Flowcytometrie bij PNH PNH is het gevolg van een genetische verandering in een bloedstamcel. Als gevolg hiervan ontbreken bij afstammelingen van deze cel bepaalde eiwitten. Deze eiwitten hebben gemeenschappelijk, dat ze allemaal op dezelfde manier aan het celmembraan bevestigd zijn, namelijk met het zogenaamde GPI-anker. Het ontbreken van deze GPI-verankerde eiwitten (GPI-deficiëntie) wordt tegenwoordig aangetoond met behulp van een flowcytometer.
Flowcytometer
Welke cellen worden gemeten? Bij verdenking en follow-up van de ziekte PNH wordt altijd een buisje bloed afgenomen. Bloed bestaat uit een dragende vloeistof (plasma) met daarin drie typen cellen: • Rode bloedcellen of erytrocyten die belangrijk zijn voor zuurstoftransport. • Witte bloedcellen of leukocyten die zorgen voor afweer (immuniteit). Hiervan zijn verschillende variëteiten: o Monocyten o Granulocyten o Lymfocyten • Bloedplaatjes of trombocyten die belangrijk zijn voor de bloedstolling. De monocyten, granulocyten en erytrocyten worden bij de vraagstelling PNH met behulp van de flowcytometer bekeken.
Hoe worden cellen herkend? Elke cel is omgeven door een membraan, die de grens vormt tussen de binnenen buitenkant van de cel. Contact van de cel met zijn omgeving vindt plaats door middel van vele eiwitten, die aan dit membraan gebonden zijn. Tegen deze eiwitten, ook wel antigenen genoemd, kunnen antistoffen gemaakt worden. Er zijn inmiddels in het laboratorium duizenden van deze antistoffen gemaakt, gericht tegen de verschillende eiwitten. Om enige orde te scheppen worden antistoffen die een zelfde eiwit herkennen ingedeeld in “clusters of differentiation” (afgekort als CD). Elk cluster krijgt een volgnummer en er zijn al meer dan 330 clusters gedefinieerd. In veel gevallen is ook het eiwit waarmee de antistoffen uit een bepaald cluster reageren, biochemisch gekarakteriseerd en vaak is zelfs de functie bekend. Een dergelijk eiwit wordt aangeduid met de naam van de antistof, gevolgd door het woord antigeen. Zo reageert de antistof CD55 met het CD55 antigeen, een molecuul dat een rol speelt bij complementactivatie. Het vaststellen van dit soort eiwitten wordt immunologische typering of immunofenotypering genoemd en speelt een belangrijke rol bij de classificatie van bloedziekten. Om de binding van een antistof aan een antigeen zichtbaar te maken, wordt gebruik gemaakt van fluorescentie. Hierbij wordt een fluorochroom aan een antistof gebonden. Een fluorochroom is simpel gezegd een soort lampje wat gaat branden wanneer er licht op valt van een bepaalde golflengte. Wanneer het door het fluorochroom uitgezonden licht gedetecteerd kan worden, heeft de binding tussen antigeen en antistof plaatsgevonden en is het bewijs geleverd dat het eiwit op de cel aanwezig is.
De met een fluorochroom gelabelde antistof wordt in contact gebracht met de cellen
+
De antistof gaat een binding aan met het antigeen op de cel
Het fluorochroom gaat “branden” wanneer er licht van een bepaalde golflengte op valt
LASER-LICHT
Figuur 1. Antigeen-antistof binding
Vroeger werd voor deze techniek een microscoop gebruikt, maar tegenwoordig is de flowcytometer het meest gebruikte apparaat. Deze fungeert hierbij als lichtbron en is tevens in staat het door de fluorochromen uitgezonden licht te detecteren.
