BIODEGRADASI LIMBAH MINYAK BERAT MENGGUNAKAN ISOLAT TUNGGAL DAN CAMPURAN DENGAN TAMBAHAN ALKILBENZENA SULFONAT LINEAR
JOKO GITOYO TARIGAN
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
2010
ABSTRAK JOKO GITOYO TARIGAN. Biodegradasi Limbah Minyak Berat Menggunakan Isolat Tunggal dan Campuran dengan Tambahan Alkilbenzena Sulfonat Linear. Dibimbing oleh AHMAD SJAHRIZA dan CHARLENA. Tumpahan minyak sering terjadi dalam kegiatan industri perminyakan yang dapat mencemari lingkungan. Bioremediasi adalah salah satu metode paling aman untuk mengangani lingkungan yang tercemar minyak bumi dengan memanfaatkan bakteri. Bakteri diisolasi dari tanah yang tercemari minyak berat yang diberi kotoran sapi dan kuda. Proses biodegradasi ditingkatkan dengan penambahan alkilbenzena sulfonat linear (LAS). Tiga isolat terbaik dan kombinasinya diaplikasikan untuk mendegradasi limbah minyak berat dengan tambahan alkilbenzena sulfonat linear. Parameter yang diamati adalah Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) padat, TPH cair, Total Plate Count (TPC), Kebutuhan Oksigen Kimiawi (KOK), dan pH. MY7, MY12, dan MYFlr dipilih sebagai 3 isolat terbaik karena memiliki nilai persentase degradasi yang paling tinggi, yaitu 32.26, 58.25, dan 40.74%. Penambahan alkilbenzena sulfonat linear mampu meningkatkan kelarutan minyak bumi di dalam air sehingga terjadi penurunan nilai TPH padat, kenaikan TPH cair, serta kenaikan nilai KOK. Nilai TPH padat pada kombinasi tiga isolat hari ke-21 sebesar 2.33% (b/b), nilai TPH cair sebesar 1.68% (b/v), dan nilai KOK sebesar 246456 mg/mL. Persentase degradasi kombinasi tiga isolat hari ke-21 adalah 81.56%. Kombinasi tiga isolat lebih mampu mendegradasi limbah minyak berat dibandingkan isolat tunggal.
ABSTRACT JOKO GITOYO TARIGAN. Biodegradation of Heavy Oil Waste using Single and Mixed Isolates with Linear Alkyl Benzene Sulphonate Addition. Supervised by AHMAD SJAHRIZA and CHARLENA. Oil spill incident in petroleum industry is inevitability event that caused environmental pollution. Bioremediation is one of the safe methods to handle petroleum polluted environment using bacterial activity. Bacterial were isolated from polluted soil and nourishment by cow and horse manure. The degradation process was improved with linear alkyl benzene sulphonate. The best three isolated microbes and its combination were applied to degrade heavy oil waste combined with linear alkyl benzene sulphonate. The observation parameters were solid Total Petroleum Hydrocarbon (TPH), liquid TPH, Total Plate Count (TPC), Chemical Oxygen Demand (COD), and pH. MY7, MY12, and MYFlr were selected as the best three isolated microbes as shown by their highest percentage of degradation, namely 32.26, 58.25, and 40.74%. The addition of linear alkyl benzene sulphonate proved to augment oil solubility in water, as shown by decreasing solid TPH, increasing liquid TPH, and increasing COD. The value of solid TPH of the three isolate combination in day-21 were 2.33% (w/w), liquid TPH were 1.68% (w/v), and COD were 246456 mg/mL. The degradation level of the three isolate combinations in 21 day-21 was 81.56%. The bacterial combination showed higher degradation level of the waste as compared to that ot the single microbe.
BIODEGRADASI LIMBAH MINYAK BERAT MENGGUNAKAN ISOLAT TUNGGAL DAN CAMPURAN DENGAN TAMBAHAN ALKILBENZENA SULFONAT LINEAR
JOKO GITOYO TARIGAN
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul Nama Nrp
: Biodegradasi Limbah Minyak Berat Menggunakan Isolat Tunggal dan Campuran dengan Tambahan Alkilbenzena Sulfonat Linear : Joko Gitoyo Tarigan : G44204080
Menyetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Drs. Ahmad Sjahriza NIP 196204081989031002
Dra. Charlena, M.Si NIP 196712221994032002
Mengetahui Ketua Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 195012271976032002
Tanggal lulus :
PRAKATA Segala puji syukur dan hormat bagi Tuhan Yesus Kristus atas kasih dan anugerahNya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini berjudul Biodegradasi Limbah Minyak Berat Menggunakan Isolat Tunggal dan Campuran dengan Tambahan Alkilbenzena Sulfonat Linear, yang dilaksanakan pada bulan Februari 2009 sampai Desember 2009 bertempat di Laboratorium Terpadu, Kampus IPB Baranangsiang. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Drs. Ahmad Sjahriza dan Ibu Dra. Charlena, M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan arahan serta masukan dalam menyusun karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak, Mamak, Kak Fitri, dan Ica yang senantiasa memberikan dukungan selama ini. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Kak Zacky, Kak Maksudin, Kak Dewi, serta Ratna yang selalu membantu. Rekan-rekan di tim Bioremediasi (Kak Asriqa, Kak Andjar, Rony, Yockie, Noviadi, Niken, Eka), Anto, Budi, Aprian, dan Dede, terima kasih atas semangat yang telah ditunjukkan dan diberikan. Semoga Tuhan senantiasa membalas setiap kebaikan yang diberikan. Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat berguna bagi para pembaca, Amin.
Bogor, Januari 2010
Joko Gitoyo Tarigan
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kabanjahe, 24 Juli 1987 sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, putra dari pasangan Krisno Tarigan dan Pasta br. Ginting. Tahun 2004 penulis lulus dari SMA Negeri 8 Bandung dan melanjutkan studi di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis melakukan praktik lapangan di Puslitbang Gizi dan Makanan, Jalan Dr. Semeru 63, Bogor. Adapun judul laporannya adalah Fortifikasi dan Analisis Besi pada Beras dengan Spektrofotometri UV-Vis. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum, Kimia Fisik Layanan S –1 Biokimia 2006/2007, Kimia Fisik Layanan S–1 Ilmu Teknologi Pangan 2007/2008. Selain itu, Penulis juga aktif di Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) PMK IPB dan menjadi pengajar sukarela untuk Mata Ajaran Pendidikan Agama Kristen (PAK) di SMA Negeri 8 Bogor dari Tahun 2006 sampai 2008.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR GAMBAR............................................................................ ................ vii DAFTAR TABEL ............................................................................................. vii DAFTAR LAMPIRAN.........................................................................................viii PENDAHULUAN....................................................................................................1 TINJAUAN PUSTAKA...........................................................................................1 Minyak Bumi ............................................................. ...................................... 1 Limbah Minyak Bumi ............................................................................. ......... 2 Bioremediasi ................................................................................ .................... 2 Degradasi Hidrokarbon oleh Mikroorganisme ......................................... ......... 3 Surfaktan dan Alkilbenzena Sulfonat Linier ........................................... ......... 4 BAHAN DAN METODE .................................................................................... 4 Bahan dan Alat ................................................................................................. 4 Pembiakan Isolat (Hadioetomo 1998)................................................................ 4 Penyiapan inokulan pada Media Kaya dan Media Minimal ............................... 5 Seleksi Isolat ..................................................................................................... 5 Aplikasi Isolat Tunggal dan Kombinasi Isolat pada Tanah Tercemar dengan Penambahan Alkilbenzena Sulfonat Linear .................................................................. 5 Pengukuran TPH Cair (U.S. EPA Method 1999) ............................................... 5 Pengukuran TPH Padat (U.S. EPA Method 1998) ............................................. 5 Total Plate Count (TPC) (Hadioetomo 1998) .................................................... 6 Analisis KOK (Clesceri et al. 2005) .................................................................. 6 Analisis pH ....................................................................................................... 6 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 6 Inokulan pada Media Kaya dan Media Minimal ................................................ 6 Seleksi Isolat ..................................................................................................... 7 Pengujian Isolat ................................................................................................ 9 Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) .............................................................. 10 Total Plate Count (TPC) ................................................................................. 10 Kebutuhan Oksigen Kimia (KOK) .................................................................. 11 pH................................................................................................................... 11 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 12 Simpulan......................................................................................................... 12 Saran............................................................................................................... 12 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 12 LAMPIRAN ...................................................................................................... 14
