Biokonjugátumok Hudecz Ferenc
Előzmények 1)
Fehérjék szerkezet – hatás összefüggéseinek kutatása (1925 –
Sumner, J.B., Graham V.A.: The nature of insoluble crease Proc Soc Exp Biol Med 22 504 (1925) Melyik aminosav (oldallánc) „kell” és melyik „nem kell” a hatás megmaradásához Olcott, H.S., Fraenkel-Conrat, H.: Specific group reagents for proteins Chem Rev 41 151 (1947) Herriot, R.M.: Reactions of nativ proteins with chemical reagents Adv Prot Chem 3 161 (1947)
2)
Szerkezet vizsgálat
Fehérjék
N-terminális meghatározások F
O 2N
H3C
N
CH3
λ = 254 nm
λs = 360 nm λe = 480 nm
NO2 SO 2Cl
Szekvencia meghatározás (1956) Edman, P., Begg, G.: A protein sequenator Eur J N Biochem 1 80 (1967) C op.: -21 C o
S
Aminosav meghatározás (1960) Moore, S., Stein, W.H.: Chromatographic determination of amino acids … CHO Methods in Enzymol 6 819 (1963)
O OH OH O
λs = 340 nm λe = 455 nm CHO
Szénhidrátok
E. Fischer 1884 Redukáló monoszacharidok O H2N
H OH HO
NH N
NH
H
fenil-hidrazin
OH
OH
HO
HO
OH HO HO HO
D-Glükóz
Glükóz-1-fenilhidrazon H2N
N
fenil-hidrazin
NH
H N HO
NH OH
HO
Glükóz fenil-oszazon HO
NH
Szénhidrátok
Reakció oxo-csoporttal HO
HO O
O
O HO
O
10 mM Nátrium-perjodát
OH
β-D-Mannóz részlet poliszacharid láncban
O
O O
O
C - C kötés hasadása aldehid részlet oxidálásával
oxo-csoport „előállítása” hidroxil-csoportból
Nukleinsavak
Maxam, A.M., Gilbert, W …: A new method for sequencing DNA PNAS 74 560-564 (1977) 6
NH2 5
1 N 2
O
7
6
N
1 HN
8
N 4 3
5
8
2
N9
H2N
R
7
N
N 3
4
N9 R
(CH3)2SO 4
NH2
O
+
N
N +
N
CH3
N R
CH3 N
HN H2N
N
N
a) 0.1 M HCl b) pH 7, 100 oC
R
Sanger, F. et al. PNAS 74 5463 (1977) Smith, L.M. et al. Nature 321 674 (1986)
ChromaTide fluoreszcein-12-dUTP szerkezete (C-7604) HO
O
O
OH O O H
O
O NH (CH2)5
NH
O
N N
H
O O
H H H
O
H H OH
O O
P O
-
O
P O
O -
3 Na
P O
+
OH -
2)
Biopolimerek kimutatása sejtben, szövetben
Fehérjék jelölése radioaktív izotóppal
Li, C.H.: Iodination of tyrosine groups in serum albumin and pepsin JACS 67 1065 (1945) I3-
I131
I2 + IH2OI+ + I-
I2 + H2O
Tyr
His
COO-
COO-
+
+
H3N
NH3 +
HN I O
-
I
I O
-
I
N H
Hnatowich, D.J. et al.: The preparation and labeling of DTPA-coupled albumin Int J Appl Radiat Isot 33 327332 (1982)
O
R
O
NH2
O
amin tartalmú molekula O O
O N
+
NH
N
O -
DTPA
O
O
O N
O R
O
-
NH
O
+
NH O
N
O O
-
-
O
-
Fehérjék jelölése biotinnal
Bayer, E.A., Wilehek, M.: The use of avidin-biotin complex Methods Biochem Anal 26 1 (1980) Chaiet, L., Wolf, F.J.: The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces Arch Biochem Biophys 106 1 (1964) Green, N.M.: Avidin Adv Protein Chem 29 85 (1975) O
Ka = 1015 M-1
2 HN
NH
S
*
op.: 232-233 oC
4 COOH
D-Biotin [Hexahidro-2-oxo-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-pentánsav]
Biopolimerek jelölése fluorofórokkal
McKinney, R. et al. Factors affecting the rate of reaction of fluorescein isothiocyanat with serum proteins J Immunol 93 232 (1964) O
R
NH2
amin tartalmú molekula
-
O
O
+
O
-
O
O
O
O
O
-
O
N
HN C
S
Fluoreszcein izotiocianát
-
C HN
S
R
Tiourea kötés létrehozása
2)
Affinitás kromatográfia
HO
Bethell, G.S. et al. A novel method of activation of cross-linked agarose with 1,1’-carbonyldiimidazol which gives a matrix for affinity chromatography J Biol Chem 254 2572 (1979) O
CH2OH O
O
O
O O
O OH
C
O
NH
O CH2
L
CNBr
CHOH
O
O O
CH2 O
O
O O
OH
NH O
C
NH L
CH2
HO
NH2
OH O
C
N
Analitika (kémiai, orvosi) Gyógyszerkutatás
Protein: hatás-szerkezet Elválasztástechnika Szerkezet vizsgálat
Definíció 1. Mindkét komponens aktív 2. Kovalens kötés 3. Lehet több komponens is
Megközelítési lehetőségek 1.
