Biomolekuláris kölcsönhatások vizsgálata felületi plazmonrezonancia elvén működő Biacore keszülékkel
Biomolekuláris interakciók
Fehérje-fehérje
Alegység-kölcsönhatások, enzim-szubsztrát, enzim-inhibitor, domén-kölcsönhatások, antigén-antitest (epitóp térképezés)
Fehérje-ligand
Farmakológiai vizsgálatok: hormon-receptor, receptor- agonista, receptor-antagonista enzim-kis molekula (≥200 Da) fehérje-kis molekula (≥200 Da)
Fehérje-DNS/RNS fehérje/ligand-lipid DNS/RNS-kötés kimutatása, DNS kötő régiók azonosítása Fehérjék/molekulák membrán asszociációja
Milyen adatok jellemzik a kölcsönhatásokat? • a kölcsönhatás kinetikája (ka és kd) • a kölcsönhatás erőssége: affinitás (Ka=ka/kd vagy Kd=kd/ka) • termodinamika (∆G, ∆H, ∆S) • a kölcsönhatás specificitása (kölcsönható régiók azonosítása)
Biomolekuláris interakciók kvantitatív vizsgálati lehetőségei
Milyen módszerek léteznek? Analitikai ultracentrifuga (AUC)
Izoterm kalorimetria (ITC)
Biacore (SPR*-tecnika) (SPR*-tecnika: Surface Plasmon Resonance, felületi plazmon-rezonancia)
Előnyök és meghatározható jellemzők • molekulatömeg meghatározás • homogenitás/tisztaság • asszociációs állapot
• affinitás (Ka/Kd) • termodinamika (∆G, ∆H, ∆S)
Hátrányok • affinitás? • kinetika? • termodinamika? • közepes mintaigény • elsősorban makromolekulák elemzésére alkalmas
• kinetika? • nagymennyiségű mintát igényel
• kinetika (ka/kd) • affinitás (Ka/Kd) • termodinamika (∆G, ∆H, ∆S) • specificitása (kölcsönható régiók azonosítása) • kismennyiségű mintát igényel
• a kölcsönható partnerek egyikének immobilizálása szükséges
Biomolekuláris interakciók Biacore vizsgálata
Milyen kérdésekre kapunk választ a kölcsönhatást illetően? Mennyire specifikus? Milyen gyors? Mennyire stabil? Milyen a hatásos koncentráció? Jelen van-e egy adott molekula biomolekulák elegyében?
SPR detektálás elve
Y +
Y
Immobilizált ligand
Fényforrás
Optikai detektáló egység
Intenzitás
Szög Rezonancia jel
Szenzor-chip felület aranyréteggel
Minta
Idő
Szenzorgram Áramlási cella
Rezonancia jel (kRU) 18 Disszociáció
12
Ass zoci áció
Kinetika
100
kd Regenerálás
ka Koncentráció
200
300
400
500
600 Idő (s)
Szenzor-chip felületek
Felépítésük
Dextrán mátrix Arany réteg Üveg
• A dextrán mátrix minden chip felületén jelen van, kivéve a HPA, C1 chipeket. • Előnyei: • Hidrofil • Flexibilis • Kis mértékű nem-specifikus kötődés • Magas kötő-kapacitás • Kitűnő kémiai stabilitás
Sensor Chips CM4 and CM3 Sensor Chip CM4 •
Karboximetilált dextrán mátrix kisebb mértékű karboxilálással (a CM5-el össszevetve): kevésébé negatív és ezzel a nem-specifikus kötődés kisebb mértékű
Sensor Chip CM3 •
Karboximetilált dextrán mátrix: a CM5-el azonos fokú karboxilálás, de kisebb méretű matrix.