De te onderzoeken cellen, die tevoren gekleurd zijn met één of meer fluorescerend gelabelde antistoffen, stromen één voor één door de meetkamer. Aan de ene zijde valt laserlicht op de meetkamer en onder een rechte hoek wordt het uittredend licht, dat afkomstig is van aan de cellen gebonden fluorochromen, gedetecteerd. Verder wordt ook de verstrooiing van het laserlicht gemeten. Hierdoor wordt informatie verkregen over de grootte (voorwaartse lichtverstrooiing of FSC) en de interne structuur (zijwaartse lichtverstrooiing of SSC) van de cel. Als men bijvoorbeeld zes verschillend gelabelde antistoffen gebruikt, kunnen op deze manier acht eigenschappen van een cel geanalyseerd worden: de aan- of afwezigheid van zes verschillende antigenen, de grootte en de interne structuur. Het voordeel van een flowcytometer is dat in zeer korte tijd een groot aantal cellen kan worden gemeten (tot wel 10.000 cellen per seconde). Ook zwakke signalen zijn objectief en reproduceerbaar te meten. Na de meting moeten de cellen nog geanalyseerd worden. Meestal begint de analyse door met behulp van de FSC en SSC karakteristieken een indeling te maken in lymfocyten, monocyten en granulocyten. Deze populaties verschillen zodanig van grootte en interne structuur dat er een duidelijke verdeling te zien is. De populatie welke verder onderzocht moet worden (bijvoorbeeld de granulocyten), kan gemarkeerd en daarna verder getypeerd worden. Bij gebruik van meerkleurenfluorescentie (meerdere gelabelde antistoffen tegelijkertijd toevoegen) is het erg informatief om de fluorescentiesignalen tegen elkaar uit te zetten. Men kan dan meteen zien welk percentage van cellen geen, één of meer van de onderzochte antigenen bezit. Voorbeeld van een PNH analyse Bij een vraagstelling PNH worden op de afdeling Immunologie van het Erasmus MC de volgende twee kleuringen ingezet: 1. Kleuring voor het detecteren van GPI-deficiënte granulocyten en monocyten. Deze bestaat uit FLAER-AF488, CD24-PE, CD45-PerCP, CD33-APC en CD14-APC-H7. 2. Kleuring voor de detectie van GPI-deficiënte erytrocyten. Hiervoor worden CD55-FITC en CD59-PE gebruikt. In buis 1 worden vier antistoffen gebruikt die allemaal met een ander fluorochroom (cursief gedrukt) gelabeld zijn. FLAER is in feite geen antistof maar een bacterieel product wat rechtstreeks aan een GPI-anker kan binden. In buis 2 worden twee antistoffen gebruikt. Voor de eerste kleuring worden aan 100 microliter bloed de verschillende antistoffen toegevoegd. Na 10 minuten worden de rode bloedcellen verwijderd en kunnen de witte bloedcellen gemeten worden. Voor de tweede kleuring worden aan 5 microliter bloed de antistoffen toegevoegd. Omat we hier juist de erytrocyten willen meten worden deze niet verwijderd en kan na een wasstap gelijk gemeten worden.
Het analyseprogramma op de computer biedt de mogelijkheid de gemeten cellen op verschillende manieren te bestuderen. De meest gebruikte weergave is een zogenaamde dot-plot. Dit is een twee dimensionale weergave (x,y-richting) waarbij een cel die de laser gepasseerd is wordt weergegeven als een stip (dot). Die figuren die hierna getoond worden zijn allemaal dot-plots. De eerste stap van de analyse vindt plaats door het zetten van een CD45/FCS regio. Hierin bevinden zich de witte bloedcellen waarin we geïnteresseerd zijn (Zie Figuur 2). Binnen deze regio wordt CD33 gebruikt om onderscheid te maken tussen de monocyten en granulocyten. De monocyten bezitten meer CD33 antigenen dan de granulocyten en binden daarom meer van de CD33 antistof. Hierdoor liggen de monocyten verder naar rechts (Zie figuur 3). De lymfocyten (rode populatie) kleuren niet aan met CD33, zij missen dit antigeen. Opmerking: de kleur van de getoonde populaties heeft niets te maken met de kleur van de fluorescentie, maar wordt bij de analyse ter verduidelijking aan de cellen toegekend.
Figuur 2.
Figuur 3.
Binnen de vastgestelde regio’s wordt vervolgens bepaald of er GPI-deficiënte cellen aanwezig zijn. Binnen de monocyten-regio (MONO) wordt hiervoor gekeken naar de aanwezigheid van het GPI-gebonden CD14 antigeen en de positiviteit voor FLAER. Gezonde monocyten bezitten het anker en kleuren dus aan met de CD14 antistof en zijn dus ook FLAER positief. Deze dubbel positieve cellen kleuren zowel in de x-richting (CD14) als in de y-richting (FLAER) aan. Dit is de groene populatie die rechtsboven ligt. PNH monocyten zijn CD14 en FLAER negatief. Dit is de paarse populatie die linksonder ligt (Zie figuur 4). Binnen de granulocyten-regio (GRAN) worden FLAER en CD24 (GPI-gebonden) gebruikt voor de detectie van GPI-deficiënte granulocyten. De granulocyten die niet aangedaan zijn liggen rechtsboven en zijn hier blauw gekleurd. De paarse cellen die linksonder liggen worden beschouwd als GPI-deficiënt (Zie figuur 5).
Bij mensen die de ziekte PNH niet hebben ontbreekt dus de paarse populatie.
Figuur 4.
Figuur 5.
Bij de analyse van de erytrocyten wordt zoals gezegd, gebruik gemaakt van CD55 en CD59. Ook hier liggen de rode bloedcellen die het GPI-anker missen linksonder (dubbel negatief) en zijn paars gekleurd. De normale erytrocyten liggen rechtsboven (Zie figuur 6). Hier is tevens een soort tussenvorm te zien van cellen met een gedeeltelijke aanwezigheid van het GPI-anker (rode populatie). Deze zogenaamde type II erytrocyten zijn overigens niet bij alle patiënten aantoonbaar (Zie figuur 6). In figuur 7 zijn de rode bloedcellen te zien van een patiënt waarbij de ziekte PNH niet is vastgesteld. De volledig en gedeeltelijk deficiënte erytrocyten ontbreken.
Figuur 6.
Figuur 7
Na voltooiing van de analyse wordt de aanwezigheid en de omvang van de deficiënte populatie, ook wel kloongrootte genoemd, aan de arts gerapporteerd. Mei 2010 Erasmus MC, afdeling Immunologie H.K. Wind V.H.J. van der Velden Stichting Contactgroep Leukemie Stichting AA & PNH Contactgroep
