdeti sebesség értékeire Michaelis-Menten egyenletet illesztettünk, OriginPro 8 szoftver (Originlab) használatával (6. egyenlet).
v
Vmax S K M S
6. egyenlet
3.5.2. Megállított áramlás (stopped-flow) dUTPáz aktivitás-mérések A stopped-flow méréseket SX-20 (Applied Photophysics, UK) műszer használatával végeztük, Tóth és munkatársai közleményében leírt módon [44]. A mérés során az enzimreakciót kísérő proton felszabadulást követtük, a 3.5.1. fejezetben leírtaknak megfelelően. A reakció puffer 1 mM HEPES-t (pH 7,5), 100 mM KCl-ot, 100 μM fenolvörös indikátort és 5 mM MgCl2-ot tartalmazott. A 20°C-on végzett mérés során a reakcióelegy fényelnyelését követtük 559 nm hullámhosszon. Az MtDUTH145W és MtDUTD28N,
H145W
enzimeket rendre 12,5 μM és 15 μM
koncentrációkban alkalmaztuk, míg a dUTP szubsztrát koncentrációja az egyes 49
mérések során 7,5, 10 illetve 50 μM volt. A 7,5 μM dUTP mérési pont során az enzim koncentráció magasabb volt a szubsztráténál, ami megfelelt az egyszeri átviteli körülménynek (single turnover). Az abszorbancia változás időbeli lefutására a stopped-flow készülék saját szoftverét illetve az Origin 7.5 szoftvert használtunk (OriginLab Corp., Northampton, MA).
3.5.3. Quench flow dUTPáz aktivitás mérés A quench flow méréseket RQF-3 quench-flow műszer (KinTek Corp., Austin TX) használatával végeztük, Tóth és munkatársai közleményében leírt módon [44]. A γ32P-dUTP radioaktív szubsztrátot Tóth és munkatársai közleményében leírt módon szintetizáltuk [44]. Méréseink során a 20 mM HEPES-t, 2 mM MgCl2-ot, 90 mM NaCl-ot és 2 mM DTT-t tartalmazó reakció elegy pufferhez 30-50 µM dUTPázt és 20 µM dUTP szubsztrátotot adtunk. A 20°C-on végzett reakciót 2 M sósav hozzáadásával állítottuk meg. A
γ32
P-dUTP és
γ32
PPi radioaktív szubsztrát és
termék elválasztására 10% aktív szenet és 0,35 M nátrium-foszfátot tartalmazó 2 M sósavas oldatot használtunk. Az elválasztás alapját az adta, hogy az aktív szén képes hatékonyan megkötni felületén a reakcióelegy nukleotid tartalmát, azonban a PPi és γ32
PPi termékeket nem adszorbeálja. A vizes oldat radioaktivitását Wallac 1409 DSA
folyadék szcintilláció számolóval mértük.
3.5.4. Folytonos spektrofotometriás PfCCT steady-state enzimaktivitás mérés A PfCCT enzim aktivitás-méréséhez egy irodalmi eljárás [128] módosításával fejlesztett folytonos spektrofotometriás csatolt-enzim módszert alkalmaztunk (15. ábra). Ennek során a CCT által katalizált reakcióban keletkező pirofoszfátot pirofoszfatáz segédenzimmel (Sigma) hidrolizáltuk, majd a keletkezett foszfátot a purin nukleozid foszforiláz (Sigma), egy újabb segédenzim használta fel a 7-metil-6-tioguanozin (MESG) szubsztráttal való reakcióban. A MESG és a reakciótermék 7-metil-6-tioguanin (MES) maximális fényelnyelésének spektrális eltérése [129] tette lehetővé a PfCCT enzim által katalizált reakció követését. 50
15. ábra A PfCCT aktivitás mérésre szolgáló módszer. A méréseket Specord 200 spektrofotométer használatával végeztük, a 600 μl össztérfogatú reakcióelegyet a mérés során 10 mm úthosszú 20°C-ra termosztált küvettákban tartva. A segédenzimeket és szubsztrátjukat olyan koncentrációban alkalmaztuk, hogy a csatolt enzim reakció körülményei között a PfCCT enzim aktivitása legyen a sebesség meghatározó: [pirofoszfatáz]=2,08 aktivitás egység (unit)/ml, [purin nukleozid foszforiláz]=2,08 unit/ml, [Mg2+]= 5 mM, [MESG]= 0,33 mM. A PfCCT konstruktokat és különböző pontmutánsaikat enzim aktivitásuktól függően 0,16-2 μM koncentrciókban alkalmaztuk. CTP szubsztrát titrálás esetén a CTP koncentrációját 12 µM és 1,2 mM között változtattuk, 5 mM állandó kolin-foszfát koncentráció mellett. ChoP szubsztrát titrálás esetén a ChoP koncentrációját 0,1 mM és 20 mM között változtattuk, 1 mM állandó CTP koncentráció mellett. A méréseket a PfCCT gyors bekeverésével indítottuk, majd a reakció előrehaladása során követtük az oldat 360 nm-en mért abszorbanciáját. Az abszorbancia változás kezdeti szakaszának meredekségéből határoztuk meg a reakció kezdeti sebességét. Az igen alacsony aktivitású enzim-konstruktok (PfCCT 51
MΔKD623N, PfCCT MΔKW692A) esetén a mérést 60 μM enzim használatával végeztük és az abszorbancia változást hosszabb időn keresztül követtük, amelyet korrigáltunk az enzim-mentes vak minta eredményével. A kapott kezdeti sebesség értékekre rendre Michaelis-Menten, illetve kompetitív szubsztrát-inhibíciót feltételező Michaelis-Menten egyenleteket illesztettünk (6. egyenlet és 7. egyenlet), OriginPro 8 szoftver (Originlab) használatával.
v
Vmax K S 1 M S K i
7. egyenlet
A fenti egyenletben v a kezdeti sebességet (s-1), Vmax a maximális reakciósebességet (s-1), [S] a szubsztrát koncentrációját, KM a szubsztrát Michaelis állandóját, Ki az enzimaktivitás felére csökkenéséhez tartozó szubsztrát koncentrációt jelöli. A termék kinetikai gátlásának mérésekor a CDP-kolint a fenti enzim-aktivitás mérési reakcióelegyhez 0, 40 és 100 μM koncentrációkban adtuk hozzá. A szubsztrát titrálásokat a másik szubsztrát telítési koncentrációjában végeztük. A CDP-kolin inhibíciós állandót a CTP titrálási görbék együttes illesztésével határoztuk meg (global fit). Az adatok illesztéséhez különböző kinetikai modelleket próbáltunk ki, ezeket az OriginPro 8 szoftver Akaike információs kritérium statisztikai tesztje alapján hasonlítottuk össze. Közülük az alábbi, kompetitív inhibíciót feltételező egyenlet adta a legjobb illeszkedést.
v
Vmax 8. egyenlet KM I 1 1 S K I
A fenti egyenletben v a kezdeti sebességet (s-1), Vmax a maximális reakciósebességet (s-1), [S] a szubsztrát koncentrációját, KM a szubsztrát Michaelis állandóját, KI az enzimaktivitás felére csökkenéséhez tartozó CDPCho koncentrációt jelöli.
52
3.6. Izotermális titrációs kalorimetria A PfCCT ligandum-kötéseinek termodinamikai jellemzésére izotermális titrációs kalorimetria (ITC) méréseket végeztünk, egy MicroCal ITC200 titrációs kaloriméter használatával (MicroCal Inc.). A titrálandó fehérje oldatot a mérés előtt egy éjszakán át 4°C-on folyamatos kevertetés mellett 20 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM TCEP oldatba dializáltuk. A puffer a kísérlettől függően 5 mM Mg2+ iont vagy 0,5 mM EDTA kelátképzőt tartalmazott. A méréshez használt ligand oldatokat frissen készítettük közvetlenül por formából a dialízis pufferben oldva vagy tömény törzsoldatukból kiindulva. A CTP és CDP-kolin koncentrációkat spektrofotometriás méréssel állapítottuk meg, moláris extinkciós koefficienseik: εCTP,271 nm = 9000 Mcm-1 és εCDP-kolin,260
1
nm=6000
M-1cm-1 ismeretében. A T= 293,0 K hőmérsékleten
elvégzett titrálások során a műszer cellájába a PfCCT oldatot, a pipettába a megfelelő ligandum oldatot szívtuk fel. A titrálás során a tengely fordulatszáma 500 fordulat/perc volt. A kezdeti 0,5 μl-es injektálást további 26, egyenként 1,5 µl térfogatú injektálás követte három perces lépésközökkel. A ligand kicserélődéses (displacement) titrálások során először az enzimet kolin-foszfáttal titráltuk 2-5 mM cellabeli végkoncentrációt elérve, majd a kapott oldatot titráltuk CDP-kolinnal. A titrálási adatokat Origin for ITC 5.0 (Originlab) szoftverrel értékeltük ki, a gyártó útmutatását követve. A ligand-enzim titrálás eredményeit az azonos körülmények között elvégzett megfelelő ligand-puffer titrálások hőértékeivel korrigáltuk. Különösen a CTP ligand-titrálások jártak számottevő hígulási hővel. A titrálási pontok integrált hőadataira nemlineáris regressziós iteratív eljárás során illesztett kötődési görbét a szoftver segítségével. Mindez lehetőséget biztosított a ligandkötés termodinamikai paramétereinek: kötési entalpiaváltozás (ΔH), disszociációs állandó (Kd), valamint a sztöchiometria (n) együttes meghatározására, melyekből az ΔG = R*T*ln(Kd) = ΔH – TΔS 9. egyenlet összefüggés révén a kötési entrópiaváltozás (ΔS) is megállapítható. Több kötődési modellt kipróbálva arra a következtetésre jutottunk, hogy a legegyszerűbb, egy kötőhelyet feltételező modell (one set of independent sites) megfelelően írja le a kötődési eseményt. Mindezek alapján az egyes PfCCT dimer-konstruktok két aktív 53
helyének ligand kötése során számottevő kooperatív hatás nem érvényesült. Alacsony affinitású (Kd > 300 μM) ligand kötődés esetén a kötési modellben a sztöchiometriát n=1 értéken rögzítettük az irodalomban javasolt kiértékelési módnak megfelelően [130,131]. Ilyen körülmények esetén ugyanis problémát jelent, hogy nem tudjuk a kísérlet során létrehozni azt az állapotot, mely során a titráló molekula közel kvantitatív mértékben asszociálódik kötőpartneréhez. Mindez az integrált hőadatok kiértékelése során a termodinamikai paraméterek (Kd, n és ΔH) együttes meghatározását célzó nemlineáris regressziónál gyakran túlillesztési problémát okoz, az illesztés nem konvergál biológiailag értelmezhető termodinamikai értékekhez. Ugyanekkor egyes esetekben ezen mérések is alkalmasak lehetnek a ligand kötés affinitásának és entalpiaváltozásának közelítő meghatározására, a kölcsönhatási sztöchiometria értékének előzetes ismeretek alapján rögzítésével. Ekkor ugyanis a legkisebb négyzetek módszerén alapuló iteráció által meghatározott Kd disszociációs állandó nagymértékben független az n sztöchiometria érték hibáitól [131]. A dolgozatban a PfCCT MΔKW692A CDPCho kölcsönhatása esetén alkalmaztuk az említett két paraméteres (Kd, és ΔH) illesztési módszert.
3.7. Egyensúlyi ligandkötés mérése fluoreszcencia spektroszkópia módszerrel 3.7.1. dUTPáz fluoreszcencia titrálások Az MtDUTD28N, H145W fluoreszcencia emissziós méréseink során kihasználtuk, hogy az enzim dUTP, dUPNPP és dUMP kötése a fluoreszcencia intenzitás csökkenésével jár együtt. A méréseket egy Jobin Yvon SpeX Fluoromax-3 spektrofluorométer segítségével végeztük 20 °C állandó hőmérsékleten, 10 mm optikai úthosszú kvarc küvetta használatával, a korábban a MtDUT
H145W
fehérjére leírt módszer szerint
[30]. A mintát 295 nm hullámhosszú fénnyel gerjesztettük, 1 nm résszélességet alkalmazva, az 5 nm résszélesség mellett mért emissziós spektrum intenzitását 354 nm-en detektáltuk. A méréshez a fehérje tömény oldatát mintegy 50-szeres mértékben hígítottuk 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2 54
összetételű oldattal. A titrálási lépések során a MtDUTD28N,
H145W
700 μl térfogatú
3 μM-os oldatához 1-2 μl tömény ligand oldatot adtunk. A mért adatokra 1:1 sztöchiometriát feltételező kvadratikus egyenletet illesztettünk:
y s A (c K x) ((c K x) 2 4cx) 0,5 / 2c 10. egyenlet ahol x a ligand koncentráció (μM), y a ligand-hozzáadás hatására megjelenő fluoreszcencia-intenzitás
maximum-eltolódása
(nm),
A
a
telítési
ligand
koncentrációnál észlelt fluoreszcencia-intenzitás maximum-eltolódása (nm), c az enzim mérés során alkalmazott koncentrációja (μM), valamint K a disszociációs állandó (Kd, μM).
3.7.2. CCT fluoreszcencia titrálások A PfCCT fluoreszcencia emissziós méréseink során kihasználtuk, hogy az enzim CDPCho kötése a fluoreszcencia-intenzitás növekedésével, valamint az emissziós hullámhossz eltolódásával jár együtt. A méréseket egy Jobin Yvon SpeX Fluoromax-3 spektrofluorométer segítségével végeztük 20°C állandó hőmérsékleten, 10 mm optikai úthosszú kvarc küvetta használatával. A mintát 295 nm hullámhosszú fénnyel gerjesztettük, 1 nm résszélességet alkalmazva, az 5 nm résszélesség mellett mért emissziós spektrum intenzitását 320-400 nm tartományban detektáltuk. A méréshez a fehérje tömény oldatát mintegy 50-szeres mértékben higítottuk 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl összetételű oldattal. A titrálási lépések során a PfCCT konstrukt 700 μl 3 μM-os oldatához adtunk 1-2 μl tömény ligand oldatot. Három perc várakozás után háromszor mértük egymás után az emissziós spektrumot, majd átlagoltuk ezeket. Mivel a CDPCho ligand gerjesztő-fény elnyelése a belső-szűrő-hatás (inner filter effect) révén a fluoreszcencia intenzitás csökkenését eredményezte, a fluoreszcencia-intenzitás változás követése nem bizonyult alkalmas módszernek e ligand kötődésének jellemzésére. Emiatt a titrálás során az emissziós maximumhoz tartozó hullámhossz eltolódásának jelét követtük. Az emissziós fluoreszcencia maximumához tartozó hullámhossz értékét (λmax) az
55
emissziós spektrum felső 10% intenzitási tartományára Gauss eloszlási görbét illesztve állapítottuk meg a 11. egyenlet szerint.
( max ) 2 2 2 y y0 A e
11. egyenlet
Az emissziós maximumhoz tartozó hullámhossz változását a CDPCho koncentráció függvényében ábrázoltuk, majd az adatokra kvadratikus függvényt (10. egyenlet) illesztve határoztuk meg a ligandkötés disszociációs állandóját.
3.8. Fehérje kristályosítás és krisztallográfia 3.8.1. Fehérje kristályosítás Az MtDUTD28N fehérje kristályosítását vízgőzdiffúziós módszer alkalmazásával végeztük, függő-cseppes elrendezésben. A kristályosításnál a vad típusú MtDUT fehérje esetén leírt kicsapószer körülményt [30] optimalizáltuk. A kísérlet során 4,5 mg/ml MtDUTD28N enzim 6,7 mM dUPNPP ligandot, 20 mM MgCl2 -ot és 0,1 mM nátrium-azidot tartalmazó oldatát 1:1 arányban kevertük az 50 mM Tris pH 8,5 puffert, 1,45 M ammónium-szulfátot és 12% glicerin tartalmazó kicsapószer körülménnyel. Három-hat nap 20°C-on állás után cápafog alakú egykristályok nőttek ki.
3.8.2. Krisztallográfiai adatgyűjtés és szerkezet meghatározás A kapott MtDUTD28N fehérje egykristályokból teljes krisztallográfiai adatkészletet vettünk fel a DESY hamburgi szinkrotron X12 sugárforrásánál. Az adatfeldolgozást az XDS és Xscale [132] programmal végeztük. Ennek során a mért diffrakciós képekből meghatároztuk a kristály elemi celláját, valamint az egy elemi cella által okozott szórást jellemző vektormennyiséget, a szerkezeti tényezőt. A fehérje dUPNPP:Mg2+ komplex szerkezetét molekuláris helyettesítéssel határoztuk meg a Molrep [133] program segítségével, melyhez a fázisokat a vad típusú M.tuberculosis dUTPáz szerkezet (PDB kód: 2PY4) szolgáltatta. A modell építést és finomítást a Coot [134] krisztallográfiai programmal, valamint a CCP4 [135] krisztallográfiai 56
programcsomag Refmac [136] programjával végeztük. A végső modell az enzim dUPNPP:Mg2+ ligand komplexét tartalmazza. A koordinátákat és a szerkezeti tényezőt a PDB adatbázisban helyeztük el, a szerkezet kódja 3H6D lett. A szerkezet megjelenítéshez a Pymol programot használtuk.
3.9. Enzim és receptor típusú kvaterner-ammónium kötőhelyek keresése Protein Data Bank adatbázisban A Relibase keresőprogrammal [137] azonosítottuk a PDB adatbázisban 2014 január 1-ig nyilvánossá tett összes olyan háromdimenziós szerkezetet, amelyek kvaternerammónium csoporttal rendelkező vegyületet tartalmaznak, beleértve az ilyen tulajdonságú, 20 aminosavnál rövidebb peptideket is. A kereséskor a kiválasztandó szerkezetek felbontás-küszöbértékének 3,5 Ångströmöt adtunk meg. A kapott 1546 találatot tartalmazó listából kiszűrtük az ismétlődéseket, amit az okozott, hogy a keresés a megfelelő homo-oligomer fehérjék alegységeinek szerkezetileg egymással megegyező
kvaterner-ammónium
ligand-kölcsönhatását
külön
találatként
azonosította. A szűkített találati listába tartozó szerkezetekben a ligandum környezetét egyenként vizsgáltuk meg. A ligand-kötőhely feltételezését legalább két, a kvaterner-ammónium csoporttal kölcsönható oldallánc jelenlétéhez kötöttük. Kizártuk a találati listából az egyes szerkezetekben megjelenő, kvaterner-ammónium szerkezeti elemet tartalmazó fehérje kristályosítási segédanyagokat, illetve puffer molekulákat. A ligand-oldallánc elhelyezkedések értelmezéséhez meghatároztuk a kationos ligand geometriai középpontját jelentő nitrogén atom, valamint a közeli oldallánc legközelebbi nem-hidrogén atomjának távolságát. A ligand közelében talált triptofán, tirozin és fenilalanin oldalláncokat az esetben minősítettük kation-π kölcsönható partnereknek, ha az aromás gyűrűjük síkja a kvaterner-ammónium csoport felé mutatott, továbbá ezek távolsága a vonatkozó irodalmi értelmezéseknek [138,139] megfelelően nem haladta meg a 6 Ångströmöt. A kvaterner-ammónium csoport töltés-dipólus, illetve töltés-töltés kölcsönhatásainak távolságkritériumaként az irodalomban megadott 5 Å értéket használtuk [140]. Az adott ligandum felismerését enzim típusúnak definiáltuk, amennyiben egy enzim aktív helyén a saját szubsztrátját, termékét, vagy ezek szerkezeti analógját találtuk. Az ettől eltérő 57
eseteket receptor típusú ligand-felismerésként értelmeztük. Az egyes találatokat a ligand-kötőhely szerkezeti felépítése alapján is osztályoztuk. A ligandum kvaternerammónium csoportot koordináló poláris vagy negatív töltésű oldalláncok, illetve a kation-π kölcsönhatást biztosító egy vagy két aromás oldallánc együttesét „összetett aromás doboz”-ként (composite aromatic box) definiáltuk. Amennyiben a ligandkoordinációt három vagy négy aromás oldallánc kation-π kölcsönhatása, illetve esetenként egy ezt kiegészítő negatív töltésű oldallánc biztosította, az irodalomban elterjedt „aromás doboz” (aromatic box) [115], illetve „aromás kalitka” (aromatic cage) [141] megjelölést használtuk.
58
4. Eredmények bemutatása és értékelése 4.1. dUTPáz Mg2+ kofaktor koordináció vizsgálata, oldatbeli és szerkezeti vizsgálatok A dolgozat 4.1 fejezete a Takács és munkatársai közleményben (FEBS Lett. 2010 Jul 16;584(14):3047-54 (a továbbiakban 7.1. fejezet, 1. közlemény) foglalt eredményeket tartalmazza.
4.1.1. Az MtDUTD28N mutáció hatásának kinetikai vizsgálata A
Mycobacterium
tuberculosis
dUTPáz
első
konzervált
motívum
aszpartát/aszparagin mutációjának hatását különböző kinetikai módszerekkel vizsgáltuk. A reakciómechanizmus egyes lépéseinek kinetikai vizsgálatához pontmutációval egy triptofán fluoreszcens szenzort építettünk be a vizsgált fehérjékbe, melynek fluoreszcens jele érzékenyen képes követni az aktív helyen történő változásokat [44]. A 145. pozícióban létrehozott hisztidin/triptofán csere nem befolyásolta a konstruktok katalitikus aktivitását, a korábbi tanulmányokhoz hasonlóan [30,44]. A továbbiakban ezért az oldatbeli vizsgálatok során a MtDUTD28N,H145W mutáns, illetve az MtDUTH145W, mint referencia fehérje viselkedését hasonlítottuk össze. A létrehozott D/N pontmutáció az enzim steadystate aktivitásának számottevő, 50-szeres csökkenését eredményezte (16. ábra/B). Tranziens kinetikai mérésekkel vizsgáltuk, hogy a katalitikus mechanizmus mely lépéseit érintette a mutáció. Az MtDUTD28N,H145W egyszeri átviteli (single turnover) körülmények között felvett proton felszabadulás görbéje a fentihez hasonló aktivitás csökkenést mutatott (16. ábra, 5. táblázat, vö. kcat és kobs értékek). Utóbbi mérés során a szubsztráténál magasabb enzim aktív hely koncentrációt biztosítottunk, hogy a szubsztrát kötés kvantitatív módon le tudjon játszódni és a mérés során ne rendelkezzen sebesség meghatározó jelleggel ([enzim] >> Kd, dUPNPP ~ Kd, dUTP ~ KM).