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Limbah Minyak Berat ..................................................................................... 2 2 Struktur alkilbenzena sulfonat linear ............................................................... 4 3 MY 12 dan blanko setelah 3 hari ..................................................................... 6 4 MY 12 (a) dan blanko (b) setelah 21 hari ........................................................ 7 5 Perubahan nilai TPH padat (a), TPH cair (b), Persentase degradasi (c), TPC (d), KOK (e), dan pH (f)................................................................................. 8 6 Mekanisme reaksi senyawa benzena menjadi aldehida .................................... 9 7 Pengujian Isolat pada media minimal dengan solar 5% tanpa LAS (a) dan dengan LAS (b) setelah 3 hari ........................................................................ 9 8 Perubahan nilai TPH padat (a), TPH cair (b), dan persentase degradasi (c) dengan penambahan LAS ............................................................................. 10 9 Jumlah koloni isolat dengan penambahan LAS.............................................. 11 10 Nilai KOK dengan penambahan LAS ........................................................... 11 11 Nilai pH isolat dengan penambahan LAS ..................................................... 11
DAFTAR TABEL Halaman 1 Produk minyak bumi berdasarkan kelas hidrokarbonnya .................................. 2 2 Komposisi media kaya dan media minimal ...................................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian ..................................................................................... 15 2 Komposisi media Marine agar (Atlas 1995) .................................................. 16 3 Data pengukuran TPH padat pada seleksi isolat ............................................. 17 4 Data pengukuran TPH cair pada seleksi isolat ............................................... 18 5 Data pengukuran persentase degradasi pada seleksi isolat ............................. 19 6 Data pengukuran KOK pada seleksi isolat ..................................................... 20 7 Data pengukuran TPC pada seleksi isolat ...................................................... 21 8 Data pengukuran pH pada seleksi isolat ........................................................ 21 9 Data pengukuran TPH padat pada aplikasi isolat ........................................... 22 10 Data pengukuran TPH cair pada aplikasi isolat .............................................. 23 11 Data pengukuran persentase degradasi pada aplikasi isolat ............................ 24 12 Data pengukuran KOK pada aplikasi isolat ................................................... 25 13 Data pengukuran TPC pada aplikasi isolat ..................................................... 26 14 Data pengukuran pH pada seleksi isolat ........................................................ 26
PENDAHULUAN Kegiatan industri perminyakan, mulai dari eksplorasi, eksploitasi, pengolahan sampai pengangkutan semakin meningkat. Hal ini sejalan dengan meningkatnya kebutuhan manusia akan minyak bumi sebagai sumber energi yang utama, terutama dalam pengembangan industri, transportasi, dan rumah tangga. Indonesia sebagai salah satu negara penghasil minyak bumi memproduksi 1320 juta barrel per hari untuk memenuhi permintaan minyak dunia (Zacky 2005). Namun, selama kegiatan industri perminyakan sering terjadi tumpahan atau buangan baik secara sengaja maupun tidak sengaja yang dapat mencemari lingkungan (Udiharto 1996). Sebenarnya lingkungan itu sendiri memiliki kemampuan untuk mendegradasi senyawa-senyawa pencemar yang masuk ke dalamnya melalui proses biologis dan kimiawi. Namun, sering kali beban pencemaran di lingkungan lebih besar dibandingkan dengan kecepatan proses degradasi zat pencemar tersebut secara alami. Akibatnya, zat pencemar akan terakumulasi sehingga dibutuhkan campur tangan manusia dengan teknologi yang ada untuk mengatasi pencemaran tersebut (Nugroho 2006). Salah satu metode paling cepat dan aman bagi lingkungan adalah degradasi limbah minyak bumi dengan memanfaatkan mikroorganisme atau biasa disebut bioremediasi. Keberadaan mikroorganisme (bakteri, jamur, dan khamir) pendegradasi hidrokarbon tersebar luas di alam. Mikroorganisme tertentu dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon dan menggunakannya sebagai sumber energi (Nurhariyani et al. 2006). Tidak semua mikroorganisme dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon minyak bumi, hanya mikroorganisme yang dapat beradaptasi dengan senyawa hidrokarbon yang dapat melakukannya. Mikroorganisme pendegradasi senyawa hidrokarbon dapat diisolasi dari tanah atau lingkungan yang tercemar minyak bumi ataupun diisolasi dari tanah setelah ditambahkan mikroorganisme pengurai untuk melengkapi mikroorganisme yang telah ada. Isolat-isolat ini dapat digunakan untuk mendegradasi senyawa hidrokarbon secara spesifik, baik dalam keadaan tunggal maupun campuran. Menurut Hikmatuloh (2004), kombinasi antara kedua isolat atau lebih memiliki kemampuan mendegradasi yang lebih baik dibandingkan dengan isolat tunggalnya. Hal ini ditunjukkan
dengan kekeruhan kombinasi isolat (Pseudomonas aeruginosa + Enterobacter agglomerans ) lebih cepat dibanding dengan isolat tunggal (Pseudomonas aeruginosa dan Enterobacter agglomerans). Biodegradasi akan lebih cepat terjadi apabila minyak berada dalam bentuk dispersi. Minyak bumi akan lebih mudah terdispersi dalam air bila ditambahkan surfaktan. Surfaktan memiliki gugus polar dan nonpolar dalam satu molekulnya. Surfaktan akan mengikat minyak pada gugus nonpolar dan air pada gugus polar sehingga memudahkan bakteri kontak dengan sumber karbon sebagai makanannya. Penelitian Poloroso (2005), menunjukkan bahwa alkilbenzena sulfonat linear (LAS) mampu meningkatkan kinerja mikroorganisme pendegradasi hidrokarbon. Hal ini terlihat dari peningkatan persentase degradasi pada minggu ke-3 sebesar 18.09% (tanpa penambahan surfaktan) menjadi 21.94% setelah ditambah surfaktan. Semakin tinggi stabilitas emulsi dari suatu surfaktan maka mikroorganisme akan semakin mudah mendegradasi hidrokarbon. Penelitian Rony (2009) menunjukkan bahwa stabilitas emulsi alkilbenzena sulfonat linear (LAS) optimum pada konsentrasi 0.04%. Oleh karena itu dalam penelitian ini akan diuji kemampuan isolat tunggal dan campuran dalam mendegradasi limbah minyak berat dengan penambahan alkilbenzena sulfonat linear (LAS).
TINJAUAN PUSTAKA Minyak Bumi Minyak bumi terbentuk sebagai hasil akhir dari penguraian bahan-bahan organik (sel-sel dan jaringan hewan/tumbuhan laut) yang tertimbun selama berjuta tahun di dalam tanah, baik di daerah daratan atau pun di daerah lepas pantai. Minyak bumi terbentuk melalui proses yang sangat lambat dan memerlukan waktu yang sangat lama sehingga minyak bumi digolongkan sebagai sumber daya alam yang tidak dapat diperbaharui (Hadi 2003). Minyak bumi merupakan campuran senyawa hidrokarbon dengan senyawaan organik dari sulfur, oksigen, nitrogen dan senyawa-senyawa yang mengandung konstituen logam terutama nikel, besi, dan tembaga (Giwangkara 2007). Minyak bumi sendiri bukan merupakan bahan yang sederhana, melainkan berkomposisi yang sangat bervariasi, tergantung pada
lokasi, umur lapangan minyak, dan juga kedalaman sumur. Komponen hidrokarbon dalam minyak bumi diklasifikasikan atas tiga golongan, yaitu golongan parafinik (alkana), golongan naftenik (sikloalkana), dan golongan aromatik . Alkana memiliki rantai lurus dan bercabang. Fraksi ini merupakan yang terbesar di dalam minyak mentah. Sikloalkana ada yang memiliki cincin 5 (lima), yaitu siklopentana ataupun cincin 6 (enam), yaitu sikloheksana. Senyawa aromatik hanya terdapat dalam jumlah kecil, tetapi sangat diperlukan dalam bensin karena stabilitas penyimpanan yang baik serta kegunaannya yang lain sebagai bahan bakar (Zuhra 2003). Senyawa-senyawa hidrokarbon berkaitan dengan jenis produk minyak bumi yang dihasilkan (Udiharto 1996). Hal ini dapat dilihat dari komposisi masing-masing produk (Tabel 1).
lingkungan. Minyak berat yang mencemari lingkungan perairan maupun daratan disebut limbah minyak berat atau heavy oil waste (HOW). Tanah yang terkontaminasi minyak berat memiliki warna hitam pekat (Gambar 1). Minyak berat mempunyai densitas yang tinggi, yaitu lebih dari 5% (b/v). Minyak berat mengandung senyawa aromatik dan sikloalkana dengan jumlah yang jauh lebih tinggi dibandingkan hidrokarbon rantai lurusnya (alkana). Minyak berat juga mengandung nitrogen, sulfur, oksigen, dan logam berat. Minyak berat memiliki lebih dari 35 atom karbon sehingga bobot molekul dan titik didihnya juga cukup tinggi (Giwangkara 2007).
