Biochemical marker for early and objective detection.of grade 1 pressure ulcers

Biochemical marker for early and objective detection .of grade 1 pressure ulcers Marieke van der Lans Master Thesis Medical Engineering BMTE 07.17 June 2007

Committee: Prof. dr. ir. F.P.T. Baaijens Prof. dr. ir. D.L. Bader Dr. ir. C.W.J. Oomens Dr. ir. E.M.H. Bosboom D. Bronneberg, M.Sc. Eindhoven University of Technology Department of Biomedical Engineering Division of Soft Tissue Biomechanics and Engineering

1

PDF processed with CutePDF evaluation edition www.CutePDF.com

Samenvatting Decubitus kan volgens de CBO-richtlijn Decubitus (2002) omschreven worden als weefselversterf, veroorzaakt door de inwerking op het lichaam van druk-, schuif-, en wrijvingskrachten of een combinatie ervan. Deze wonden zijn pijnlijk en moeilijk te behandelen. Naast het menselijke leed vormt decubitus een grote kostenpost in de gezondheidzorg. In 1999 werd meer dan 700 miljoen van het totale budget van de gezondheidszorg besteed aan het behandelen en voorkomen van decubitus. De methodes die nu gebruikt worden voor het voorkomen van decubitus zijn subjectief en voldoen niet. Er wordt daarom gezocht naar een objectieve manier om decubitus preventief aan te tonen. Uit literatuuronderzoek is gebleken dat cytokinen en chemokinen veelvuldig gebruikt worden voor het detecteren van een ontsteking. Cytokinen en chemokinen zijn eiwitten die door cellen uitgescheiden worden om een ontstekingsreactie tot stand te brengen als eerste respons op cel- en weefselschade. Na in-vivo metingen op een modelsysteem van de epidermis blijkt dat bij klinisch relevante drukken een toename van bepaalde cytokinen en chemokinen zichtbaar is. Voor preventief aantonen van decubitus zijn we opzoek naar het gedrag van de cytokinen en chemokinen die vroeg in het ontstekingsproces tot expressie komen, IL-1α, IL1RA en IL-8 zijn hier voorbeelden van. Met een niet invasieve methode, door middel van het aanbrengen van Sebutape op de huid, is het mogelijk om de concentratie van deze cytokinen en chemokine aan te tonen. Hiermee is het mogelijk om vast te stellen of cytokinen en chemokinen geschikt zijn als objectieve maat voor de vroegtijdige detectie van decubitus. Het doel is om het gedrag van de vroege cytokinen en chemokinen te bepalen bij patiënten met graad 1 decubitus en zonder decubitus Bij 33 patiënten zonder decubitus en 18 patiënten met een graad 1 decubitus (8 patiënten met decubitus op de hiel, 6 patiënten op de stuit, 3 patiënten op de elleboog en 1 op het oor) en 5 studenten zijn de cytokinenconcentraties gemeten. Bij studenten en patiënten zonder decubitus is de concentratie gemeten op de arm als controle en op de stuit omdat deze gevoelig is voor het ontwikkelen van decubitus. Bij patiënten met graad één decubitus is de concentratie gemeten op de arm, de graad één doorligwond en 10 cm van de doorligwond vandaan om te kijken hoe lokaal de concentratie is. Alle metingen zijn twee keer uitgevoerd, op tijdstip 1 en een half uur later. De IL-1α concentratie [pg/ml] is bij dit onderzoek de enige cytokinen concentratie die aangetoond kon worden. Deze concentratie is genormeerd naar het totale eiwit niveau (TE in [mg/ml]) van de persoon zelf. Bij patiënten met graad 1 decubitus op de hiel was geen verhoging te zien op de hiel ten op zichte van de arm. De groep met patiënten die graad 1 decubitus op de elleboog (n = 3) was op tijdstip 1 een verhoging van de IL-1α concentratie te zien t.o.v. de arm. Er is niet veel over deze groep te zeggen omdat de groep erg klein is. Dit is ook het geval bij de patiënt met graad 1 decubitus op het oor. Bij zowel patiënten zonder decubitus als patiënten met graad 1 decubitus op de stuit (n = 6) is een verhoging van IL-1α concentratie te zien op de stuit t.o.v. de arm. Niet alleen graad 1 decubitus zorgt voor een verhoging van de IL-1α concentratie maar ook de wrijving en druk van het in bed liggen zorgt voor een stijging van de concentratie. De verhoging van de IL-1α concentratie is lokaal want bij patiënten met graad 1 decubitus op de stuit is 10 cm van de decubitus geen verhoging van de IL-1α concentratie zichtbaar. Bij studenten was geen verschil te zien tussen de arm en de stuit. De leeftijd van de patiënten zonder decubitus lag lager dan patiënten met graad 1 decubitus. Er is geen verband te vinden tussen de risico score en het geslacht en de IL-1α concentratie.