59
16. ábra A D28N mutáció hatása az M. tuberculosis dUTPáz enzim kinetikai viselkedésére. Az eredmények a humán dUTPáz megfelelő pontmutációjának (D49N) hatásával együttesen láthatóak. A) Az M. tuberculosis és humán dUTPázok szekvencia illesztése. Az enzimek konzervált szekvencia motívumai szürke háttérrel láthatóak. A szigorúan konzervált aminosavakat félkövér betűstílus jelzi. B) MtDUTD28N,H145W (fekete vonal) és hDUTD49N,F148W (szürke vonal) proton felszabadulás fenolvörös indikátorral követett kinetikai mérése, egyszeres átviteli körülmények között megállított áramlás módszerrel mérve (fő panel). A mért görbékre egyszeres exponenciális görbét illesztettünk. Az oszlopdiagramon a steady-state körülmények között mért enzim-aktivitások láthatóak, MtDUTH145W tömör fekete, MtDUTD28N,H145W fehér csíkozott, hDUTF148Wtömör szürke, hDUTD49N,F148W szürke csíkozott oszlopokkal jelölve. C) A hidrolízis lépésének vizsgálata egyszeres átviteli körülmény mellett, MtDUTD28N,H145W (teli négyzet) és hDUTD49N,F148W (üres kör) enzimek esetén, a 32PPi/γ32P-dUTP arány követésével. A mérés során a megfelelő enzim és γ32P-dUTP koncentrációja rendre 20 és 30 μM volt. Az ábra 7.1. fejezet 1. közleményében jelent meg.
Az enzim hidrolízis lépésének sebességi állandóját (kH) közvetlen módon is megmértük a γ32P-dUTP részleges hidrolízisével, egyszeri átviteli körülmények között (16. ábra/C, 5. táblázat). A kutatócsoport korábbi eredményei igazolták, hogy a dUTPáz szubsztrát foszforsavanhidrid kötés hidrolízisének velejárója a proton felszabadulás, és az enzimatikus ciklusban ez jelenti a sebességmeghatározó lépést [44]. A MtDUTD28N,H145W mutáns esetén ezen kinetikai lépés sebességi állandójának értéke a steady-state körülmények közt mért átviteli szám (kcat) értékével egy nagyságrendűnek adódott. Mindez arra utal, hogy a mutáció hatása 60
kifejezetten a hidrolízis lépés sebességét érintette, a teljes enzimatikus mechanizmus megváltoztatása nélkül. Előzetes elképzeléseink alapján a D/N pontmutáció hatása a fémion kofaktor aktív helyen történő kötődését zavarhatta volna meg. Az aktivitás csökkenés mértéke azonban sokkal nagyobbnak bizonyult, mint amit a fémion távolléte okozhatna. A M. tuberculosis dUTPáz enzim ugyanis kétértékű fémionok hiányában is megtartotta eredeti aktivitásának felét [45]. Továbbá, mivel az MtDUTD28N,H145W enzim aktivitása Mg2+ távollétében szintén mintegy 50%-os csökkenést mutatott a fémion jelenlétében elvégzett kísérletekhez képest, a mutáció nem befolyásolta az aktivitás Mg2+ koncentrációtól való függését. MtDUTH145W
MtDUTD28N,H145W
kcat (s-1)a
1,2 ± 0,1
0,024 ± 0,005
STOb kobs (s-1)
1,2 ± 0,1
0,017 ± 0,002
STOc kH (s-1)
n.d.
0,0064 ± 0,0002
5. táblázat MtDUT enzimek kinetikai vizsgálata (a) A kcat értékek steady-state proton kibocsátási mérésekből származnak. (b) A STO kobs az egyszeres átviteli körülmények közt végrehajtott megállított áramlás (stopped-flow) kinetikai mérésekből megállapított sebességi állandó. (c) A STO kH sebességi állandót a egyszeres átviteli körülmények közt végrehajtott quench flow radioaktív mérés során közvetlenül mért hidrolízis sebességi állandó.
61
4.1.2. MtDUTD28N, H145W szubsztrát és termék kötésének vizsgálata Megvizsgáltuk, hogy a D28N mutáció hatással van-e a nukleotid ligandok és a Cterminális karban található 5. konzervált motívum kölcsönhatására. Ennek során a motívumba mutagenezissel beépített triptofán fluoreszcens jelét követtük. Ezt az aktív hely konformációs változásait érzékenyen követő fluoreszcens riportert a kutatócsoportban korábban eredményesen használták az MtDUT enzim nukleotid kötésének
jellemzésére
[30].
A
mérések
során
kapott
értékek
hasonló
nagyságrendűek voltak, mint a további dUTPáz komplexek Kd, illetve KM értékei [42–44,142–145]. A MtDUTD28N,H145W, illetve MtDUTH145W fehérjék dUPNPP és dUMP ligand titrálásai (17. ábra) jól illeszthetőek voltak az 1:1 sztöchiometriát feltételező kötési modellel, a megfelelő disszociációs állandó értékek a 6. táblázatban találhatóak.
17. ábra Szubsztrát és termék kötődés triptofán fluoreszcencia mérések. A) dUTPáz enzimek MtDUTH145W (teli négyzet), illetve MtDUTD28N,H145W (üres kör) fluoreszcens titrálása dUPNPP szubsztrát analóg illetve dUMP termék hozzáadásával (betétábra). A vonatkozó Kd értékek a 5. táblázatban találhatóak. B) Az aktív helyen elhelyezkedő triptofán relatív fluoreszcencia kioltás nagysága telítési ligand koncentrációk esetén (1 mM dUMP, 1 mM dUTP, 250 μM dUPNPP) MtDUTH145W (teli oszlopok) illetve MtDUTD28N,H145W (csíkozott oszlopok) esetén. Az ábra 7.1. fejezet 1. közleményében jelent meg.
62
A D/N mutáció jelentősen csökkentette a MtDUTD28N,H145W fehérje dUPNPP affinitását, amit a disszociációs állandó tizenötszörös növekedése jelez. Ezzel szemben a mutáció nem befolyásolta számottevően a fehérje dUMP kötő képességét (17. ábra, 6. táblázat). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az 1. motívumban létrehozott pontmutáció megzavarta a szubsztrát nukleotid-trifoszfát láncának koordinációját, annak ellenére, hogy nem létesít vele közvetlen kölcsönhatást. A kötéserősség mellett a triptofán szenzor fluoreszcencia kioltásának (quench) mérése is felhasználható a nukleotid-trifoszfát szubsztrát és -monofoszfát termék kötődésének megkülönböztetésére, valamint a különböző kinetikai állapotok betöltöttségének egyensúlyi meghatározására a Mycobacterium dUTPáz esetén [30,44,142]. A fluoreszcencia jel ezen változását a triptofán indol oldallánca és az uracil gyűrű között fellépő aromás-aromás (stacking) kölcsönhatás okozza, mely az 5. motívum aktív helyre rendeződése során alakul ki [30,43]. Ez a kölcsönhatás a dUTPáz enzimek esetén konzervált, mivel a C-terminális kar triptofán szenzornak megfelelő pozícióján kizárólag aromás aminosavak (fenilalanin vagy hisztidin) helyezkednek el [146]. Egy korábbi tanulmányban a humán dUTPáz (hDUTF158W) reakciójának steady-state állapotában, a nagy dUTP felesleg jelenlétében alacsony relatív fluoreszcencia állapotot tapasztaltak [44]. Mindez az enzim katalízisnek megfelelő konformációs állapot meghatározó jelenlétét jelezte az enzim molekulák sokaságában. Az MtDUTH145W fehérje dUTP, továbbá dUPNPP szubsztrát analóg jelenlétében hasonlóan nagy fluoreszcens kioltást (quench) tapasztaltunk (17. ábra, 6. táblázat). Az MtDUTD28N,H145W fehérje dUTP illetve dUPNPP kötése esetén azonban ennél jóval kisebb fluoreszcencia kioltás értékeket mértünk. Mindez arra utal, hogy a D/N mutáns enzim aktív helye kevéssé képes a katalitikus funkció betöltéséhez szükséges konformáció kialakítására, ami összhangban van a mért csökkent katalitikus aktivitással, valamint a MtDUTD28N szerkezetben az 5. motívum megnövekedett rendezetlenségével (vö. 4.1.3. fejezet). A D/N mutáció hatására dUMP kötés fluoreszcencia kioltás mértéke ugyanakkor nem változott (17. ábra), ami a kölcsönhatás disszociációs állandójával (6. táblázat) együtt arra utal, hogy a termék kötődése az aktív helyen változatlan. 63
KddUPNPP (μM) KddUMP (μM) Fmaxapo FmaxdUMP FmaxdUTP FmaxdUPNPP λmaxapo (nm) λmaxdUMP (nm) λmaxdUTP (nm) λmaxdUPNPP (nm)
MtDUTH145W
MtDUTD28N,H145W
0,32 ± 0,1 72 ± 17 1 0,87 ± 0,04 0,14 ± 0,03 0,21 ± 0,02 354,0 ± 0,1 354,2 ± 0,3 351,9 ± 2,0 350,8 ± 0,4
4,7 ± 0,5 58 ± 14 1 0,79 ± 0,09 0,88 ± 0,05 0,55 ± 0,02 354,2 ± 0,3 353,7 ± 0,2 354,8 ± 0,3 353,1 ± 0,5
6. táblázat MtDUT enzimek kvantitatív ligand kötési vizsgálata. A táblázat jelölései: Kd: disszociációs állandó, F: fluoreszcencia emissziós intenzitás, Fmax: a megfelelő dUMP, dUTP illetve dUPNPP liganddal telítés során mért, apo enzimhez viszonyított relatív fluoreszcencia intenzitás, λmax:: a fluoreszcencia intenzitás maximumhoz tartozó hullámhossz az enzim apo állapotában illetve megfelelő dUMP, dUTP illetve dUPNPP liganddal telítésekor. A bemutatott mérési értékek 3-5 független mérés átlagát és szórását jelenítik meg.
4.1.3. A MtDUTD28N mutáns szerkezeti vizsgálata: a pontmutáció továbbterjedő szerkezeti hatása Az enzim-kinetikai és ligand-kötési vizsgálatok valószínűsítették, hogy az 1. konzervált motívumhoz tartozó aszpartát mutációja jelentősen megzavarja az enzim működését. Ahhoz, hogy megértsük ennek szerkezeti alapját, az MtDUTD28N fehérjét dUPNPP
nem-hidrolizálható
szubsztrát-analóg
és
Mg2+
jelenlétében
kristályosítottuk. A kapott jól diffraktáló egykristályok röntgen diffrakcióját szinkroton sugárforrásnál megmértük, majd a szerkezet megoldása során a molekuláris
helyettesítés
lépésnél
a
hozzá
nagyon
hasonló
vad-típusú
M. tuberculosis dUTPáz szerkezetet (PDB-kód: 2PY4) használtuk modellként (vö. Függelék, 8.1 fejezet). A végső szerkezet tartalmazta a dUPNPP szubsztrátanalógot, valamint az általa koordinált Mg2+ iont is, ugyanakkor ezek megnövekedett mozgékonysággal rendelkeztek (18. ábra/A, 7. táblázat). A dUPNPP szubsztrát-analóg három foszfát-oxigénje a fémiont tridentát módon koordinálta, a vad-típusú enzimnél megfigyelthez hasonlóan [30]. A Mg2+ 64
hexagonális koordinációs szférájába tartozó további három szerkezeti vizet azonban nem lehetett beilleszteni az elektronsűrűségi térképbe, feltehetően megnövekedett mozgékonyságuk miatt. A mutációval létrehozott aszparagin jól látható volt a szerkezetben. Karboxamid végcsoportja 45°-os elfordulást mutat az eredeti aszpartát karboxilát csoport síkjához képest (18. ábra/B). A karbonsav/savamid helyettesítés és a csoport elfordulása számos további kedvezőtlen szerkezeti változáshoz vezetett. A változtatás egyrészről nem tette lehetővé a Mg2+ hidrátburkához tartozó két víz koordinációját. Ennek a szerkezeti stabilizáló hatásnak a hiánya a hidrátburok rendezetlenebbé válását, a vizek rögzített helyzetének megszűnését okozhatta. Mindez együtt jár a nukleotidhoz kötött Mg2+ mozgékonyabbá válásával is (18. ábra/A, 7. táblázat). Másrészről a mutációval megváltoztatott N28 (1. motívum) és a 4. konzervált motívumhoz tartozó, az enzim aktív-helyének kialakításában fontos szerepet játszó R110 oldallánc közötti hidrogén-hidas kölcsönhatás is megszűnt (19. ábra). Az érintett oldallánc elmozdult a vad-típusú enzimnél tapasztalt pozíciójához képest, emiatt nem volt képes két hidrogénhidas kölcsönhatással kapcsolódni a S148 oldallánchoz. Ez utóbbi alegységek közti kapcsolat fontos szerepet játszott az 5. motívum aktív helyre rendeződésében a vad típusú enzim dUPNPP:Mg2+ komplex esetén [30]. A nukleotid-trifoszfát egyéb aktív-hely oldalláncokkal kialakított kölcsönhatásai is gyengültek, beleértve a katalitikus vizet is koordináló Q113 oldalláncot (19. ábra). Emellett
érdekes
módon
a
2.
motívum
konzervált,
az
enzim
reakció
mechanizmusban fontos szerepet játszó [41] Ser65 oldallánca két alternatív konformációval jelenik meg a kristályszerkezetben. A fentebb említett szerkezeti változásokon túl megvizsgáltuk a katalitikus víz elhelyezkedését az enzimszerkezetben. A dUTPáz szerkezetekben ez a vízmolekula a nukleotid szubsztrát αfoszfátjára irányuló ún. in-line nukleofil támadásra alkalmas pozícióban található [36].
65
18. ábra Az MtDUTD28N fehérje szerkezeti összevetése a vad típusú enzimmel. Az uracil kötő zsebet kialakító 3. konzervált motívum β-hajtű aminosavait használtuk a szerkezetek egymásra illesztéséhez. A) Az MtDUTD28N szerkezet megnövekedett mozgékonysággal bír, ami az aktív hely környékét, valamint a dUPNPP nukleotidot (pálcika modell) is érinti. A fehérje komplexet szalag modellel ábrázoltuk, a krisztallográfiai B-faktor szerinti színezéssel (sötétkéktől piros színig átmenet a növekvő B-faktor értékek szerint). A katalitikus vizet és a Mg2+ kofaktor fémion helyét vörös és lila nyilakkal jelöltük. B) A katalitikus víz elhelyezkedése az MtDUTWT és MtDUTD28N szerkezetekben a dUPNPP szubsztrát analóghoz képest (sztereo nézet). A két szerkezetben rendre sárga illetve zöld szénatom jelölést használunk, a vizeket rózsaszín illetve mélyvörös színű gömbökkel, a Mg2+ kofaktor fémiont világosszürke, illetve sötétszürke gömbbel jelöltük. A mutáció hatására az D28N oldallánc karboxil csoportja elfordult. Emellett a katalitikus víz pozíciója is megváltozott, noha közelebb került az α-foszfát reakciócentrumhoz, a távozó csoporttal már kisebb szöget zár be, ami kedvezőtlen az asszociatív típusú mechanizmus szempontjából. Az ábra a 7.1. fejezet 1. közleményében jelent meg.
66
19. ábra A dUPNPP szubsztrát analóg foszfát láncának kölcsönhatási hálózata az MtDUT (A) és MtDUTD28N (B) enzimekben. A dUTPáz három kölcsönható alegységét kékeszöld, sötétkét és világoskék színnel jelöltük, a vizeket piros, a Mg2+ iont bíborvörös szín jelzi. Az ábrán a számok az Ångströmben mért távolságot mutatják. Az MtDUTD28N: dUPNPP:Mg2+ komplexben a C-terminális kar és a szubsztrát között nem jelennek meg kölcsönhatások az R140 oldalláncától eltekintve. A D28/R110/S148 alegységen belüli és alegységek közti kölcsönhatás hálózat is gyengül. A MtDUTD28N szerkezetben a több, mint 10%-kal megváltozott távolságokat félkövér és dőlt szedéssel emeltük ki. A katalitikus víz és az αP távolságát piros színnel jelöltük, emellett nyíl mutatja a nukleofil támadás irányát. Az ábra a 7.1. fejezet 1. közleményében jelent meg.
67
Az MtDUTD28N szerkezetben a víz elhelyezkedése a nukleofil támadás szempontjából kedvezőtlen módon változik meg. A vízmolekula oxigén atomja, az α-foszfát reakciócentrum és a távozó csoport által bezárt szög a vad típusú enzim esetén tapasztalt 169°-hoz képest 154°-ra változik, nagyobb eltérést mutatva az ideális 180°-tól. A vízmolekula ezzel együtt jelentősen közel, mintegy 2,0 Å távolságra kerül az α-foszfát egyik oxigénjéhez, ami vélhetően csökkenti nukleofil jellegét is. A vízmolekula új pozíciójában az eredetileg tetraéderes koordinációs szféra is torzul (19. ábra) és feltehetően jelentősen meggyengül a Q113 oldallánccal alkotott kölcsönhatása. Az 5. konzervált motívumot tartalmazó teljes C-terminális kar, az R140 oldalláncának kivételével, nem lokalizálható a kristályszerkezetben megnövekedett mozgékonysága miatt. Az enzim ezen szerkezeti eleme flexibilitása révén nem minden esetben válik láthatóvá a dUTPáz szerkezetekben (ld. [146,147]). A P63 tércsoport szimmetriával rendelkező Mycobacterium tuberculosis dUTPázokban dUPNPP és Mg2+ jelenlétében azonban szinte minden esetben láthatóvá vált a szerkezetben ez a régió is, amiben a kristálypakolódás is szerepet játszhat [27,30]. Ennek fényében a jelen kristály-szerkezetben az 5. motívumnak megfelelő elektronsűrűség hiánya a mutáció hatásaként értékelhető. A kar megnövekedett mozgékonysága összhangban van a fluoreszcencia titrálás eredményekkel is, amelyek a C-terminális kar és az enzim trifoszfát-ligandjának megváltozott kölcsönhatására utalnak (17. ábra). A mutációt hordozó fehérje aktív helyén az ismert elhelyezkedésű fehérje-oldalláncok, szubsztrát-analóg valamint Mg2+-kofaktor
szintén
megnövekedett
krisztallográfiai
B-faktor
értékekkel
rendelkeznek, ami nagyobb mértékű hőmozgásukat mutatja. (18. ábra, 7. táblázat). Az előbbiekben részletezett szerkezeti rendezetlenség hozzájárulhatott a mutáns enzim csökkent katalitikus hatékonyságához. Az eredményeket összegezve megállapítható, hogy az 1. konzervált motívumban létrehozott pontmutáció számos, nem csupán a közvetlen környezetére kiható konformáció-változást eredményezett. Az alegységek közötti kölcsönhatások megzavarása a katalízisben fontos szerepet betöltő
oldalláncok
megnövekedett
konformációs 68
szabadságát
okozta.
Átlagos Bfaktor (Å2) aminosav
Központi csatorna
Aktív hely
MtDUT vad típus
MtDUTD28N
Motívum Aminosav Főlánc Összes Főlánc Összes
4. 4. 4.
1. 2. 2. 2. 3. 3. 4. 4. 5. 5. 5. 5.
M57 V58 G59 L60 V61 H62 I111 A112 Q113 L114 L115 V116 Q117 R118 D/N28 R64 S65 G66 T81 D83 R110 Q113 R140 G146 S147 S148 dUPNPP Mg2+
15,4 14,1 13,5 13,5 12,2 13,1 13,8 12,7 13,8 13,9 13,9 14,0 15,0 14,9 14,8 12,9 12,5 13,6 14,8 13,6 14,2 13,8 21,7 18,9 20,5 22,5
16,3 14,2 13,6 14,6 12,7 13,8 15,8 13,0 14,9 14,7 14,1 14,4 15,0 21,0 15,5 13,7 13,0 13,6 15,2 14,3 16,3 14,9 19,7 18,9 21,0 21,5 14,7 15,3
15,4 14,3 14,0 14,1 14,2 13,7 17,4 15,1 14,6 14,7 13,8 13,8 14,5 16,1 18,7 17,5 18,8 18,7 15,9 13,8 18,1 14,6 * * * *
16,9 14,2 14,0 15,7 15,1 14,5 19,2 15,2 19,9 15,3 14,0 14,3 15,6 29,8 21,8 26,8 19,6 18,7 16,8 16,1 31,0 19,9 42,5 * * * 34,0 37,7
7. táblázat Atomi mozgékonyságra jellemző krisztallográfiai B-faktor értékek MtDUT kristályszerkezetekben. A vad típusú és mutáns (MtDUTD28N) M. tuberculosis dUTPáz kristályszerkezetek mozgékonyságát jellemeztük (PDB kódok rendre 2PY4 ill. 3H6D). A 16-nál nagyobb krisztallográfiai B-faktorokat félkövér szedéssel emeltük ki. A * jellel jelölt oldalláncokat nem lehetett az elektronsűrűségi térképbe illeszteni, vélhetően nagy mozgékonyságuk miatt. A pontmutáns fehérjében a trimer központi csatorna oldalláncainak mozgékonysága nem változott, míg az aktív hely közelében lévő oldalláncok, a dUPNPP, illetve a Mg2+ mozgékonysága jelentősen nőtt a vad-típusú fehérjéhez képest.
69
4.1.4. Az MtDUTD28N pontmutáns fehérje oldatbeli és szerkezeti vizsgálatainak együttes értékelése Homo-oligomer enzimek esetén az egyes aktív helyek kialakításában több alegység is részt vehet. A legtöbb ilyen esetben az aktív helyet két alegység alkotja, három vagy négy alegység ilyen kölcsönhatása jóval ritkább (vö. a FAD-függő ThyX timidilát szintáz szerkezete, [148]). A dUTPáz enzimek esetén az aktív helyet konzervált szekvencia motívumok építik fel úgy, hogy az alegységek közötti kölcsönhatások a szubsztrát kötő zsebet alakítják ki, ebben számos kölcsönhatással vesz részt a mozgékony, 5. motívumot is tartalmazó C-terminális kar a katalitikusan kompetens konformáció kialakításakor. Az általunk létrehozott 1. motívumhoz tartozó D28N mutáció az MtDUT enzim aktivitását, valamint nukleotid-trifoszfát szubsztrát-kötő képességét jelentősen csökkentette. A humán dUTPáz megfelelő pontmutáns enzimének vizsgálata hasonló hatásról árulkodott (7.1. fejezet, 1. közlemény). A megfelelő aszpartát alanin mutációja a Saccharomyces cerevisiae dUTPáz enzim esetén is az enzimaktivitás drasztikus csökkenését eredményezte [149]. A munkánknál később publikált közlemény szerzői azonban nem szolgáltak további kísérletes eredménnyel a tapasztalt változások értelmezésére. Eredményeink alapján az oldallánc csere az MtDUT fehérje szerkezetében messze ható konformációs változásokat idézett elő, melyek érintik az ugyanezen alegységbe tartozó 4. motívum, illetve az eltérő alegységhez tartozó 5. motívum kölcsönhatásait, valamint a nukleofil támadást végző víz elhelyezkedését. Az aktív hely környékét érintő szerkezeti változások értelmezéséhez érdemes elvégezni az MtDUTD28N és egy, a C-terminális kart nem tartalmazó M. tuberculosis dUTPáz pontmutáns enzim (MtDUTT138STOP, PDB-kód: 3I93) szerkezeti összehasonlítását (vö. 7.1. fejezet, 1. közlemény). Utóbbi pontmutáció az enzimaktivitás három nagyságrendbeli csökkenését eredményezte [40]. Ugyanakkor ez a csonkítás nem változtatta meg a nukleotid fehérje-kölcsönhatását az aktív helyen, az eltávolított C-terminális kartól eltekintve. Ezzel összhangban a krisztallográfiai B-faktorok sem mutattak a MtDUTD28N enzim esetén tapasztalthoz hasonló rendezetlenség növekedést (vö. 7. táblázat). Mindez igazolja, hogy a D28N mutáció felelős a fehérje alegységek
70
egymásba fonódó kölcsönhatásainak megbontásáért, beleértve a C-terminális kar tapasztalt rendezetlenségét is. Megállapítható, hogy az 1. konzervált motívum aszpartát oldalláncának feladata az előzetes elképzeléssel ellentétben nem kizárólag a Mg2+ kofaktor jelenlétének és katalízis szempontjából megfelelő elhelyezkedésének biztosítása. A mutáció ugyanis sokkal súlyosabban érintette az enzim működését, mint a Mg2+ távollétének hatása. Utóbbi, a fémion jelenlététől függő enzim-aktiváló hatás az MtDUTD28N konstrukt esetén is jelentkezett, és feltehetőleg a nukleotid trifoszfát szubsztrát katalízis szempontjából kedvező konformációjának biztosítását jelentheti [45]. Eredményeink arra utalnak, hogy a Mg2+ kofaktor hidrátburkának koordinációján túl a D28 aminosav meghatározó szereppel bír konzervált motívumok kölcsönhatási hálózatának kialakításában, ami az enzim katalitikus hatékonyságát biztosítani képes.
