Elektrochemické převodníky elektrochemický měřící systém tvoří nejméně dvě elektrody - pracovní (měřící) a referentní imobilizací biorekogniční vrstvy vzniká bioelektroda, nejčastěji se jedná o enzymovou elektrodu potenciometrické biosensory amperometrické biosensory konduktometrické biosensory
Pracovní Pracovní elektrody pro biosensory zahrnují zahrnují velmi širokou škálu materiá materiálů i konfigurací konfigurací: uš ušlechtilé lechtilé kovy (Pt (Pt,, Au), skelný uhlí uhlík, grafit a nejrů nejrůzně znější kompozitní kompozitní smě směsi, vodivé vodivé polymery a organické organické vodivé vodivé soli. Rozsah pracovní pracovního potenciá potenciálu je tř třeba volit tak, aby nedoš nedošlo k elektrochemické elektrochemickému rozkladu materiá materiálu elektrody nebo k interferenč interferenčním reakcí reakcím (rozklad vody nebo jiných slož složek pracovní pracovního roztoku, redukce rozpuš rozpuštěného kyslí kyslíku). Důlež ležitá itá je př příprava povrchu elektrody př před vlastní vlastním měřen Provádí se leš leštění ěřeníím nebo imobilizací imobilizací biomolekul. biomolekul. Prová povrchu brusnými práš ky (diaman prášky (diaman--tový nebo oxid hlinitý), následuje oplá opláchnutí chnutí a př případně padně ozvuč ozvučení ení ultrazvukem. Někdy je tř třeba odod-stranit povrchové povrchové neč nečistoty (oxidy kovů kovů) buď buď pomocí pomocí kyselin nebo anodizací anodizací.
Pomocné Pomocné elektrody musí musí být tvoř tvořeny dobré dobrého vodič vodiče s dostateč dostatečnou plochou a elektrochemicky neaktivní neaktivní. Použ Používá se platina (drá ku, sí (drátek, plíš plíšku, síťka), uhlí uhlíková ková tyč tyčinka, mnohdy stač stačí i nerezový drá drát.
1
Referentní elektrody
slouž slouží jako srovná srovnávací vací bod k měřen ěřeníí nebo nastave nastavení potenciá potenciálu pracovní pracovních elektrod. Jejich potenciá potenciál je př přesně esně definovaný a pokud mož ž no č asově ě stá á lý. mo asov st
Typ Normální vodíková elektroda + Pt, H 2 (1 atm ) | H Kalomelové elektrody Hg | Hg 2 Cl 2 | KCl nasycená norm ální nasycená NaCl Argentchloridové elektrody Ag | AgCl | KCl nasycená norm ální Ag | AgCl | LiCl Merkurosulfátová elektroda Hg | HgSO 4 | K 2O 4
Zkratka
E NHE (V)
E SCE (V)
(a=1)
NHE
0
0.2412
(. . .) (sat.) (1 M) (sat.)
SCE NCE SSCE
0.2412 0.2801 0.2360
0 0.0389 0.0052
(. . .) (sat.) (3 M) (1 M) (sat. v EtOH)
0.197 0.2042 0.2362 0.140
-0.045 0.037 -0.005 -0.101
(sat.)
0.655
0.414
Referentní elektrody
Miniaturní Ag/AgCl
2
Potenciometrické bioelektrody
-
-
-
-
A A A A +
K
základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem
+
K
převodní evodníkem je iontově iontově selektivní selektivní elektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvou. Rozsah měř itelných koncentrací měřitelných koncentrací je dá dán ISE: 10 µM až ž 0.1 M, pro koneč č n é biosensory typicky 0.1 až a kone až 10 mM, odezva je logaritmická logaritmická. Měř Měříí se potenciá potenciál pracovní pracovní elektrody proti referentní referentní elektrodě elektrodě - ta musí musí být kvalitní kvalitní (časově asově stá stálá), př přitom v systé systému neteč neteče proud - je tř třeba měř měříící přístroj s velkým vstupní vstupním odporem (operač (operační zesilovač zesilovač).
Potenciometrické enzymové elektrody Potenciá Potenciál ISE pro sledovaný iont (aktivita ai) v př přítomnosti ) ruš š ivé é ho iontu (aktivita a ru iv j
E =E0 +
RT ln(a i + k ij a jz / y ) zF
skleně ně dostupná skleněná elektroda - H+ - měřen ěřeníí pH, běž běžn dostupná pevné pevné ISE (solid state) - tenká tenká vrstva iontové iontového vodič vodiče: monokrystal nebo smě směs krystalů krystalů, precipitá precipitát; homogenní homogenní nebo heterogenní heterogenní (mnohoná (mnohonásobně sobně levně levnější, ší, vlastní vlastní materiá materiál dispergová dispergován v inertní inertní matrici (PVC, silikon, ...) na bá eníí pH: bázi oxidů oxidů kovů kovů pro měř měřen MxOy + 2y(e + H+) ———→ ———→ xM + yH2O nebo dva oxidač oxidační stavy: 2MOy + 2H+ +2e- ———→ (2y(2y-1)M2O + H2O antimonová á elektroda Sb/Sb O , d á le Ir/IrO antimonov Ir/IrO2 nebo Pd/PdO Pd/PdO2 2 3
3
ISE
ukázka pH, NH3 a CO2 ISE Crytur
Příklady potenciometrických enzymových elektrod
pH : penicilin (penicilin asa a), acetylcholin (cholinesteras a), (penicilinas cholinesterasa esteras y, nukleové y) esterasy, nukleové kyseliny (nukleas (nukleasy) NH3 / NH4+ : moč a), aminokyseliny (oxidač močovina (ureas (ureasa), (oxidační deaminace - glutamá a L- / D-aminok glutamát DH, oxidas oxidasa aminokyselin; α,γeliminace amoniaku – L-methionin γ-lyá lyáza), za), nitrá nitrát a nitrit (bakterie) CO2 : moč a), aminokyseliny (lysin dekarboxylas a, močovina (ureas (ureasa), dekarboxylasa tyrosin dekarboxylas a), laktá adekarboxylasa laktát (laktá (laktát monooxygenas monooxygenasa dekarboxylují a) dekarboxylující oxidas oxidasa I : potenciometrická potenciometrická detekce peroxidu vodí vodíku v př přítomnosti peroxidas y peroxidasy F : peroxid vodí asa a - oxidace fluorofenolu) vodíku (peroxid (peroxidas fluorofenolu) CN- : amygdalin (β-glukosidas asa a ) glukosid
4
Polovodičové sensory
výhodou jsou miniaturní miniaturní rozmě rozměry, masová masová produkce a tudí tudíž nízká zká cena ve srovná srovnání s klasickými ISE. základní kladním konstrukč konstrukčním materiá materiálem je kř křemí emík. Jeho vodivost je velmi ní nízká zká, avš avšak př přídavkem vhodných stopových př příměsí lze jeho vodivost zvýš zvýšit získá ská se polovodič polovodič. Podmí Podmínkou vodivosti je mož možnost volné volného pohybu elektronů elektronů.