Sensor Chip C1
• •
Sima karboximetilált felület Sejtekkel és vírusokkal történő munka esetén
A szenzorchipek felületén lejátszódó kémiai reakciók
Sensor Chip CM5 amino- tiol-ligand felületi-tiol -aldehid
Kovalens módosítás
• • •
Karboximetilált dextrán mátrix Különböző funkciós csoportokkal módosítható Kitűnő kémiai stabilitás
Immobilizálási módszerek Indirekt
Direkt
analyte
analyte
analyte
Elemzési formák 2)
1)
jelnövelő molekula
Direkt kötődés
3)
Direkt kötődés jelerősítést eredményező molekulával
4) analyte
kompetitív analyte analyte
kompetitív ligand
Gátlási vizsgálat az oldatban alkalmazott kompetitív liganddal
Kompeticíó a felületen
Sensor Chip SA DNS fragmentum
DNS kölcsönható molekulák
biotin streptavidin
• Karboximetilált dextrán mátrixon streptavidint immobilizálnak • •
Ideális biotinilált DNS fragmentumok kötésére és a nukleinsav kölcsönhatások elemzésére Alkalmas biotinilált szénhidrátok, peptidek, fehérjék és polinukleotidok immobilizálására
Sensor Chip NTA His-tag fehérje
His-tag fehérjéhez kötődő molekula
immobilizált nitrilo-triacetát (NTA)
• • • •
Karboximetilált dextrán mátrixon nitrilo-triacetátot (NTA) immobilizálnak, amelyhez Ni2+ ionokat kötnek A Ni2+-komplex szabad vegyértékei által hexahisztidin peptiddel (Histag) expresszált fehérjék megkötésére képes A fehérjét megfelelő orientációban köti, lehetővé téve a kötőhelyek exponálását Könnyen regenerélható EDTA-val vagy EGTA-val
Sensor Chip HPA Lipid felület (egyrétegű) kialakítása membránhoz kötődő biomolekulák
• • • •
Sima hidrofób felület Lipid felület (egyrétegű) kialakítására alkalmas és lehetővé teszi membránhoz kötődő biomolekulák elemzését Alternativ módszer a membrán-asszociált molekulák szolubilizációs technikával történő vizsgálatának Receptorok kölcsönhatásának vizsgálata membrán-szerű környezetben vizes oldatban előforduló ligandokkal
Sensor Chip L1
•
Karboximetilált dextrán mátrixhoz lipofil molekulát kötnek
•
Ez alkalmas liposzómák megkötésére úgy, hogy a lipid kettősréteg intakt marad
•
Alkalmas lipid-fehéreje-ligand kölcsönhatások vizsgálatára
ligand
Gyógyszerek membrán transzportjának vizsgálata
Különböző transzport lehetőségek
A legtöbb molekula által használt útvonal
Gyógyszerek membrán transzportjának vizsgálata
Különböző összetételű liposzómákból lipid kettősréteget alakítanak ki
Különböző gyógyszermolekulák eltérő kölcsönhatása a lipid kettősréteggel
Az anyagok lipid abszorpciójának mértéke
Az anyagok lipid abszorpciójának osztályozása
Hogyan nyerhetjük vissza a kötődő komponens(eke)t miután a komplex létrejött?
Ez szövetkivonatokból, eddig nem azonosított kötődő partnerek felismerésében és azonosításában fontos és egyben immunprecipitációt és pull-down kisérleteket helyettesíthet
KALMODULIN IZOLÁLÁSA NAGY AFFINITÁSÚ KÖTŐDŐ PEPTIDDEL
KALMODULIN IZOLÁLÁSA NAGY AFFINITÁSÚ KÖTŐDŐ PEPTIDDEL a minta injektálása
mosás
visszanyerés
visszanyert minta
A visszanyert minták tömegspektrometriás elemzése
A tisztított mintából visszanyert fehérje spektruma
A teljes agy extrakt spektruma
A agy extrakt kötődése után visszanyert fehérje spektruma
A agy extrakt kötődése után visszanyert fehérje tripszines emésztése után kapott peptidek spektruma
Biomolekuláris interakciók feltárása Biacore készülékkel Fehérje-fehérje Alegység-kölcsönhatások, enzim-szubsztrát, enzim-inhibitor, domén-kölcsönhatások, antigén-antitest (epitóp térképezés)
√
Fehérje-ligand Farmakológiai vizsgálatok: hormon-receptor, receptor- agonista, receptor-antagonista enzim-kis molekula (≥200 Da) fehérje-kis molekula (≥200 Da)
√
Fehérje-DNS/RNS Fehérje-ligand-lipid DNS/RNS-kötés kimutatása, DNS kötő régiók azonosítása Fehérjék/molekulák membrán asszociációja
√
• a kölcsönhatás kinetikája (ka és kd) • a kölcsönhatás erőssége: affinitás (Ka=ka/kd vagy Kd=kd/ka) • termodinamika (∆G, ∆H, ∆S) • a kölcsönhatás specificitása (kölcsönható régiók azonosítása) • kölcsönható patrner azonosítása lizátumból