71
4.2. A PfCCT katalitikus domént tartalmazó konstrukt létrehozása és működésének jellemzése A dolgozat 4.2 fejezete a Nagy és munkatársai közleményében (FEBS J. 2013 Jul;280(13):3132-48,
a
továbbiakban
7.1.
fejezet,
2.
közlemény)
foglalt
eredményeket tartalmazza.
4.2.1. A PfCCT rendezetlenségi vizsgálata A teljes hosszúságú PfCCT jellegzetességeinek feltárásához elvégeztük a fehérje in silico rendezetlenségi becslését. A fehérje rendezetlenségi profilját összevetettük a PfCCT ismert funkciójú szegmenseinek (katalitikus domén, membrán kötő szegmens) elhelyezkedésével (20. ábra).
20. ábra A teljes hosszúságú PfCCT rendezetlenségi profilja. Az ábra az egyes aminosavak esetén a különböző rendezetlenség-becslő szerverek (RONN [150], IUPRED [151], és DISOPRED [152]) által számított rendezetlenségi valószínűségeket mutatja. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
Az említett szegmensek szakaszhatárát szekvencia-hasonlóság alapján állapítottuk meg, más fajokhoz tartozó CCT enzimeket figyelembe véve. Az ábrán zöld színnel jelölt két katalitikus domént (C1 és C2, rendre 36.-197. és 621.-782. aminosavak) 72
mindhárom használt predikciós program rendezettnek ítélte. Az ezeken a szakaszokon belül elhelyezkedő egy-egy Plasmodium-specifikus, lizin-gazdag szakasz (K, világoskék színű, 133.-152. ill. 720.-737. aminosavak) ugyanakkor rendezetlennek bizonyult. A két katalitikus domént megelőző szakaszok (1.-30. ill. 528.-620. aminosavak) szintén megnövekedett rendezetlenséget mutattak. A membrán-kötő szegmensek (M1, M2, sárga színnel, 208.-297. ill. 793.-880. aminosavak) katalitikus doméneknél nagyobb becsült rendezetlensége összhangban van
ezen
ismert
szakaszok
átrendeződésével.
Végül
a
membrán-kölcsönhatás-függő
szekvencia-alapú
becslő-programok
szerkezeti a
fehérje-
szekvencián belül számos rendezetlennek, vagy nagymértékben flexibilisnek ítélt régiót azonosítottak a két duplikált, katalitikus és membrán kötő domént is magába foglaló szegmens közötti linker régióban.
4.2.2. Kísérleti vizsgálatokhoz alkalmas, enzimatikus aktivitással bíró PfCCT konstrukt létrehozása Ahogy az irodalmi áttekintésben említettük, Yeo és munkatársai megmutatták, hogy a PfCCT fehérje E.coliban rekombinánsan termeltetett 528-896 szakasza membránkölcsönhatás függő enzimatikus aktivitással rendelkezik [111]. A vizsgált konstrukt a gén duplikációval kialakult PfCCT második felének felelt meg és tartalmazta a CCT-specifikus szegmenseket: a második katalitikus domént (C2) valamint a második membrán kötő szegmens (M2) részét képző két, in vitro tanulmány által vizsgált α-hélixet [119]. Kísérletes vizsgálatainkhoz egy, a második katalitikus domént magába foglaló konstruktot (PfCCT528-795) állítottunk elő. A katalitikus domént
megelőző,
rendezetlennek
ítélt
(528-610)
szakasz
jelenlétének
szükségességét kezdeti PfCCT expressziós vizsgálataink igazolták, mely során egy, csupán a katalitikus domén konzervált szakaszára korlátozódó PfCCT619-767 konstruktot sikertelenül próbáltunk oldható formában E. coliban termeltetni. A jóslások limitációit figyelembe véve elképzelhető, hogy a katalitikus domént megelőző szakasz önmagában rendezetlen, ugyanakkor a vizsgált konstruktban mégis
részben
rendezett
szerkezetet
vehet
fel
a
katalitikus
doménnel
kölcsönhatásban. Hasonló rekombináns kifejeztetést elősegítő hatást figyeltek meg a 73
patkány CCT prekatalitikus szegmense (40-75. szakasz) esetén is [90]. Mivel a PfCCT528-795 magába foglalja a második katalitikus domént, azonban nem tartalmazza a membrán kötő régiót, az irodalmi analógiának megfelelően várhatóan ún. konstitutív enzim aktivitással rendelkezhet [88], azaz aktivitása nem függ lipid összetevők jelenlététől. A fehérje hatékony tisztítása érdekében a konstruktból továbbá eltávolítottuk a lizin-gazdag régiót (720.-737. aminosavak). Az így kapott PfCCT528-795,
Δ720-737
fehérje konstruktra továbbiakban a PfCCT MΔK jelölést
alkalmazzuk. Differenciális pásztázó fluorimetria (Thermofluor) módszerrel megmutattuk, hogy a lizin-gazdag régió eltávolítása révén a PfCCT konstrukt denaturációs hőmérséklete 9°C-kal nőtt a PfCCT528-795 konstrukthoz képest, ami számottevően megnövekedett hőstabilitásra utal (21. ábra).
21. ábra A Plasmodium-specifikus lizin-gazdag szakasz (720.-737. oldalláncok) hatása a PfCCT katalitikus domén konstruktok hőstabilitására. A szakasz Δ720-737
eltávolításával kapott PfCCT528-795, konstrukt (PfCCT MΔK) jelentősen magasabb denaturációs hőmérséklettel rendelkezik, mint a szakaszt tartalmazó PfCCT528-795 fehérje (rendre 53,8°C és 45°C). Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
4.2.3. A PfCCT katalitikus domén szerkezeti jellemzése A PfCCT enzim második katalitikus doménjének szerkezeti becsléséhez homológiamodellezést végeztünk (22. ábra). Ehhez templátként a patkány CCT katalitikus domén homodimer kristályszerkezetét választottuk [90], mellyel a PfCCT a modellezett régióban (581.-774. aminosavak) 39,7% szekvencia azonossággal 74
rendelkezik. A modell a templáthoz hasonló harmadlagos szerkezettel jellemezhető, az α szénatomok négyzetes távolságeltérése 0,928 Å -nek adódott.
22. ábra A PfCCT MΔK és a PfCCT528-795 konstruktok szerkezeti modellje. A PfCCT528-795, illetve a PfCCT528-795, Δ720-737 (MΔK) konstrukt rendre világosnarancs illetve világoskék színű homológia modelljeinek egymásra illesztett képe. A fehérjeláncot szalagmodell jelöli, az aktív helyen kötött CDP-kolin termék pálcika modellel van megjelenítve, atomi színezéssel (szén: sárga, oxigén, piros, foszfor: narancs, nitrogén: kék). A W682, W692 és W743 triptofánok kék színnel, pálcikamodellként vannak ábrázolva. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
Megvizsgáltuk a C2 doménnel 90%-ot meghaladó szekvencia azonosságot mutató C1 domén aminosav eltéréseinek helyét a modell szerkezetben. Mivel ezek nem érintették az enzim konzervált aktív centrumát, valamint a dimer kölcsönható felszínt, a létrehozott homológia modell vélhetően alkalmas lehet a fiziológiás formában várt katalitikus domén C1/C2 dimer szerkezet megjelenítésére. Megvizsgáltuk továbbá a lizin-gazdag szakasznak a katalitikus domén szerkezetét befolyásoló szerepét. A homológia modell alapján ez a szakasz a β4 redő és αL hélix szerkezeti
elemeket
összekötő rendezetlen hurkot
képez.
A PfCCT528-795
és PfCCT528 -795, Δ720-737 (MΔK) fehérjék homológia modelljeit összehasonlítva látható, hogy a kivágott régiót tartalmazó, illetve nélkülöző homológia modellek nem mutattak változást a katalitikus domén feltekeredésében (22. ábra).
75
4.2.4. A PfCCT MΔK tisztítása és oligomerizációs állapotának jellemzése A PfCCT MΔK konstruktot méretkizárásos kromatográfiával vizsgálva a kromatogram egyetlen, 268 kDa látszólagos molekulaméretnek megfelelő csúcsot adott, ami számottevően nagyobb, mint a rekombináns, His-címkét is tartalmazó fehérje dimer aminosav összetételből számolt 61,8 kDa tömege (23. ábra/A). A fehérje minta denaturáló SDS-poliakrilamid gélelektroforézise 37 kDa látszólagos molekulatömegnek megfelelő sávot jelzett, ami szintén nagyobb a fentebb említett számolt molekulatömegnél. A tapasztalt nagyobb látszólagos molekulaméretet feltehetően a PfCCT MΔK fehérje konstrukt N-terminálisán elhelyezkedő, rendezetlennek ítélt szakasz okozhatja (528.-610. aminosavak). Ez a jelenség a szakirodalomban nem ismeretlen, egy jellemző példa a Plasmodium falciparum CTP:etanolamin citidililtranszferáz (PfECT) oldatbeli viselkedése [153]. Ez esetben a méretkizárásos kromatográfia nem alkalmazható a valós molekula méret becslésére, mivel a fehérje ideálistól eltérő hidrodinamikai tulajdonságai nagyban befolyásolhatják az elúciós viselkedését. A PfCCT MΔK oldatbeli oligomerizációs állapotát electrospray ionizációs tömegspektrometriával is megvizsgáltuk, amely egy ismert módszer fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosítására [154]. A fehérje natív körülmények között felvett elektrospray tömegspektruma két meghatározó ion-csúcs sorozatot mutat az 1900-4000 tömeg/töltés (m/z) tartományban (23. ábra/B). A tartomány magasabb, 3000-4000 m/z régiójában a dimer szerkezetnek megfelelő ion csúcs sorozat figyelhető meg, közülük a legnagyobb intenzitású csúcsok tizennyolchúsz pozitív töltéssel rendelkeznek.
76
23. ábra A PfCCT MΔK fehérje tisztítása és oligomer formájának jellemzése. A) A fehérje tisztítási lépései, a megfelelő mintákat 12% SDS-PAGE gélen futtattuk meg. B) A PfCCT MΔK natív electrospray körülmények közt felvett tömegspektruma. Az ábrán M és D a monomer és dimer csúcsokat, a számok, a részecskék töltését jelzik. A két betétábra a spektrum monomer és dimer ion csúcsoknak megfelelő régiónak nagyított képét mutatja. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
A
megfelelően
keskeny
töltés-eloszlás
arra
utal,
hogy
az
oldatból
a
tömegspektrométerbe jutva a fehérje megtartotta natív konformációját [155]. A mérés során megállapított dimer molekulatömeg 61840 ± 200 Da volt, amely gyakorlatilag megegyezik a 61,8 kDa számított dimer molekulatömeg értékkel. A tömeg/töltés tartomány 1900-3000 m/z értékeinél megjelenő ion csúcs sorozat a fehérje monomer állapotának felel meg. A csúcs-sorozat +13 körüli töltés eloszlást mutat, a hozzájuk tartozó tömeg 30870 ± 200 Da, ami jó egyezést mutat a fehérje számolt monomer tömegével (30898 Da). Az integrált csúcs alatti területek 10:13 monomer:dimer arányt mutatnak. A dimernél nagyobb oligomereknek megfelelő jelek nem azonosíthatóak a tömegspektrumban, a mérés jel/zaj arányát figyelembe véve relatív gyakoriságuk kisebb, mint 3%. A fehérje tömegspektrumában azonosított dimer állapot megfelelhet a fehérje oldatbeli asszociációs formájának, és azt nem az ionizáció során bekövetkező nemspecifikus aggregáció okozza. Megjegyzendő, hogy a kísérlet önmagában nem alkalmas a monomer oldatbeli forma kizárására. A PfCCT MΔK valószínűsített dimer állapota ugyanakkor egybecseng a homológia modell által javasolt szerkezeti formával, valamint más CCT enzimek oligomerizációs állapotával [90]. 77
4.2.5. A PfCCT reakciómechanizmusának kinetikai vizsgálata A PfCCT MΔK konstrukt enzim aktivitásának mérésére egy folytonos steady-state spektrofotometriai módszert fejlesztettünk ki. A CTP és ChoP szubsztrát titrálások során az állandó koncentrációjú szubsztrátot telítési mennyiségben alkalmaztuk. Mivel utóbbi szubsztrát koncentrációjának változtatása nem befolyásolja a mért reakciósebességet, a titrálásokat pszeudo-elsőrendű körülmények közt végeztük. A CTP titrálás kezdeti sebesség értékei a szubsztrát koncentráció növelésével telítési jelleget mutattak. Ezekre Michaelis-Menten kinetikai modellt illesztve az átviteli szám (kcat) 1,45 ± 0,05 s-1-nek adódott, a CTP Michaelis állandó (KM,
CTP)
168 ± 17 µM volt (24. ábra, 8. táblázat). A ChoP titrálás esetén a fiziológiás 30 μM ChoP koncentrációnál [156] jóval magasabb koncentrációtartományban kinetikai szubsztrát gátlást figyeltünk meg. Az adatokra kompetitív szubsztrát inhibíciós modellt illesztve a ChoP látszólagos Michaelis állandója 1,8 mM-nak adódott (24. ábra, 8. táblázat). Összevetésképpen, a Plasmodium falciparummal fertőzött vörösvértestek vizsgálatakor a teljes hosszú PfCCT1-896 enzim aktivitása MichaelisMenten kinetikának megfelelő ChoP függést mutatott, a megfelelő Michaelis állandó KM, ChoP = 511 µM volt [157]. CTP titrálás
ChoP titrálás
kcat (s )
KM,CTP (μM)
kcat (s )
KM,ChoP(mM)
KI,ChoP (mM)
1,45 ± 0,05
168 ± 17
1,2 ± 0,4
1,8 ± 1,1
10,5 ± 7,5
-1
-1
8. táblázat A PfCCT MΔK katalízisének kinetikus paraméterei. A szubsztrát inhibíciós hatás legkézenfekvőbb magyarázata két szubsztrát aktív helyen történő koordinációja lehet. A feltételezés alapján a CCT enzim aktív centrumában a CTP trifoszfát láncának konzervált kötőhelye szolgálhat alternatív, kisebb affinitású kolin-foszfát kötőhelyként. Amennyiben valóban képes ide kötődni egy kolin-foszfát molekula, az kompetitív módon gátolhatja a CTP szubsztrát kötését. A
fehérje
konstrukt
aktivitása,
valamint
a
homológia
modell,
és
a
tömegspektrometria alapján valószínűsített dimer állapot együttesen megerősítette, 78
hogy a konstrukt egy megfelelő, katalitikus aktivitással rendelkező modellt jelent a PfCCT enzim fiziológiás formájában jelentkező, első és második katalitikus domén alkotta dimer formájára. Egy később megjelent publikáció további kísérletes adatokkal igazolta ezt az állítást [80]. A kinetikai mechanizmus jobb megértéséhez megvizsgáltuk a CTP és ChoP szubsztrátok enzimhez kötésének sorrendjét. Ehhez a termék-gátlás szubsztrát titrálás során érvényesülő hatását követtük (24. ábra/C1, D1). Ennek során az enzim aktív helyeit elfoglaló termékmolekulák gátolják a szubsztrátok ismételt bekötődését, egy következő enzimatikus ciklus lejátszódását. Meghatározott szubsztrát kötődés és termék távozás sorrend esetén az aktív helyet először elhagyó termék nemkompetitív jellegű gátlást mutat mindkét szubsztráttal szemben. Random ligand kötődési mechanizmus esetén ezzel szemben mindegyik termék legalább az egyik szubsztrát kompetitív inhibitoraként viselkedik [158]. A kísérlet során az összemérési lépésben a CDPCho terméket is a reakcióelegyhez adtuk. Ennek 0, 40 illetve 100 µM állandó bemérési koncentrációja mellett végeztük a szubsztrát titrálásokat. A kiértékeléskor a termék gátlási titrálások együttes globális regressziós illesztését végeztük el, mely egyetlen inhibíciós állandót eredményezett. Különböző kinetikai modelleknek próbáltuk megfeleltetni a mért adatokat (kompetitív inhibíció, nemkompetitív inhibíció, unkompetitív inhibíció). Az illesztett modelleket az Akaike információs kritérium (AIC) statisztikai teszttel hasonlítottuk össze. Mindkét szubsztrát titrálás esetén a CDPCho kompetitív inhibíciós modellje illett legjobban a mért adatokra, a vonatkozó CDPCho inhibíciós állandók a CTP és ChoP titrálásra rendre KI, CTP titrálás = 65 ± 21 μM illetve KI, ChoP titrálás = 68 ± 32 μM voltak. Mindezzel összhangban vannak a mérési adatokat bemutató Lineweaver-Burk ábrák is, ahol a különböző inhibitor koncentrációhoz tartozó egyenesek az y tengelyen metszik egymást (24. ábra/C2, D2). A termék inhibíciós titrálások így random bi-bi mechanizmusra utalnak, mely során mindkét szubsztrát képes a szabad állapotú enzimhez kötődni. Megjegyzendő, hogy korábbi tanulmányok a patkány CCT működésének leírására szintén a random szubsztrát kötődés kinetikai mechanizmust javasolták [105,108]. 79
24. ábra A PfCCT MΔK által katalizált reakció steady-state kinetikai vizsgálata, hozzáadott CDPCho liganddal, vagy anélkül. A) CTP titrálás 5 mM rögzített ChoP koncentráció mellett. Az ábra egy jellemző kísérlet eredményét mutatja. A kezdeti sebesség értékekre Michaelis-Menten kinetikai modellt illesztettünk. B) ChoP titrálás 900 μM rögzített CTP koncentráció mellett. Az ábra egy jellemző kísérlet eredményét mutatja. A kezdeti sebesség értékekre kompetitív szubsztrát inhibíciót feltételező kinetikai modellt illesztettünk. A szubsztrát inhibíciós hatás 5 mM-nál magasabb ChoP koncentrációknál, a kezdeti sebesség értékek csökkenésében jelentkezik. C1) CTP titrálás 5 mM rögzített ChoP koncentráció mellett különböző CDPCho koncentrációk jelenlétében: teli négyzet: 0 μM CDPCho, üres háromszög: 40 μM CDPCho, üres kör: 100 μM CDPCho. A mért adatok globális illesztését kompetitív inhibíciós modellel végeztük. D1) ChoP titrálás 900 μM rögzített CTP koncentráció mellett különböző CDPCho koncentrációk jelenlétében: teli négyzet: 0 μM CDPCho, üres kör: 100 μM CDPCho. C2) és D2) rendre C1) és D1) ábrák szemléltetésre közölt kettős reciprok (Lineweaver-Burk) ábrázolásai. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
80
4.2.6. A kolin csoportot tartalmazó szubsztrát és termék egyensúlyi kőtődésének vizsgálata izotermális titrációs kalorimetria (ITC) módszerrel Az izotermális titrációs kalorimetria (ITC) a biológiai kölcsönhatások kvantitatív termodinamikai elemzésére alkalmas módszer. Ennek segítségével határoztuk meg a PfCCT MΔK szubsztrát és termék kötődésének termodinamikai paramétereit (ΔH: kötési entalpiaváltozás, ΔS: entrópia változás, Kd: disszociációs állandó). A titrációs méréseket az aktivitás mérés pufferét használva végeztük 5 mM Mg2+ jelenlétében (25. ábra, 9. táblázat). CTP és CDPCho titrálások esetén a mért eredményekre a legjobb illeszkedést 1:1 sztöchiometria feltételezése adta (25. ábra/A, D). A CDPCho mért disszociációs állandója (89 μM) egy nagyságrendbe esett a kinetikai mérések termék inhibíciós állandójával. A CTP mért disszociációs állandója (294 μM) hasonló nagyságrendűnek adódott a Michaelis állandó értékével (KM, CTP = 168 μM). Mindkét nukleotid ligand kötése negatív entalpia- és entrópiaváltozással jár, így ezek a folyamatok entalpikusan kedvezőek, míg entrópikusan
kedvezőtlenek.
A
mért
kölcsönhatások
entalpia
és
entrópiaváltozásainak szoros összefüggését az entrópia-entalpia kompenzáció jelensége magyarázza [159]. Eszerint a fehérje-ligand kölcsönhatásokon alapuló kedvező entalpiaváltozás közvetlenül magával vonja a kölcsönhatásban résztvevő molekulák
mozgékonyságának
csökkenését.