A partnerek mérete
2.
Kicsi – kicsi Kicsi – nagy Nagy – nagy
A kötés jellege
Közvetlen NH2
HOOC
Közvetett NH2
HOOC
spacer
3.
A kötés típusa
Savamid
O
O C
NH
O
S
NH
O
P
O
karbonsav
szulfonsav
foszforamidát O
C
O
O
-
P
O CH3
O
karbonsav
Savanhidrid
O
O
C
C
O
karbonsav
NH
O
O
Savészter
-
foszforsav HO
O
O O P
O
C
P OH
foszforsav
O O
P OH
„vegyes”
Hidrazon
O
N C
Schiff bázis
C H
Éter
O
CH2
Aldehid + hidrazon
NH
CH2
N
Aldehid + amin Alkohol
Karbamát
O NH CH2 C CH2
Alkohol
O
CH2
Szekunder amin
Izourea
NH
NH
CH2
+ aldehid
NH CH2
(N-glikozid)
Amin
NH
C
+ aril-halogenid
CH2
CH2
Amin
O
Izotiourea
NH NH CH2 C CH2 S
Amin
CH2
Tioéter
S S
Tiol
C
Diszulfid
S
CH2
S
Diazo
C–X
CH2
O
Tioészter
S
Tiol
CH2
N
C
N
I
CH2
S
S
CH2
Tiol
CH2
Azid
1.
Példa: kicsi – kicsi, közvetlen, anhidrid kötés „Firefly” lumineszcencia LH2 1
LH2 + ATP-Mg +
ATP
2
LH2AMP proton elvonás
3
luciferáz enzim LHAMP konformáció változás + O2 AMP + CO2 +
P + hν
LHAMP
1.
Példa O O
P
O O
P
OH
O O
OH
P
O
OH O
OH
Mg2+ 3' N HO
S 1'
N S 1 H
3' N
4 COOH HO
H
D (-) luciferin (LH2)
O
OH
Luciferáz
ATP
P
N
S 1'
4
S 1 H
Luciferil-adenilát Adenilsav N R S
oxiluciferin
O
"Karbonsav"
andidrid
O H
+
ADP
2.
Példa: kicsi – nagy, közvetlen, amid kötés Liposzoma – haptén konjugátum +
NH2
O O H3C
O
P
NH3
-
O
O O
CH3
O NH2
PE liposzóma
O
Foszfatidil etanolamin
Példa
2.
+
O O H3C
O
NH3
-
P
+
O
HOOC
GAFA
O
NH
O O
CH3
O
CH3 CH3
O
EDC 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid
O O H3C
O
P
NH
-
CO
O
CH3 O
C
H3C
NH
CH3
O
GAFA
NH
CH3
O
O
O
N
+
N
+
EDC HOH
NH
CO
GAFA
NHAc
NH2
NH
CO
GAFA
NHAc
3.
Példa: nagy – nagy, közvetett,diszulfid kötés Immunotoxin konjugátum lépés: védett -SH csoport kiépítése az ellenanyag molekulán (Ab + SPDP → amidkötés) 2. lépés: szabad -SH csoport létrehozása a toxin alegységben (-S-S- kötés hasítása, DTT) 3. lépés: az –SH partner reakciója a „védett” SH tartalmú komponenssel (AB-SSP + Toxin-SH → diszulfid kötés) 1.
3.
Példa
Carlsson, J. et al. Biochem J 173 723 (1978) O
+ NH2
N
O
SPDP aktivált antitest O
O
S
N
amino csoportot tartalmazó
N
SPDP
OH
O
S
N S
antitest
NH
O
S
O
NHS
Cleland W. Biochemistry 3 480 (1964) A lánc DTT
B lánc
B lánc
A lánc N
Toxin molekula A és B alegységgel
Redukció, szabad tiol csoportok keletkezése
Immunotoxin képződés diszulfid híddal
S
Piridin-2-tion λ = 343 nm
NH O
S S
O
O
O
R
R O
S
R1 (C, P)
észter
Térkép
R R1
NH R1
tioészter
amid
O R OH O
O R
O
O
R NH NH2
O
NH
R2 O
O
R
R3 O
R4
éter
N3
karbamát
R1
azid
O R NH N R2
R
N
diazo
hidrazon
O R2 H
N R2 H
Schiff bázis
CH2
R3 OH
N CH2
redukció
hidrazid
oxidáció
anhidrid
R4
Térkép
R5 NH
R (Ar)
R
R5 NH
O
szekunder amin
amid (SO, POH)
R6 SH
R5 NH2
R5 N
R5 NH CH
NH O
Schiff-bázis
R5 NH
izourea
R
R6 NH
S
R6 S
R6 S S
R
R
izotiourea
tioéter
diszulfid híd
1) Hogyan lehet funkciós csoportot kiépíteni? (-COOH, -CHO, -OH, -SH, -NH2) 2) Hogyan lehet funkciós csoportot eltüntetni?