EC Energetické Energetické hladiny elektronů elektronů u čisté istého kř křemí emíku (nevodivý)
1.1 eV
EV u kř křemí emíku je zá základní kladní valenč valenční hladina EV plně plně obsazena, ale elektrony se na ní nemohou pohybovat. Na vodivostní vodivostní hladině hladině EC je mí místo pro pohyb, ale nejsou zde elektrony. Kinetická ných Kinetická energie elektronů elektronů na EV je za běž běžných podmí podmínek kolem 0.04 eV, takž takže nemohou př přeskoč eskočit na vodivostní vodivostní hladinu EC
Zvýš výšení ení vodivosti se dosá dosáhne dopová dopováním - přídavkem atomů atomů z V. (P, As, negativní negativní - n) nebo ze III. (B, Al, Al, pozitivní pozitivní - p) skupiny periodické periodické tabulky. Tak př při n dopová dopování se vytvoř vytvoří donorová donorová hladina elektronů elektronů ED těsně sně pod vodivostní vodivostní hladinou, takž takže př přenos elektronů elektronů z ED na EC je snadný. Opač Opačně působí sobí přidá idání atomů atomů s volnými pozice elektronů elektronů (dí (díry, pozitivní pozitivní dopová dopování), vytvoř vytvoří se tak akceptorová akceptorová hladina EA.
e-
e-
EC ED
Energetické Energetické hladiny elektronů elektronů po př přidá idání příměsí
EA EV
U polovodič polovodičových materiá materiálů se pak hladina, na které které je pravdě pravděpodobnost obsazení obsazení elektrony 50%, 50%, nazývá nazývá Fermiho (EF). Nachá Nachází se mezi EV a EC, její její poloha odpoví odpovídá množ množství ství dopují dopujících atomů atomů.
5
ISFET
ion-sensitive field effect transistor
R e f
NS source
G gate
Membrána
SiO2
VG
ND drain
Křemík Pizolace - epoxypryskyřice
Schéma zapojení ISFETu
VD
Odpor mezi S (source (source)) a D (drain (drain)) se změ změní, když když se na hradlo G (gate (gate)) př přivede napě napětí (změ (změní se elektrické elektrické pole). pole). Povrch ISFETu mimo S a D je pokryt pokryt oxidem kř křemič emičitým, oblast hradla G (gate) gate) je potaž potažena selektivní selektivní membrá membránou, která která je v kontaktu s okolní okolním roztokem; ostatní ostatní části jsou izolová izolovány epoxypryskyř epoxypryskyřicí icí. Potenciá Potenciál hradla se urč určuje vzhledem k referentní referentní elektrodě elektrodě. Jako iontově iontově-selektivní selektivní membrá membrány lze použ použít řadu materiá materiálů. Nejběž nější jsou solidNejběžn solid-state membrá membrány pro sledová sledování změ změn pH, pH, materiá materiál Si3N4, Al2O3, Ta2O5. Odezva tě těchto ISFETů ISFETů je logaritmická logaritmická (52(52-59 mV/ mV/pH), pH), masová masová produkce vede k ní nízké zké ceně ceně. Polymerní Polymerní membrá membrány mohou být např např. valinomycin/PVC valinomycin/PVC pro stanovení stanovení draslí draslíku. Heterogenní Heterogenní membrá membrány tvoř tvoří AgCl, AgCl, AgI, AgI, AgCN krystalky v PNF (polyfluorovaný (polyfluorovaný fosfazin). fosfazin). Př Při výrobě výrobě ISFETů eníí jednotlivých ISFETů se použ používá litografie - postupné postupné nanáš nanášen vrstev, vytvá vytváření ení struktury pomocí pomocí masek.
6
ISFET – ukázka
LAPS biosensory
Tento polovodičový převodník je konstrukčně jednodušší než ISFETy, navíc je možné připojení kontaktů ze strany která není v kontaktu s roztokem. Základem je křemíkový čip potažený vrstvami oxidu křemičitého a nitridu křemíku. Navíc je na povrchu rozdělen na několik aktivních oblastí pomocí další vrstvy SiO2. Celý čip má pouze jeden kontakt. V neosvětleném stavu je sensor neaktivní. Pokud se z druhé strany osvětlí (infračervená LED, při 940 nm pronikne světlo do křemíku 50 nm hluboko), dojde k lokální aktivaci a získá se signál odpovídající změnám pH v aktivované („adresované”) zóně. Výhodou je jednoduchá možnost vícekanálového měření.
7
LAPS
„light addressable potentiometric sensor“ Výmě Výměnný páskový sensor s biovrstvou
potenciostat
referenč referenční a pomocná pomocná electroda electroda
LAPS struktura struktura
přítlak pracovní pracovní roztok se substrá substrátem
LEDky ání” LEDky pro “adresov adresová biomembrá biomembrána LAPS biosensor Threshold
Cytosensor
křemík (P nebo N) (
Cytosensor microphysiometer (Molecular Devices) Devices) se použ používá pro testová testování toxicity nebo fyziologických účinků inků léčiv. Do komů komůrek se imobilizují imobilizují buň buňky (bakteriá (bakteriální lní nebo tká tkáňová ová kultura - fibroblasty, fibroblasty, keratinocyty, keratinocyty, rakovinné rakovinné buň buňky, 104 až 106). Při mí mírné rném prů průtoku médía se část buně buněk zachytí zachytí na povrch a v př přítomnosti substrá substrátu vyvolá vyvolávají vají urč určitou změ změnu pH, pH, která která je úměrná rná metabolické metabolické aktivitě aktivitě; např např. respirací respirací glukó glukózy vzniká vzniká kyselina mlé mléčná a oxid uhlič uhličitý. Po př přídavku testované testované látky se pak zaznamená zaznamená odezva jako časová asová změ změna dpH/ dpH/dt. dt. Na konci pokusu se rychlým prů průtokem buň buňky z komů komůrek vyplá vypláchnou a lze zač začít další další cyklus. Vhodné Vhodné účinek rů růstových regulá regulátorů torů, hormonů hormonů, lymfokinů lymfokinů, virů virů nebo virostatik. virostatik.