2

Abstract According to the CBO-standards Decubitus (2002) decubitus is defined as tissue necrosis caused by pressure, friction, shear or a combination of these on the body. The wounds are painful and difficult to treat. Besides the human distress, pressure ulcers represent a huge burden for the health care budget. In 1999 more than 700 million of the total health care budget is spent on the treatment and prevention of pressure ulcers. The methods now used for prevention are subjective and are not satisfactory. That is the reason that there is looked for an objective way to disprove preventive pressure ulcers. Literature research shows that cytokines and chemokines are frequently used to detect inflammations. Cytokines and chemokines are proteins which are secreted by cells as a result of mechanical loading or irritation of the skin. In vivo measurements on a model system of the epidermis show an increase of cytokines and chemokines after loading with clinical relevant pressure. For preventive detection of pressure ulcer the behaviour of cytokines and chemokines which are early expressed in the inflammation process are of most interest, IL1α, IL-1RA and IL-8 for example. With a non invasive method, by applying Sebutape on the skin, it is possible to measure the cytokine and chemokine concentration. With this method it is possible to determine if the cytokine and chemokine are suitable as an objective marker for early detection of pressure ulcers. The objective is to determine the behaviour of the early cytokines and chemokines at patients with a grade 1 pressure ulcer and without a pressure ulcer. 33 Patients without a pressure ulcer are included, 18 patients with a grade 1 pressure ulcer (8 patients with a ulcer at the heel, 6 at the sacrum, 3 at the elbow and 1 at the ear) and 5 students without a pressure ulcer. The cytokine and chemokine levels are measured at the arm (as a control) and at the sacrum (sensitive for developing pressure ulcers) at patients without a pressure ulcer. At patients with a grade 1 pressure ulcer the arm, on top of the pressure ulcer and at 10 cm distance of the pressure ulcer (look how local the cytokine levels are) were measured. All measurements are carried out two times, time 1 and half an hour later. The IL-1α concentration [pg/ml] is the only cytokine concentration which can be measured. The IL-1α concentration is normalised to the total protein level of the patients self (TP in [mg/ml]). At patients with a grade 1 pressure ulcer at the heel there was no increase of IL-1α visible compared to the arm. The group size of the patients with a pressure ulcer on the elbow and ear are too small to In the patients without a pressure ulcer as well as patients with a grade 1 pressure ulcer at the sacrum (n = 6) there is an increase of IL-1α concentration at the sacrum compared to the arm. Not only the grade 1 pressure ulcer but also the pressure and friction of lying in bed cause an increase in IL-1α concentration. The increase of IL-1α is local; at 10 cm distance of the pressure ulcer no increase of IL-1α concentration is visible. At the students no difference of IL-1α concentration is visible between arm and sacrum. The age of the patients without a pressure ulcer is lower than patients with a grade 1 pressure ulcer. There is no relation between the risk score and genders and the IL-1α concentration.