A
CDPCho
kötésével
járó
entalpiaváltozás és entrópiaváltozás nagysága ugyanakkor többszöröse volt a CTP kötés megfelelő értékének, ami a két ligand eltérő enzim-kölcsönhatásaira utalhat. Ez egyrészt a két ligand foszfát csoportjainak eltérő koordinációjából, másrészt a CDPCho
kvaterner-ammónium
csoportjának
aktív
hely
kölcsönhatásaiból
származhat. A CDPCho kötés során azonosított kedvezőtlen entrópiaváltozás összhangban van a Lee és munkatársai által publikált molekuladinamikai szimuláció eredményével [97]. Ennek során a patkány CCT enzim aktív-helyének CDPCho kötött állapota csökkentette az aktív helyet felépítő szegmensek többségének mozgékonyságát. Mindez alátámasztja a létrehozott PfCCT katalitikus domén homológia modellben, valamint a patkány CCT szerkezetben megfigyelhető kedvező enzim-ligand másodrendű kölcsönhatások jelentőségét. 81
25. ábra PfCCT MΔK izotermális titrációs kalorimetria módszerrel mért egyensúlyi szubsztrát és termék kötődés görbéi Mg2+ jelenlétében. A) 301 μM PfCCT MΔK titrálása 9 mM CTP-vel 5 mM Mg2+ jelenlétében. B) 257 μM PfCCT MΔK titrálása 30 mM ChoP-tal 5 mM Mg2+ jelenlétében. C) 257 μM PfCCT MΔK titrálása 10 mM PPi-tal 5 mM Mg2+ jelenlétében. D) 219 μM PfCCT MΔK titrálása 3,5 mM CDPCho-nal 5 mM Mg2+ jelenlétében. E) 257 μM PfCCT MΔK titrálása 3 mM CDPCho-nal 5 mM ChoP és 5 mM Mg2+ jelenlétében. A szubsztrát jelenléte nem befolyásolta a CDPCho kötési görbéjét számottevően. A megadott fehérje moláris koncentrációk monomer egységekre értendőek. A mérési adatok integrált hőértékeit korrigáltuk a kontrollként megmért ligand hígulás hőértékeivel. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
82
Kd
ΔH
ΔS
(μM)
(kcal mol-1)
(cal mol-1 K-1 )
0,88 ± 0,03
89 ± 7
-24,0 ± 1,0
-63,3 ± 19,0
5
0,62 ± 0,01
294 ± 38
-9,6 ± 1,7
-16,6 ± 3,6
MΔK, +5 mM ChoPa CDPCho
5
0,85 ± 0,01
89 ± 3
-23,2 ± 0,4
-60,5 ± 2,5
MΔK
CDPCho
0
0,57 ± 0.02
44 ± 3
-22,9 ± 1,0
-58,1 ± 5,0
MΔK
CTP
0
0,96 ± 0.02
60 ± 2
-8,6 ± 0,3
-10,1 ± 0,5
MΔK +2 mM ChoPa CDPCho
0
0,75 ± 0,01
43 ± 1
-20,7 ± 0,1
-50,7 ± 1,0
Mg2+
Titrálandó oldat
Ligand
MΔK
CDPCho
5
MΔK
CTP
(mM)
n
MΔK
W743H
CDPCho
0
0,96 ± 0,01
68 ± 1
-13,5 ± 0,1
-27,0 ± 0,4
MΔK
W692Y
CDPCho
0
0,83 ±0,24
218 ± 50
-9,8 ± 4,5
-16,8 ± 8,6
9. táblázat PfCCT MΔK közvetlen és ITC titrálási mérések által meghatározott ligand kötés termodinamikai paraméterei 20°C-on. (a): ligand kicserélődés titrálások
Az enzim pirofoszfáttal történő titrálása jóval kisebb hőhatással járt (25. ábra/C). A mérés millimólos nagyságrendű ligand affinitásra utalt, ami a kölcsönhatás kvantitatív termodinamikai jellemzését nem tette lehetővé. Ugyanekkor a PfCCT MΔK enzim ChoP titrálása során nem tapasztaltunk értékelhető hőváltozást, még a ligand Michaelis állandóját meghaladó koncentráció (2 mM) alkalmazása esetén sem (25. ábra/B). Mindez arra utalhat, hogy a mérési körülmények közt vagy a ChoP nem képes az apo enzimhez számottevő mértékben kötődni, vagy ez a kölcsönhatás minimális entalpikus jelleggel bír. A ChoP kötődés ITC-vel nem követhető hatásának felderítéséhez ligand-kicserélődéses titrálást végeztünk, mely módszer megfelelő körülmények esetén millimólos affinitású ligandok kötődését is képes értelmezni. A kísérlet során a fehérje nagyobb affinitású kicserélő liganddal titrálása során a valós kötési affinitásnál és entalpiaváltozásnál kisebb látszólagos értékek mérhetőek a jelen levő kisebb affinitású kompetitív molekula fehérje kölcsönhatása révén. A csökkenés mértékéből számolva meghatározhatók a kisebb affinitású ligand kölcsönhatásának termodinamikai paraméterei (Kd, ΔH) [160]. A szubsztrát 83
fokozatos kiszorulását az enzim aktív helyéről úgy értük el, hogy az enzimet a ChoP titrálása után közvetlenül tovább titráltuk CDPCho termékkel. Ez utóbbi titrálás (25. ábra/E) termodinamikai paraméterei hasonlónak adódtak a PfCCT MΔK CDPCho titrálásához, ChoP távollétében (9. táblázat). A kötési entalpiák közötti minimális különbség miatt a ChoP affinitását nem sikerült meghatároznunk.
4.2.7. A Mg2+ jelenléte csökkenti az enzim CTP affinitását Számos tanulmány leírta, hogy a Mg2+ szükséges a különböző organizmusokból származó CCT enzimek hatékony katalíziséhez. Noha a megfelelő CCT enzim aktivitás mérések során rendre biztosították a fémion jelenlétét, még nem vizsgálták, hogyan hat a Mg2+ ion a szubsztrátok és termékek egyensúlyi kötődésére. A PfCCT esetén ezért ezen ligandok kötődését Mg2+ távollétében is megmértük ITC módszerrel (26. ábra/A-D, 9. táblázat). A CDPCho termék kötődésének termodinamikai paraméterei nem változtak jelentősen, míg az affinitása mintegy kétszeresére nőtt, amit a 44 és 89 μM-os disszociációs állandók mutatnak. A CTP affinitás mértéke ezzel szemben számottevően függött a fémion jelenlététől. Az esetlegesen jelen levő szabad Mg2+ komplex képzését szolgáló 0,5 mM EDTA jelenlétében jelentősen növekedett szubsztrát affinitást mértünk (Kd = 59,5 μM, 25. ábra/A) a Mg2+ iont tartalmazó körülményhez képest (Kd = 294 μM, 26. ábra/A, 9. táblázat). A két különböző körülmény esetén vizsgált CTP-enzim kölcsönhatás emellett eltérő kölcsönhatási entrópiataggal volt jellemezhető. Figyelemre méltó különbség továbbá, hogy míg a Mg2+ távollétében elvégzett CTP titrálás egyetlen exoterm folyamat hatását mutatja, addig Mg2+ jelenlétében a hőváltozást egy exoterm és egy endoterm folyamat együttesen szolgáltatja. Elképzelhető, hogy emögött a ligand kölcsönhatás során a nukleotid-trifoszfát Mg2+ koordinációs állapotának változása áll. A ChoP és PPi titrálások nem mutattak jelentős eltérést Mg2+ jelenlététől függően (25. ábra/B, C, 26. ábra/B, C).
84
26. ábra PfCCT MΔK izotermális titrációs kalorimetria módszerrel mért egyensúlyi szubsztrát és termék kötődés görbéi Mg2+ távollétében. A) 360 μM PfCCT MΔK titrálása 7,5 mM CTP-vel 0,5 mM EDTA jelenlétében. B) 329 μM PfCCT MΔK titrálása 12 mM ChoP-vel. C) 356 μM PfCCT MΔK titrálása 10 mM PPi-tal. D) 146 μM PfCCT MΔK titrálása 2,0 mM CDPCho-nal. E) 329 μM PfCCT MΔK titrálása 3,0 mM CDPCho-nal 2,0 mM ChoP jelenlétében. A szubsztrát jelenléte nem befolyásolja a CDPCho kötési görbéjét számottevően. A megadott fehérje moláris koncentrációk monomer egységekre értendőek. A mérési adatok integrált hőértékeit korrigáltam a kontrollként megmért ligand hígulás hőértékeivel. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
85
4.2.8. A Mg2+ szerepének értelmezése a PfCCT CTP kötése és katalízise során Noha a Mg2+ ion a citidililtranszferáz enzimek (GCT, ECT, CCT) kofaktoraként ismert [110,161–163], a PfCCT képes volt a CTP és CDPCho ligandok hatékony koordinációjára a fémion távollétében is. A GCT:CTP, és CCT:CDPCho komplexek együtt kristályosodása Mg2+ távollétében a fenti megállapítással egyezően szintén hatékony enzim:nukleotid kölcsönhatásokra utal [90,120]. Az ITC titrálás eredményeink ezen felül a PfCCT MΔK CTP affinitás számottevő csökkenésére utalnak Mg2+ jelenlétében. A nukleotid negatív töltésű trifoszfát láncának megfelelő koordinációját a fémion távollétében a fehérje pozitív töltésű illetve poláris oldalláncai végezhetik. Az elkészített homológia modell alapján a CCT enzimek aktív helyének konzervált felépítését és más fajok CCT enzimeinek vizsgálatát figyelembe véve [96,106] az R755, K663 illetve T761 és T762 aminosavak láthatják el ezt a feladatot a PfCCT enzim esetén. Az eredmények alapján valószínűsíthető, hogy a PfCCT enzim működésében a Mg2+ ion a megfelelő affinitású ligand kötődés biztosítása helyett a katalizált kémiai átalakítás elősegítését szolgálhatja. Említésre méltó, hogy hasonló jelenséget figyeltek meg a HIGH nukleotidiltranszferáz fehérjeszupercsaládba tartozó két enzim esetén. Az I. típusú (class I) aminoacil-tRNS szintetáz valamint a riboflavin kináz/flavin adenin dinukleotid szintetáz enzimek jelentősen nagyobb ATP nukleotid szubsztrát affinitással rendelkeznek Mg2+ kofaktoruk távollétében, mint annak jelenlétében [164,165]. Az említett enzimek által katalizált reakció során a PfCCT enzim működéséhez hasonlóan a nukleotid αfoszfátra történő nukleofil támadás megy végbe, mely pirofoszfát távozását eredményezi [165,166]. Mivel ez a reakciómechanizmus konzervált a HIGH nukleotidiltranszferáz enzim evolúciós szupercsaládba tartozó enzimek esetén [86], a továbbiakban érdemesnek tartjuk megvizsgálni, hogy a Mg2+ hasonló szerepet tölt-e be a nukleotid-trifoszfát kötés során az enzim-szupercsaládba tartozó további enzimek esetén is.
86
4.2.9. Az enzim saját (intrinsic) fluoreszcens jele a ChoP illetve CDPCho ligand kötött állapotok közötti különbségeket mutatja Az enzim aktív helyének mikrokörnyezetéről a PfCCT MΔK saját (intrinsic) triptofán fluoreszcencia jelét vizsgálva nyertünk információt. A fehérje monomer egysége három ilyen aminosavat (W682, W692, W743) tartalmaz. Amíg a W682 a háromdimenziós homológia modell alapján a dimer kölcsönható felületen egy „eltemetett” (buried) aminosav oldallánc, a másik kettő jobban kitett az oldószer kölcsönhatásnak. A homológia modell szerint a W743 oldallánc a fehérje felszínen elhelyezkedő αL-hélix részét képezi, míg a W692 az aktív hely kialakításában vesz részt (22. ábra). Az enzim CDPCho titrálása során a triptofán fluoreszcencia intenzitás mintegy 15%-os növekedését illetve az emisszós maximumhoz tartozó hullámhossz (λmax) kék-eltolódását tapasztaltuk, melynek értéke 347,7 nm-ről 344,2 nm-re csökkent (27. ábra/A).
27. ábra PfCCT MΔK konstruktok egyensúlyi CDPCho kötése triptofán fluoreszcencia módszerrel követve. A) A PfCCT MΔK emissziós spektruma apo állapotban illetve 100 μM CDPCho jelenlétében. A ligand hozzáadás hatására az intenzitás maximumhoz tartozó hullámhossz eltolódását segédvonalak szemléltetik. B) Fluoreszcencia intenzitás maximumhoz tartozó hullámhossz eltolódása PfCCT MΔK ligand titrálásai, valamint PfCCT MΔKW743H CDPCho titrálása során. A hullámhossz eltolódása csupán a CDPCho titrálások esetén jelentkezett. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
87
A λmax érték változása a CDPCho koncentráció függvényében telítési görbét adott, ami az enzim aktív helyek CDPCho liganddal telítődését mutatja (27. ábra/B). Az ebből számolt disszociációs állandó 19,2 ± 2,4 μM értéke összhangban van az izotermális titrációs kalorimetria által meghatározott 44 ± 2 μM értékkel (9. táblázat). A továbbiakban helyspecifikus mutagenezissel határoztuk meg, hogy mely triptofán felelős a CDPCho titrálás során tapasztalt fluoreszcencia változásért. A létrehozott MΔKW743H és MΔKW692Y pontmutánsok enzimatikus működését enzim aktivitás méréssel és a CDPCho kötő képesség ITC módszerrel történt meghatározásával jellemeztük. Az MΔKW743H pontmutáns hasonló CDPCho ligand kötési (28. ábra/A) és katalitikus tulajdonságokkal (kcat= 0,6 s-1) rendelkezett, mint az eredeti MΔK konstrukt.
28. ábra PfCCT MΔK konstruktok izotermális titrációs kalorimetria módszerrel mért egyensúlyi CDPCho kötődés görbéi. A) 165 μM PfCCT MΔKW743H titrálása 3,0 mM CDPCho-nal. B) 179 μM PfCCT MΔKW692Y titrálása 2,5 mM CDPCho-nal. A megadott fehérje moláris koncentrációk monomer egységekre értendőek. A mérési adatok integrált hőértékeit korrigáltuk a kontrollként megmért ligand hígulás hőértékeivel. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
Ezen enzim CDPCho fluoreszcens titrálása során a vad típusúhoz hasonló intenzitás és hullámhossz változással járt, illetve a kölcsönhatás disszociációs állandójának is a vad típusú enziméhez hasonló érték (Kd = 32,4 ± 5,8 μM, 28. ábra/A) adódott. 88
Méréseink alapján tehát a W743 aminosav fluoreszcens jele nem járul hozzá számottevő
mértékben a
CDPCho kölcsönhatással együtt
járó spektrális
változásokhoz. Az aktív helyen lévő triptofánt érintő MΔKW692Y pontmutáns CDPCho kötő képessége szintén megmaradt, noha affinitása mintegy harmadára gyengült (28. ábra/B, 12. táblázat, 4.3.2. fejezet) emellett enzim aktivitása is jelentősen csökkent (vö. 31. ábra, 11. táblázat, 4.3.2. fejezet). Ugyanakkor a CDPCho fluoreszcencia titrálása során nem tapasztaltuk a fluoreszcencia intenzitás növekedését, illetve λmax eltolódását (27. ábra/B). Az eredmények alapján a CDPCho kötésével járó fluoreszcencia változásáért döntően az aktív helyen elhelyezkedő W692 oldallánc felelős. A W692 fluoreszcens jelének molekuláris alapját a triptofán és a CDPCho trimetilammónium csoportja közötti kation-π kölcsönhatás jelentheti (29. ábra), mely összhangban van a patkány CCT kristályszerkezet esetén leírtakkal is [90].
29. ábra A PfCCT MΔK homológia modell aktív helye CDPCho kötött állapotban. Az aktív hely oldalláncokra és a CDPCho termék megjelenítésére atomi színezésű pálcikamodell jelölést alkalmaztunk PfCCT, szürke szénatom, CDPCho, sárga szénatom. Az ábra jobboldalán található W692 kation-π kölcsönhatást létesít a CDPCho trimetilammónium csoportjával. Az ábra a 7.1. fejezet 2. közleményében jelent meg.
A PfCCT MΔK többi ligandjának titrálása során, beleértve a kvaterner-ammónium funkciós csoportot tartalmazó kolin-foszfátot is, ugyanakkor nem tapasztaltuk λmax változását illetve a fluoreszcencia intenzitás növekedését.
89
4.2.10. A PfCCT ChoP kölcsönhatás elemzése a kinetikai és ligand-kötési eredmények fényében A PfCCT MΔK termék-gátlási kinetikai mérések során a CDPCho mindkét szubsztrát kompetitív inhibitorának bizonyult, ami arra utal, hogy képes ugyanazon enzim konformációs állapothoz kötődni, mint az egyes szubsztrátok. Mindez random ligand kötődés kinetikai mechanizmusra utal, mely szerint mind a CTP, mind a ChoP szubsztrát képes az apo enzimhez kötődésre. A fluoreszcencia illetve kalorimetria alapú egyensúlyi ligand kötődés mérések azonban nem szolgáltattak a ChoP enzim kölcsönhatásra specifikus jelet. A CDPCho kötődés sikeres követése igazolja, hogy a használt biofizikai módszerek alkalmasak lehetnek a fehérje-ligand kölcsönhatások kiértékelésére. A PfCCT enzim kinetikai és ligand kötés vizsgálatok eredményeinek helyes együttes értelmezéséhez figyelembe kell venni az alkalmazott mérési módszerek eltérő megközelítéseit. Frieden közleménye arra utal, hogy a random ligand kötődés mechanizmusra utaló kinetikai viselkedés nem minden esetben alkalmas az elemi reakciólépések közvetlen azonosítására [167]. A PfCCT ChoP ITC titrálás során tapasztalt minimális hőváltozást elméletben a kölcsönhatás entalpiaváltozásának hőmérsékletfüggése is okozhatja. Előfordul, hogy egy adott hőmérsékleten a kölcsönhatás entalpiaváltozása zérusnak felel meg és így lejátszódását csupán entrópiaváltozás kíséri. Mivel az ITC mérés hőjel követésén alapul, nem lehet egy méréssel egyértelműen kizárni egy kölcsönhatás létrejöttét. Ehhez egy másik, jelentősen eltérő hőmérsékleten megismételt mérés szükséges. A ChoP fluoreszcencia titrálás során a jelváltozás hiánya az enzim kolin kötőhelyénél elhelyezkedő W692 aminosav CDPCho kötött állapottól eltérő mikrokörnyezetét jelzi. CDPCho kötődést követő közvetlen és ligand kicserélődéses ITC mérések arra utalnak, hogy a kolin-foszfát csoport kölcsönhatását az enzim kötőhelyével befolyásolja a hozzá kapcsolódó citidin-monofoszfát csoport jelenléte vagy hiánya. A ChoP szubsztát és CDPCho termék eltérő enzim kölcsönhatásának további vizsgálata hozzájárulhat az enzim mechanizmus jobb megértéséhez.
90
4.3. A PfCCT kolin kötőhely kölcsönhatásainak jellemzése A dolgozat 4.3. fejezete a Nagy és munkatársai közleményében (Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Dec 1;53(49):13471-6, a továbbiakban 7.1. fejezet, 3. közlemény) foglalt eredményeket tartalmazza.
4.3.1. Pontmutáns konstruktok létrehozása és oldatbeli állapotuk vizsgálata A PfCCT kolin kötő helye a ChoP szubsztrát és CDPCho termék kvaternerammónium csoportját koordináló, részben hidrofób kötőzseb (30. ábra). Felépítésében szigorúan konzervált, töltéssel vagy aromás jelleggel bíró oldalláncok vesznek részt, utóbbiak a ligand kolin csoportjával kation-π kölcsönhatást alakítanak ki.
30. ábra A PfCCT enzim kolin kötőhelye. A PfCCT MΔK homológia modell (Fehérje modell adatbázis (PMDB) azonosító: PM0078719) szürke szalag megjelenítésben látható, a CDPCho ligandot atomi színezésű pálcikamodell jelöli, ahol a szénatom színe zöld. Az elektrosztatikus valamint kation-π kölcsönhatást biztosító oldalláncokat atomi színezésű pálcikamodell jelöli, elektrosztatikus kölcsönhatás esetén kék, aromás kölcsönhatás esetén sárga szénatommal. A kölcsönhatási távolságok Ångström egységben vannak jelölve. A W692 oldallánc további kölcsönható partnereit szintén pálcika modellel jelöltük (F662, N716). Az ábra a 7.1. fejezet 3. közleményben jelent meg.
91
Ezen oldalláncok ligand kötésben és enzim katalízisben betöltött szerepének vizsgálatára a PfCCT MΔK konstrukt olyan konzervatív típusú pontmutáns változatait hoztuk létre, melyek nem járnak az oldallánc eltörlésével, csupán megváltoztatják a ligand kötésben szerepet játszó megfelelő elektrosztatikus (D623N, Y741F) illetve aromás (W692F, W692Y, Y714F) tulajdonságukat. A pontmutáns fehérjék natív körülmények közt felvett fehérje tömegspektrumai az eredeti PfCCT MΔK spektrumához hasonlónak bizonyultak (Függelék, 8.2. fejezet). Az egyes spektrumokban megjelenő csúcssorozatok tömeg/töltés arányai alapján megfeleltethetőek voltak a CCT alegység monomereknek ill. dimereknek (10. táblázat). A monomer és dimer megfelelő csúcsok 1:1-hez közeli arányban jelentek meg, ennél nagyobb oligomer méret ugyanekkor nem volt azonosítható. Mivel mindez specifikus dimer szerveződési formára utal, a létrehozott pontmutációk nem változtatták meg az enzim alapvető kvaterner szerkezetét. A PfCCT MΔKY741F konstrukt esetén a monomer és dimer m/z csúcsok alacsony felbontása a konstrukt mérsékelt stabilitására utal az electrospray fehérje tömegspektrometria körülményei között. Fehérje
Mr, ESI-MS, (Da)
Mw, elméleti, (Da)
30906 ± 50
30898
PfCCT MΔKY714F
30840 ± 50
30882
PfCCT MΔKW692F
30808 ± 50
30859
PfCCT MΔKW692Y
30846 ± 50
30875
PfCCT MΔK
D623N
30856 ± 50
30897
PfCCT MΔK
Y741F
30956 ± 50
30882
30786 ± 50
30783
PfCCT MΔK
WT
PfCCT MΔKW692A
10. táblázat PfCCT konstruktok monomerjeinek relatív molekulatömege (Mr) natív fehérje tömegspektroszkópia mérés alapján. Az elméleti molekulatömegek számításakor a 6xHis epitóp címkét is tartalmazó fehérje szekvenciát vettük alapul.
92
4.3.2. A kötőhely egyes kölcsöhatásainak enzim aktivitásra és ligand kötésre gyakorolt hatása A pontmutáns fehérjék jellemzéséhez enzim kinetikai vizsgálatukat, valamint az ITC módszerrel mért egyensúlyi CDPCho kötésük termodinamikai elemzését végeztük el. Az eredmények alapján a töltött oldalláncok semlegesre cserélése súlyosan rontotta az enzim katalitikus hatékonyságát (31. ábra, 33. ábra, 11. táblázat).
31. ábra PfCCT MΔK pontmutáns enzimek steady-state kinetikai vizsgálata A) Kezdeti sebesség mérések különböző CTP koncentrációk és 5 mM rögzített ChoP koncentráció alkalmazásával. B) Kezdeti sebesség mérések különböző ChoP koncentrációk és 1 mM rögzített CTP koncentráció alkalmazásával. Az elektrosztatikus kölcsönhatást biztosító negatív töltésű oldalláncok pontmutációit tartalmazó enzimek mérési pontjait háromszöggel, a kation-π kölcsönható partnerek mutánsainak kinetikai eredményeit kör szimbólummal jelöltük. A PfCCT MΔK ChoP titrálás (üres négyszög) során észlelt szubsztrát inhibíciós hatás nem figyelhető meg a pontmutáns enzimek esetén. Az ábra a 7.1. fejezet 3. közleményben jelent meg.
Mindezért döntően a kolin csoport koordinációjának változása lehet a felelős, amit a KM,
ChoP
értékek változása, valamint a mutáns konstruktok csökkent CDPCho kötő
képessége jelez. Ez utóbbit nem csupán az ITC módszerrel mért disszociációs állandók növekedése, hanem a kedvező kötési entalpiaváltozások (ΔH) csökkenése is mutatja, ami gyengülő enzim-ligand kölcsönhatásra utal. (32. ábra, 33. ábra, 12. táblázat).