8
Amperometrické sensory
e-
Xred
jsou založ založeny na heterogenní heterogenním př přenosu elektronů elektronů mezi elektrodou a redoxní redoxním párem molekul poskytují poskytují jako signá signál proud, který je úměrný koncentraci analytu. analytu. Proud I se obvykle měř měříí při konstantní konstantním napě napětí (potenciá (potenciál E) pracovní pracovní elektrody velikost proudu proš prošlá za daný čas t v systé systému udá udává náboj Q, který odpoví odpovídá molá molární rnímu množ množství ství látky př přemě eměněné na elektrodá elektrodách:
Xox
Q = I t = n F m / Mr
F = 96487 C/mol znač značí Faradayovu konstantu k elektrochemické elektrochemické oxidaci lá látek dochá dochází na anodě anodě (I > 0), redukč redukční děje (I < 0) probí probíhají hají na katodě katodě. smě směr proudu je totož totožný se smě směrem toku pozitivní pozitivních ekvivalentů ekvivalentů (ná (nábojů bojů)
Amperometrické měření
je mož možné prová provádět v dvoudvou- nebo tř tříelektrodové elektrodovém uspoř uspořádání; pro první první systé systém se napě napětí na pracovní pracovní elektrodě elektrodě W (working (working)) nastavuje proti pomocné pomocné elektrodě elektrodě A (auxiliary (auxiliary,, resp. counter) counter) v tř tříelektrodové elektrodovém uspoř uspořádání se naví navíc použ použije referenč referenční elektroda R, vůči ůči které které se nastavuje potenciá potenciál pracovní pracovní
2-E -
-
+
A
+
A V
Aux
3-E
Ref
V
Work
9
Potenciostat
je zař zařízení zení, které které udrž udržuje konstantní konstantní potenciá potenciál pracovní pracovní elektrody vůč vůčii referentní referentní nezá nezávisle na prochá procházejí zejícím proudu rozsah - RM
_ +
_ +
I
_
Uout = RMI
+
_
Uin
Příklad konstrukce potenciostatu
+
zpracová zpracování měřených ěřených signá signálů lze prová provádět pomocí pomocí zapisovač zapisovače, nebo lé lépe použ ž ití í m poč č í tač č e vybavené é ho analogově ě digitá á lní í m př ř evodní í kem (A/D); pou it po ta vybaven analogov digit ln p evodn pomocí analogového př převodní evodníku (D/A) lze řídit pracovní pracovní napě napětí. pomocí digitá digitálně lně-analogové
Potenciostat
moderní moderní digitá digitální lní konstrukce - analogový obvod řízený A/D (sbě (sběr dat) a D/A (nastavení (nastavení excitač excitačního potenciá potenciálu) převodní evodníky W R A
POTENCIOSTAT
D/A
A/D
POČÍTAČ Měřící uspořádání
obr. - mikroprocesorem řízený osmikaná osmikanálový potenciostat, výstup dat na externí externí poč počítač tač přes RS232 rozhraní rozhraní
10
Měřící techniky
Amperometrie chronoamp. pulsní
E čas
Voltametrie lineární normální pulsní
square wave
cyklická diferenciální pulsní
Techniky založené na měření proudu
dle časové asového prů průběhu potenciá potenciálu na pracovní pracovní elektrodě elektrodě nejjednodušší nejjednodušší je amperometrie chronoamperometrie umožň uje zí umožňuje získat informace o přechodných elektrodových jevech po skokové skokové změ změně potenciá potenciálu pulsní pulsní amperometrie zvyš zvyšuje podí podíl signá signálu vůč vůčii šumu lineá lineární rní a zejmé zejména cyklická cyklická voltametrie mají mají důlež ležitou úlohu př při vývoji amperometrických biosensorů biosensorů pulsní pulsní voltametrické voltametrické techniky již již vyž vyžadují adují pomě poměrně rně drahé drahé přístrojové strojové vybavení vybavení, i když když potř potřebné ebné pulsy lze relativně relativně snadno generovat pomocí pomocí poč počítač tače s D/A př převodní evodníkem.
Elektrochemické měřící zařízení
„laboratorní verze“ enzymová elektroda v míchané nádobce potenciostat s LCD a zapisovačem jednoúčelový systém v biochemickém praktiku
11
Analyzátory
Metrohm Polarecord EGG PAR 173 EGG PAR 263 Autolab
Amperometrické detektory
ABD (Universal Sensors) ADLC2 (Lab. Přístroje)
12
Ruční systémy
PalmSens Univ. Florence MEB (MU) iStat
Kapesní systémy
spolehlivost a robustnost velmi jednoduché ovládání
13
Konektory…
opravdu různorodé
Měření kyslíku a H2O2 Clarkův sensor Velkou výhodou tohoto sensoru je prakticky absolutní absolutní specifita pouze ke kyslí kyslíku - ruš rušivé ivé látky nemohou projí projít Ag/AgCl elektroda předř edřazenou membrá membránou. Konstrukce elektrody pro stanovení stanovení elektrolyt peroxidu vodí vodíku je podobná podobná kyslí kyslíkové kové s tím rozdí rozdílem, že není není použ použita membrána plynopropustná používá plynopropustná membá membána a použ propustná pro O2 se pozitivní pozitivní polarizace, polarizace, při které které nastá nastává anodická anodická oxidac oxidace peroxidu Elektrodová Elektrodová redukce kyslí kyslíku ((-750 mV) je čtyř tyřelektronový proces:
Au (Pt) elektroda zatavená ve skle
O2 + 2 H2O + 2 eH2O2 + 2 e-
H2O2 + 2 OH2 OH-
Elektrodová Elektrodová oxidace peroxidu vodí vodíku (> (> 600 mV mV):
2 H2O2
2 H2O + O2 + 2 e- + 2 H+
14
Kyslíková elektroda
Enzymové elektrody s oxidasami
tyto enzymy oxidují oxidují molekulu substrá substrátu (analytu (analytu)) za účasti kyslí kyslíku, př přitom vzniká vzniká buď buď peroxid vodí vodíku nebo voda:
substrát + O2 substrát + O2
produkt + H2O2 produkt + H2O
detekce peroxidu je obecně obecně citlivě citlivější (nulová (nulová výchozí výchozí hladina)
Proud
O2
analyt H2O2 0 čas
Rozsahy detektoru
oxidace peroxidu vodí vodíku je spojená spojená s nebezpeč nebezpečím interference ze strany jiných oxidabilní oxidabilních lá látek, např např. v sé séru mohou vadit kyseliny askorbová askorbová a moč močová ová či paracetamol specifita se dá dá zlepš zlepšit př předř edřazení azením kontrolní kontrolní membrá membrány, která která omezí omezí přístup interferují interferujících lá látek
15
Přehled oxidas
Substrát oxidasy Alkohol L-Aminokyseliny D-Aminokyseliny Askorbát Bilirubin Diaminy Fenol (Tyrosinasa) Galaktosa Glukosa L-Glutamát Cholin Cholesterol p-difenoly (Lakasa) L-Laktát L-Laktát (dekarb.) L-Lyzin Monoaminy NADH Oxalát Pyruvát Sulfit Urát(Urikasa) Xanthin
Zkratka AOD
MAO
EC číslo 1.1.3.13 1.4.3.2 1.4.3.3 1.10.3.3 1.3.3.5 1.4.3.6 1.14.18.1 1.1.3.9 1.1.3.4 1.4.3.11 1.1.3.17 1.1.3.6 1.10.3.2 1.1.3.2 1.13.12.4 1.4.3.14 1.4.3.4
XOD
1.2.3.4 1.2.3.3 1.8.3.1 1.7.3.3 1.1.3.22
BRO DAO
GOD
COD LOD LMO
koenzym FAD FAD FAD Cu Cu Cu Cu FAD FAD FAD FAD Cu FAD FMN FAD Fp FAD Mo Cu Mo