Limbah Minyak Bumi Selama kegiatan industri perminyakan mulai dari pengeboran, produksi, transportasi minyak bumi, pengilangan, dan transportasi produk minyak umumnya terjadi tumpahan maupun ceceran minyak bumi dan produkproduknya yang terjadi di lingkungan lahan maupun perairan. Dalam kondisi normal, limbah yang terbuang ke lingkungan tidak terlalu besar tetapi apabila terjadi kecelakaan akan berakibat lain seperti yang terjadi di beberapa tempat di dunia. Tabel 1 Produk minyak bumi berdasarkan kelas hidrokarbonnya Produk
Bensin
6−10
Kerosin
11−12
Minyak diesel ringan
12−18
Minyak diesel berat
18−25
Kelas hidrokarbon Alkana rantai normal dan bercabang Alkana dan sikloalkana Campuran alkana, sikloalkana, dan aromatik Sikloalkana, olefin, dan campuran aromatik Polisiklik
Pelumas Aspal
25−38 ≥38
Poliaromatik Polisiklik berat
Gas
Jumlah rantai karbon 1−5
Sumber: Baker dan Herosn (1994)
Minyak berat atau heavy oil merupakan salah satu jenis minyak mentah yang dapat tumpah atau tercecer dan mencemari
Gambar 1 Limbah Minyak Berat. Bioremediasi Bioremediasi merupakan penggunaan mikroorganisme hidup untuk mendegradasi kontaminan-kontaminan pada lingkungan daratan atau perairan menjadi bahan yang tidak beracun. Sering kali mikroorganisme ini merupakan mikroorganisme indigenous dan dapat diadaptasikan pada lingkungan tercemar lainnya dengan bahan kimia yang sama sebagai pencemarnya. Mikroorganisme tersebut akan terus mengubah senyawa kontaminan tersebut sehingga nutrien yang ada di lingkungan itu mencapai batas minimum (Vidali 2001). Metode ini sangat menguntungkan, alami, murah, lebih fleksibel, dan mudah untuk digandakan skalanya dalam penanganan limbah dalam jumlah yang besar. Bioremediasi dapat dilaksanakan di lingkungan terjadinya pencemaran tanpa menimbulkan kerusakan serta dapat mengurangi limbah secara permanen dan dapat digabungkan dengan teknik penanganan secara fisik dan kimia. Namun bioremediasi juga memiliki batasan, beberapa senyawa kimia tidak dapat untuk didegradasi seperti logam berat dan beberapa senyawa klor. Dalam beberapa kasus, metabolisme
bakteri dapat memproduksi senyawa metabolit yang beracun (Boopathy 2000) Bioremediasi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara in situ dan ex situ. Bioremediasi in situ disebut juga dengan intrinsic bioremediation atau natural attenuatio, pada prinsipnya adalah suatu proses bioremediasi yang hanya mengandalkan kemampuan mikroorganisme indigenous yang telah ada di lingkungan tercemar limbah untuk mendegradasinya. Bioremediasi ex situ merupakan proses bioremediasi yang dilakukan dengan cara memindahkan kontaminan ke suatu tempat untuk memberikan beberapa perlakuan. Pemilihan konsep perancangan bioremediasi ditentukan oleh lokasi kontaminan, kondisi hidrogeologi setempat, dan kendala-kendala di lokasi. Bioremediasi tanah bisa ditingkatkan efisiensinya dengan mengubah sampel (tanah tercemar) dari fase padat menjadi slurry atau fase cairan. Sistem bioslurry lebih menguntungkan karena sampel/substrat dapat ditingkatkan degradasinya dikarenakan kontak antara kontaminan dan mikroorganisme, pencampuran yang efektif, dan pemeliharaan populasi bakteri yang tinggi (Sarma et al. 2006). Sebuah bioreaktor slurry mengandung slurry encer yang dibuat dengan mengombinasikan tanah, sedimen atau lumpur dengan air. Campuran ini diaerasi dan diagitasi masing-masing dalam sistem tertutup untuk jangka waktu tertentu. Landfarming atau juga dikenal sebagai land treatment merupakan sebuah teknologi remediasi untuk tanah yang dapat menurunkan konsentrasi unsur-unsur utama minyak bumi melalui biodegradasi. Teknologi ini biasanya meliputi penyebaran galian tanah yang tercemar di dalam sebuah lapisan tipis pada permukaan tanah dan merangsang aktivitas mikroorganisme secara aerobik di dalam tanah melalui aerasi dengan penambahan mineral dan nutrisi. Peningkatan aktivitas mikroorganisme dihasilkan dalam mendegradasi adsorben produk minyak bumi melalui respirasi mikroorganisme. Degradasi Hidrokarbon oleh Mikroorganisme Di dalam minyak bumi terdapat dua macam komponen yang dibagi berdasarkan kemampuan mikroorganisme untuk menguraikannya, yaitu komponen minyak bumi yang mudah diuraikan oleh mikroorganisme dan komponen yang sulit
didegradasi oleh mikroorganisme. Komponen minyak bumi yang mudah didegradasi oleh bakteri merupakan komponen terbesar dalam minyak bumi atau mendominasi, yaitu alkana yang bersifat lebih mudah larut dalam air dan terdifusi ke dalam membran sel bakteri. Jumlah bakteri yang mendegradasi komponen ini relatif banyak karena substratnya yang melimpah di dalam minyak bumi. Isolat bakteri pendegradasi komponen minyak bumi ini biasanya merupakan pengoksidasi alkana normal. Komponen minyak bumi yang sulit didegradasi merupakan komponen yang jumlahnya lebih kecil dibanding komponen yang mudah didegradasi. Hal ini menyebabkan bakteri pendegradasi komponen ini berjumlah lebih sedikit dan tumbuh lebih lambat karena kalah bersaing dengan pendegradasi alkana yang memiliki substrat lebih banyak. Isolasi bakteri ini biasanya memanfaatkan komponen minyak bumi yang masih ada setelah pertumbuhan lengkap bakteri pendegradasi komponen minyak bumi yang mudah didegradasi (Hadi 2003). Saat ini telah banyak ditemukan mikroorganisme yang mampu mendegradasi hidrokarbon. Mikroorganisme pendegradasi hidrokarbon dapat ditemukan di tanah maupun di air. Bossert dan Bartha (1984) telah menemukan 22 genus bakteri yang hidup di lingkungan minyak bumi. Isolat yang mendominasi di lingkungan tersebut terdiri atas beberapa genus, yaitu Alcaligenes, Arthrobacter, Acenitobacter, Nocardia, Achromobacter, Bacillus, Flavobacterium, dan Pseudomonas (Crawford dan Crawford 1996; Bossert dan Bartha 1984; Cookson 1995). Di samping itu juga ditemukan sejumlah khamir pendegradasi minyak bumi, yaitu dari genus Aureobacterium, Candida, Rhodotorula, dan Sporobolomyces yang diisolasi dari laut serta Trichoderma dan Mortierella yang diisolasi dari tanah (Udiharto 1996). Salah satu yang mempengaruhi keefektifan proses biodegradasi limbah minyak bumi adalah adanya jumlah populasi dan keragaman jenis mikroorganisme pendegradasi limbah minyak tersebut. Oleh karena itu, penerapan beragam jenis mikroorganisme akan lebih efektif daripada hanya mengandalkan kultur tunggalnya. Hal ini disebabkan adanya sinergi di antara mikroorganisme tersebut. Jika dua atau lebih mikroorganisme ditumbuhkan dalam satu medium yang sama, maka aktivitas
metabolismenya secara kuantitatif dan kualitatif akan berbeda dibandingkan mikroorganisme yang ditumbuhkan di dalam medium yang sama secara terpisah (Suardana et al. 2002). Surfaktan dan Alkilbenzena Sulfonat Linear Surfaktan merupakan molekul amfoterik yang mengandung gugus hidrofobik yang nonpolar, biasanya hidrokarbon rantai lurus atau bercabang, atau fluorokarbon yang memiliki 8-18 atom karbon, yang diikat dengan gugus polar atau hidrofilik. Gugus hidrofilik dapat berupa nonionik, ionik, atau zwitter ionik. Rantai hidrokarbon berinteraksi lemah dengan molekul air dalam lingkungan berair, sedangkan kepala polar atau ionik berinteraksi kuat dengan molekul air melalui interaksi dipol atau ion-dipol. Ini merupakan interaksi yang kuat dengan molekul air yang menyebabkan surfaktan larut di dalam air. Tindakan kooperatif dispersi dan ikatan hidrogen antar molekul air cenderung menekan rantai hidrokarbon keluar dari air dan oleh sebab itu rantai ini disebut hidrofobik (Tadros 2005). Salah satu aplikasi dari surfaktan adalah sebagai pengemulsi. Emulsi merupakan dispersi suatu cairan dengan cairan lain yang tidak bercampur. Ada dua macam emulsi, yaitu emulsi minyak dalam air dan emulsi air dalam minyak. Di dalam emulsi minyak dalam air, surfaktan memecah minyak menjadi droplet-droplet kecil (tetesan) di bagian antarmuka dan mencegahnya untuk kembali bersatu (koalesensi). Stabilitas emulsi merupakan parameter untuk melihat sejauh mana kemampuan surfaktan dalam mencegah koalesensi (Bajpai & Tyagi 2007). Surfaktan LAS dibuat dari sulfonat minyak bumi hasil proses sulfonatisasi dan merupakan surfaktan jenis anionik (surfaktan bermuatan negatif: R-Benzena-ion SO3-). Karakteristik surfaktan alkilbenzena sulfonat linear adalah larut di dalam air (water solubility), tidak mudah menguap, pH berkisar antara 7–8, dan specific gravity sebesar 1,036 (pada suhu 26 ºC) (Suardana et al. 2002). Toksisitas surfaktan jenis alkilbenzena sulfonat linear ini berdasarkan material safety data sheet (MSDS) adalah 500–2000 mg/kg dari suatu hasil tes LD50 dan termasuk kelompok moderat. Toksisitas yang dimiliki surfaktan berkaitan dengan adanya sejumlah cincin benzena didalam bagian
hidrofobiknya. Alkilbenzena sulfonat linear dikenal dalam kehidupan sehari-hari sebagai detergen yang ramah lingkungan (Poloroso 2005). Struktur molekul LAS dapat dilihat pada Gambar 2. O
CH3
-
O S +
O
Na
CH3
Gambar 2 Struktur alkilbenzena sulfonat linear.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat MY1, MY3, MY6, MY7, MY8, MY12, dan MYFlr yang telah diisolasi dari tanah tercemar yang telah diberi kotoran sapi dan kuda, heavy oil waste (HOW) diperoleh dari industri minyak di Riau, solar, air laut, marine broth (Lampiran 2), alkilbenzena sulfonat linear (LAS), heksana, spirtus, Na2SO4 anhidrat, silika gel, NaCl, larutan baku FAS, indikator feroin, H2SO4 pekat, AgSO4, K2Cr2O7. Alat-alat yang digunakan adalah labu bulat, refluks, sumbat kapas, buret, pipet mikro,tip, radas uap putar, shaker incubator, autoklaf, cawan petri, inkubator, tabung KOK, kondensor tegak serta peralatan gelas lainnya. Metode Penelitian Pembiakan Isolat (Hadioetomo 1998) Bakteri yang digunakan sebanyak 7 isolat dan telah diisolasi dari tanah tercemar yang diberi kotoran sapi dan kuda. Ketujuh isolat ini diketahui memiliki kemampuan dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon. Peremajaan masing-masing isolat dilakukan pada media miring marine agar (Lampiran 2). Sebanyak 100 mL marine agar disiapkan di dalam erlenmeyer kemudian sebanyak 5 mL marine agar dimasukkan ke dalam tabung biakan atau tabung reaksi menggunakan pipet mikro. Tabung tersebut disumbat kapas dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit.