93
Enzim MΔK
kcat
KM,CTP
KM,ChoP
s-1
μM
mM 1,8 ± 1,1
1,45 ± 0,05
168 ± 17
Y714F
0,21 ± 0,01
W692F
rel. rel. kcat/KM,CTP kcat/KM,ChoP
1
1
580 ± 60 10,2 ±1,1
0,042
0,026
0,13 ± 0,03 890 ± 380 7,5 ± 2,4
0,018
0,022
0,03 ± 0,003 191 ± 64
1,3 ± 0,2
0,017
0,029
0,006 ± 0,001 460± 190 13,1 ±3,1
0,0015
0,00057
MΔKY741F 0,019 ± 0,002 790 ±180 8,5 ± 2,0
0,0028
0,0028
ND.
ND.
MΔK MΔK MΔK
W692Y
MΔK
D623N
MΔKW692A
6·10-4
ND.
ND.
11. táblázat PfCCT MΔK mutánsok kinetikai vizsgálata. ND: nem megállapítható. A kation-π kölcsönhatást biztosító aromás oldalláncok esetén a mutációk mellett a kölcsönhatás továbbra is megmaradt, csupán az aromás gyűrű elektrosztatikus, sztérikus és kvadrupol momentum tulajdonságainak megfelelően változott. A vonatkozó mutáns konstruktok, noha számottevően csökkent mértékben, de képesek voltak a ligand kötési és katalitikus funkciók betöltésére. A fehérje mutánsok két csoportjának eltérő viselkedése így igazolja a megfelelő oldalláncok meghatározó poláris, elektrosztatikus illetve kation-π típusú ligand kölcsönhatását, kiemelve az előbbi típusú kölcsönhatás jelentőségét. Kísérletes eredményeink a kötőhely két tirozin oldalláncának (Y714, Y741) eltérő típusú kölcsönhatását igazolták.
94
32. ábra A PfCCT MΔK pontmutáns enzimek izotermális titrációs kalorimetriával mért CDPCho kötési görbéi. A mért adatokra legjobb illeszkedést az ITC200 készülék saját Origin szoftverének egyetlen típusú kötőhely modellje (one set of binding sites) szolgáltatta, amely a dimer két aktív helyén egymástól független CDPCho kötődést feltételezi. A) 319 μM PfCCT MΔKY714F titrálása 10 mM CDP-kolinnal; B) 369 μM PfCCT MΔKW692F titrálása 11 mM CDP-kolinnal; C) 430 μM PfCCT MΔKD623N titrálása 13 mM CDP-kolinnal; D) 357 μM PfCCT MΔKY741F titrálása 10 mM CDP-kolinnal; E) 250 μM PfCCT MΔKW692A titrálása 7,5 mM CDPkolinnal. A feltüntetett fehérje koncentrációk monomer egységre vonatkoznak. Az ábra a 7.1. fejezet 3. közleményben jelent meg.
95
33. ábra A PfCCT MΔK mutációinak hatása az enzim katalízisre valamint a ligand kötő képességre. PfCCT MΔK és pontmutánsainak katalitikus aktivitása (fent, az y tengelyen töréssel ábrázolva az értékeket), valamint a CDPCho kötés termodinamikai paraméterei, (kötési szabadentalpia- (ΔG), entalpia- (ΔH) és entrópiaváltozás (-TΔS), lent). A színes ábrák a különböző enzimek kvaterner-ammónium kötőhelyének (zöld kör) felépítését mutatják, az elektrosztatikus kölcsönhatást biztosító negatív töltésű oldalláncokat kék háromszög, a kation-π kölcsönhatásban részt vevő aromás oldalláncokat sárga ellipszis jelöli. Az egyes mutációk oldalláncra gyakorolt hatása az ábráról leolvasható, a megváltozott aromás jelleget rács jelöli, a töltött oldallánc semlegesre cserélését üres háromszög mutatja, míg az oldallánc alaninra cserélésére a megfelelő szimbólum távolléte utal. Az ábra a 7.1. fejezet 3. közleményben jelent meg.
96
Enzim MΔK
Kd
ΔH
ΔS
μM
kcal·mol-1
cal·mol−1·K−1
44,4 ± 3,3
−22,9 ± 1,0 −58,1 ± 5,0
Y714F
140 ± 50
−19,6 ± 6,0 −49,1 ± 22,3
MΔKW692F
680 ± 60
−6,8 ± 0,8
MΔKW692Y
220 ± 50
−9,8 ± 4,5 −16,8 ± 8,6
MΔK
D623N
790 ± 60
−2,7 ± 0,1
5,1 ± 0,5
MΔK
Y741F
1000 ± 80
−9,3 ± 1,9
-17,8 ± 3,9
460 ± 100
−1,7 ± 0,3
9,6 ± 2,6
MΔK
MΔKW692A
−8,9 ± 1,3
12. táblázat A PfCCT MΔK pontmutáns enzimek CDPCho kötésének termodinamikai adatai. Az egyensúlyi ligand kötés vizsgálatok izotermális titrációs kalorimetria méréssel végeztük 20°C hőmérsékleten.
A kvaterner-ammónium ligand kation-π koordinációjának jelentőségét alanin mutagenezissel is megvizsgáltuk, amely a megfelelő kölcsönható aromás oldallánc eltörlését vonja maga után. A PfCCT MΔK konstruktban létrehozott W692A pontmutáció hatására az enzim katalitikus funkciója súlyosan sérült, amit a közel négy nagyságrendnek megfelelő enzim aktivitás csökkenés mutat (31. ábra, 11. táblázat). A mutáció jelentős zavart okozott az enzim CDPCho ligand kötő képességében is. A kötés termodinamikai paramétereinek vizsgálata fényt derít arra, hogy mind a ligand affinitás, mind a kötési entalpiaváltozás értéke hozzávetőleg tizedére csökkent (32. ábra, 12. táblázat). Mindezzel a kötés alapvető energetikai jellege is megváltozik, a kölcsönhatást jelentős mértékben a kedvező kötési entrópiaváltozás határozza meg, ami éles ellentétben áll a PfCCT MΔK entalpiavezérelt CDPCho kölcsönhatásával. A kölcsönhatási mintázat változása laza és kevésbé
specifikus
komplexképződésre
utal,
mely
során
számottevő
intermolekuláris mozgás lehetséges [159]. A fenti pontmutációk hatását a PfCCT MΔK CDPCho komplex szerkezeti modell alapján is értelmeztük. A kísérletes eredmények összhangban vannak azzal, hogy a 97
mutációk valószínűleg közvetlenül érintették az enzim kölcsönhatását kolin csoportot tartalmazó ligandumjaival. A szerkezeti modell alapján a W692 aminosavnak emellett kiemelt szerepe lehet a kötőzseb szerkezeti egységének biztosításában, mivel N716 valamint F662 oldalláncokkal kialakított kölcsönhatásai révén három különálló másodlagos szerkezeti elemet köt össze (30. ábra). Ennek ismeretében feltehető, hogy a kolin kötőzseb megzavart szerkezeti egysége is hozzájárul a W692A mutáció tapasztalt funkcionális következményeihez. A pontmutáns konstruktok vizsgálata összességében rámutatott, hogy a PfCCT enzimatikus funkcióit egyaránt meghatározzák a kolin csoportot tartalmazó ligandjaival kialakított kation-π és elektrosztatikus kölcsönhatásai. Felkeltette az érdeklődésünket, hogy ezek a kölcsönhatások mennyire jellemzőek további kvaterner-ammónium ligandokat átalakító enzimek esetén.
98
4.4. Fehérjék kvaterner-ammónium kötőhelyének szerkezeti elemzése 4.4.1. Általános enzim típusú kvaterner-ammónium kötőhely azonosítása A dolgozat 4.4 fejezete a Nagy és munkatársai közleményében (Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Dec 1;53(49):13471-6, a továbbiakban 7.1. fejezet, 3. közlemény) foglalt eredményeket tartalmazza. A
kvaterner-ammónium
ligandot
átalakító
enzimek
ligand
kötőhelyének
elemzéséhez egy általános keresést végeztünk el a PDB adatbázisban a Relibase szerver segítségével, mely során összegyűjtöttük az összes, kvaterner-ammónium ligandot tartalmazó makromolekulás szerkezetet. Az anyagok és módszerek részben leírtak szerint a találatokat a kvaterner-ammónium ligand szerkezeten belüli elhelyezkedése szempontjából elemeztük. Kiszűrtük a valódi kötőhellyel rendelkező szerkezeteket és osztályoztuk ezeket a ligand felismerés enzim illetőleg receptor típusa alapján (13. táblázat). Az enzim-ligand komplex szerkezetek döntő többségében (93%, 86 független találat), egy vagy két aromás oldallánc illetve poláris vagy töltött oldalláncok együttesen végzik a kvaterner-ammónium csoportok koordinációját (34. ábra/A-E). Számos esetben kimutatták ezen aromás oldalláncok meghatározó szerepét az enzim ligand kötésében [90] vagy katalízisében [168–174]. Figyelemre méltó, hogy ez az általános enzim típusú kötőhely nagyszámú, evolúciósan különböző fehérje családban jelentkezik, melyek tizenöt, független fehérje család klánhoz tartoznak (15. táblázat, Függelék). Mindez egy újabb példát szolgáltat a konvergens evolúció jelenségére [175,176], igazolva, hogy egy adott biológiai feladatot optimális módon ellátó megfelelő szerkezeti elem kedvező tulajdonságai révén képes független evolúciós utakon kialakulni. A továbbiakban az összetett aromás doboz kifejezést használjuk ezen általános enzim kötőhely megnevezésére.
99
34. ábra Enzim típusú (A-E), illetve receptor típusú (F) kvaterner-ammónium kötőhelyek. A jellegzetes összetett aromás doboz típusú ligand kötőhely felépítését kiválasztott példák mutatják. A) LicC bakteriális CTP:foszfokolin citidililtranszferáz, PDB kód: 1JYL; B) Acetilkolinészteráz (AchE), PDB kód: 2HA3; C) Foszfolipáz C (PLC), PDB kód: 1P6D; D) Karnitin O-acetiltranszferáz PDB kód: 1S5O; E) hiszton-lizin Nmetiltranszferáz, PDB kód: 4I58; F) Glicin-betain-kötő fehérje (proX), PDB kód: 1R9L, mint a receptorok esetén elterjedt aromás doboz szerkezeti elem képviselője. A megfelelő ligandoknak csupán a kvaterner-ammónium csoportja látható, a vele kölcsönható aminosav oldalláncokkal együtt. A megjelenített elektrosztatikus és kation-π kölcsönható partnerek távolsága a kvaterner nitrogén atomtól rendre kisebb 5 Å-nél és 6 Å-nél. Az oldalláncokat atomi színezésű pálcikamodell mutatja, színkódjuk az általuk létesített kölcsönhatás típusára utal: kation-π: sárga szénatom, elektrosztatikus: kék szénatom, a kvaterner-ammónium ligand szénatomjai zöld színűek. A Függelékben (37. ábra, 14. táblázat) további példák találhatóak enzim és receptor típusú ligand felismerésre. Az ábra a 7.1. fejezet 3. közleményben jelent meg.
100
Összes független kvaterner-ammónium ligandot tartalmazó enzim találat[a] összetett aromás doboz (composite aromatic box) kötőhely eltérő kötőhely nem helytálló találat (a ligand a fehérje felszínén vagy egyéb oldószernek kitett környezetben található) Összes független kvaterner-ammónium ligandot tartalmazó receptor találat[a] aromás doboz vagy kalitka kötőhely (aromatic box, aromatic cage) összetett aromás doboz-szerű (composite aromatic box) kötőhely nem helytálló találat (a ligand a fehérje felszínén vagy egyéb oldószernek kitett környezetben található)
150
86
93%
6
7%
64
313
107
78%
30
22%
176
13. táblázat Kvaterner-ammónium ligandot tartalalmazó makromolekuláris szerkezetek a PDB adatbázisban. Minden vonatkozó enzimet és receptort egyetlen szerkezet képvisel, hogy a kísérletes adatok fehérje típusonként változó mennyisége ne torzítsa az eredmények értékelését.
Az általunk felismert összetett aromás doboz ligand kötőhely láthatóan különbözik az irodalomban leírt aromás doboz (aromatic box) vagy aromás kalitka (aromatic cage) felismerési helytől, amely a receptor típusú kvaterner-ammónium kötő fehérjéknél meghatározó arányban, a receptor találatok 78%-a esetén található (35. ábra, 13. táblázat). Ezekben három, vagy négy aromás oldallánc határolja a ligand kötő helyet, a gyűrű síkjával a kvaterner-ammónium ligand csoport felé mutatva. A ligand koordinációt esetenként egy savas oldallánc egészíti ki, amely a ligand csoport töltés kiegyenlítését végzi. (34. ábra/F, 35. ábra, valamint a 38. ábra (Függelék, 8.4. fejezet)). Az aromás doboz felismerő hely aromás oldalláncai a gyűrű síkjával a pozitív töltésű kvaterner-ammónium csoport felé fordulva annak optimális geometriai 101
illeszkedését biztosítják [177]. Ebben az elrendezésben az oldallánc kölcsönhatások egymást erősítő hatása (az ún. multivalens hatás [178]) nagy affinitású ligand kötést tesz lehetővé. Ennek megfelelően ezen aromás oldalláncok eltörlése számos esetben a ligand affinitás nagymértékű csökkenését eredményezte [179–182]. A receptor ligand kölcsönhatások között a hiszton fehérjék módosított trimetillizin csoportjának felismerése különleges esetnek számít. Ezért a kölcsönhatásért számos esetben egy olyan, fél aromás kalitkaként (half aromatic cage) azonosított kötőhely felelős, melynek szerkezetét két aromás oldallánc mellett negatív töltésű oldalláncok alakítják ki [183]. Ezen ligand kölcsönható hely típus a harminc összetett aromás doboz receptor találat közül húszat tesz ki (13. táblázat). Megjegyzendő ugyanekkor, hogy a trimetillizin ligand kötődésen túl további peptid-peptid kölcsönhatások járulnak hozzá ezen biológiai kölcsönhatáshoz [184].
4.4.2. A kvaterner-ammónium ligandot átalakító enzimek és receptorok kötőhelyének és működésének összevetése Már 1990-ben felismerték, hogy a kvaterner-ammónium ligandok biológiai felismerése a korábban javasolt anionos kötőhely elképzeléssel szemben hidrofób és kation- π kölcsönhatások révén történik [185]. Később mindezt igazolta az acetilkolinészteráz enzim szerkezete, melyben egy triptofán aromás oldallánca stabilizálja az aktív helyen elhelyezkedő pozitív töltésű kvaterner-ammónium ligand helyzetét [186]. Egy ilyen típusú kölcsönhatás a hidrogén híd kötéshez vagy ionpár kölcsönhatáshoz hasonló mértékben képes hozzájárulni a ligand kötődéshez [187]. Az ismert fehérjeszerkezetek összehasonlításakor az enzim és receptor típusú kvaterner-ammónium felismerő helyek jellegzetes szerkezeti eltéréseként a kation-π kölcsönható partnerek különböző mértékű jelenlétét azonosítottuk. Az általunk elsőként felismert összetett aromás doboz enzim típusú kvaternerammónium kötőhely általános jellege lehetőséget ad az enzimatikus funkció mélyebb megértésére kvaterner-ammónium ligandot felhasználó enzimek esetén.
102
A megfelelő enzimek különböző biológiai folyamatokban, az ingerületátvivő anyagok és membránalkotók átalakításában, valamint a gének átírásának szabályzásában vesznek részt és kulcsszereppel rendelkeznek számos fertőző betegségben [188–190], valamint kóros elváltozásban [191–196] (35. ábra). A felismerés így hozzájárulhat az ilyen típusú enzimek aktív helyéhez kötődő gyógyszerjelöltek kölcsönhatásának szerkezeti értelmezéséhez. Az enzim illetve receptor típusú kvaterner-ammónium kötőhelyek jelentős különbségeit vélhetően meghatározzák az enzimek és receptorok működésének eltérő kinetikai és termodinamikai sajátosságai. Az enzimatikus szereppel nem rendelkező receptorok fiziológiás feladata legtöbbször a megfelelően nagy ligand affinitás biztosítása, mely gyors ligand asszociációs és lassú disszociációs lépéseket követel meg. Az aromás doboz körülhatárolt, oldószertől jobban elzárt és számos esetben merev kötőzsebe kiválóan alkalmasnak tűnik erre a feladatra [197]. Az ilyen típusú kötőhelyet tartalmazó receptor fehérjék fiziológiai szerepe a jelátviteltől a lipid kötésen és szállításon át egészen a sejtszintű védekezési mechanizmusig terjed (35. ábra). Az enzimatikus funkcióhoz ugyanakkor ettől eltérő követelmények társulnak. Az enzimek aktív helye a ligand kötődésén túl annak aktiválásáért, kémiai átalakításáért, majd a termék(ek) elengedéséért felelős, és az ehhez szükséges konformációs dinamikával is rendelkeznie kell. Kinetikai szempontból a katalízis hatékonyságát a gyors ligand kötődés és eltávozás egyaránt segíti. Erre egy jó szemléltető példa a G-fehérjék működése, melyeknél a GTP hidrolízist a lassú GDP termék
disszociáció
korlátozza,
ami
ezen
enzimek
alacsony
hatékonyságát eredményezi, kölcsönható fehérjék távollétében [198].
103
katalitikus
35. ábra Általánosan elterjedt kvaterner-ammónium kötő enzim és receptor kötőhelyek felépítése: összetett aromás doboz és aromás doboz. Az enzimekre jellemző kvaterner-ammónium ligand kötőhely felépítése eltér a receptor kötőhelyek többségétől. A különböző típusú fehérje-ligand kölcsönhatásokat sematikusan jelenítettük meg, sárga: kation-π kölcsönhatást biztosító oldallánc, kék: elektrosztatikus vagy poláris kölcsönhatást biztosító oldallánc. Az ábra jobb szélén a kvaterner-ammóniumot kötő enzimek illetve receptorok biológiai szerepük szerint vannak csoportosítva a rövidítések feloldásához ld. 14. táblázat és 15. táblázat, függelék. Az enzimek és receptorok eltérő ligand kölcsönhatását szabadentalpia változás görbék szemléltetik, utalva az enzimek (E) szubsztrát (S) - termék (P) átalakítására, valamint a receptorok (R) ligand (L) kötésére. Az ábra a 7.1. fejezet 3. közleményben jelent meg.
Az összetett aromás doboz töltött vagy poláris oldalláncai meglátásunk szerint csökkentik a kvaterner-ammónium kötőhely hidrofób jellegét, a ligand enzim kötött állapotban kevésbé lesz elzárva az oldószertől. Ez hozzájárulhat a kötőhely konformációs dinamikájának növekedéséhez, ahogy azt az acetilkolinészteráz enzim esetén leírták [199]. A megnövekedett lokális mozgékonyságot a poláris jelleggel is rendelkező aromás oldalláncok (például tirozin) is biztosíthatják. A betain-aldehiddehidrogenáz kvaterner-ammónium kötőhelyét például négy, megnövekedett mozgékonysággal rendelkező aromás oldallánc határolja, melyek képesek a ligandcsoport kötésére még úgy is, ha annak elhelyezkedése némileg változik. A ligand kötésének flexibilitása így ebben az esetben is fontos szereppel bírhat az enzim katalízisben [200,201]. Az egyes enzimek eltérő felépítése és működése miatt 104
azonban hangsúlyozni kívánjuk, hogy minden egyes kvaterner-ammónium ligandot kötő enzim alapos kinetikai és szerkezeti vizsgálata szükséges az összetett aromás doboz kötőhelyet alkotó oldalláncok enzimatikus működésben betöltött szerepének tisztázásához.
105
5. Összefoglalás A dolgozat eredményeit a Célkitűzések (2. fejezet) pontban megfogalmazott kérdések alapján foglaltam össze. 1. Kimutattuk, hogy a Mycobacterium tuberculosis dUTPáz aktív helyén a Mg2+ koordinációjában részt vevő D28 aszpartát fontos szereppel bír az aktív hely szerkezeti összetartásában, ugyanakkor a fémion kofaktor koordinációjához nem elengedhetetlen.
Az
oldallánc
szerepének
vizsgálatához
konzervatív
aszpartát/aszparagin mutációját hoztuk létre. A konstrukt oldatbeli vizsgálata során az enzimaktivitás 50-szeres csökkenését, valamint a dUPNPP szubsztrát analóg kötésének gyengülését tapasztaltuk. Ezek a változások nem vezethetők vissza egyedül a Mg2+ koordinációjának megzavarására. A fémion távolléte ugyanis csupán az enzim aktivitásának felére csökkenését eredményezte és ez a hatás a pontmutáns fehérje esetén is észlelhető volt. A mutáció hatásának értelmezéséhez egykristály röntgendiffrakció segítségével meghatároztuk az MtDUTD28N:dUPNPP:Mg2+ komplex 1,8 Å felbontású térszerkezetét. A D28N pontmutáns
fehérje
szerkezeti
elemzésével
megmutattuk,
hogy
az
aszpartát/aszparagin csere az enzim aktív helyén továbbterjedő szerkezeti változásokat
eredményezett,
mely
befolyásolta
az
alegységek
közti
kölcsönhatásokat, valamint a nukleofil támadást végző víz koordinációját. A vizsgált oldallánc konzerváltsága révén más fajokból származó dUTPáz enzimek esetén is hasonló szerepet tölthet be az enzim működésben. 2. A PfCCT enzim biokémiai jellemzéséhez egy, az enzim második katalitikus doménjét tartalmazó PfCCT MΔK konstruktot hoztunk létre. Megállapítottuk, hogy a konstrukt dimer oligomerizációs állapottal is rendelkezik és megfelelően reprezentálja a PfCCT két, nagy szekvenciális azonosságot mutató katalitikus doménjeinek
a
kölcsönhatását.
Az
enzim
kinetikai
analízise
során
megállapítottuk, hogy az enzimatikus ciklus során a szubsztrátok kötődése az enzim aktív helyén tetszőleges sorrendben valósulhat meg. Fluoreszcencia és 106
izotermális titrációs kalorimetria ligand-kötés mérések alapján különbséget mutattunk ki a ChoP és CDPCho kvaterner-ammónium csoportot tartalmazó ligandok enzim kölcsönhatása közt. Megmutattuk, hogy az enzim Mg2+ kofaktora nem szükséges a hatékony szubsztrát kötődéshez, így fő feladata az enzim katalizált kémiai átalakítás elősegítése. Mivel a Mg2+ hasonló szerepet tölt be a nukleotid trifoszfát kötés során az azonos enzim szupercsaládba tartozó további két vizsgált enzim esetén, feltételezhető, hogy a fémion hasonló szereppel bírhat a ligand kötésben és az enzimatikus átalakításban a CCT enzimet is magába foglaló HIGH nukleotidiltranszferáz evolúciós enzimcsalád további enzimei esetén is. 3. Megállapítottuk, hogy a PfCCT aktív hely kolin kötő zsebénél a ligand kötődés elektrosztatikus
valamint kation-π
kölcsönhatások révén
valósul
meg.