H2O2 ano ano ano ne ne ano ne ano ano ano ano ano ne ano ne ano ano ano ano ano ano ano ano
Enzymové elektrody s dehydrogenasami
nejvě největší skupinou oxidoreduktas jsou dehydrogenasy (existuje př přes 250 NAD+ a 150 NADP+ dependentní í ch enzymů ů ), analyticky významné dependentn enzym významné druhy jsou shrnuty v tabulce katalyzují katalyzující redoxní redoxní reakce s účastí astí NAD(P)+ / NAD(P)H:
Přehled dehydrogenas Substrát Alkohol Aldehyd Alanin Formiát Galaktosa Glycerol Glukosa Glukosa-6-fosfát Glutamát
Zkratka ADH AlDH Ala-DH FDH Gal-DH Gly-DH GDH G6P-DH GlDH
EC číslo 1.1.1.1 1.2.1.5 1.4.1.1 1.2.1.2 1.1.1.48 1.1.1.6 1.1.1.47 1.1.1.49 1.4.1.3
3-Hydroxybutyrát 3-Hydroxysteroid Isocitrát Inositol L-Laktát D-Laktát L-Leucin L-Malát Sorbitol
3-HBDH 3-HSDH ICDH IDH L-LDH D-LDH L-LeDH L-MDH SDH
1.1.1.30 1.1.1.50 1.1.1.42 1.1.1.18 1.1.1.27 1.1.1.28 1.4.1.9 1.1.1.37 1.1.1.14
16
Detekce NAD(P)H N
PMS Fenazin methosulfát
+
N
CH3
CH3OSO3 R: methyl Meldola Blue
N H2N
+
O
N R2
R: ethyl Nile Blue
H3C
N
XHN
S
N+Me2
Toluidine Blue O
X: H
X: naphthoyl
Naphthoyltoluidine Blue O
Mox + NADH
CT +
CT
Mred + NAD
Mred
Mox + 2 e- + n
+
elektrochemická elektrochemická detekce NADH je mož možná amperometrickou reoxidací reoxidací vznikají vznikajícího NADH (E° (E° -560 mV/SCE); mV/SCE); přímá oxidace vyž vyžaduje vysoký potenciá potenciál (př (přes 1 V na uhlí uhlíku), nastá nastává dimerizace a adsorpce produktů produktů na povrch elektrody reoxidace se můž e prové může provést lé lépe prostř prostřednictví ednictvím modifikují modifikujících lá látek (E° (E° -200 až až -50 mV) mV) vá vázaných na povrchu elektrody nejč nejčastě astěji se použ používají vají fenaziny, fenaziny, fenoxaziny a fenothiaziny, fenothiaziny, oxidace nastá nastává již již kolem 0 V/SCE lze už užít také také hexakyanož hexakyanoželezitan nebo TTF.TCNQ prů průběh reakce je homogenní homogenní - vzniká vzniká charge transfer komplex CT, po rozpadu je pak reoxidová reoxidován mediá mediátor, tor, přitom E > E° E° lze pracovat př při niž nižším ším potenciá potenciálu
Přenos elektronů z biomolekul
substrá substrát
Eox e-
produkt
Ered
Přímý př přenos elektronů elektronů pro konstrukci biosensorů biosensorů je tento proces atraktivní atraktivní zjednoduš zjednodušil by konstrukci; konstrukci; bohuž ohužel, př přímý přenos elektronů elektronů z biomolekul na elektrody elektrody byl pozorová pozorován u malých malých redoxní redoxních bílkovin (cytochromy cytochromy c a b, azurin, azurin, ferredoxin) ferredoxin) a některých kterých enzymů enzymů (laká lakáza, za, peroxidá peroxidáza). za).
Přímý reversibilní reversibilní přenos elektronů z biomolekuly (bí (bílkovina, nukleová nukleová kyselina) je obvykle ztí í ž en ř adou faktorů ů . V bí í lkoviná á ch se sice zt faktor b lkovin vyskytuje celá celá řada redoxně redoxně aktivní aktivních skupin (disulfidické (disulfidické můstky, FeFe-S skupiny, flaviny, hem, řada iontů ů kovů ů ), ale nachá á z í se obvykle uvnitř iont kov nach uvnitř molekuly. Kontakt redoxní í skupiny s povrchem elektrody je mož ž redoxn mo ný pouze pro urč č itým způ ů sobem orientované é molekuly, coý ý výrazně ur zp orientovan co výrazně sniž snižuje proudové é odezvy. Velikost molekuly zase vede k velmi pomalé é difú proudov pomal difúzi. Naví í c se biomolekuly č asto adsorbují í pevně ě na povrch elektrod a Nav adsorbuj pevn dochá á z í t í m souč č asně ě k jejich denaturaci. doch sou asn
17
Přenos elektronů z biomolekul
substrá substrát
Eox
Mred e-
produkt
Ered
Mox
Požadavky na mediátor
pro usnadně usnadnění výmě výměny elektronů elektronů mezi enzymy a elektrodou se použ používají vají nízkomolekulá zkomolekulární rní redoxní redoxní látky – mediá mediátory použ oužití ití mediá mediátorů torů urychluje a obvykle vů uje výmě vůbec umožň umožňuje výměnu elektronů elektronů mezi aktivní aktivním centrem enzymu a elektrodou.
reaguje s biokomponentou a elektrodou dostateč dostatečně rychlý př přenos elektronů elektronů (mě (měla by být zná známa stechiometrie a poč ených elektronů počet př přenáš enášených elektronů) stabilní stabilní formy (redukovaná (redukovaná i oxidovaná oxidovaná) za podmí podmínek použ použití ití neú neúčastní astní se postranní postranních reakcí reakcí (např (např. s kyslí kyslíkem) vhodný redoxní redoxní potenciá potenciál (vě (větší rozdí rozdíl redoxní redoxních potenciá potenciálů E° mezi enzymem a mediá mediátorem sice zvě zvětší užiteč itečný proud, souč současně asně však naroste také také šum, nebezpeč nebezpečí interferencí interferencí a doba ustalová ustalování pozadí pozadí) bez vlivu pH na prů průběh redoxní redoxní reakce netoxický (např (např. pro aplikace in vivo) vhodný k imobilisaci (nerozpustný či snadno adsorbovatelný)
Mediátory Název tris-(2,2’-bipyridyl)ruthenium(III) tris-(2,2’-bipyridyl)osmium(III) ferrocen-1,1’-dikarboxylová kyselina ferrocenylmethyltrimethylamonium 1,1’-bis(hydroxymethylferrocen] ferrokyanid K4[Fe(CN)6]4hydroxyethylferrocen N,N‘-dimethyl-p-fenylendiamin ferrocenoctová kyselina p-benzochinon N,N,N‘,N‘-tetramethyl-p-fenylendiamin 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) 1,2-naftochinon fenazin methosulfát (PMS) methylenová modř tetramethyl-p-benzochinon (durochinon) 2-hydroxy-1,4-naftochinon fenosafranin
E° (V) 1.031 0.603 0.403 0.388 0.224 0.190 0.161 0.139 0.124 0.039 0.029 -0.016 -0.090 -0.161 -0.230 -0.191 -0.378 -0.493
Fe
ferrocen Fc S
S
S
S
tetrathiafulvalen TTF NC
CN
NC
CN
tetrakyanochinodimethan TCNQ
18
Použití mediátorů
přímý př přenos v roztoku
kovalentně kovalentně na elektrodě elektrodě
v micelá micelách
3D3D-polymerní polymerní mediá mediátor
v elektrodě elektrodě
navá navázaný na enzym
Biosensor pro glukosu
Enzymová elektroda na jedno použití
Měřící jednotka
19
Konduktometrie ω Vm
čas
Im
θ
stř střídavé davé napě napětí (sinusoidá sinusoidální lní vlně vlnění) se př přivá ivádí na dvouelektrodový systé systém neuplatní neuplatní se faradaické faradaické procesy, konc. konc. polarizace, nabí nabíjení jení dvojdvoj-vrstvy mimo velikosti napě napětí Vm (běž ně kolem 100 mV) (běžn mV) lze měnit i frekvenci f (ω (ω=2π =2πf "spektroskopie") studuje se odezva systé systému (elektrody a prostř prostředí edí mezi nimi), měř měříí se proud i a jeho fázový posun θ.