Setelah disterilisasi, tabung diletakkan pada papan miring dan dibiarkan menjadi dingin dan padat. Secara aseptis masing-masing bakteri diinokulasikan pada agar miring tersebut dan inkubasi pada suhu 30 ºC selama 24 jam. Bakteri tersebut masing-masing ditumbuhkan dalam agar miring sebagai stok. Penyiapan Inokulan pada Media Kaya dan Media Minimal Masing-masing isolat ditumbuhkan terlebih dahulu pada media kaya dan media minimal sebelum diaplikasikan pada limbah minyak berat. Media kaya dibuat dalam erlenmeyer 250 mL dan diberi sumbat kapas dengan komposisi pada Tabel 1 dan disterilisasi pada suhu 121 ºC selama 15 menit. Kemudian secara aseptis bakteri diinokulasikan dengan ose pada media kaya tersebut dan digoyang pada shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 3 hari. Setelah ditumbuhkan selama 3 hari pada media kaya, kemudian bakteri sebanyak 1 mL dipindahkan ke dalam media minimal yang telah disterilisasi, lalu solar yang telah disterilisasi dengan sinar UV selama 15 menit ditambahkan pada media minimal. Media minimal lalu digoyang pada shaker dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 7 hari. Penumbuhan bakteri pada media minimal dilakukan sebanyak 3 kali. Tabel 2 Komposisi media kaya dan media minimal Bahan Komposisi (per 100 mL air laut) Media kaya Media minimal Yeast 1,5 0,5 ekstrak Pepton 0,3 0,1 Solar *) 5 Keterangan ; *) disterilisasi secara terpisah
Seleksi Isolat Sebanyak 25 g heavy oil waste (HOW) ,0.1 g ekstrak ragi, dan 0.5 pepton ditimbang lalu ditempatkan dalam erlenmeyer 250 mL, kemudian ditambahkan 100 mL air laut dan disumbat kapas. Lalu disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 ºC, kemudian didinginkan (slurry). Sebanyak 1 mL inokulan ditambahkan secara aseptis menggunakan pipet mikro. Kemudian diaduk di dalam shaker. Lalu dilakukan analisis total petroleum hydrokarbon (TPH) cair, TPH padat, total plate count (TPC), pH, dan kebutuhan oksigen kimia (KOK) masing-
masing untuk hari ke-0, 3, 7, 14, dan 21. Dari tahap ini diperoleh 3 isolat terpilih yang akan diaplikasikan dengan penambahan linear alikilbenzena sulfonat (LAS). Aplikasi Isolat Tunggal dan Kombinasi Isolat pada Tanah Tercemar dengan Penambahan Alkilbenzena Sulfonat Linear. Sebanyak 3 isolat (A, B, dan C) dengan kinerja degradasi terbaik hasil dari tahap seleksi isolat serta kombinasinya (AB, AC, BC, dan ABC) diaplikasikan untuk mendegradasi heavy oil waste (HOW) dengan penambahan alkilbenzena sulfonat linear (LAS). Langkah pembuatan slurry sama seperti pada tahap seleksi isolat. Hanya saja, ditambahkan alkilbenzena sulfonat linear (LAS) sebanyak 4 gram sebelum disterilisasi dalam autoklaf. Setiap hari ke-0, 3, 7, 14, dan 21, aplikasi tersebut secara rutin dianalisis TPH cair, TPH padat, TPC, pH, dan KOK.
Pengukuran TPH Cair (U.S. EPA Method 1999) Sebanyak 50 mL larutan surfaktan yang telah dicampur dengan limbah minyak disaring kemudian diekstrak dengan corong pisah menggunakan 25 mL heksana sebanyak dua kali. Kandungan air pada ekstrak dihilangkan dengan menambahkan Na2SO4 anhidrat, kemudian disaring. Pelarut dihilangkan menggunakan radas penguap putar setelah itu dipanaskan dalam oven selama 45 menit pada suhu 70 °C. Wadah dan sampel didinginkan dalam desikator lalu ditimbang. Bobot yang terukur adalah bobot minyak dan lemak. Sampel hasil pengeringan dilarutkan kembali dengan heksana dan ditambahkan silika gel untuk menghilangkan senyawa-senyawa polar dan disaring. Pelarut diuapkan kembali dan dipanaskan dalam oven, bobot yang terukur merupakan residu minyak (nilai TPH). Pengukuran TPH Padat (U.S. EPA Method 1998) Limbah minyak sebanyak 5 gram diekstraksi dengan sokhlet menggunakan 100 mL heksana. Kandungan air pada ekstrak dihilangkan dengan menambahkan Na2SO4 anhidrat, kemudian disaring. Pelarut dihilangkan menggunakan radas penguap putar setelah itu dipanaskan dalam oven selama 45 menit pada suhu 70°C. Wadah dan sampel didinginkan dalam desikator lalu ditimbang. Bobot yang terukur adalah bobot
minyak dan lemak. Sampel hasil pengeringan dilarutkan kembali dengan heksana dan ditambahkan silika gel untuk menghilangkan senyawa-senyawa polar dan disaring. Pelarut diuapkan kembali dan dipanaskan dalam oven. Bobot yang terukur merupakan residu minyak (nilai TPH). Analisis TPC (Hadioetomo 1998) Larutan garam fisiologis dibuat dengan konsentrasi NaCl 0.85% (b/v) dalam akuades. Larutan garam fisiologis ini dimasukkan masing-masing 9 mL ke dalam tabung ulir menggunakan pipet mikro dengan label 10-1 sampai 10-8. Tabung ulir disterilisasi dengan isinya pada 121 oC selama 15 menit. Selain itu, disterilisasi juga pada suhu dan selang waktu yang sama yaitu marine agar, cawan petri, dan tip untuk mikropipet yang akan digunakan. Setelah sterilisasi selesai, tabung ulir dinginkan. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam tabung ulir yang berlabel 10-1. Tabung ulir dikocok sehingga benar-benar merata pencampurannya. Sebanyak 1 mL dari tabung ulir yang berlabel 10-1 dipipet lalu dimasukkan dalam tabung ulir yang berlabel 10-2. Tabung ulir dengan label 10-2 dikocok lalu sebanyak 1 mL dimasukkan dalam tabung ulir yang berlabel 10-3. Pemindahan dan pengocokan ini dilakukan pada setiap tabung ulir sampai dengan pengenceran/tabung ulir berlabel 10-8. Dari semua tabung ulir (10-1– 10-8), dipindahkan masing-masing 1 mL ke dalam cawan petri terpisah (berlabel 10-1 sampai 10-8) yang sudah disterilisasi. Larutan marine agar (MA) yang sudah agak dingin dan belum padat dituang ke cawan petri. MA ditunggu hingga padat lalu dimasukkan ke dalam inkubator, lalu diinkubasi selama 1–2 hari. Koloni yang tampak terbentuk pada cawan petri dihitung setelah 1 atau 2 hari tersebut. Nilai yang dapat diterima antara 30–300. Analisis KOK (Clesceri et al. 2005) Sebanyak 2.5 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung KOK menggunakan pipet mohr. Selanjutnya 1.25 mL larutan campuran kalium dikromat-merkuri sulfat dimasukkan ke dalam sampel. Setelah itu, ditambahkan 2.5 mL larutan campuran asam sulfat-perak sulfat dan campuran diaduk kemudian ditutup. Tahap di atas diulangi untuk membuat blanko. Setelah masing-masing unit pengaman pada tutup dipasang, tabung dimasukkan ke dalam oven pada suhu 150 °C. Setelah 2 jam, tabung KOK dikeluarkan
dari dalam oven dan dibiarkan hingga dingin. Campuran dari tabung KOK dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer 100 mL dan dibilas dengan 2.5 mL air suling, lalu 0.5 mL asam sulfat pekat dan 2 tetes larutan indikator feroin ditambahkan secara berturut-turut ke dalam campuran. Campuran dititrasi dengan larutan baku fero amonium sulfat 0,05 N yang telah distandardisasi sampai terjadi perubahan warna dari hijau menjadi merah coklat lalu dicatat volume pemakaian larutan baku fero amonium sulfat Analisis pH Nilai pH diukur dengan menggunakan indikator pH universal. Sebanyak 10 mL sampel dipipet ke dalam gelas piala. Kertas indikator dicelupkan ke dalam sampel, lalu dibaca pH-nya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Inokulan pada Media Kaya dan Media Minimal Penyiapan inokulan pada media kaya dilakukan selama 3 hari. Penggunaan media kaya bertujuan agar isolat dapat tumbuh dengan cepat. Pertumbuhan isolat ini ditandai dengan terjadinya kekeruhan pada media yang diberi isolat MY12 setelah 3 hari (Gambar 3). Penyiapan inokulan pada media minimal dengan penambahan solar 5%(v/v) dilakukan selama 21 hari dengan penyegaran media setiap 7 hari sekali. Penambahan solar 5% bertujuan sebagai sumber karbon yang akan digunakan isolat sebagai sumber energi, di samping nutrisi dari media minimal.