Megvizsgáltuk a kölcsönhatásokért felelős oldalláncok egyedi hozzájárulását a megfelelő konzervatív pontmutációik létrehozásával, mely során szerkezetileg hasonló, de eltérő kölcsönhatást biztosító aminosavakra cseréltük őket. Az így létrehozott fehérje konstruktok katalitikus hatékonyságának valamint ligand kötésének vizsgálata során azonosítani tudtuk az egyes oldalláncok ligand kölcsönhatásának meghatározó elektrosztatikus, illetve kation-π jellegét. Megmutattuk, hogy mindkét típusú kölcsönhatás elengedhetetlen a PfCCT hatékony kvaterner-ammónium ligand kötéséhez, valamint enzim aktivitásához. Eredményeink hozzájárulhatnak
a
lipid
metabolizmus
útvonalon
ható
maláriaellenes hatóanyagok szerkezet alapú fejlesztéséhez. 4. Elvégeztük a PfCCT enzim kolin kötő helyének szerkezeti összehasonlítását további fehérjék kvaterner ammónium ligandot felismerő helyével. A PDB adatbázisban közölt fehérje szerkezetek átfogó elemzésével azonosítottunk egy általánosan elterjedt enzim típusú kvaterner-ammónium ligand kötő helyet. A felismerő hely összetett aromás doboz elnevezése a jellemző kation-π valamint elektrosztatikus ligand kölcsönhatásaira utal, melyet egy vagy két aromás oldallánc mellett negatív töltésű vagy poláris oldalláncok biztosítanak. Az ilyen 107
szerkezetű felismerő hellyel rendelkező enzimek szerteágazó biokémiai folyamatokban vesznek részt, beleértve az ingerület átvitelt, epigenetikát és a lipid metabolizmust. Rámutattunk, hogy a zömmel enzimek esetén megfigyelt összetett aromás doboz felépítése eltér a kvaterner-ammónium ligandokat kötő, de az átalakításukat nem katalizáló fehérjék aromás doboz vagy aromás kalitka felismerő helyétől. A kvaterner-ammónium felismerő helyek szerkezeti különbségei meglátásunk szerint a fehérjék különböző feladatának - enzim katalízis illetve megfelelő affinitású ligand kötés - eltérő kinetikai és termodinamikai követelményeit tükrözik.
108
.
6. Irodalomjegyzék 1 Who (2014) World Health Organization (2014) Global tuberculosis report. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/. . 2 Bomanji JB, Gupta N, Gulati P & Das CJ (2015) Imaging in Tuberculosis. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 3 Trunz BB, Fine P & Dye C (2006) Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness. Lancet 367, 1173–1180. 4 Russell DG, Barry CE & Flynn JL (2010) Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science 328, 852–856. 5 Verma I & Grover A (2009) Antituberculous vaccine development: a perspective for the endemic world. Expert Rev. Vaccines 8, 1547–1553. 6 Böttger EC & Springer B (2008) Tuberculosis: Drug resistance, fitness, and strategies for global control. Eur. J. Pediatr. 167, 141–148. 7 Macq J, Solis A & Martinez G (2006) Assessing the stigma of tuberculosis. Psychol. Health Med. 11, 346–352. 8 Günther G (2014) Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a review of current concepts and future challenges. Clin. Med. 14, 279–85. 9 Chernyshev A, Fleischmann T & Kohen A (2007) Thymidyl biosynthesis enzymes as antibiotic targets. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 282–289. 10 Ahmad SI, Kirk SH & Eisenstark A (1998) Thymine metabolism and thymineless death in prokaryotes and eukaryotes. Annu. Rev. Microbiol. 52, 591–625. 11 Rengarajan J, Sassetti CM, Naroditskaya V, Sloutsky A, Bloom BR & Rubin EJ (2004) The folate pathway is a target for resistance to the drug paraaminosalicylic acid (PAS) in mycobacteria. Mol. Microbiol. 53, 275–282. 12 Zhang Z, Zhao Y-L, Li Z-H, Jia H-Y, Liu Y-H, Chen X, Liu Z-Q, Du B-P, Xing A-Y & Ma Y (2007) Mutations in the thymidylate synthase gene is a major mechanism in the para-aminosalicylic acid resistance of M. tuberculosis. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi 30, 683–685. 109
13 Zhao F, Wang X De, Erber LN, Luo M, Guo AZ, Yang SS, Gu J, Turman BJ, Gao YR, Li DF, Cui ZQ, Zhang ZP, Bi LJ, Baughn AD, Zhang XE & Deng JY (2014) Binding pocket alterations in dihydrofolate synthase confer resistance to para-aminosalicylic acid in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1479–1487. 14 Fivian-Hughes AS, Houghton J & Davis EO (2012) Mycobacterium tuberculosis thymidylate synthase gene thyX is essential and potentially bifunctional, while thyA deletion confers resistance to p-aminosalicylic acid. Microbiology 158, 308–318. 15 Basta T, Boum Y, Briffotaux J, Becker HF, Lamarre-Jouenne I, Lambry J-C, Skouloubris S, Liebl U, Graille M, van Tilbeurgh H & Myllykallio H (2012) Mechanistic and structural basis for inhibition of thymidylate synthase ThyX. Open Biol. 2, 120120–120120. 16 Vértessy BG & Tóth J (2009) Keeping uracil out of DNA: physiological role, structure and catalytic mechanism of dUTPases. Acc. Chem. Res. 42, 97–106. 17 Helt SS, Thymark M, Harris P, Aagaard C, Dietrich J, Larsen S & Willemoes M (2008) Mechanism of dTTP Inhibition of the Bifunctional dCTP Deaminase:dUTPase Encoded by Mycobacterium tuberculosis. J. Mol. Biol. 376, 554–569. 18 Ladner RD (2001) The role of dUTPase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr. Protein Pept. Sci. 2, 361–370. 19 Pecsi I, Hirmondo R, Brown AC, Lopata A, Parish T, Vertessy BG & Tóth J (2012) The dUTPase enzyme is essential in Mycobacterium smegmatis. PLoS One 7, e37461. 20 Moroz O V., Harkiolaki M, Galperin MY, Vagin AA, González-Pacanowska D & Wilson KS (2004) The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the “basic module” for dimeric d(C/U)TPases. J. Mol. Biol. 342, 1583–1597. 21 Whittingham JL, Leal I, Nguyen C, Kasinathan G, Bell E, Jones AF, Berry C, Benito A, Turkenburg JP, Dodson EJ, Ruiz Perez LM, Wilkinson AJ, Johansson NG, Brun R, Gilbert IH, Pacanowska DG & Wilson KS (2005) dUTPase as a platform for antimalarial drug design: Structural basis for the selectivity of a class of nucleoside inhibitors. Structure 13, 329–338. 22 Baragaña B, McCarthy O, Sánchez P, Bosch-Navarrete C, Kaiser M, Brun R, Whittingham JL, Roberts SM, Zhou XX, Wilson KS, Johansson NG, 110
González-Pacanowska D & Gilbert IH (2011) β-Branched acyclic nucleoside analogues as inhibitors of Plasmodium falciparum dUTPase. Bioorganic Med. Chem. 19, 2378–2391. 23 Miyakoshi H, Miyahara S, Yokogawa T, Endoh K, Muto T, Yano W, Wakasa T, Ueno H, Chong KT, Taguchi J, Nomura M, Takao Y, Fujioka A, Hashimoto A, Itou K, Yamamura K, Shuto S, Nagasawa H & Fukuoka M (2012) 1,2,3Triazole-containing uracil derivatives with excellent pharmacokinetics as a novel class of potent human deoxyuridine triphosphatase inhibitors. J. Med. Chem. 55, 6427–6437. 24 Miyahara S, Miyakoshi H, Yokogawa T, Chong KT, Taguchi J, Muto T, Endoh K, Yano W, Wakasa T, Ueno H, Takao Y, Fujioka A, Hashimoto A, Itou K, Yamamura K, Nomura M, Nagasawa H, Shuto S & Fukuoka M (2012) Discovery of a novel class of potent human deoxyuridine triphosphatase inhibitors remarkably enhancing the antitumor activity of thymidylate synthase inhibitors. J. Med. Chem. 55, 2970–2980. 25 Saito K, Nagashima H, Noguchi K, Yoshisue K, Yokogawa T, Matsushima E, Tahara T & Takagi S (2014) First-in-human, phase I dose-escalation study of single and multiple doses of a first-in-class enhancer of fluoropyrimidines, a dUTPase inhibitor (TAS-114) in healthy male volunteers. Cancer Chemother. Pharmacol. 73, 577–583. 26 Wilson PM, LaBonte MJ, Lenz H-J, Mack PC & Ladner RD (2012) Inhibition of dUTPase Induces Synthetic Lethality with Thymidylate Synthase-Targeted Therapies in Non-Small Cell Lung Cancer. Mol. Cancer Ther. 11, 616–628. 27 Chan S, Segelke B, Lekin T, Krupka H, Cho US, Kim MY, So M, Kim CY, Naranjo CM, Rogers YC, Park MS, Waldo GS, Pashkov I, Cascio D, Perry JL & Sawaya MR (2004) Crystal structure of the Mycobacterium tuberculosis dUTPase: Insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol. 341, 503–517. 28 Tormo-Más MA, Mir I, Shrestha A, Tallent SM, Campoy S, Lasa I, Barbé J, Novick RP, Christie GE & Penadés JR (2010) Moonlighting bacteriophage proteins derepress staphylococcal pathogenicity islands. Nature 465, 779–82. 29 Szabó JE, Németh V, Papp-Kádár V, Nyíri K, Leveles I, Bendes AÁ, Zagyva I, Róna G, Pálinkás HL, Besztercei B, Ozohanics O, Vékey K, Liliom K, Tóth J & Vértessy BG (2014) Highly potent dUTPase inhibition by a bacterial repressor protein reveals a novel mechanism for gene expression control. Nucleic Acids Res. 42, 11912–20.
111
30 Varga B, Barabás O, Takács E, Nagy N, Nagy P & Vértessy BG (2008) Active site of mycobacterial dUTPase: structural characteristics and a built-in sensor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 8–13. 31 Horváti K, Bacsa B, Szabó N, Fodor K, Balka G, Rusvai M, Kiss É, Mező G, Grolmusz V, Vértessy B, Hudecz F & Bősze S (2015) Antimycobacterial activity of peptide conjugate of pyridopyrimidine derivative against Mycobacterium tuberculosis in a series of in vitro and in vivo models. Tuberculosis, (epub ahead of print). 32 Hemsworth GR, González-Pacanowska D & Wilson KS (2013) On the catalytic mechanism of dimeric dUTPases. Biochem. J. 456, 81–8. 33 Barabás O, Németh V, Bodor A, Perczel A, Rosta E, Kele Z, Zagyva I, Szabadka Z, Grolmusz VI, Wilmanns M & Vértessy BG (2013) Catalytic mechanism of α-phosphate attack in dUTPase is revealed by X-ray crystallographic snapshots of distinct intermediates, 31P-NMR spectroscopy and reaction path modelling. Nucleic Acids Res. 41, 10542–55. 34 Takács E, Barabás O, Petoukhov M V., Svergun DI & Vértessy BG (2009) Molecular shape and prominent role of β-strand swapping in organization of dUTPase oligomers. FEBS Lett. 583, 865–871. 35 Fiser A & Vértessy BG (2000) Altered subunit communication in subfamilies of trimeric dUTPases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 534–542. 36 Barabás O, Pongrácz V, Kovári J, Wilmanns M & Vértessy BG (2004) Structural insights into the catalytic mechanism of phosphate ester hydrolysis by dUTPase. J. Biol. Chem. 279, 42907–15. 37 Vertessy BG, Persson R, Rosengren AM, Zeppezauer M & Nyman PO (1996) Specific derivatization of the active site tyrosine in dUTPase perturbs ligand binding to the active site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219, 294–300. 38 Mol CD, Harris JM, McIntosh EM & Tainer JA (1996) Human dUTP pyrophosphatase: Uracil recognition by a ?? hairpin and active sites formed by three separate subunits. Structure 4, 1077–1092. 39 García-Nafría J, Timm J, Harrison C, Turkenburg JP & Wilson KS (2013) Tying down the arm in Bacillus dUTPase: Structure and mechanism. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 69, 1367–1380. 40 Lopata A, Jambrina PG, Sharma PK, Brooks BR, Toth J, Vertessy BG & Rosta E (2015) Mutations decouple proton transfer from phosphate cleavage in the dUTPase catalytic reaction. ACS Catal., 150408092741004. 112
41 Palmén LG, Becker K, Bülow L & Kvassman JO (2008) A double role for a strictly conserved serine: Further insights into the dUTPase catalytic mechanism. Biochemistry 47, 7863–7874. 42 Pécsi I, Szabó JE, Adams SD, Simon I, Sellers JR, Vértessy BG & Tóth J (2011) Nucleotide pyrophosphatase employs a P-loop-like motif to enhance catalytic power and NDP/NTP discrimination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 14437–42. 43 Pecsi I, Leveles I, Harmat V, Vertessy BG & Toth J (2010) Aromatic stacking between nucleobase and enzyme promotes phosphate ester hydrolysis in dUTPase. Nucleic Acids Res. 38, 7179–86. 44 Tóth J, Varga B, Kovács M, Málnási-Csizmadia A & Vértessy BG (2007) Kinetic mechanism of human dUTPase, an essential nucleotide pyrophosphatase enzyme. J. Biol. Chem. 282, 33572–82. 45 Kovári J, Barabás O, Varga B, Békési A, Tölgyesi F, Fidy J, Nagy J & Vértessy BG (2008) Methylene substitution at the α-β bridging position within the phosphate chain of dUDP profoundly perturbs ligand accommodation into the dUTPase active site. Proteins Struct. Funct. Genet. 71, 308–319. 46 Németh-Pongrácz V, Barabás O, Fuxreiter M, Simon I, Pichová I, Rumlová M, Zábranská H, Svergun D, Petoukhov M, Harmat V, Klement E, HunyadiGulyás E, Medzihradszky KF, Kónya E & Vértessy BG (2007) Flexible segments modulate co-folding of dUTPase and nucleocapsid proteins. Nucleic Acids Res. 35, 495–505. 47 Mustafi D, Bekesi A, Vertessy BG & Makinen MW (2003) Catalytic and structural role of the metal ion in dUTP pyrophosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 5670–5675. 48 Caradonna SJ & Adamkiewicz DM (1984) Purification and properties of the deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase enzyme derived from HeLa S3 cells. Comparison to a distinct dUTP nucleotidohydrolase induced in herpes simplex virus-infected HeLa S3 cells. J. Biol. Chem. 259, 5459–5464. 49 Freeman L, Buisson M, Tarbouriech N, Van der Heyden A, Labbé P & Burmeister WP (2009) The flexible motif V of Epstein-Barr virus deoxyuridine 5’-triphosphate pyrophosphatase is essential for catalysis. J. Biol. Chem. 284, 25280–9. 50 Mildvan AS, Xia Z, Azurmendi HF, Saraswat V, Legler PM, Massiah MA, Gabelli SB, Bianchet MA, Kang LW & Amzel LM (2005) Structures and mechanisms of Nudix hydrolases. Arch. Biochem. Biophys. 433, 129–143. 113
51 Maguire ME & Cowan J a. (2002) Magnesium chemistry and biochemistry. BioMetals 15, 203–210. 52 World Health Organization (2014) World Malaria Report. 53 Gething PW, Patil AP, Smith DL, Guerra CA, Elyazar IRF, Johnston GL, Tatem AJ & Hay SI (2011) A new world malaria map: Plasmodium falciparum endemicity in 2010. . 54 Klein EY (2013) Antimalarial drug resistance: A review of the biology and strategies to delay emergence and spread. Int. J. Antimicrob. Agents 41, 311– 317. 55 Conway DJ (2015) Paths to a malaria vaccine illuminated by parasite genomics. Trends Genet. 31, 97–107. 56 Efficacy and safety of RTS,S/AS01 malaria vaccine with or without a booster dose in infants and children in Africa: final results of a phase 3, individually randomised, controlled trial (2015) Lancet, (epub ahaed of print). 57 Mendis K, Rietveld A, Warsame M, Bosman A, Greenwood B & Wernsdorfer WH (2009) From malaria control to eradication: The WHO perspective. Trop. Med. Int. Heal. 14, 802–809. 58 Tanser FC, Pluess B, Lengeler C & Sharp BL (2007) Indoor residual spraying for preventing malaria. Cochrane Database Syst. Rev. 59 Pates H & Curtis C (2005) Mosquito behavior and vector control. Annu. Rev. Entomol. 50, 53–70. 60 Ross R (1910) The Prevention of Malaria, Murray London. 61 Kleinschmidt I, Schwabe C, Shiva M, Segura JL, Sima V, Mabunda SJA & Coleman M (2009) Combining indoor residual spraying and insecticide-treated net interventions. Am. J. Trop. Med. Hyg. 81, 519–524. 62 Achan J, Talisuna AO, Erhart A, Yeka A, Tibenderana JK, Baliraine FN, Rosenthal PJ & D’Alessandro U (2011) Quinine, an old anti-malarial drug in a modern world: role in the treatment of malaria. Malar. J. 10, 144. 63 Bjorkman A & Phillips-Howard PA (1990) The epidemiology of drug-resistant malaria. Trans R Soc Trop Med Hyg 84, 177–180. 64 Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH & Meshnick SR (2002) Reviews Epidemiology of drug-resistant malaria. 2, 209–218. 114
65 Dondorp AM, Nosten F, Yi P, Das D, Phyo AP, Tarning J, Lwin KM, Ariey F, Hanpithakpong W, Lee SJ, Ringwald P, Silamut K, Imwong M, Chotivanich K, Lim P, Herdman T, An SS, Yeung S, Singhasivanon P, Day NPJ, Lindegardh N, Socheat D & White NJ (2009) Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria. N. Engl. J. Med. 361, 455–467. 66 Ashley E a, Dhorda M, Fairhurst RM, Amaratunga C, Lim P, Suon S, Sreng S, Anderson JM, Mao S, Sam B, Sopha C, Chuor CM, Nguon C, Sovannaroth S, Pukrittayakamee S, Jittamala P, Chotivanich K, Chutasmit K, Suchatsoonthorn C, Runcharoen R, Hien TT, Thuy-Nhien NT, Thanh NV, Phu NH, Htut Y, Han K-T, Aye KH, Mokuolu O a, Olaosebikan RR, Folaranmi OO, Mayxay M, Khanthavong M, Hongvanthong B, Newton PN, Onyamboko M a, Fanello CI, Tshefu AK, Mishra N, Valecha N, Phyo AP, Nosten F, Yi P, Tripura R, Borrmann S, Bashraheil M, Peshu J, Faiz MA, Ghose A, Hossain MA, Samad R, Rahman MR, Hasan MM, Islam A, Miotto O, Amato R, MacInnis B, Stalker J, Kwiatkowski DP, Bozdech Z, Jeeyapant A, Cheah PY, Sakulthaew T, Chalk J, Intharabut B, Silamut K, Lee SJ, Vihokhern B, Kunasol C, Imwong M, Tarning J, Taylor WJ, Yeung S, Woodrow CJ, Flegg J a, Das D, Smith J, Venkatesan M, Plowe C V, Stepniewska K, Guerin PJ, Dondorp AM, Day NP & White NJ (2014) Spread of Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Malaria. N. Engl. J. Med. 371, 411–423. 67 World Health Organization (2010) Guidelines for the treatment of malaria, 2nd edition. Who, 197p. 68 Gogtay N, Kannan S, Thatte UM, Olliaro PL & Sinclair D (2013) Artemisininbased combination therapy for treating uncomplicated Plasmodium vivax malaria. Cochrane database Syst. Rev. 10, CD008492. 69 Anthony MP, Burrows JN, Duparc S, JMoehrle J & Wells T (2012) The global pipeline of new medicines for the control and elimination of malaria. . 70 Fairhurst RM, Nayyar GML, Breman JG, Hallett R, Vennerstrom JL, Duong S, Ringwald P, Wellems TE, Plowe C V & Dondorp AM (2012) Artemisininresistant malaria: research challenges, opportunities, and public health implications. Am. J. Trop. Med. Hyg. 87, 231–41. 71 Wernsdorfer WH & Payne D (1991) The dynamics of drug resistance in Plasmodium falciparum. Pharmacol. Ther. 50, 95–121. 72 Wongsrichanalai C, Sirichaisinthop J, Karwacki JJ, Congpuong K, Miller RS, Pang L & Thimasarn K (2001) Drug resistant malaria on the Thai-Myanmar and Thai-Cambodian borders. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 32, 41–49.
115
73 Looareesuwan S, Viravan C, Webster HK, Kyle DE, Hutchinson DB & Canfield CJ (1996) Clinical studies of atovaquone, alone or in combination with other antimalarial drugs, for treatment of acute uncomplicated malaria in Thailand. Am. J. Trop. Med. Hyg. 54, 62–66. 74 Ashley E a, Dhorda M, Fairhurst RM, Amaratunga C, Lim P, Suon S, Sreng S, Anderson JM, Mao S, Sam B, Sopha C, Chuor CM, Nguon C, Sovannaroth S, Pukrittayakamee S, Jittamala P, Chotivanich K, Chutasmit K, Suchatsoonthorn C, Runcharoen R, Hien TT, Thuy-Nhien NT, Thanh NV, Phu NH, Htut Y, Han K-T, Aye KH, Mokuolu O a, Olaosebikan RR, Folaranmi OO, Mayxay M, Khanthavong M, Hongvanthong B, Newton PN, Onyamboko M a, Fanello CI, Tshefu AK, Mishra N, Valecha N, Phyo AP, Nosten F, Yi P, Tripura R, Borrmann S, Bashraheil M, Peshu J, Faiz MA, Ghose A, Hossain MA, Samad R, Rahman MR, Hasan MM, Islam A, Miotto O, Amato R, MacInnis B, Stalker J, Kwiatkowski DP, Bozdech Z, Jeeyapant A, Cheah PY, Sakulthaew T, Chalk J, Intharabut B, Silamut K, Lee SJ, Vihokhern B, Kunasol C, Imwong M, Tarning J, Taylor WJ, Yeung S, Woodrow CJ, Flegg J a, Das D, Smith J, Venkatesan M, Plowe C V, Stepniewska K, Guerin PJ, Dondorp AM, Day NP & White NJ (2014) Spread of Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Malaria. N. Engl. J. Med. 371, 411–423. 75 Vial HJ, Ancelin ML, Philippot JR & Thuet MJ (1990) Biosynthesis and dynamics of lipids in Plasmodium-infected mature mammalian erythrocytes. Blood Cells 16, 531–555; discussion 556–561. 76 Déchamps S, Shastri S, Wengelnik K & Vial HJ (2010) Glycerophospholipid acquisition in Plasmodium - A puzzling assembly of biosynthetic pathways. Int. J. Parasitol. 40, 1347–1365. 77 Ancelin ML & Vial HJ (1989) Regulation of phosphatidylcholine biosynthesis in Plasmodium-infected erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta 1001, 82–89. 78 Sen P, Vial HJ & Radulescu O (2013) Kinetic modelling of phospholipid synthesis in Plasmodium knowlesi unravels crucial steps and relative importance of multiple pathways. BMC Syst. Biol. 7, 123. 79 Peyrottes s (2012) Choline Analogues in Malaria Chemotherapy. Curr. Pharm. Des. 80 Contet A, Pihan E, Lavigne M, Wengelnik K, Maheshwari S, Vial H, Douguet D & Cerdan R (2015) Plasmodium falciparum CTP:phosphocholine cytidylyltransferase possesses two functional catalytic domains and is inhibited by a CDP-choline analog selected from a virtual screening. FEBS Lett.