3

Contents 1

Introduction ................................................................................................................ 5

2

Materials and method ................................................................................................. 8 2.1

Materials................................................................................................................ 8

2.2

Patients .................................................................................................................. 8

2.3

Sebutape sample collection .................................................................................... 9

2.4

Sebutape extraction................................................................................................ 9

2.5 Data collection......................................................................................................10 2.5.1 Cytokine assay methods.................................................................................10 2.5.2 Total protein assay method ............................................................................10 2.6

Data analysis.........................................................................................................11

3

Results ........................................................................................................................12

4

Discussion ...................................................................................................................18

5

Conclusion ..................................................................................................................20

6

Recommendations ......................................................................................................21

7

Bibliography ...............................................................................................................22

Appendix A: Protocols used for this study........................................................................24 A1: Protocol: Sebutape extracting ....................................................................................24 A2: Protocol: Pilot study healthy volunteers.....................................................................25 A3: Protocol: ELISA .......................................................................................................26 A4: Protocol: BCA assay .................................................................................................31 Appendix B: Different pilot for this study ........................................................................32 B1: Pilot: Extraction efficiency ........................................................................................32 B2: Pilot: Basal interleukin level of healthy volunteers (students group)...........................34 B3: Pilot: Cytokine and chemokine level after loading a healthy volunteer .......................38 B4: Pilot: AZM................................................................................................................40 B5: Data tables: Measurements at the Catharina hospital ..................................................42 Appendix C: Medical Ethical approval ...................................................................... a - nn

4

1

Introduction A pressure ulcer is defined as an area of localised damage to the skin and underlying tissue caused by pressure, shear, friction or a combination of these (Schoonhoven et al. 2002). Patients admitted to a hospital, or otherwise confined to bed, chair, or wheelchair, are at risk for pressure ulcer formation. The prevalence of pressure ulcers is still unacceptably high and varies between academic and general hospitals 15% and in nursing homes 24% (Bours et al. 2003). Pressure ulcers are painful and difficult to treat. They represent a huge burden for the health care budget in Western countries. In the Netherlands more than 1% of the total health care budget is spend on the prevention and the treatment of pressure ulcers as well as on the prolonged hospital stay once a pressure ulcer had developed *(CBO richtlijnen 2002). In the skin, pressure ulcers are characterised in four different stages: non-blanchable erythema (grade 1), partial skin loss involving epidermis, dermis or both (grade 2), full thickness skin loss involving subcutaneous tissue (grade 3) and full skin loss with extensive tissue destruction due to necrosis or damage to muscle and bone (grade 4) (CBO richtlijnen 2002). In general, a grade one pressure ulcer accounts for approximately 50% of the prevalence in all institutions (Bours et al. 2003). Figure1.1 Grade one pressure ulcer The present study only involves grade 1 pressure ulcers in which the skin is unimpaired (Peirce et al. 2000). When preventive measurements are not taken in time, pressure ulcers might become more severe. Therefore, early detection of pressure ulcers is very important. Currently the transparent disk method is used, in which a transparent disk is placed the non-blanchable erythema (NBE). When the NBE stays red after covering with a transparent disk, the spot is defined a grade 1 ulcer. A disadvantage of this method is that it does not work on darker skin types (Roose et al. 2006). In the clinical setting, subjective risk assessment scales are currently used to identify patients who are at risk for pressure ulcer development. At least 40 risk assessment scales have been developed to detect high-risk patients (Nixon J, McGough A. 2001). The CBO, Norton, Waterloo and Braden scales are the most frequently used questionnaires for prevention of pressure ulcers (L.Schoonhoven 2002). Schoonhoven et al. analysed these risk assessment scales. The study proved that the scales do not predict pressure ulcer development satisfactorily for hospital patients. Only 70% of the patients with and without high-risk on developing pressure ulcers are correctly identified, leaving 30% of the patients with pressure ulcers which have been misclassified (Schoonhoven et al. 2002). The demand for a better way to detect risk patients is high. A first step to improve the risk assessment is to find an objective marker for early detection of pressure ulcers. Currently, cytokines and chemokines are widely used as markers for screening the damaging potential before the physiological signs of skin irritation occur (Gibbs et al. 2002) (Coquette et al. 2003). Cytokines and chemokines are proteins which are secreted by cells as a result of mechanical loading and/or irritation of the skin surface (Uchi et al. 2000). The stratum corneum mostly consists of keratinocytes. * Central Begeleidings Orgaan (= central accompanying organ)