Gambar 3 MY 12 dan blanko setelah 3 hari. Pada tahap ini terjadi proses aklimatisasi, yaitu penyesuaian isolat tehadap lingkungan baru, dalam hal ini lingkungan yang kaya hidrokarbon sehingga isolat dapat diaplikasikan terhadap tanah yang tercemar limbah minyak berat.
Seleksi isolat
(a)
(b)
Gambar 4 MY 12 (a) dan blanko (b) setelah 21 hari. Pengamatan visual selama 21 hari menunjukkan adanya perubahan warna pada media yang diberi isolat. Media minimal yang diberi isolat dan solar 5% lamakelamaan menjadi keruh (Gambar 4a). Hal ini tidak terjadi pada blanko (Gambar 4b). Solar yang semula menyatu dan membentuk lapisan sendiri di permukaan media lamakelamaan terpecah menjadi butiran-butiran yang lebih kecil. Terbentuknya butiranbutiran kecil ini disebabkan adanya biosurfaktan yang diproduksi oleh isolat bakteri. Menurut Al-Tahhan et al. (2000), dalam meningkatkan proses biodegradasi minyak, terjadi dua mekanisme yang dilakukan oleh biosurfaktan. Pertama, biosurfaktan dapat melarutkan senyawa hidrofobik pada struktur sel yang dapat meningkatkan daya larut antara minyak dengan media, sehingga dapat dipergunakan oleh sel. Kedua, biosurfaktan dapat menyebabkan permukaan sel menjadi lebih hidrofobik yang dapat meningkatkan interaksi antara sel dengan minyak sehingga akan menurunkan tegangan permukaan pada minyak. Leahy dan Colwell (1990), telah menemukan bahwa sebagian bakteri pendegradasi hidrokarbon diketahui memiliki kemampuan untuk memproduksi biosurfaktan. Pseudomonas aeruginosa diketahui memproduksi rhamnolipid pada C12 n-alkana sebagai biosurfaktan sedangkan Enterobacter sp menghasilkan trehalose, sukrosa, dan fruktosa lipid sebagai biosurfaktan (Banat 1994). Berdasarkan kekeruhan yang terjadi dan terbentuknya butiran-butiran pada lapisan solar dapat disimpulkan bahwa telah terjadi pertumbuhan isolat. Pemeliharaan isolat selama 21 hari bertujuan untuk menjaga kemampuan isolat agar tetap menghasilkan enzim oksigenase yang diperlukan untuk mendegradasi minyak (Yani & Akbar 2004; Hadi 2004).
Tahap seleksi isolat bertujuan memilih tiga isolat tunggal dengan kemampuan degradasi yang paling baik. Kemampuan degradasi diukur berdasarkan nilai TPH padat, TPH cair, dan persentase degradasi. Penurunan nilai TPH padat menunjukkan adanya kemampuan isolat dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon dari limbah minyak berat (Gambar 5a). Berdasarkan nilai TPH padat MY12, MYFlr, dan MY6 memiliki kinerja yang terbaik dengan nilai TPH padat pada hari ke-28 masing-masing 7.90% (b/b), 10.22% (b/b), dan 14.18% (b/b) (Lampiran 3). Pada TPH cair, tidak begitu terlihat karena nilainya sangat kecil, yaitu di bawah 0.3% (v/v) sehingga tidak dapat disimpulkan isolat yang memiliki kinerja terbaik. Hal ini disebabkan dispersi minyak ke dalam air sangat rendah sehingga jumlah hidrokarbon di dalam cairan sangat kecil. Persentase degradasi yang terbaik ditunjukkan oleh isolat MY12, MYFlr, dan MY7sebesar 58.25%, 40.74%, dan 32.26% (Lampiran 5). Persentase degradasi menggambarkan selisih nilai TPH dibandingkan dengan TPH awalnya. Oleh karena itu meskipun TPH padat MY6 lebih besar daripada MY7, tetapi persentase degradasinya lebih rendah. Perubahan nilai TPH padat MY6 sekitar 5%, sedangkan MY7 sekitar 8%. Oleh sebab itu, MY7 lebih dipilih dibandingkan MY6. Pada umumnya kenaikan nilai TPC akan diikuti oleh penurunan nilai TPH. Hal ini ditunjukkan dengan kenaikan nilai TPC MY12 dari 2.27x109 cfu/mL di hari ke-7 menjadi 2.2x1010 cfu/mL di hari ke-14 (Lampiran 7) yang diikuti penurunan nilai TPH padatnya dari 12.58% (b/b) di hari ke-7 menjadi 7.78% (b/b) di hari ke-14 (Lampiran 3). Selain MY12, kenaikan TPC yang linier terjadi pada MY7 dan MYFlr (Gambar 5d). Nilai KOK untuk MY12 dan MYFlr pada awalnya mengalami kenaikan tetapi kemudian mengalami penurunan hingga 8160 mg/mL pada hari ke-28 (Gambar 5e). Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi proses degradasi senyawa hidrokarbon oleh isolat. Nilai pH mempengaruhi kemampuan isolat dalam mendegradasi hidrokarbon minyak bumi. MY7, MY12, dan MYFlr mempunyai nilai pH di atas 6 setelah hari ke7 (Gambar 5f). Hal ini membuat ketiga isolat),
30
0.4
20
0.3
MY3
0.3
MY3
0.2
MY6
MY6 MY7
15
MY8 MY12
10
MYFlr 5
TPH cair (%b/v)
TPH padat (%b/b)
25
MY1
Blanko
5
10
15
20
25
MY7
0.2
MY8
0.1
MY12
0.1
MYFlr Blanko
0.0
0 0
MY1
-0.1
30
0
5
10
15
20
25
30
Waktu (hari)
Waktu (hari)
(b)
(a)
Persentase degradasi (%)
70 60
MY1
50
MY3
40
MY6 MY7
30
MY8
20
MY12
10
MYFlr Blanko
0 -10
0
5
10
15
20
25
30
Waktu (hari)
(d)
(c)
pH
9 8
MY1
7
MY3
6
MY6
5
MY7
4
MY8
3
MY12
2
MYFlr
1
Blanko
0 0
5
10
15
20
25
30
Waktu (hari)
(f) (e) Gambar 5 Perubahan nilai TPH padat (a), TPH cair (b), Persentase degradasi (c), TPC (d), KOK (e), dan pH (f). tersebut optimum dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon. Menurut Vidali (2001) aktivitas mikrob tanah optimum pada pH 5.5– 8.5. Hal ini berkaitan dengan penurunan nilai TPH padat (Gambar 5a dan Lampiran 3). Berdasarkan nilai persentase degradasi maka ditentukan tiga isolat terbaik, yaitu MY7, MY12, dan MYFlr. Bakteri mendegradasi senyawa hidrokarbon, terutama benzena
menjadi aldehida. Mekanisme reaksi benzena menjadi aldehida menurut Nickelsen et al. (1992) dihasilkan melalui pembukaan cincin aromatik (Gambar 6). Radikal OH akan menyerang benzena menghasilkan radikal hidroksi sikloheksadienil (I) yang selanjutnya bereaksi dengan oksigen terlarut membentuk radikal yang tidak stabil. Reaksi berikutnya adalah terjadinya pembukaan
cincin aromatik dari senyawa tersebut membentuk asam mukonat (IV) dengan melepaskan radikal OH. Radikal OH akan menyerang atom C ke-3 dari asam mukonat kemudian dioksidasi dan terjadi pemutusan ikatan C-C sehingga terbentuk aldehida (VI).
nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme pada permukaan senyawa hidrokarbon tersebut. Kondisi ini sangat membantu mikroorganisme untuk lebih cepat dapat mendegradasikan limbah minyak tersebut (Suardana et al. 2002). Pengujian Isolat Pengujian isolat dilakukan dengan menginokulasikan isolat ke dalam media minimal dengan penambahan solar 5% dan diamati secara visual.