116
81 Wengelnik K, Vidal V, Ancelin ML, Cathiard A-M, Morgat JL, Kocken CH, Calas M, Herrera S, Thomas AW & Vial HJ (2002) A class of potent antimalarials and their specific accumulation in infected erythrocytes. Science 295, 1311–1314. 82 Visser BJ, van Vugt M & Grobusch MP (2014) Malaria: an update on current chemotherapy. Expert Opin. Pharmacother., 1–36. 83 Wein S, Maynadier M, Bordat Y, Perez J, Maheshwari S, Bette-Bobillo P, Tran Van Ba C, Penarete-Vargas D, Fraisse L, Cerdan R & Vial H (2012) Transport and pharmacodynamics of albitiazolium, an antimalarial drug candidate. Br. J. Pharmacol. 166, 2263–76. 84 Peyrottes S, Caldarelli S, Wein S, Perigaud C & Vial H (2014) Exploring prodrug approaches for albitiazolium and its analogues. Curr. Top. Med. Chem. 14, 1653–67. 85 Li Z & Vance DE (2008) Phosphatidylcholine and choline homeostasis. J. Lipid Res. 49, 1187–1194. 86 Aravind L, Anantharaman V & Koonin E V. (2002) Monophyly of Class I aminoacyl tRNA synthetase, USPA, ETFP, photolyase, and PP-ATPase nucleotide-binding domains: Implications for protein evolution in the RNA world. Proteins Struct. Funct. Genet. 48, 1–14. 87 Rao ST & Rossmann MG (1973) Comparison of super-secondary structures in proteins. J. Mol. Biol. 76, 241–256. 88 Friesen J a., Campbell H a. & Kent C (1999) Enzymatic and Cellular Characterization of a Catalytic Fragment of CTP:Phosphocholine Cytidylyltransferase . J. Biol. Chem. 274, 13384–13389. 89 Xie M, Smith JL, Ding Z, Zhang D & Cornell RB (2004) Membrane binding modulates the quaternary structure of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase. J. Biol. Chem. 279, 28817–28825. 90 Lee J, Johnson J, Ding Z, Paetzel M & Cornell RB (2009) Crystal structure of a mammalian CTP: phosphocholine cytidylyltransferase catalytic domain reveals novel active site residues within a highly conserved nucleotidyltransferase fold. J. Biol. Chem. 284, 33535–48. 91 Sarri E, Sicart A, Lázaro-Diéguez F & Egea G (2011) Phospholipid synthesis participates in the regulation of diacylglycerol required for membrane trafficking at the Golgi complex. J. Biol. Chem. 286, 28632–28643.
117
92 Krahmer N, Guo Y, Wilfling F, Hilger M, Lingrell S, Heger K, Newman HW, Schmidt-Supprian M, Vance DE, Mann M, Farese R V. & Walther TC (2011) Phosphatidylcholine synthesis for lipid droplet expansion is mediated by localized activation of CTP:Phosphocholine cytidylyltransferase. Cell Metab. 14, 504–515. 93 Cole LK, Vance JE & Vance DE (2012) Phosphatidylcholine biosynthesis and lipoprotein metabolism. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids 1821, 754–761. 94 Tian Y, Zhou R, Rehg JE & Jackowski S (2007) Role of phosphocholine cytidylyltransferase alpha in lung development. Mol. Cell. Biol. 27, 975–82. 95 Ding Z, Taneva SG, Huang HKH, Campbell SA, Semenec L, Chen N & Cornell RB (2012) A 22-mer segment in the structurally pliable regulatory domain of metazoan CTP: Phosphocholine cytidylyltransferase facilitates both silencing and activating functions. J. Biol. Chem. 287, 38980–38991. 96 Huang HKH, Taneva SG, Lee J, Silva LP, Schriemer DC & Cornell RB (2013) The membrane-binding domain of an amphitropic enzyme suppresses catalysis by contact with an amphipathic helix flanking its active site. J. Mol. Biol. 425, 1546–1564. 97 Lee J, Taneva SG, Holland BW, Tieleman DP & Cornell RB (2014) Structural basis for autoinhibition of CTP: Phosphocholine cytidylyltransferase (CCT), the regulatory enzyme in phosphatidylcholine synthesis, by its membranebinding amphipathic helix. J. Biol. Chem. 289, 1742–1755. 98 Yang W, Boggs KP & Jackowski S (1995) The association of lipid activators with the amphipathic helical domain of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase accelerates catalysis by increasing the affinity of the enzyme for CTP. J. Biol. Chem. 270, 23951–23957. 99 Taneva S, Dennis MK, Ding Z, Smith JL & Cornell RB (2008) Contribution of each membrane binding domain of the CTP:Phosphocholine cytidylyltransferase-?? dimer to its activation, membrane binding, and membrane cross-bridging. J. Biol. Chem. 283, 28137–28148. 100 Dennis MK, Taneva SG & Cornell RB (2011) The intrinsically disordered nuclear localization signal and phosphorylation segments distinguish the membrane affinity of two cytidylyltransferase isoforms. J. Biol. Chem. 286, 12349–12360.
118
101 Attard GS, Templer RH, Smith WS, Hunt a N & Jackowski S (2000) Modulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase by membrane curvature elastic stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 9032–9036. 102 Chong SSY, Taneva SG, Lee JMC & Cornell RB (2014) The curvature sensitivity of a membrane-binding amphipathic helix can be modulated by the charge on a flanking region. Biochemistry 53, 450–461. 103 Jamil H, Yao Z & Vance DE (1990) Feedback regulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase translocation between cytosol and endoplasmic reticulum by phosphatidylcholine. J. Biol. Chem. 265, 4332– 4339. 104 Cornell RB & Northwood IC (2000) Regulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase by amphitropism and relocalization. Trends Biochem. Sci. 25, 441–447. 105 Veitch DP, Gilham D & Cornell RB (1998) The role of histidine residues in the HXGH site of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase in CTP binding and catalysis. Eur. J. Biochem. 255, 227–34. 106 Helmink BA, Braker JD, Kent C & Friesen JA (2003) Identification of lysine 122 and arginine 196 as important functional residues of rat CTP:phosphocholine cytidylyltransferase alpha. Biochemistry 42, 5043–51. 107 Wang XM & Moore TS (1989) Partial purification and characterization of CTP:cholinephosphate cytidylyltransferase from castor bean endosperm. Arch. Biochem. Biophys. 274, 338–347. 108 Mages F, Rey C, Fonlupt P & Pacheco H (1988) Kinetic and biochemical properties of CTP:choline-phosphate cytidylyltransferase from the rat brain. Eur. J. Biochem. 178, 367–72. 109 Price-Jones MJ & Harwood JL (1986) The control of CTP:choline-phosphate cytidylyltransferase activity in pea (Pisum sativum L.). Biochem. J. 240, 837– 842. 110 Tilley DM, Evans CR, Larson TM, Edwards KA & Friesen JA (2008) Identification and characterization of the nuclear isoform of Drosophila melanogaster CTP:phosphocholine cytidylyltransferase. Biochemistry 47, 11838–46. 111 Yeo HJ, Larvor MP, Ancelin ML & Vial HJ (1997) Plasmodium falciparum CTP:phosphocholine cytidylyltransferase expressed in Escherichia coli:
119
purification, characterization and lipid regulation. Biochem. J. 324 ( Pt 3, 903– 10. 112 Jamil H & Vance DE (1991) Substrate specificity of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase. Biochim. Biophys. Acta - Lipids Lipid Metab. 1086, 335– 339. 113 Mahadevi AS & Sastry GN (2013) Cation-π interaction: its role and relevance in chemistry, biology, and material science. Chem. Rev. 113, 2100–38. 114 Dougherty DA (2013) The cation-π interaction. Acc. Chem. Res. 46, 885–93. 115 Salonen LM, Ellermann M & Diederich F (2011) Aromatic rings in chemical and biological recognition: energetics and structures. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 4808–42. 116 Déchamps S, Wengelnik K, Berry-Sterkers L, Cerdan R, Vial HJ & GannounZaki L (2010) The Kennedy phospholipid biosynthesis pathways are refractory to genetic disruption in Plasmodium berghei and therefore appear essential in blood stages. Mol. Biochem. Parasitol. 173, 69–80. 117 Aurrecoechea C, Brestelli J, Brunk BP, Dommer J, Fischer S, Gajria B, Gao X, Gingle A, Grant G, Harb OS, Heiges M, Innamorato F, Iodice J, Kissinger JC, Kraemer E, Li W, Miller JA, Nayak V, Pennington C, Pinney DF, Roos DS, Ross C, Stoeckert CJ, Treatman C & Wang H (2009) PlasmoDB: a functional genomic database for malaria parasites. Nucleic Acids Res. 37, D539–43. 118 Llinás M, Bozdech Z, Wong ED, Adai AT & DeRisi JL (2006) Comparative whole genome transcriptome analysis of three Plasmodium falciparum strains. Nucleic Acids Res. 34, 1166–1173. 119 Larvor M-P, Cerdan R, Gumila C, Maurin L, Seta P, Roustan C & Vial H (2003) Characterization of the lipid-binding domain of the Plasmodium falciparum CTP:phosphocholine cytidylyltransferase through synthetic-peptide studies. Biochem. J. 375, 653–661. 120 Weber CH, Park YS, Sanker S, Kent C & Ludwig ML (1999) A prototypical cytidylyltransferase: CTP:glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase from bacillus subtilis. Structure 7, 1113–24. 121 Eswar N, Webb B, Marti-Renom MA, Madhusudhan MS, Eramian D, Shen MY, Pieper U & Sali A (2007) Comparative protein structure modeling using MODELLER. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 2, Unit 2.9.
120
122 MacKerell AD, Banavali N & Foloppe N (2000) Development and current status of the CHARMM force field for nucleic acids. Biopolymers 56, 257– 265. 123 Brooks BR, Brooks CL, Mackerell AD, Nilsson L, Petrella RJ, Roux B, Won Y, Archontis G, Bartels C, Boresch S, Caflisch A, Caves L, Cui Q, Dinner AR, Feig M, Fischer S, Gao J, Hodoscek M, Im W, Kuczera K, Lazaridis T, Ma J, Ovchinnikov V, Paci E, Pastor RW, Post CB, Pu JZ, Schaefer M, Tidor B, Venable RM, Woodcock HL, Wu X, Yang W, York DM & Karplus M (2009) CHARMM: The biomolecular simulation program. J. Comput. Chem. 30, 1545–1614. 124 Laskowski RA, MacArthur MW, Moss DS & Thornton JM (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Crystallogr. 26, 283–291. 125 Hooft RW, Vriend G, Sander C & Abola EE (1996) Errors in protein structures. Nature 381, 272. 126 Colovos C & Yeates TO (1993) Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions. Protein Sci. 2, 1511–1519. 127 Vertessy BG, Persson R, Rosengren AM, Zeppezauer M & Nyman PO (1996) Specific derivatization of the active site tyrosine in dUTPase perturbs ligand binding to the active site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219, 294–300. 128 Lloyd AJ, Thomann HU, Ibba M & Söll D (1995) A broadly applicable continuous spectrophotometric assay for measuring aminoacyl-tRNA synthetase activity. Nucleic Acids Res. 23, 2886–92. 129 Webb MR (1992) A continuous spectrophotometric assay for inorganic phosphate and for measuring phosphate release kinetics in biological systems. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 4884–4887. 130 Turnbull WB & Daranas AH (2003) On the Value of c: Can Low Affinity Systems Be Studied by Isothermal Titration Calorimetry? J. Am. Chem. Soc. 125, 14859–14866. 131 Tellinghuisen J (2008) Isothermal titration calorimetry at very low c. Anal. Biochem. 373, 395–397. 132 Kabsch W (2010) XDS. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 125–32. 133 Vagin A & Teplyakov A (2010) Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 22–5. 121
134 Emsley P, Lohkamp B, Scott WG & Cowtan K (2010) Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 486–501. 135 Winn MD, Ballard CC, Cowtan KD, Dodson EJ, Emsley P, Evans PR, Keegan RM, Krissinel EB, Leslie AGW, McCoy A, McNicholas SJ, Murshudov GN, Pannu NS, Potterton EA, Powell HR, Read RJ, Vagin A & Wilson KS (2011) Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 67, 235–42. 136 Murshudov GN, Skubák P, Lebedev AA, Pannu NS, Steiner RA, Nicholls RA, Winn MD, Long F & Vagin AA (2011) REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 67, 355–67. 137 Hendlich M, Bergner A, Günther J & Klebe G (2003) Relibase: design and development of a database for comprehensive analysis of protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 326, 607–20. 138 Rapp C, Goldberger E, Tishbi N & Kirshenbaum R (2014) Cation-π interactions of methylated ammonium ions: A quantum mechanical study. Proteins 82, 1494–502. 139 Gallivan JP & Dougherty DA (1999) Cation-pi interactions in structural biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 9459–64. 140 Kumar S & Nussinov R (2002) Relationship between ion pair geometries and electrostatic strengths in proteins. Biophys. J. 83, 1595–612. 141 Daze KD & Hof F (2013) The cation-π interaction at protein-protein interaction interfaces: developing and learning from synthetic mimics of proteins that bind methylated lysines. Acc. Chem. Res. 46, 937–45. 142 Varga B, Barabás O, Kovári J, Tóth J, Hunyadi-Gulyás E, Klement E, Medzihradszky KF, Tölgyesi F, Fidy J & Vértessy BG (2007) Active site closure facilitates juxtaposition of reactant atoms for initiation of catalysis by human dUTPase. FEBS Lett. 581, 4783–8. 143 Leveles I, Németh V, Szabó JE, Harmat V, Nyíri K, Bendes ÁÁ, Papp-Kádár V, Zagyva I, Róna G, Ozohanics O, Vékey K, Tóth J & Vértessy BG (2013) Structure and enzymatic mechanism of a moonlighting dUTPase. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69, 2298–308. 144 Vertessy BG, Larsson G, Persson T, Bergman AC, Persson R & Nyman PO (1998) The complete triphosphate moiety of non-hydrolyzable substrate
122
analogues is required for a conformational shift of the flexible C-terminus in E. coli dUTP pyrophosphatase. FEBS Lett. 421, 83–88. 145 Larsson G, Nyman PO & Kvassman JO (1996) Kinetic characterization of dUTPase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 271, 24010–24016. 146 Prasad GS (2001) Glycine rich P-loop motif in deoxyuridine pyrophosphatase. Curr. Protein Pept. Sci. 2, 301–311. 147 González A, Larsson G, Persson R & Cedergren-Zeppezauer E (2001) Atomic resolution structure of Escherichia coli dUTPase determined ab initio. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 57, 767–774. 148 Ulmer JE, Boum Y, Thouvenel CD, Myllykallio H & Sibley CH (2008) Functional analysis of the Mycobacterium tuberculosis FAD-dependent thymidylate synthase, ThyX, reveals new amino acid residues contributing to an extended ThyX motif. J. Bacteriol. 190, 2056–2064. 149 Tchigvintsev A, Singer AU, Flick R, Petit P, Brown G, Evdokimova E, Savchenko A & Yakunin AF (2011) Structure and activity of the Saccharomyces cerevisiae dUTP pyrophosphatase DUT1, an essential housekeeping enzyme. Biochem. J. 437, 243–53. 150 Yang ZR, Thomson R, McNeil P & Esnouf RM (2005) RONN: the bio-basis function neural network technique applied to the detection of natively disordered regions in proteins. Bioinformatics 21, 3369–76. 151 Dosztányi Z, Csizmok V, Tompa P & Simon I (2005) IUPred: web server for the prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics 21, 3433–4. 152 Ward JJ, McGuffin LJ, Bryson K, Buxton BF & Jones DT (2004) The DISOPRED server for the prediction of protein disorder. Bioinformatics 20, 2138–9. 153 Maheshwari S, Lavigne M, Contet A, Alberge B, Pihan E, Kocken C, Wengelnik K, Douguet D, Vial H & Cerdan R (2013) Biochemical characterization of Plasmodium falciparum CTP:phosphoethanolamine cytidylyltransferase shows that only one of the two cytidylyltransferase domains is active. Biochem. J. 450, 159–67. 154 Ngounou Wetie AG, Sokolowska I, Woods AG, Roy U, Loo JA & Darie CC (2013) Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics 13, 538–57.
123
155 Ashcroft AE (2005) Recent developments in electrospray ionisation mass spectrometry: noncovalently bound protein complexes. Nat. Prod. Rep. 22, 452–64. 156 Ancelin ML & Vial HJ (1989) Regulation of phosphatidylcholine biosynthesis in Plasmodium-infected erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta 1001, 82–9. 157 Wein S, Maynadier M, Bordat Y, Perez J, Maheshwari S, Bette-Bobillo P, Tran Van Ba C, Penarete-Vargas D, Fraisse L, Cerdan R & Vial H (2012) Transport and pharmacodynamics of albitiazolium, an antimalarial drug candidate. Br. J. Pharmacol. 166, 2263–2276. 158 Wähnert U (2007) H. J. FROMM, Initial Rate Enzyme Kinetics (Reihe: Molecular Biology, Biochemistry and Biophysics, Vol. 22). X, 321 S., 88 Abb., 19 Tab. Berlin-Heidelberg-New York 1975: Springer-Verlag. DM 78,00. Z. Allg. Mikrobiol. 17, 327–328. 159 Brown A (2009) Analysis of cooperativity by isothermal titration calorimetry. Int. J. Mol. Sci. 10, 3457–3477. 160 Christensen T, Gooden DM, Kung JE & Toone EJ (2003) Additivity and the physical basis of multivalency effects: a thermodynamic investigation of the calcium EDTA interaction. J. Am. Chem. Soc. 125, 7357–66. 161 Moore JP, Smith GA, Hesketh TR & Metcalfe JC (1983) The bivalent-cation dependence of phosphatidylinositol synthesis in a cell-free system from lymphocytes. Biochem. J. 212, 691–697. 162 Young Seo Park, Sweitzer TD, Dixon JE & Kent C (1993) Expression, purification, and characterization of CTP:glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase from Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 268, 16648–16654. 163 Sundler R (1975) Ethanolaminephosphate cytidylyltransferase. Purification and characterization of the enzyme from rat liver. J. Biol. Chem. 250, 8585–8590. 164 Kapustina M, Weinreb V, Li L, Kuhlman B & Carter CW (2007) A conformational transition state accompanies tryptophan activation by B. stearothermophilus tryptophanyl-tRNA synthetase. Structure 15, 1272–84. 165 Serrano A, Frago S, Velázquez-Campoy A & Medina M (2012) Role of key residues at the flavin mononucleotide (FMN): Adenylyltransferase catalytic Site of the bifunctional Riboflavin kinase/flavin adenine dinucleotide (FAD) synthetase from Corynebacterium ammoniagenes. Int. J. Mol. Sci. 13, 14492– 14517.