Impedance
Impedance Z je vektorová vektorová velič veličina charakterisují charakterisující chová chování systé systému v přítomnosti stř střídavé davého napě napětí. Jako komplexní komplexní velič veličina má má velikost |Z |Z| a úhel θ, nebo slož složky reá reálnou R (resistance) a imaginá imaginární rní X (reaktance). Platí Platí pro ni ná následují sledující vztahy:
Z = R + jX
tgθ tgθ = –X/R
|Z| = (R2+X2)1/2
|Z| = Vm/im
Konduktometrické biosensory
sledová ledování změ změn vodivosti př při biochemických reakcí reakcích vyž vyžaduje produkci či spotř spotřebu iontů iontů nebo změ změny velikosti nabitých částic. Produkce iontů iontů je spojena s účinkem hydrolas a amidas, amidas, změ změna velikosti nabitých částic probí probíhá u reakcí reakcí fosfatas, fosfatas, sulfatas či nukleas. Velmi pohodlně pohodlně tak lze např např. prová provádět stanovení stanovení neutrá neutrální lních lipidů lipidů, které které po naš naštěpení pení lipas ou poskytují y př lipasou poskytují ionty. Klasickým př příkladem je vš však reakce ureas ureasy při stanovení stanovení moč močoviny:
NH2CONH2 + 3 H2O ⎯→ 2 NH4+ + HCO3- + OH
problé roblémem je vlastní vlastní vodivost pracovní pracovního prostř prostředí edí (použ (použití ití málo vodivých pufrů pufrů - organické organické, např např. imidazol) imidazol); také aké změ změnu vodivosti vyvolanou samotným př přídavkem vzorku je tř třeba odliš odlišit, je žádoucí doucí zanedbat změ m tě změny vodivosti v celé celém roztoku a sledovat př předevší edevším těsné sné okolí okolí elektrod s imobilisovanými enzymy (vlastní (vlastní signá signál v dů důsledku bioreakce), ioreakce), proto se výhodně výhodně použ používá diferenč diferenční uspoř uspořádání.
20
Konduktometrické převodníky kontakty izolace
detail elektrod interdigitated array
enzymová referentní vrstva
uká ukázka dvojité dvojitého konduktometrické konduktometrického převodní evodníku (sí (sítotisková totisková technologie, rozmě rozměry 7 x 25 mm)
Optické převodníky
zdroje svě světla: – – – –
lasery svě světloemitují tloemitující diody (LED) výbojky (pro UV oblast - Xe) Xe) lampy (halogenové (halogenové, deuteriové deuteriové)
detektory pro měř eníí intenzity svě měřen světla: – fotoná fotonásobič sobiče - jsou nejcitivě nejcitivější, ší, nevýhodou je potř potřeba vysoké vysokého napě napětí – fotodiody „avalanche“ avalanche“ - o ně něco mé méně citlivé citlivé, vě větší šum – obyč než fotoná fotonásobič sobiče), vykazují vykazují obyčejné ejné fotodiody (1000x mé méně než větší šum (malý vnitř vnitřní odpor), velmi levné levné, mechanicky stabilní stabilní a vhodné vhodné zejmé zejména pro př přenosná enosná zař zařízení zení – fotodiodová rní řada fotodiodová pole - DAD „diode array detector“ detector“ - lineá lineární fotodiod vedle sebe (100 - 1000), profil intenzity v zá závislosti na úhlu dopadu (spektrum) – CCD prvky (videokamery) - ploš plošný profil intenzity, „image“ image“ techniky
21
Princip laseru
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation ('zesilová ('zesilování svě světla pomocí pomocí stimulované stimulované emise zá záření ení') svě ě tlo ve formě ě ú zké é ho svazku, je polarizované é , koherentní sv form zk polarizovan koherentní a monochromatické monochromatické slož složky: aktivní aktivní prostř prostřední ední, rezoná rezonátore, zdroj energie funkce: zdrojem energie je do aktivní aktivního mé média pumpová pumpována energie, vybudí vybudí elektrony, ty př hladinu vyzá při pá pádu na niž nižší energetickou vyzáří fotony. Fotony ná následně sledně He-Ne vrá ch elektronů í = zesilová á n í toku fotonů ů , jestliž ž e tok vrážejí ejí do další dalších elektronů, zase je vybudí vybud zesilov foton jestli laser dopadne na zrcadlo s odrazivostí odrazivostí 100% je zpá zpátky odraž odražen do zesilovací zesilovacího procesu, nebo narazí narazí na polopropustné polopropustné zrcadlo, které které paprsek propustí propustí aktivní aktivní prostř prostředí edí - oddě oddělené lené kvantové kvantové energetické energetické hladiny elektronů elektronů – – – –
plyn nebo smě směs plynů plynů (plynové (plynové lasery) monokrystal - hladiny vznikají vznikají dopová dopováním (pevnol (pevnoláátkové tkové) polovodič polovodič s pp-n př přechodem (diodových laserů laserů) polovodič polovodičové ové multivrstvy – jsou zá základem kvantových kaská kaskádní dních laserů laserů
přechod elektronů ho do niž elektronů z vyšší vyššího nižšího šího stavu př při souč současné asném vyzá vyzáření ení fotonu: – spontá spontánní nní emise (př (při ní nízké zkém stupni obsazení obsazení vyšší vyšší hladiny) – stimulovaná á emise (generace laserové é ho zá á ř ení stimulovan laserov z ení) - je tř třeba čerpá erpáním dosá dosáhnout tzv. populač populační inverze, kdy vyšší vyšší hladina je obsazena ví více elektrony než než niž nižší
Lasery
22
Fotonásobič
PMT, Photo Multiplier Tube citlivá citlivá el. souč součástka k registraci slabé slabého zá záření ení
princip:
– záření ení dopadají dopadající na fotokatodu z ní ní uvolní uvolní několik primá primární rních elektronů elektronů – v el. poli jsou tyto elektrony urychlová m elektrodá urychlovány k další dalším elektrodám (dynodá (dynodám), na kaž každé z nich uvolní uvolní další další sekundá sekundární rní elektrony icíích obvodech – vzniká silnější proud elektronů elektronů, který vyvolá vyvolá v měř měřic vzniká stá stále silně fotoná fotonásobič sobiče elektrický impulz
kaná kanálová lová konstrukce
Další fotodetektory