(a)
Gambar
6
Mekanisme reaksi senyawa benzena menjadi aldehida.
Aldehida akan dioksidasi lebih lanjut menjadi asam oksalat serta asam fumarat. Adanya asam fumarat yang dihasilkan membuat pH menjadi asam. Hal ini yang mengakibatkan penurunan pH pada sampel (Gambar 5f). Aplikasi Isolat dan Kombinasinya Menggunakan LAS Pada tahap ini ketiga isolat tunggal serta kombinasinya akan diujikan pada limbah minyak berat dengan penambahan LAS 0.04% (b/v). Penambahan LAS bertujuan meningkatkan kelarutan bagian hidrofobik dari hidrokarbon minyak bumi sehingga dapat menyediakan permukaan senyawa hidrokarbon yang lebih luas melalui pembentukan mikroemulsi dan ketersediaan biologis untuk keperluan metabolisme mikroorganisme. Dengan adanya peningkatan kontak antara minyak dan air, maka akan mempermudah masuknya asupan oksigen dan
(b) Gambar 7 Pengujian Isolat pada media minimal dengan solar 5% tanpa LAS (a) dan dengan LAS (b) setelah 3 hari (1=blanko; 2=MY7; 3=MY12; 4=MYFlr; 5=MY7+MY12; 6= MY7+MYFlr;7=MYFlr+MY1 2; 8=MY7+MY12+MYFlr). Pengamatan secara visual pada Gambar 7a dan 7b menunjukkan bahwa MY12 lebih keruh dibandingkan MY7 dan MYFlr. Hal ini menunjukkan bahwa kinerja MY12 lebih baik daripada MY7 dan MYFlr dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon. Kombinasi isolat MY12+MYFlr dan MY7+MY12+MYFlr juga memiliki kekeruhan yang yang cukup tinggi serta ada
Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) Keberhasilan suatu proses bioremediasi limbah minyak bumi ditentukan berdasarkan kandungan akhir dari kadar minyak bumi atau TPH. Nilai TPH menunjukkan besarnya kandungan kadar hidrokarbon (unsur C dan H) di dalam minyak bumi dan digunakan sebagai acuan utama untuk menilai berhasil atau tidaknya suatu proses biodegradasi senyawa hidrokarbon minyak bumi yang dilakukan (Suardana et al. 2002).
TPH Padat (%b/b)
14 12
MY7
10
MY12 MYFlr
8
MY7+MY12
6
MY7+MYFlr MY12+MYFlr
4
MY7+MY12+MYFlr Blanko
2 0 0
5
10
15
20
25
Waktu (Hari)
(a)
6 MY7
5 TPH Cair (%)
MY12 4
MYFlr MY7+MYFlr
3
MY7+MYFlr MY12+MYFlr
2
MY7+MY12+MYFlr 1
Blanko
0 0
5
10
15
20
Waktu (Hari)
(b)
25
90 Persentase degradasi (%b/v)
butiran-butiran kecil pada lapisan solar yang terbentuk. Hal ini menandakan terjadi pertumbuhan isolat yang cukup baik. Pada Gambar 6b, kombinasi MY7+MY12+MYFlr memiliki kekeruhan yang paling tinggi di antara yang lain sehingga dapat disimpulkan bahwa kombinasi tiga isolat memiliki kinerja terbaik. Kombinasi tiga isolat ini lebih keruh dibandingkan kombinasi tiga isolat tanpa LAS. Hal ini terjadi karena LAS berperan mendispersikan solar ke dalam media sehingga kontak isolat dan solar menjadi lebih mudah.
80
MY7
70
MY12
60
MYFlr
50
MY7+MY12
40
MY7+MYFlr
30
MY12+MYFlr MY7+MY12+MYFlr
20
Blanko
10 0 0
5
10
15
20
25
Waktu (Hari)
(c) Gambar 8 Perubahan nilai TPH padat (a), TPH cair (b), dan persentase degradasi (c) dengan penambahan LAS. Pada tahapan aplikasi ini terjadi penurunan TPH padat yang cukup besar (Gambar 8a), terutama pada kombinasi tiga isolat, yaitu sebesar 2.33% (b/b) pada hari ke21. Kombinasi dua isolat yang terbaik juga mengalami penurunan TPH padat, yaitu MY12+MYFlr sebesar 4.78% (b/b). Hal ini terjadi karena adanya sinergisme antara masing-masing isolat. Dispersi minyak ke dalam air akan meningkatkan nilai TPH cair. Nilai TPH cair meningkat di hari ke-3 (Gambar 8b) kemudian mengalami penurunan hingga hari ke-21. Hal ini dikarenakan pada hari ke-3 terjadi peningkatan kontak antara isolat dan minyak sehingga jumlah senyawa hidrokarbon mulai berkurang. Penurunan TPH cair terbesar terjadi pada kombinasi tiga isolat, yaitu sebesar 1.68% (b/b) di hari ke21. Persentase degradasi terbesar terjadi pada kombinasi tiga isolat, yaitu sebesar 81.56%. Nilai ini lebih tinggi jika dibandingkan isolat tunggal dan kombinasi dua isolat (Gambar 8c). Nilai persentase degradasi kombinasi isolat dengan penambahan LAS lebih tinggi dibandingkan tanpa penambahan LAS. Nilai persentase degradasi MY7+MY12, MY7+MYFlr, MY12+MYFlr, dan MY7+MY12+MYFlr masing-masing sebesar 10.16%, 34.15%, 8.09%, dan 36.74% (Lestari 2010). Nilai persentase degradasi kombinasi isolat dengan penambahan LAS masing-masing sebesar 60.13%, 57.00%, 62.47%, dan 81.56% (Lampiran 11). Total Plate Count (TPC) TPC merupakan cara perhitungan jumlah koloni yang terdapat dalam suatu produk
yang tumbuh pada media agar pada suhu dan waktu yang ditetapkan (SNI 2008). Perhitungan dapat dilakukan dengan hitung cawan tanpa menggunakan mikroskop.
Gambar 9 Jumlah koloni isolat dengan penambahan LAS. Jumlah koloni berkaitan dengan persentase degradasi. Secara umum semakin besar jumlah koloni mikrob maka semakin tinggi persentase degradasinya. Jumlah koloni mikrob yang dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon adalah 106−108 cfu/mL. Jumlah koloni kombinasi tiga isolat paling tinggi di antara yang lain, yaitu 7x1010 cfu/mL di hari ke-14 (Lampiran 13). Hal ini tentunya sebanding dengan meningkatnya persentase degradasi, yaitu sebesar 54.62% (Lampiran 11).
Nilai KOK yang semakin meningkat menunjukkan bahwa limbah minyak berat tersebut banyak mengandung senyawa organik berupa hidrokarbon, sulfur, dan nitrogen. Oleh karena itu jumlah oksigen yang dibutuhkan untuk menguraikan senyawa tersebut menjadi senyawa yang lebih sederhana semakin tinggi. Gambar 10 menunjukkan penambahan LAS akan menambah senyawa organik yang harus dioksidasi, sebab LAS sendiri adalah senyawa organik. Kombinasi tiga isolat memiliki nilai KOK yang paling rendah, yaitu sebesar 246456 mg/mL di hari ke-21. Nilai KOK ini sebanding dengan nilai TPH cair kombinasi tiga isolat yang lebih rendah dari isolat tunggal dan kombinasi dua isolat (Lampiran 10). Hal ini terjadi karena senyawa hidrokarbon yang ada di dalam cairan didegradasi oleh isolat bakteri, terutama kombinasi tiga isolat. Semakin besar jumlah hidrokarbon yang didegradasi maka semakin rendah kandungan senyawa organiknya. pH Biodegradasi minyak bumi dipengaruhi oleh nilai pH yang terjadi pada lingkungan tersebut (Zhu et al. 2001). Nilai pH berhubungan dengan jumlah asam yang terkandung dalam tanah. Mayoritas mikrorganisme tanah akan tumbuh dengan subur pada pH antara 6 sampai 8.
Kebutuhan Oksigen Kimia (KOK) Pengukuran KOK pada penelitian ini dilakukan dengan metode refluks tertutup yang diikuti dengan metode titrimetri.
