Miért érdekes a szerkezet...? 1023 Atom
Hangya
1 milliméter
Poratka
Biomolekuláris szerkezet
Mikroskála
Emberi hajszál
Vörösvértest, fehérvérsejt
Kellermayer Miklós
Milliskála
Termodinamika
1010 Atom
Látható spektrum
Mezoskála
Nanoskála
103 Atom DNS
101 Atom
Kvantumkémia
Kvantumfizika
Biomolekuláris szerkezet
5 db Si atom
100 Atom
A szerkezetet az anyag elektronmágneses hullámokkal való kölcsöhatásaival vizsgáljuk Elektromágneses hullámok fontos paraméterei
• Diffrakció, interferencia • Röntgen diffrakció, röntgen krisztallográfia • Diffrakció-limitált mikroszkópia • A feloldási határ leküzdése • Polarizáció; CD spektroszkópia • Tömegspektrometria
Amplitudó (A) - Intenzitás ~A2 Periódusidő: egyetlen oszcilláció alatt eltelt idő (“T”). Frekvencia: periódusidő reciproka (f); egy s alatti oszcillációk száma. Terjedési sebesség (“fázis-sebesség”, “v”, “c”) Hullámhossz (λ): egy periódusidő alatt megtett távolság Fáziseltolódás (φ): hullámok ugyanazon pontjai közötti “távolság” (szögben vagy λ egységekben fejezzük ki)
λ = cT =
c f
Röntgen-krisztallográfia
Diffrakció és interferencia Hullámok kölcsönhatásai: konstruktív és destruktív interferencia (erősítés vagy kioltás)
Diffrakció hullámhosszal összemérhető nagyságú rés esetén (=d távolságra levő pontszerű rések, ahol d~λ)
Kristály
Kristály
λ
Rtgnyaláb
Rtg sugárzás
Hullámok fázisban (φ=0): erősítés Mérés
fázisok
Elhajási interferencia mintázat
Ha φ= : kioltás Erősítő interferencia feltétele:
2d sin θ = nλ
Kialakuló interferencia mintázat a pontszerű sugárforrások közötti távolságtól (d) függ
finomítás
2-dimenziós optikai rács elhajlási interferenciaképe
Elektronsűrűség térkép
+1 illesztés
0 Atomi model interferencia maximumok
kis d
-1
nagy d
DNS szerkezet megfejtése röntgenkrisztallográfiával
3D szerkezet
Képalkotás hullámokkal Diffrakciólimitált képalkotás
Képalkotás röntgensugarakkal
Kép (I) Tárgy (optikai rács, O)
Fókuszsík (F)
Rayleigh feltétel
Legkisebb feloldott távolság (Abbé): hélix dőlésszöge bázisok közötti távolság hélix menetemelkedése
Speciális fókuszáló mechanizmusra van szükség
Diffrakció miatt: pontszerű tárgy képe elhajlási korong (Airy disk)
átfedés
d=
0.61λ n sinα
A feloldási határ leküzdése
Képalkotás elektronhullámokkal: az elektronmikroszkóp Sugárforrás: elektronágyú
• Az Abbé-féle képlet paramétereinek javítása (λ csökkentése, N.A. növelése)
Fókuszálás: elektronnyaláb kitérítése mágneslencsével
• Feloldási probléma konvertálása pozicionálási problémává
F = eBVe sin α
• Nem diffrakció-limitált képalkotás
F=elektronra ható erő; e=elektron töltése; B=mágneses térerő; Ve=elektron sebessége; α=optikai tengely és a mágneses tér iránya által bezárt szög
Feloldóképesség:
d=
λ α
d=legkisebb feloldott távolság λ=”de Broglie” hullámhossz α=optikai tengely és a mágneses tér iránya által bezárt szög
de Broglie hullámhosz alapján elméleti d~ 0,005 nm (=5 pm)
Transmissziós elektronmikroszkóp (TEM)
Felbontás és kontraszt az elektronmikroszkópban A. Elméleti feloldóképesség: módosított Abbé-képlet (kis α szögekre) Elektronok sebessége (100000 km/s) alapján d=0.005 nm B.Valódi feloldóképesség: kis NA által limitált, ~0.1 nm. A kis NA miatt azonban “hatalmas” mélységélesség (több μm).