Fotorezistor – princip - vnitř vnitřní fotoelektrický jev, nelineá nelineární rní, pomalý (zá (závisí visí na osvě osvětlení tlení), sniž snižuje odpor s rostoucí rostoucím ozá ozáření ením – monokrystal polovodič polovodiče nebo polykrystalická polykrystalická tenká tenká vrstva (CdS (CdS)) nanesená nanesená na nosné ujícím př přístup nosné destič destičce, dva kontakty, hermetické hermetické pouzdro zaruč zaručují záření ení Fotodioda – PN a PIN, foton vstupují vstupující do polovodič polovodiče s dostateč dostatečnou energií energií může ůže být absorpová absorpován, př přičemž emž vzniklý volný elektron a dí díra vytvá vytváří v polovodič polovodiči napě napětí (fotovoltaický jev) nebo zvě zvětšují ují jeho vodivost (fotovodivostn (fotovodivostníí jev) – lavinové lavinové (avalanche) avalanche) PIN fotodiody - vykazují vykazují vlastní vlastní zesí zesílení lení. Toto zesí zesílení lení fotoproudu je způ způsobeno př přilož iložení ením napě napětí, které které urychluje dopadají při srá srážce s mř mřížkou dopadajícími fotony vzniklé vzniklé nosič nosiče ná náboje natolik, že př krystalu polovodič ch (sekundá polovodiče dojde k vyraž vyražení ení další dalších (sekundární rních) elektronů elektronů Fototranzistor – místo bá báze dopadá dopadá svě světlo, zesí zesílení lení 10 až až 100x
23
CCD detektor AvaSpec
Focussing mirror
Collimating mirror
Grating Slit, mode stripper
Detector SMA connector
Porovnání detekčních elementů Detector
TAOS 102
HAM256
HAM1024
SONY2048
Type
Photo diode array
CMOS linear array
CMOS linear array
CCD linear array
# Pixels, pitch
102, 85 µm
256, 25 µm
1024, 25 µm
2048, 14 µm
pixel width/height
77 x 85 µm
25 x 500 µm
25 x 500 µm
14 x 56 µm
Sensitivity (HL2000, 8 µm fiber)
3400 counts @ 5ms int. time (AvaSpec-102)
3000 counts @ 100 ms int. time
3000 counts @ 200 ms int. time
13000 counts @ 2ms int. time
Peak wavelength
750 nm
500 nm
500 nm
500 nm
Signal/Noise
1000:1
10.000 :1
10.000 :1
1000 :1
Dark noise
Ca. 11 counts
Wavelength range
360-1100 nm
200-1000 nm
200-1000 nm
200*-1100 nm
Frequency
2 MHz
330 kHz
330 kHz
2 MHz
Ca. 22 counts
24
Optické převodníky
pomocné pomocné prvky – – – – –
zrcadla (normá (normální lní, polopropustná polopropustná), hranoly mřížky, filtry štěrbiny, zá závěrky polarizá polarizátory, depolarizá depolarizátory lampy (halogenové (halogenové, deuteriové deuteriové)
svě světlovodné tlovodné prvky – planá planární rní (vrstvy) – cylindrické cylindrické (optická (optická vlá vlákna)
přesná esná výroba, nákladné kladné
Optická vlákna kritická kritická mez
šíř šíření ení paprsku ve svě světlovodu jádro (core) - index lomu n1 pláš ť (cladding) - n2, n2
úhel dopadu vě větší než než kritická kritická mez - paprsek se šíř šíří
úhel dopadu menší menší než než kritická kritická mez - paprsek se tlumí tlumí numerická numerická apertura - úhel dopadu menší menší než než kritická kritická mez
25
Měřící konfigurace
nejběž něji se optická nejběžn optická vlá vlákna v oblasti biosensorů biosensorů použ používají vají pro př přímé ozař ujíí na ozařová ování vzorků vzorků (extrinsic sensing), sensing), interakce se tedy uskutečň uskutečňuj konci vlá vlákna:
D
S dual fibre
D
vzorek
beam splitter S S
D D
bifurcated
M
Fotometrie
vlákna
I = I 0 exp(εcl )
optická kyveta
intenzita I0
I c
ln (I 0 / I ) =
A = εcl
D detektor
tloušťka l
Lambert-Beerův zákon
pokles intenzity (absorbce (absorbce)) svě světelné telného paprsku po prů průchodu kyvetou s barevnou lá á tkou je ú m ě rný koncentraci stanovované l stanovované látky v praxi se použ používá absorbance A, která která je př přímo úměrná rná koncentraci c (extinkč (extinkční koeficient ε při dané dané vlnové vlnové délce je konstantou úměrnosti) a velikosti l kyvety absorbance je bezrozmě bezrozměrná rná velič veličina (rozptyl svě světla se obvykle zanedbá zanedbává )
26
Fluorescence
intenzita I0
fluorescence (kolmo na excitač excitační paprsek)
I f = kΦ εcl zdroj svě světla
c
If
D
I0 >> If je využ využívána velmi často z důvodu detektor vysoké vysoké citlivosti absorbcí bsorbcí energie př přechá echází molekula do excitované excitovaného stavu, ná návrat do zá základní kladního stavu je prová provázen emisí emisí záření ení – fluorescence intenzita fluorescence If závisí ku visí na absorbanci a kvantové kvantovém výtěž výtěžku Φ emisní m misní spektrum lá látky je oproti excitač excitačnímu posunuto k vyšší vyšším vlnovým dé ův posuv) délká lkám (Stokes (Stokesů pro budí budící záření ení se často použ používá svě světlo laseru, je také také výhodné výhodné použ používat polarizované polarizované záření ení
Měřící konfigurace
při tzv. intrinsic sensing optický vodič vodič neslouž neslouží jen pasivně pasivně pro vedení vedení svě světla, ale chemické chemické změ změny v tě těsné sném okolí okolí svě světlovodu se sledují sledují na zá základě kladě vyvolaných změ změněných podmí podmínek pro vedení vedení uvnitř uvnitř svě světlovodu
Při vedení vedení svě světla uvnitř uvnitř svě světlovodu dochá dochází k interferenci mezi dopadají dopadajícím a odraž odraženým svě světelným paprskem a tí tím vzniká vzniká elektromagnetické elektromagnetické stojaté stojaté vlně vlnění kolmé kolmé k odrá odrážejí ejícímu povrchu (tlumená tlumená vlna, evanescent wave) V tenké tenkém svě světlovodu př připadá ipadá na jednotku dé délky mnohem ví více odrazů odrazů. Svě Světlo se zač začíná šíř šířit pouze v urč určitých diskré diskrétní tních modech, daných pouze urč určitými úhly dopadu. Mody lze urč určit na zá základě kladě prů průměru svě světlovodu, indexů indexů lomu a vlnové vlnové délky svě světla. Za tě těchto podmí podmínek se mimo jiné jiné zachová zachovává fázová zová koherence laserové laserového paprsku.