9 MY7
7
MY12
6
MYFlr
5
MY7+MY12
4
MY7+MYFlr
400000
3
MY12+MYFlr
350000
2
MY7+MY12+MYFlr
1
Blanko
KOK (mg/L)
pH
8
MY7
300000
MY12
250000
MYFlr MY7+MY12
200000
0 0
5
MY7+MYFlr
150000
MY12+MYFlr
100000
MY7+MY12+MYFlr Blanko
50000 0 0
5
10
15
20
25
Waktu (Hari)
Gambar
10
Nilai KOK dengan penambahan LAS.
10
15
20
25
Waktu (hari)
Gambar 11
Nilai pH isolat dengan penambahan LAS.
Isolat menghasilkan basa dan asam organik pada proses metabolisme sehingga mempengaruhi nilai pH-nya. Nilai pH kombinasi tiga isolat tetap di atas 6 sehingga kemampuan degradasinya optimum. Hal ini dapat dilihat dari penurunan TPH padat, TPH
cair, serta kenaikan persentase degradasinya (Lampiran 9, 10, dan 11).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan MY7, MY12, dan MYFlr ditentukan sebagai 3 isolat terbaik karena memiliki nilai persentase degradasi yang tinggi, yaitu 32.26, 58.25, dan 40.74%. Penambahan LAS meningkatkan kelarutan minyak bumi di dalam air. Kombinasi tiga isolat lebih mampu mendegradasi senyawa hidrokarbon dibandingkan kombinasi dua isolat dan isolat tunggalnya. Nilai TPH padat pada campuran tiga isolat pada hari ke-21 sebesar 2.33% (b/b), nilai TPH cair sebesar 1.68% (b/v), dan nilai KOK sebesar 246456 mg/mL. Nilai persentase degradasi kombinasi tiga isolat hari ke-21 adalah 81.56%. Saran Berdasarkan hasil penelitian ini, perlu dilakukan kajian mengenai hidrokarbon yang didegradasi oleh serta aplikasi pada skala percobaan lebih besar.
maka jenis isolat yang
DAFTAR PUSTAKA Al-Tahhan RA, Sandrin TR, Bodour AA, Maier RM. 2000. Rhamnolipid-Induced Removal of Lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa: Effect on Cell Surface Properties and Interaction with Hydrophobic Substrates. Applied and Environmental Microbiology 66(8):32623268. Banat MI. 1995. Biosurfactants Production and Possible Uses in Microbial Enhanced Oil Recovery And Oil Pollution Remediation : A Review. Journal of bioresource Technology. 51:1-12. Bajpai D, Tyagi VK. 2007. Laundry Detergents: an Overview. J. Oleo Scie. 7:327-340. Baker KT, Herosn BS. 1994. Bioremediation. New York: McGraw Hill.
Bartha R, Bossert I. 1984. Treatment and Disposal of Petroleum Refinery Wastes. New York: Macmillan Publishers. Boopathy R. 2000. Factors limiting Bioremediation Technologies (review paper). Journal of Bioresource Technology. 74:63-67. Cookson JT. 1995. Bioremediation Engineering : Design and Application. Toronto: McGraw-Hill. Clesceri LC, Greenberg AE, Eaton AD. 2005. Standard Method for Examination of Water and Wastewater 21th .5220.CClossed Reflux, Titrimetri Method. APHA, AWWA, WEF. Crawford R, Crawford DL. 1996. Bioremediation Principles and Applications. USA: Cambridge University Pr. Giwangkara EG. 2007. Apa Komposisi Miyak Bumi?. [terhubung berkala]. http://www.chemistry.org/tanya_pakar apa_komposisi_dari_minyak_ bumi/ [8 Oktober 2009]. Hadi SN. 2003. Degradasi Minyak Bumi via ”Tangan” Mikroorganisme. [terhubung berkala]. http://www.chem-istry.org/artikel_kimia/kimia_material/degr adasi_minyak_bumi_via_tangan_mikroor ganisme/ [8 Oktober 2009]. Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Hikmatuloh YA. 2004. Pengembangan Kombinasi Bakteri dan Proses Biodegradasi Minyak Diesel. [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Leahy JG, Colwell RR. 1990. Microbial Degradation of Hydrocarbons in the Environment. American Society for Microbiology. 54:305–315 Lestari MS. 2010. Kemampuan Isolat Tunggal dan Campuran dalam Mendegradasi Senyawa Hidrokarbon dari Heavy Oil Waste. [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nickelsen MG, Cooper WJ, Kurucz CN, Waite TD. 1992. Removal of Benzene and Selected Alkyl Substituted From Aqueous Solution Utilizing Continuous High-Energy Electron Irradiation. Environ. Sci. Technol. 26:144-152 Nugroho A. 2006. Biodegradsi Sludge Minyak Bumi dalam Skala Mikrokosmos: Simulasi Sederhana sebagai Kajian Awal Bioremediasi Land Treatment. Makara Teknologi 10:82-89. Nurhariani T, Ni’matuzahroh, Surtiningsih T. 2006. Biodegradasi Minyak oleh Rhodotorula dan Candida Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak Surabaya. Berk.Panel.Hayati 12:27-31. Poloroso A. 2005. Potensi Alkil Linear Sulfonat dalam Mempengaruhi Kinerja Mikrob Pendegradasi Minyak Bumi. [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Rony. 2009. Pengaruh Surfaktan Anionik dan Pengadukan Terhadap Kelarutan Limbah Minyak Bumi dalam Air. [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sarma PN, Mohan SV, Khrisna MR, Shailaja S. 2006. Bioremediation of Pendimenthalin Contaminated Soil by Augmented Bioslurry Phase Reaktor Operated In Sequential Batch (SBR) Mode: Effect of Substrate Concentration. Indian Journal of Biotechnology. 5:169174. [SNI 2897] Standar Nansional Indonesia. 2008. Metode Pengujian Cemaran Mikrob dalam Daging, Telur, dan Susu serta Hasil Olahannya. Jakarta: Badan Standardisasi Nasional. Suardana P et al. 2002. Pengaruh Surfaktan Alkilbenzena sulfonat linear dalam Mempercepat Bioremediasi Limbah Minyak Bumi. Simposium NasionalIATMI, Jakarta.
Udiharto M. 1996. Bioremediasi Minyak Bumi. Prosiding Pelatihan dan Lokakarya “Peranan Bioremediasi dalam Pengelolaan Lingkungan”, Cibinong 2428 Juni 1996. LIPI-BPPT-HSF. Tadros TF. 2005. Applied Surfactant. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. [US EPA] United States Environmental Protection Agency. 1998. Method 1664, Revision A: n-Hexane Extractable Material (HEM; Oil and Grease) and Silica Gel Treated n-Hexane Extractable Material (SGT-HEM; Non-polar Material) by Extraction and Gravimetry. Washington DC: U.S.EPA. [US EPA] United States Environmental Protection Agency. 1999. Method 9071B, n-Hexane Extractable Material (HEM) for Sludge, Sediment, and, Solid Samples. Washington DC: U.S.EPA. Vidali M. 2001. Bioremediation. Overview. Padova: Department Inorganic Chemical, University Padova.
An of of
Yani M, Akbar Y. 2004. Proses Biodegradasi Minyak Diesel oleh Campuran Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon. J. Tek. Ind. Pert. 19:40-44. Zacky M. 2005. Produksi dan Karakterisasi Inokulum serta Aplikasinya dalam Mendegradasi Senyawa Hidrokarbon Minyak Bumi. [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Zuhra CF. 2003. Penyulingan, Pemrosesan, dan Penggunaan Minyak Bumi. http://library.usu.ac.id/download/fmipa/ki mia-fatimah2.pdf [8 Oktober 2009]. Zhu XD, Venosa MT, Suidan, Lee K. 2001. Guidelines For The Bioremediation of Marine Shorelines and Freshwater Wetlands. U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati
LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian Pembiakan 7 Isolat
Penyiapan Inokulan dan Aklimatisasi
Aplikasi isolat tunggal dan campuran dengan penambahan LAS
A, B, C, AB, AC, BC, dan ABC
TPH cair, TPH padat, TPC, KOK, dan pH, hari ke-0, 3, 7, 14, 21.