λ d= α
Szuperfelbontású mikroszkópia A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk Feloldási probléma (Abbé-elv)
Pozíciómeghatározási probléma
“Sztochasztikus” adatgyűjtés egyedi fluorofórokról
(pontosság a fotonszámtól függ)
d
d=
0.61λ n sinα
C. Biológiai gyakorlati feloldóképesség: metszetvastagság 1/10-ed része. STORM: “stochastic optical reconstruction microscopy”
D. Kontrasztképződés: elektronszóródás alapján Kontrasztfokozás: elektrondenz festékek használata
Mikrotubulusok
Krio-elektronmikroszkópia, partikulum-analízis képrekonstrukcuó
Adatgyűjtési folyamat
Bekapcsolt fluorofórok 3
Bekapcsolt fluorofórok 1
Bekapcsolt fluorofórok 4
Bekapcsolt fluorofórok 2
Pozíciókból számított kép
Mikrotubuláris rendszer
Nem diffrakció-limitált mikroszkópiák
Polarizáció
Pásztázó tűszondás mikroszkópiák (SPM, AFM)
Pásztázó elektronmikroszkóp
• Polarizáció: kitüntetett irányú rezgés • Kettős törés: anizotróp terjedési sebesség
• Csak a tranzverzális hullámok Oxigén atomok ródium egykristály felületén
polarizálhatók.
Elektromágneses hullámok polarizálása
Polarizátor lemez
“Extinkció”
Síkpolarizált hullám
Polarizátor
“Analizátor”
Polarizáció illusztrálása a terjedési irányból nézve: nanovilág léptéke: 1 nanométer
Cirkulárisan polarizált hullám
Polarizált fény kölcsönhatása az anyaggal Síkpolarizált fény
Síkpolarizált hullám
Polarizálatlan hullám
Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia Elv: L/D cirkulárisan polarizált fény differenciált, hullámhossz-függő elnyelése
•A cirkulárisan polarizált fény elnyelődése függ a rotációs iránytól (L/D) ÉS •A cirkulárisan polarizált fény elnyelődése függ a frekvenciától (hullámhossztól)
Cirkulárisan polarizált fény
Dikroizmus (“kétszínűség”): Jobbra forgó (D)
1.) Hullámhossz függvényében a fény áthalad vagy visszaverődik az anyag felületéről 2.) Különböző polarizációs állapotú fény különböző mértékben nyelődik el az anyagban.
Királis molekulák erős cirkuláris dikroizmust mutatnak Izomrost polarizációs mikroszkópban A-szakasz
Balra forgó (L)
I-szakasz Izomrostok
CD spektrum: x-tengely: hullámhossz vagy frekvencia; y-tengely: “cirkuláris dikroizmus”: az L és D cirkulárisan polarizált fényre vonatkozó moláris extinkciós együtthatók különbsége
Cirkuláris dikroizmus:
Optikai kettőstörés: a törésmutató (~fény terjedési sebessége) függ a síkpolarizált fény polarizációs síkjától.
Cirkuláris kettőstörés: a törésmutató (~fény terjedési sebessége) függ a cirkulárisan polarizált fény forgási irányától
ΔA(λ) = A(λ)LCPL - A(λ)RCPL λ: hullámhossz
Tömegspektrometria
Tömegspektrometriás alkalmazások
Tömegspektrometria - mass spectrometry (MS): a minta atomjai és molekulái tömegeinek eloszlását mérő analitikai módszer. A megmért spektrum a minta elemi vagy izotóp ujjlenyomata, amely a kémiai szerkezetre jellemző. Detektálás
Lépések: 1. Ionizáció 2. Gyorsítás 3. Elhajlás 4. Detektálás
Eredmény: “Vonal” diagram
Faraday kollektorok
sejtek vagy szövet
Relatív gyakoriság
mágnes
fehérje keverék
1DE
peptid szétválasztás folyadék kromatográfiával semleges gáz
ion-peptid (prekurzor ion)
erősítők
gáz befúvó ionizáló filamentum
ütköztetéses fragmentáció
m = ion tömeg q = ion töltése
tömeg analizátor
relatív frekvencia (%)
A spektrumot szerkezeti adatbázissal vetjük össze
Normál colon
peptid szekvencia
relatív frekvencia (%)
JEL
nyaláb fókuszálás iongyorsító elektroncsapda iontaszító
ion-peptid “electrospray” ionizáció) jel detektálás
tömeg analizátor
Tömeg-töltés arány
Ionforrás
emésztés peptidekre
peptid keverék
áram
az elhajlás a tömeg-töltés aránytól (m/q) függ
Valós idejű szövetanalízis (“onkokés”)
Fehérje analitika (proteomika)
MS spektrum
MS/MS spektrum
Tumoros colon
Normál máj
Metasztatikus máj