124
166 Perona JJ, Rould MA & Steitz TA (1993) Structural basis for transfer RNA aminoacylation by Escherichia coli glutaminyl-tRNA synthetase. Biochemistry 32, 8758–8771. 167 Frieden C (1976) On the kinetic distinction of ordered and random bireactant enzyme systems. Biochem. Biophys. Res. Commun. 68, 914–7. 168 Kwak B-Y, Zhang Y-M, Yun M, Heath RJ, Rock CO, Jackowski S & Park H-W (2002) Structure and mechanism of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (LicC) from Streptococcus pneumoniae. J. Biol. Chem. 277, 4343–50. 169 Yuan C & Kent C (2004) Identification of critical residues of choline kinase A2 from Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 279, 17801–9. 170 Ordentlich A, Barak D, Kronman C, Ariel N, Segall Y, Velan B & Shafferman A (1995) Contribution of aromatic moieties of tyrosine 133 and of the anionic subsite tryptophan 86 to catalytic efficiency and allosteric modulation of acetylcholinesterase. J. Biol. Chem. 270, 2082–91. 171 Martin SF, Follows BC, Hergenrother PJ & Trotter BK (2000) The choline binding site of phospholipase C (Bacillus cereus): insights into substrate specificity. Biochemistry 39, 3410–5. 172 Jogl G & Tong L (2003) Crystal structure of carnitine acetyltransferase and implications for the catalytic mechanism and fatty acid transport. Cell 112, 113–22. 173 Green KD, Porter VR, Zhang Y & Garneau-Tsodikova S (2010) Redesign of cosubstrate specificity and identification of important residues for substrate binding to hChAT. Biochemistry 49, 6219–27. 174 Campanacci V, Mukherjee S, Roy CR & Cherfils J (2013) Structure of the Legionella effector AnkX reveals the mechanism of phosphocholine transfer by the FIC domain. EMBO J. 32, 1469–77. 175 Bartlett GJ, Borkakoti N & Thornton JM (2003) Catalysing new reactions during evolution: Economy of residues and mechanism. J. Mol. Biol. 331, 829– 860. 176 Galperin MY & Koonin E V. (2012) Divergence and convergence in enzyme evolution. J. Biol. Chem. 287, 21–28. 177 Schärer K, Morgenthaler M, Paulini R, Obst-Sander U, Banner DW, Schlatter D, Benz J, Stihle M & Diederich F (2005) Quantification of cation-pi interactions in protein-ligand complexes: crystal-structure analysis of Factor 125
Xa bound to a quaternary ammonium ion ligand. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44, 4400–4. 178 Schneider H-J (2009) Binding mechanisms in supramolecular complexes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 3924–77. 179 Schiefner A, Breed J, Bösser L, Kneip S, Gade J, Holtmann G, Diederichs K, Welte W & Bremer E (2004) Cation-pi interactions as determinants for binding of the compatible solutes glycine betaine and proline betaine by the periplasmic ligand-binding protein ProX from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 279, 5588–96. 180 Kruse AC, Hu J, Pan AC, Arlow DH, Rosenbaum DM, Rosemond E, Green HF, Liu T, Chae PS, Dror RO, Shaw DE, Weis WI, Wess J & Kobilka BK (2012) Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor. Nature 482, 552–6. 181 Ressl S, Terwisscha van Scheltinga AC, Vonrhein C, Ott V & Ziegler C (2009) Molecular basis of transport and regulation in the Na(+)/betaine symporter BetP. Nature 458, 47–52. 182 Olsen JA, Balle T, Gajhede M, Ahring PK & Kastrup JS (2014) Molecular recognition of the neurotransmitter acetylcholine by an acetylcholine binding protein reveals determinants of binding to nicotinic acetylcholine receptors. PLoS One 9, e91232. 183 Yun M, Wu J, Workman JL & Li B (2011) Readers of histone modifications. Nat. Publ. Gr. 21, 564–578. 184 Lu R & Wang GG (2013) Tudor: A versatile family of histone methylation “readers.” Trends Biochem. Sci. 38, 546–555. 185 Dougherty DA & Stauffer DA (1990) Acetylcholine binding by a synthetic receptor: implications for biological recognition. Science 250, 1558–60. 186 Harel M, Schalk I, Ehret-Sabatier L, Bouet F, Goeldner M, Hirth C, Axelsen PH, Silman I & Sussman JL (1993) Quaternary ligand binding to aromatic residues in the active-site gorge of acetylcholinesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 9031–9035. 187 Zacharias N & Dougherty DA (2002) Cation-pi interactions in ligand recognition and catalysis. Trends Pharmacol. Sci. 23, 281–7. 188 Hermoso JA, Lagartera L, González A, Stelter M, García P, Martínez-Ripoll M, García JL & Menéndez M (2005) Insights into pneumococcal pathogenesis 126
from the crystal structure of the modular teichoic acid phosphorylcholine esterase Pce. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 533–8. 189 Mukherjee S, Liu X, Arasaki K, McDonough J, Galán JE & Roy CR (2011) Modulation of Rab GTPase function by a protein phosphocholine transferase. Nature 477, 103–106. 190 Zeng X-F, Ma Y, Yang L, Zhou L, Xin Y, Chang L, Zhang J-R & Hao X (2014) A C-terminal truncated mutation of licC attenuates the virulence of Streptococcus pneumoniae. Res. Microbiol. 165, 630–638. 191 Tousoulis D, Bakogiannis C, Briasoulis A, Papageorgiou N, Androulakis E, Siasos G, Latsios G, Kampoli A-M, Charakida M, Toutouzas K & Stefanadis C (2013) Targeting myocardial metabolism for the treatment of stable angina. Curr. Pharm. Des. 19, 1587–92. 192 Biancotto C, Frigè G & Minucci S (2010) Histone modification therapy of cancer. 193 Anghelescu I & Heuser I (2007) [Acetylcholinesterase inhibitors for dementia-an update]. MMW Fortschr. Med. 149 Suppl, 76–8. 194 Yang YR, Follo MY, Cocco L & Suh PG (2013) The physiological roles of primary phospholipase C. Adv. Biol. Regul. 53, 232–241. 195 Payne F, Lim K, Girousse A, Brown RJ, Kory N, Robbins A, Xue Y, Sleigh A, Cochran E, Adams C, Dev Borman A, Russel-Jones D, Gorden P, Semple RK, Saudek V, O’Rahilly S, Walther TC, Barroso I & Savage DB (2014) Mutations disrupting the Kennedy phosphatidylcholine pathway in humans with congenital lipodystrophy and fatty liver disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 8901–6. 196 Mohamed T & P.N. Rao P (2011) Alzheimer’s Disease: Emerging Trends in Small Molecule Therapies. Curr. Med. Chem. 18, 4299–4320. 197 Haga K, Kruse AC, Asada H, Yurugi-Kobayashi T, Shiroishi M, Zhang C, Weis WI, Okada T, Kobilka BK, Haga T & Kobayashi T (2012) Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature 482, 547–51. 198 Vale RD (1996) Switches, latches, and amplifiers: common themes of G proteins and molecular motors. J. Cell Biol. 135, 291–302. 199 Sanson B, Colletier J-P, Xu Y, Lang PT, Jiang H, Silman I, Sussman JL & Weik M (2011) Backdoor opening mechanism in acetylcholinesterase based on X127
ray crystallography and molecular dynamics simulations. Protein Sci. 20, 1114–8. 200 Gruez A, Roig-Zamboni V, Grisel S, Salomoni A, Valencia C, Campanacci V, Tegoni M & Cambillau C (2004) Crystal structure and kinetics identify Escherichia coli YdcW gene product as a medium-chain aldehyde dehydrogenase. J. Mol. Biol. 343, 29–41. 201 Díaz-Sánchez ÁG, González-Segura L, Mújica-Jiménez C, Rudiño-Piñera E, Montiel C, Martínez-Castilla LP & Muñoz-Clares RA (2012) Amino acid residues critical for the specificity for betaine aldehyde of the plant ALDH10 isoenzyme involved in the synthesis of glycine betaine. Plant Physiol. 158, 1570–82. 202 Punta M, Coggill PC, Eberhardt RY, Mistry J, Tate J, Boursnell C, Pang N, Forslund K, Ceric G, Clements J, Heger A, Holm L, Sonnhammer ELL, Eddy SR, Bateman A & Finn RD (2012) The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res. 40, D290–301.
128
7. Közlemények listája 7.1. A doktori értekezés témájához kapcsolódó originális közlemények 1. Takács E*, Nagy G*, Leveles I, Harmat V, Lopata A, Tóth J, Vértessy BG; Direct contacts between conserved motifs of different subunits provide major contribution to active site organization in human and mycobacterial dUTPases, FEBS Lett. 2010 Jul 16;584(14):3047-54. *: megosztott első szerzők 2. Nagy GN#, Marton L, Krámos B, Oláh J, Révész Á, Vékey K, Delsuc F,
Hunyadi-Gulyás É, Medzihradszky KF, Lavigne M, Vial H, Cerdan R, Vértessy BG#; Evolutionary and mechanistic insights into substrate and product accommodation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase from Plasmodium falciparum , FEBS J. 2013 Jul;280(13):3132-48. #: levelező szerzők 3. Nagy GN#, Marton L, Contet A, Ozohanics O, Ardelean LM, Révész A, Vékey K, Irimie FD, Vial H, Cerdan R, Vértessy BG# Composite aromatic boxes for enzymatic transformations of quaternary ammonium substrates, Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Dec 1;53(49):13471-6. #: levelező szerzők
129
7.2. További közlemények 1. Nagy GN#, Leveles I, Vértessy BG#; Preventive DNA repair by sanitizing the cellular (deoxy)nucleoside triphosphate pool, FEBS J. 2014 Sep;281(18):4207-23. #: levelező szerzők
2. Róna G, Pálinkás HL, Borsos M, Horváth A, Scheer I, Benedek A, Nagy GN, Zagyva I, Vértessy BG.;NLS copy number variation governs efficiency of nuclear import: case study on dUTPases, FEBS J. 2014 Dec;281(24):5463-78. 3. Chiş L, Hriscu M, Bica A, Toşa M, Nagy G, Róna G, G Vértessy B, Dan Irimie F; Molecular cloning and characterization of a thermostable esterase/lipase produced by a novel Anoxybacillus flavithermus strain, J Gen Appl Microbiol. 2013;59(2):119-34.
7.3. Konferencia előadások 7.3.1. Konferencián tartott szóbeli előadások (előadó neve aláhúzva) 1.) GN.Nagy, L. Marton, B. Vértessy; Composite aromatic box: structural motif for binding and enzyme-catalyzed conversion of quaternary ammonium substrates; A Magyar Biokémiai Egyesület éves vándorgyűlése, Debrecen (2014) 2.) G. N. Nagy, B. G. Vértessy; Investigation of catalytic properties of a key lipid biosynthesis enzyme from the malaria parasite; Hungarian Molecular Life Sciences Conference Siófok, Hungary (2013) 3.) G. N. Nagy, B. G. Vértessy; A Plasmodium falciparum CCT szerkezeti vizsgálata, kolin kölcsönhatás, ligand kötés és enzim katalízis; XVIIth. Nemzetközi Vegyészkonferencia, Kolozsvár, Románia (2011)
130
4.) G.N. Nagy, E. Takács, A. Lopata, I. Leveles, V. Harmat, J. Tóth, B. G. Vértessy; Interaction of conserved motifs from different subunits establish optimal catalytic efficiency of trimeric dUTPases; A Magyar Biokémiai Egyesület éves vándorgyűlése, Budapest (2009)
7.3.2. Konferencián tartott poszter előadások (előadó neve aláhúzva) 1.) A. Contet, S. Maheshwari, E Pihan, G. N. Nagy, B. Vertessy, H. Vial, D. .Douguet, R. Cerdan; Insights into the catalytic mechanism of PfECT by thermodynamic, kinetic and structural analyses; FEBS-EMBO conference, Paris, France, (2014) 2.) I. Leveles, G. N.Nagy, B. Vértessy; Preventive DNA repair by sanitizing the cellular (deoxy)nucleoside triphosphate pool; A Magyar Biokémiai Egyesület éves vándorgyűlése, Debrecen (2014) 3.) G. N. Nagy, L. Marton, B. Vértessy; Cation-π Interaction in Enzyme Catalysis on Quaternary Ammonium Substrates: the Composite Aromatic Box (poster presentation); EMBO Enzyme Mechanisms by Biological Systems Conference, Manchester, UK (2014) 4.) L. Marton, G.N. Nagy, B. Vertessy; Plasmodium falciparum CTP:phosphocholine cytidylyltransferase localisation studies in mammalian cell lines (poster presentation); 44th Membrán Transzport Konferencia, Sümeg (2014) 5.) G. N. Nagy, L. M. Chis, L. Marton, A. N. Varga, S. Maheshwari, B. Kramos, J. Olah, F. D. Irimie, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Spotlight on two characters on stage: role of a conserved aromatic residue and Mg2+ cofactor in the mechanism of P. falciparum CCT; EMBO Catalytic Mechanisms by Biological Systems Conference, Groningen, the Netherlands (2012) 6.) G. N. Nagy, L. M. Chis, L. Marton, A. N. Varga, S. Maheshwari, B. Kramos, J. Olah, F. D. Irimie, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Exploring the mechanism of P. falciparum CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (CCT): The role of a conserved aromatic residue and Mg2+ cofactor; EMBO Chemical Biology Conference, Heidelberg, Germany (2012)
7.) G. N. Nagy, Á. N. Varga, L. M. Chis, B.Krámos, J. Oláh, S. Maheshwari, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy ; Cation-πinteraction determines efficiency of CTP: 131
phosphocholine cytidylyltransferase from Plasmodium falciparum; ”From molecules to life and back” FEBS 3+ meeting, Opatija, Croatia (2011) 8.) G. N. Nagy, Á. N. Varga, L. M. Chis, B.Krámos, J. Oláh, S. Maheshwari, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Cation-π interaction determines efficiency of CTP: phosphocholine cytidylyltransferase from Plasmodium falciparum; Straub Napok Konferencia, Szeged (2011) 9.) G. N. Nagy, Á. N. Varga, S. Maheshwari, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Mechanism of action of Plasmodium falciparum CTP:phosphocholine cytidylyltransferase ; 3rd EMBO Meeting, Bécs, Ausztria (2011) 10.) G. N. Nagy, S. Maheshwari, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Investigating the structural basis of regulation and catalysis of CCT enzyme from Plasmodium falciparum; 4th European Conference on Chemistry for Life Sciences, Budapest (2011) 11.) G. N. Nagy, S. Maheshwari, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Role of cation -π interaction in ligand binding and catalytic efficiency: structural investigations of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase enzyme from Plasmodium falciparum; A Magyar Biokémiai Egyesület éves vándorgyűlése, Pécs (2011) 12.) G. N. Nagy, S. Maheshwari, R. Cerdan, H. Vial, B. G. Vértessy; Structural investigations of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase enzyme from Plasmodium falciparum (poster presentation); Oláh György Doktoráns Konferencia, Budapest (2011)
132
8. Függelék 8.1. Röntgen-krisztallográfiai mérések, illetve a modellépítés és finomítás statisztikai adatai
Crystallographic data collection and refinement statistics Enzyme MtDUTD28N Accession code PDB ID: 3H6D Space group P63 Cell parameters a,c (Å) 55.23, 83.65 Data collection Wavelength (Å) 0.97861 Resolution (Å) 20.0-1.80 (1.85-1.80)b Measured reflections 45296 (2517) Unique reflections 13348 (992) Redundancy 3.39 (2.54) Completeness (%) 99.0 (99.2) < I/σ(I)> 14.58 (2.41) Rmeasa 0.069 (0.471) Refinement statistics Resolution (Å) 19.16 −1.80 Non-hydrogen atoms 1203 Water molecules 89 c R.M.S. deviation bond (Å) 0.015 c R.M.S. deviation angles (°) 1.741 d Rwork 0.158 d,e Rfree 0.207 Values in parentheses correspond to the highest resolution shell. a Rmeas=Σh{(n/(n − 1))0.5Σj|
−Ihj|}/ΣhjIhj with = (ΣjIhj)/nj. b values for the highest resolution shell in parenthesis. c Root mean square deviation from ideal/target. d Rwork,free = Σh||Fobs|− |Fcalc||/ Σh|Fobs|. e Rfreevalues are calculated for a randomly selected 5% of the data that was excluded from the refinement.
133
8.2. PfCCT konstruktok tömegspektruma
134
36. ábra A PfCCT MΔK pontmutáns fehérjék natív elektrospray körülmények között felvett tömegspektruma. Az ábrán M és D amonomer illetve dimer jeleket, míg a felső indexükben jelölt számok töltöttségi állapotukat jelzik. A PfCCT MΔK pontmutációk típusa az ábrák jobb felső sarkában vannak jelölve, WT: PfCCT MΔK vad típusú konstrukt.
135
8.3. Összetett aromás doboz felépítésű enzim aktív helyek
37. ábra Összetett aromás doboz felépítésű enzim aktív helyek. További példák mutatják az enzimek kvaterner-ammónium ligand kötésének általánosan elterjedt szerkezeti megoldását.Az ábrán egyetlen jellemző példa található a Pfam [202] annotációk alapján minden olyan fehérje evolúciós klánból, melyhez kvaterner-ammónium csoportot tartalmazó szubsztráttal vagy termékkel komplexált fehérje szerkezet tartozik a PDB adatbázisban. A legjobb felbontású ligandumot kötő szerkezetek aktív helyét mutatjuk. A jobb átláthatóság kedvéért a megfelelő ligand molekuláknak csak a kvaterner-ammónium csoportja látható (pálcika modell, atomi színezés: szén: zöld, nitrogén, kék). A különböző típusú fehérjeligandum kölcsönhatásokat eltérő színkóddal jeleztük, a poláris, elektrosztatikus, illetve a kation-π kölcsönhatást biztosító oldalláncok rendre kék illetve sárga szénatommal láthatóak. A fehérje oldallánc és a ligandum relatív elhelyezkedését a kvaterner-ammónium nitrogén atom és a hozzá legközelebb álló oldallánc atom távolságával jellemeztük. A) Betain aldehid dehidrogenáz, PDB kód: 1WNB; B) JMJD2D lizin demetiláz, PDB kód: 4HON; C) RuBisCO LSMT, PDB kód: 2H23; D) Foszfokolin transzferáz (AnkX), PDB kód: 4BES; E) Kronobetainil-CoA:karnitin CoA transzferáz (CaiB), PDB kód: 1XVV; F) 4-hidroxiprolin betain 2-epimeráz, PDB kód: 4J1O; G) Teichoic sav foszforilkolin észteráz (CbpE), PDB kód: 2BIB.
136
8.4. Aromás doboz típusú ligand felismerő helyek receptor fehérjékben
137
38. ábra Aromás doboz típusú ligand felismerő helyek receptor fehérjékben Tovább szerkezeti példák igazolják, hogy az aromás doboz egy általánosan elterjedt receptor típusú kvaterner-ammónium ligand felismerő hely. Receptor funkciót állapítottunk meg enzimek esetén is, ha azok a megfelelő kvaterner-ammónium ligandokat allosztérikus módon kötötték. A fehérjék ligand kötőhelyét ábrázoltuk, a job átláthatóság kedvéért a megfelelő ligand molekuláknak csak a kvaterner-ammónium csoportja látható (pálcika modell, atomi színezés: szén: zöld, nitrogén, kék). A különböző típusú fehérje-ligandum kölcsönhatásokat eltérő színkóddal jeleztük, a poláris illetőleg elektrosztatikus, valamint a kation-π kölcsönhatást biztosító oldalláncok rendre kék illetve sárga szénatommal láthatóak. A) M3 muszkarinos acetilkolin receptor, PDB kód: 4DAJ; B) Citokróm b-c1, PDB kód: 1SQP; C) Ondóplazma fehérje (PDC-109), PDB kód: 1H8P; D) Koagulációs factor X (Factor X) PDB kód: 2JKH; E) Polycomb fehérje EED, PDB kód: 3K26; F) Transzkripciós szabályzó, C7MT25, PDB kód: 4KWA; G) Nukleoszóma átalakító (remodeling) factor alegység (BPTF), PDB kód: 2F6J; H) CRAL-TRIO domént tartalmazó fehérje, PDB kód: 3B7Z; I) Kolint kötő fehérje F (CbpF), PDB kód: 2V05; J) Foszfatidilkolin transzfer fehérje (PC-TP), PDB kód: 1LN1; K) Glicin betain transzporter (BetP), PDB kód: 4AIN; L) Spindlin-1 (SPIN1), PDB kód: 4H75; M) Acetilkolin-kötő fehérje (AchBP), PDB kód: 1UV6; N) SAGA-kapcsolt faktor 29 homológ, (SGF-29), PDB kód: 3MEA; O) Cink ujj CW-típusú PWWP domén fehérje 1, PDB kód: 2RR4; P) Ig λ1 lánc V, PDB kód:1DL7.
138
8.5. Összetett aromás doboz felépítésű enzim kötő helyek Enzim
E.C. #
Fehérje család
Evolúciós fehérje klán (Pfam)
Ligand
PDB kód
Felbontás (Å)
Betain-aldehid-dehidrogenáz (BALDH)
1.2.1.8
Aldedh (PF00171)
ALDH-like (CL0099)
betain aldehid
1WNB
2,20
JMJD2D lizin demetiláz
1.14.11
Cupin (CL0029)
trimetillizin
4HON
1,80
Hiszton-lizin N-metiltranszferáz MLL5
2.1.1.43
MORN (CL0251)
trimetillizin
4L58
1,48
RuBisCO LSMT
2.1.1.127
Rubis-subs-bind (PF09273)
n/a
trimetillizin
2H23
2,45
2.7.7.15
NTP_transferase (PF00483)
GT-A (CL0110)
CDP-kolin
1JYL
2,40
2.7.7.15
CTP_transf_2 (PF01467)
HUP (CL0039)
CDP-kolin
3HL4
2,20
Karnitin O-acetiltranszferáz (CrAT)
2.3.1.7
Carn_acyltransf (PF00755)
CoA-acyltrans (CL0149)
karnitin
1S5O
1,80
Foszfokolin transzferáz, AnkX
2.7.1.-
Ank (CL0465)
kolin-foszfát
4BES
2,54
Kolin-kináz (Ck)
2.7.1.32
PKinase (CL0016)
kolin
3C5I
2,20
Kronobetainil-CoA:karnitin CoA transzferáz (CaiB)
2.8.3.-
n/a
karnitinil-CoA
1XVV
2,40
Acetilkolinészteráz (AchE)
3.1.1.7
COesterase (PF00135)
AB_hydrolase (CL0028)
kolin
2HA3
2,25
Foszfolipáz C (PLC)
3.1.4.3
Zn_dep_PLPC (PF00882)
PhosC-NucP1 (CL0368)
foszfatidilkolin 1P6D
2,00
MR_MLE (PF0118) MR_MLE_N (PF02746) Lactamase_B (PF00753)
Enolase_TIM (CL0256), Enolase_N (CL0227) Metallo-HOrase (CL0381)
l-prolin betain
4J1O
1,60
kolin-foszfát
2BIB
1,92
CTP:foszfokolin citidililtranszferáz (LicC)[a] CTP:foszfokolin citidililtranszferáz (CCT)[a]
4-hidroxiprolin betain 2-epimeráz (Hyp-B 2-epimerase) Teichoic sav foszforilkolin észteráz /kolin kötő fehérje E (CbpE)
5.1.1.n/a
JmjC (PF02373) JmjN (PF02375) MORN (PF02493) SET (PF00856)
Fic (PF02661), Ank_2 (PF12796) Choline_kinase (PF01633) CoA_transf_3 (PF02515)
14. táblázat Összetett aromás doboz felépítésű enzim kötőhelyek. A táblázat egy jellemző képiselőt tartalmaz minden vonatkozó Pfam fehérje evolúciós klánból. [a] Ezek analóg enzimek, melyek ugyanazt a reakciót katalizálják, azonban nincsenek evolúciós rokonságban.
139
8.6. Aromás doboz felépítésű receptor kötő helyek Receptorok[a]
Fehérje-család
Evolúciós fehérje klán (Pfam) Ligand
M3 muszkarinos acetilkolin receptor (M3 mAChR)
7_tm (PF00001)
GPCR_A (CL0192)
tiotrópium
4DAJ
3,40
Citokróm b-c1
Cytochrome b N_2 (PF00032)
2heme_cytochrom (CL0328)
foszfatidilkolin
1SQP
2,70
Ondóplazma fehérje (PDC-109)
fn_2 (PF00040)
n/a
kolin-foszfát
1H8P
1,82
Polycomb fehérje EED (EED)
WD40 (PF00400)
Beta_propeller (CL0186)
trimetillizin
3K26
1,58
Transzkripciós szabályzó, C7MT25
tetR (PF00440)
HTH (CL0123)
kolin
4KWA
1,80
Nukleoszóma átalakító-faktor alegység (BPTF)
PHD (PF00628)
zf_FYVE_PHD (CL0390)
trimetillizin
2F6J
2,00
CRAL-TRIO domént tartalmazó fehérje (YKL091C)
CRAL_TRIO (PF00650)
CRAL_TRIO (CL0512)
foszfatidilkolin
3B7Z
2,03
Kolint kötő fehérje F (CbpF)
CW_binding_1(PF01473)
n/a
kolin
2V05
1,67
Foszfatidilkolin transzfer fehérje (PC-TP)
START (PF01852)
Bet_V_1_like (CL0209)
foszfatidilkolin
1LN1
2,40
Glicin/betain transzporter (BetP)
BCCT (PF02028)
n/a
betain
4AIN
3,10
Spindlin-1 (SPIN1)
Spin-Ssty (PF02513)
n/a
trimetillizin
4H75
2,1
Acetilkolin-kötő fehérje (AchBP)
Neur_chan_LBD (PF02931)
n/a
karbamoil-kolin
1UV6
2,50
Glicin betain-kötő periplazmás fehérje (proX)
OpuAC (PF04069)
PBP (CL0177)
betain
1R9L
1,59
SAGA-kapcsolt faktor 29 homológ, (SGF-29)
DUF1325 (PF07039)
Tudor (CL0049)
trimetillizin
3MEA
1,26
zf-CW (PF07496)
n/a
trimetillizin
2RR4
(NMR)
V-set (PF07686)
Ig (CL0011)
kolin-foszfát
1DL7
2,35
Cink ujj CW-típusú PWWP domén fehérje 1 (ZCWPW1) Fv egyláncú antitest
PDB kód Felbontás (Å)
15. táblázat Aromás doboz felépítésű receptor kötő helyek. A táblázat egy jellemző képiselőt tartalmaz minden vonatkozó Pfam fehérje evolúciós klánból.[a] Receptor funkciót azonosítottunk a megfelelő ligandot allosztérikusan kötő enzim esetén is.
140
NYILATKOZAT
Alulírott Nagy Gergely Nándor kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos tartalommal, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával jelöltem.
Budapest, 2015. május 31.
……………….…………………….. Nagy Gergely Nándor
141