Stok Isolat
Media Kaya, 3 hari
3 Isolat terbaik
Media Minimal, 7 hari, 3 kali
Seleksi 7 Isolat
TPH cair, TPH padat, TPC, KOK, dan pH, hari ke-0, 3, 7, 14, 21, 28
Lampiran 2 Komposisi media Marine agar (Atlas 1995) Bahan Yeast extract Pepton Ferric citrate NaCl MgCl2 Na2SO4 CaCl2 KCl Na2CO3 SrCl2 Asam Borat Natrium silikat Natrium flourida Amonium nitrat Na2PO4
Komposisi(g/1000 mL) 1 5 0.1 19.45 8.8 3.24 1.88 0.55 0.16 0.034 0.022 0.004 0.0024 1.6 0.008
Lampiran 3 Data pengukuran TPH padat pada seleksi isolat (%b/b) Sampel Blanko MY1 MY3 MY6 MY7 MY8 MY12 MYFlr
Hari ke0 19.92 18.19 18.96 19.32 23.20 21.28 18.91 17.24
Perhitungan : TPH (%b/b) =
bobot min yak X 100% bobot sampel
3 20.86 18.72 21.44 22.01 23.26 21.61 17.29 15.96
7 25.20 18.45 18.52 18.52 17.91 19.13 12.58 13.84
14 26.86 20.39 18.30 16.78 16.31 17.05 7.78 9.11
21 26.62 13.69 18.73 14.15 15.81 17.33 7.64 12.43
28 26.85 16.18 16.23 14.18 15.71 17.59 7.90 10.22
Lampiran 4 Data pengukuran TPH cair pada seleksi isolat (%b/v) Sampel Blanko MY1 MY3 MY6 MY7 MY8 MY12 MYFlr
Hari ke0 0.0126 0.2883 0.0004 0.0132 0.0014 0.0912 0.0000 0.0037
3 0.0012 0.0080 0.0092 0.0125 0.0098 0.0184 0.0000 0.0000
7 0.0108 0.0049 0.0002 0.0076 0.0157 0.0110 0.0120 0.0075
Perhitungan : TPH (%b/v) =
bobot min yak X 100% volume sampel
Lampiran 5 Data pengukuran persentase degradasi pada seleksi isolat (%)
14 0.0100 0.3162 0.0000 0.0100 0.0000 0.0070 0.0855 0.0000
21 0.0035 0.0074 0.0020 0.0040 0.0000 0.0000 0.0528 0.0533
28 0.2355 0.0000 0.0111 0.0000 0.0000 0.0000 0.0568 0.0000
Sampel Blanko MY1 MY3 MY6 MY7 MY8 MY12 MYFlr
3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 8.59 7.48
7 0.00 0.00 2.37 4.11 22.78 10.12 33.51 19.71
Hari ke14 0.00 0.00 3.49 13.11 29.67 19.92 58.54 47.16
Perhitungan : Persentase degradasi (%) =
TPH H 0
TPH H n
TPH H 0
X 100%
Ket : n adalah jumlah hari
Lampiran 6 Data pengukuran KOK pada seleksi isolat (mg/mL) Sampel
Hari ke-
21 0.00 24.75 1.25 26.74 31.83 18.56 59.60 27.92
28 0.00 11.04 14.43 26.58 32.26 14.36 58.25 40.74
Blanko MY1 MY3 MY6 MY7 MY8 MY12 MYFlr
0 5858.29 6923.43 3195.43 2130.29 5592.00 3461.72 6528.00 6936.00
3 7456.00 9692.80 11184.00 15657.00 9692.80 16403.20 48280.01 8160.00
7 14688.00 17136.00 22032.00 24480.00 20400.00 11424.00 27540.00 16320.00
14 55760.01 59840.01 59840.01 48960.01 46240.01 55080.01 14280.00 28560.00
21 69360.00 89760.00 80580.00 41820.00 51000.00 61200.00 20400.00 18360.00
28 81600.00 79560.00 63240.00 65280.00 57120.00 40800.00 8160.00 8160.00
14 2.03x108
21 5.10x108
28 2.29x108
Perhitungan : KOK (mg/mL) =
A B x N x 1000 x BE oksigen xfp Volume Sampel mL
Lampiran 7 Data pengukuran TPC pada seleksi isolat (cfu/mL) Sampel MY1
Hari ke0 0.00
3 0.00
7 5.10x107
MY3 MY6 MY7 MY8 MY12 MYFlr
0.00 0.00 0.00 2.52x106 0.00 0.00
3.4x107 1.97x107 4.45x107 2.31x109 2.27x109 8.75x108
0.00 5.65x106 0.00 0.00 9.70x108 2.77x108
2.12x109 2.49x107 7.31x108 2.07x109 2.2x1010 2.46x109
1.61x108 2.65x107 3.31x109 1.74x109 9.00x109 2.26x109
1.57x108 9.55x106 2.27x108 2.62x109 5.92x108 3.11x108
14 7.5 6.5 7.0 5.5 7.5 7.0 8.0 7.5
21 7.5 5.5 6.0 6.5 6.5 7.0 8.0 8.0
28 7.5 6.0 6.5 6.5 6.5 7.0 8.0 8.5
Lampiran 8 Data pengukuran pH pada seleksi isolat Sampel Blanko MY1 MY3 MY6 MY7 MY8 MY12 MYFlr
Hari ke0 4.5 5.0 4.5 5.5 4.5 4.5 5.5 5.5
3 5.0 5.0 4.5 5.5 4.5 4.5 7.5 7.5
7 7.0 7.0 7.5 6.5 7.5 7.0 8.0 7.5
Lampiran 9 Data pengukuran TPH padat pada aplikasi isolat (%b/b) Sampel Blanko MY7 MY12 MYFlr
0 12.47 8.51 12.69 11.63
3 11.36 7.41 11.10 11.12
Hari ke7 10.59 6.82 8.83 8.61
14 8.07 4.84 6.95 7.20
21 7.72 3.57 5.80 6.19
MY7+MY12 MY7+MYFlr MY12+MYFlr MY7+MY12+MYFlr
12.53 11.97 12.74 12.61
11.23 11.57 10.60 10.34
8.53 8.89 7.72 8.61
6.13 6.67 6.19 5.72
4.99 5.15 4.78 2.33
Hari ke7 4.77 5.44 3.43 4.20 2.88 3.35
14 5.33 4.85 2.88 3.67 2.49 3.16
21 5.08 4.41 2.24 3.87 2.12 2.67
Perhitungan : TPH (%b/b) =
bobot min yak X 100% bobot sampel
Lampiran 10 Data pengukuran TPH cair pada aplikasi isolat (%b/v) Sampel Blanko MY7 MY12 MYFlr MY7+MY12 MY7+MYFlr
0 1.79 2.45 1.63 1.58 1.67 1.53
3 3.86 4.26 3.72 3.46 3.10 3.68
MY12+MYFlr MY7+MY12+MYFlr
1.56 1.67
3.57 2.42
3.20 2.62
2.63 2.07
2.33 1.68
Perhitungan : TPH (%b/v) =
bobot min yak X 100% volume sampel
Lampiran 11 Data pengukuran persentase degradasi pada aplikasi isolat (%) Sampel
Hari ke3
7
14
21
Blanko
8.92
15.08
35.29
38.14
MY7
13.01
19.95
43.14
58.11
MY12
12.49
30.38
45.24
54.26
MYFlr
4.45
25.99
38.08
46.76
MY7+MY12
10.33
31.92
51.09
60.13
MY7+MYFlr
3.34
25.71
44.26
57.00
MY12+MYFlr
16.79
39.40
51.41
62.47
MY7+MY12+MYFlr
17.99
31.71
54.62
81.56
Perhitungan : Persentase degradasi (%) =
TPH H 0
TPH H n
TPH H 0
X 100%
Ket : n adalah jumlah hari
Lampiran 12 Data pengukuran KOK pada aplikasi isolat (mg/mL) Sampel Blanko MY7 MY12 MYFlr MY7+MY12 MY7+MYFlr MY12+MYFlr MY7+MY12+MYFlr Perhitungan :
0 114240 116280 153000 114240 110160 114240 110160 112200
3 138720 187680 110160 146880 134640 175440 177480 132600
Hari ke7 242544 305136 226896 258192 242544 219072 219072 219072
14 250368 367728 211248 281664 273840 258192 234720 226896
21 258192 250368 277752 301224 250368 281664 293400 246456
KOK (mg/mL) =
A B x N x 1000 x BE oksigen xfp Volume Sampel mL
Lampiran 13 Data pengukuran TPC pada aplikasi isolat (cfu/mL) Sampel MY7 MY12 MYFlr MY7+MY12 MY7+MYFlr MY12+MYFlr MY7+MY12+MYFlr
0 0.00 4.24x105 4.32x104 2.61x105 1.36x103 2.88x105 2.65x106
3 1.36x105 1.38x109 1.56x107 1.15x109 1.52x106 5.28x108 6.90x108
Lampiran 14 Data pengukuran pH pada seleksi isolat
Hari ke7 1.64x106 1.67x109 8.52x107 1.34x108 1.05x108 7.30x109 9.80x109
14 1.60x108 6.49x109 6.00x109 6.04x109 2.71x109 6.42x109 7.10x1010
21 8.20x107 1.25x109 1.61x109 2.46x109 1.01x109 3.79x109 4.07x109
Sampel Blanko MY7 MY12 MYFlr MY7+MY12 MY7+MYFlr MY12+MYFlr MY7+MY12+MYFlr
0 6.5 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.5 7.5.
3 7.0 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 8.0 8.0
Hari ke7 7.0 7.5 7.5 7.5 7.5 8.0 7.5 7.5
14 6.5 7.5 7.5 7.5 7.5 75. 75. 7.5
21 6.0 7.0 7.0 6.0 7.0 7.0 7.0 7.0