27
Exponenciální vlna
mod:
0
z
1
E
2
elektromagnetická elektromagnetická vlna se šíř šíří do okolí okolí mimo svě světlovod, tlovod, př přitom její její intenzita klesá klesá exponenciá exponenciálně lně se vzdá vzdáleností leností od rozhraní rozhraní („exponenciá exponenciální lní vlna“ vlna“) na vně vnějším ším povrchu svě světlovodu může ůže dochá docházet k interakcí interakcím s př přítomnými lá látkami energetické energetické profily exponenciá exponenciální lní vlny jsou pro tř tři zá základní kladní mody uká ukázány na obrá obrázku pro vyšší vyšší mody narů narůstá stá podí podíl „vně vnější energie“ energie“ a zvě zvětšuje se penetrač penetrační hloubka.
Enzymové optody
Přímé typy - opticky měř enáá látka (nejč měřen (nejčastě astěji fluorofor) fluorofor) se př přímo vyskytuje v biokatalytické biokatalytické reakci. NADH - pomě poměrně rně „slabý“ slabý“ fluofor (Φf = 0.02), extinkč extinkční a emisní emisní maxima jsou při 350 a 450 nm. nm. Biorekognič Biorekogničním elementem jsou dehydrogenasy imobilisované imobilisované před koncem optické optického vlá vlákna. Aby se i koenzym dal zachytit v systé systému biosensoru, biosensoru, použ používá se jeho konjugá konjugát s polyethylenglykolem, polyethylenglykolem, který neprochá membránou. Výhodná Výhodná je konstrukce sensoru pro alkohol, neprochází dialysač dialysační membrá kde je vzorek oddě oddělen mikroporé mikroporézní zní teflonovou membrá membránou, NADH se nachá nachází ve vnitř vnitřním roztoku sensoru. sensoru. Existuje řada pokusů pokusů využ využít fluorescenci flavinových koenzymů koenzymů (FADH2, FMNH2) vá vázaných pevně pevně v molekule mnoha oxidas. oxidas. Př Při vyšší vyšší koncentraci substrá substrátu se zpomaluje zpě zpětná tná oxidace redukované redukované formy kyslí kyslíkem a intensita „vnitř vnitřní“ (intrinsic) intrinsic) fluorescence redukované redukovaného koenzymu narů narůstá stá. Výhodou je reversibilita takové takového systé systém U sensorů sensorů využ využívají vajících celé celé buň buňky se sleduje vnitř vnitřní fluorescence NADH (je úměrná rná metabolické metabolické aktivitě aktivitě). Chlorofylové Chlorofylové optické optické sensory se konstruují konstruují pro detekci toxicity pů působené sobené látkami inhibují inhibujícími fotosysté fotosystém u rostlin.
28
Enzymové optody
Nepř Nepřímé („mediované mediované“, extrinsic) extrinsic) optické optické biosensory využ využívaji optické optické indiká eníí kyslí indikátory. Nejč Nejčastě astější jsou optické optické sensory pro měř měřen kyslíku a pH. pH. sledová eníí fluorescence indikač sledování kyslí kyslíku využ využívá zháš zhášen indikační molekuly, pokles intensity fluorescence je dá dán SternStern-Volmerovým vztahem:
I f = I f 0 /(1 + K SV [O 2 ])
Indiká Indikátor se obvykle nachá nachází v silikonové silikonové vrstvě vrstvě před čelem optické optického vlá vlákna. Nejč Nejčastě astěji se použ používá kyselina pyrenmá pyrenmáselná selná (pyrenebutyric acid, acid, PBA), PBA), excitace př dekacyklen, při 350 až až 400 nm; nm; další alší mož možnosti jsou perylen a dekacyklen, organokovové organokovové komplexy ruthenia lze výhodně výhodně excitovat př při 460 nm, nm, takž takže jako zdroj mů může slouž sloužit modrá modrá LED. (CH2)3COOH
PBA
pH změ změny lze sledovat pomocí pomocí acidobasických indiká indikátorů torů. Z fluorescenč fluorescenčních lze použ použít např např. 1-hydroxypyrenhydroxypyren-3,6,83,6,8-trisulfonovou kyselinu (HPTS, pH př přechod 5 až až 8) nebo 44-methylmethylumbelliferon. Absobč Absobčních indiká indikátorů torů je celá celá řada, kresolová kresolová zeleň zeleň a bromthymolová bromthymolová modř modř.
Luminiscence
k1 k2 A ⎯⎯→ B* ⎯⎯→ X + hν
aktivace
rozpad
je to emise svě světla z molekuly v excitované excitovaném stavu, který vznikl jako dů důsledek chemických reakcí reakcí kvantový výtěž ek luminiscence odpoví výtěžek odpovídá podí podílu poč počtu vyzá vyzářených fotonů fotonů a excitovaných molekul, molekul, u přírodní rodních systé systémů může ůže dosahovat až až 90% intenzita I vyzař vyzařované ovaného svě světla je zá závislá vislá na čase, v urč určité itém okamž okamžiku prochá prochází maximem (t (tmax)
k2 k1 = k2 − k1 ln
I ≈ [A0 ]
k1k2 [exp( − k1t ) − exp( − k2t ) k1 − k2
tmax
vztah mezi luminiscencí luminiscencí a lá látkovým množ množství stvím analytu se urč určí kalibrací kalibrací
29
Chemiluminiscence
účinnost luminiscence zá ku reakce poskytují závisí visí na chemické chemickém výtěž výtěžku poskytující aktivovaný meziprodukt (B*), podí podílu excitovaných molekul a koneč konečně na fluorescenč fluorescenčním výtěž ku (ten by se mě výtěžku měl blí blížit 1) aktivovaný meziprodukt je výhodně výhodnější v singletové singletovém stavu; delší delší životnost tripletové tripletového stavu zvyš zvyšuje pravdě pravděpodobnost„ podobnost„zhasnutí“ zhasnutí“ ve vedlejší vedlejší reakci. pro citlivou detekci peroxidu vodí vodíku se použ používá luminol (5(5-aminoamino-2,32,3dihydroftalazin1,4dion); ); intensita svě ě tla je ú m ě rná á koncentraci H dihydroftalazin 1,4 dion sv rn 2O2, jako katalyzá á tor se můž ůže e uplatnit ferrikyanid, , hemin nebo v neutrá á lní í m prostř katalyz m ferrikyanid neutr ln prostředí edí peroxidasa, , v nevodné é m prostř ř edí í vyvolá á luminiscenci jen kyslí í k a bá á ze peroxidasa nevodn prost ed vyvol kysl b celkový výtěž ek je pouze 0.01 (š výtěžek (špatná patná fluorescence) O
-
NH NH NH2
COO
-
+H2O2 +OH
*
N2 -
C OO
katalyzátor
-N2
hν + 3-aminoftalát
NH2
O
Bioluminiscence emise svě světla př při (bio)chemické (bio)chemické reakci v živé ivém organismu (cca 1000 druhů druhů) se účastní astní enzymy luciferasy; luciferasy; tyto enzymy štěpí substrá substrát luciferin (rů (různé zné druhy dle organismu), př přičemž emž dochá dochází k emisi svě světla svě světluš tluška (firefly, firefly, Photinus pyralis) pyralis) COOH Luciferin luciferasa (EC 1.13.12.7) oxiduje N N přísluš slušný luciferin za účasti ATP, H emise př ek asi 0.88 !: při 560 nm, nm, výtěž výtěžek S S HO
ATP + luciferin + O2
AMP + PP + oxyluciferin + CO2 + hν
moř mořské ské bakterie (Vibrio fischeri, V. harveyi, Photobact. Photobact. phosphoreum) luciferasa (EC 1.14.14.3) až až 5% obsahu buň buňky, oxiduje aldehydy (> (>C8, dekanal, tetradekanal); v buň buňce obsahují obsahují i NAD(P)H:FMN oxidoreduktasu:
NAD(P)H + FMN + H+
NADH oxidoreduktasa Luciferasa
FMNH2 + R-CHO + O2
NAD(P)+ + FMNH2
FMN + R-COOH + H2O + hν
což uje napojení což umožň umožňuje napojení na dehydrogenasy - spolu s bakt. luciferasou jsou imobilisová imobilisovány na konec optické optického vlá vlákn
30
Aplikace bioluminiscence
citlivá citlivá detekce ATP - 10–12 M, stanovení stanovení biomasy stanovení stanovení s účastí astí ATP (kreatin kinasa, kinasa, ATPasa, ATPasa, pyruvá pyruvát kinasa, kinasa, ...) specifická specifická detekce druhu mikroorganismů mikroorganismů pomocí pomocí bakteriofá bakteriofágů nesoucí nesoucích lux gen (z Vibria, u svě světluš tlušek luc geny) citlivá kých kovů citlivá detekce těž těžkých kovů (rtuť (rtuť, arsen): genový konjugá konjugát mermerlux (mer je promotor aktivovaný Hg) Hg) je vpraven do plasmidů plasmidů v E. coli, coli, v př přítomnosti rtuti se aktivuje, probě proběhne exprese luciferasy a následuje luminiscence, citlivost 200 nM rtuti stanovení stanovení Ca2+ - působí sobí rozpad a luminiscenci fotoproteinu (peroxoforma luciferinu vá vázáná v komplexu s luciferasou, luciferasou, Aequorea) Aequorea)
Zhodnocení optod
Výhody:
není není třeba referentní referentní prvek imobilizovaná imobilizovaná fáze nemusí nemusí být ve fyziká fyzikální lním kontaktu s optickým systé systémem (snadná (snadná výmě výměna biovrstvy) biovrstvy) stabilní stabilní kalibrace (zvláš (zvlášttě při použ použití ití dvou vlnových dé délek) souč současně asně mohou reagovat na ně několik analytů analytů (rů (různé zné reagenty, reagenty, rů různé zné vlnové vlnové délky) - vysoká vysoká hushus-tota přenosu informací informací nemají eníí na nemají vliv interference elektromagnetické elektromagnetické povahy (lze prová provádět měř měřen velké velké vzdá vzdálenosti) při použ ivém organismu nehrozí nehrozí elektrický šok (př (při zkratu) použití ití v živé
Nevýhody:
není eníí intenzity svě není reference př při měř měřen světla (sví (svítivost zdroje kolí kolísá), proto je třeba kalibrace ve dvou bodech dynamický rozsah je omezený (pro pH 2 až až 6 řádů, elektrochemicky 12!) odezvy jsou často pomalé pomalé dlouhodobá dlouhodobá stabilita je limitová limitována vyč vyčerpá erpáním indiká indikátoru (fotorozklad (fotorozklad,, radě raději "sví "svítit" mé méně intenzivně intenzivně) vadí vadí svě světlo z okolí okolí
31
Kalorimetrické biosensory
využ využívají vají změ změny teploty v prů průběhu enzymových reakcí reakcí (ně (některé které typické typické příklady jsou uvedeny v tabulce). Př e Při konstrukci biosensorů biosensorů to je spíš spíše okrajová okrajová zálež ležitost, ale existují existují některé které analyty, analyty, pro které které mohou být kalorimetrické kalorimetrické převodní evodníky zvláš zvlášttě výhodné výhodné. Meze detekce bývají bývají do 10 µM, rozliš rozlišení ení 0.001 °C; vývoj tepla př při biochemických reakcí reakcích (– (–kJ/mol): kJ/mol):
Katalasa H2O2 100
GOD glukosa 80
Hexokinasa Laktá Laktát DH glukosa pyruvá pyruvát 28 62
Ureasa moč močovina 61
Urikasa kys. kys. moč močová ová 49
pokud vlastní vlastní reakce s analytem neuvolň neuvolňuje teplo, lze zař zařadit ná následný krok uvolň uvolňují ující teplo: oxidasa ⎯⎯→ ⎯⎯→ H2O2 ⎯⎯→ ⎯⎯→ katalá kataláza hydrolasy ⎯⎯→ ⎯⎯→ anion + H+ ⎯⎯→ ⎯⎯→ hydratace na H3O+
hydratač hydratační teplo protonu činí iní v Tris pufru ∆H = –48 kJ/mol, kJ/mol, ve fosfá fosfátu je ∆H = –4.7 kJ/mol kJ/mol recyklač ujíí produkci tepla ně recyklační pochody umožň umožňuj několikaná kolikanásobně sobně zvýš zvýšit
Termistor
převodní evodníkem je obvykle termistor, jeho odpor R zá závisí visí na teplotě teplotě T: 1/T = a + b ln R + c (ln (ln R)2
Enzymový reaktor s termistorem
často se pracuje v prů průtoč točném syté sytému s enzymovým reaktorem tepelně tepelně izolovaným od okolí okolí použ použití ití diferenciá diferenciální lního uspoř uspořádání umožň uje pracovat př umožňuje při teplotě teplotě místnosti měřen ení í odporu termistoru se prová ěř provádí pomocí í Wheatstoneova m ů stku pomoc jiný př e být termoč převodní evodník můž může termočlánek (CMOS)
Výhodou je, že nevadí nevadí částice ve vzorku, interferují interferující látky nebo zbarvení zbarvení. Někdy také kopá ádné také jiné jiné metody mohou být dost těž těžkop dné, např např. stanovení stanovení triglyceridů triglyceridů lipá lipázou se sleduje kalorimetricky velmi výhodně výhodně
32