5

The cytoplasm of keratinocytes of all epidermal layers contains the pro-inflammatory cytokine interleukine-1α (IL-1α). IL-1α is the so-called main switch in the induction of an inflammatory cascade (Corsini and Galli 1998). The passively released IL-1α induces the expression of other cytokines and chemokines (e.g. IL-8). IL-1RA is a competitive inhibitor of IL-1α (Welss et al. 2004). Research on wound fluid and biopsies show an increase of cytokines and chemokines (IL-1α IL-1β and IL-6) in non-healing ulcers compared to healing ulcers (Trengove et al. 1999) (Harris et al. 1995). Recent in vitro studies at Eindhoven University of Technology showed an increase in secretion of cytokines and chemokines from a tissue-engineered epidermis after sustained mechanical loading (Bronneberg et al. 2006). In addition, Lee et al. (1997) showed that mechanical straining of keratinocyte monolayer promotes the release of IL-1α and IL1RA. Previous studies by Trengove et al and Harris et al. are invasive and therefore inconvenient for the patient. In 2001, Perkins et al. developed a simple non-invasive method to collect cytokines and chemokines in human skin, even in the absence of visible clinical irritations (Perkins et al. 2001). For this method Sebutape was applied to the skin surface. Perkins et al. investigated baseline values of these cytokines and chemokines on the skin surface. Furthermore, Sebutapes were used to assess normal skin conditions and evaluate changes due to chemical insult, or sun exposure (Perkins et al. 2001). A great advantage of this method is that both application and removal of Sebutape is associated with minimal pain to an individual. Grade 1 pressure ulcers are superficial and are preceded by an inflammatory response (Uchi et al. 2000), hence cytokines and chemokines (IL-1α, IL-1RA, IL-8) might prove suitable markers for objective, early detection of pressure ulcers at the skin surface in vivo. With the method of Perkins et al it is possible to measure the cytokine and chemokine changes noninvasively. To determine if cytokines and chemokines in the skin might be suitable as biochemical markers for early and objective detection of pressure ulcers, a proof of principle has to be established. This is based on the premise that cytokine and chemokine concentrations increase at a beginning pressure ulcer. Thus the objective of the present study is to measure the change of cytokine and chemokine concentrations in patients without a pressure ulcer and in patients with a grade 1 pressure ulcer. The study was designed to answer the following questions: - Are the cytokine and chemokine concentrations high enough to penetrate the stratum corneum so that these concentrations can be measured by using Sebutape? - Is it possible to measure all the cytokines and chemokines in the present study? - What is the basal cytokine and chemokine concentration on the left arm (control) and how does it vary in time and between different people? - Do the results of this method depend on the location at the body where the Sebutape is applied? - Do the cytokine and chemokine concentrations change on top of a pressure ulcer compared to the left arm? In cooperation with the decubitus committee of the Catharina hospital in Eindhoven a clinical trial was established. Patients with grade 1 pressure ulcers and patient without grade 1 pressure ulcer were involved in this clinical trial. The cytokine and chemokine levels as well as the total protein (TP) levels were collected from the skin surface using Sebutape. Two patient groups were used in this study: the reference group is a group of patients with no

6

pressure ulcers, while the second group is a group of patients with grade one pressure ulcers. In the first group, the amount of the two markers were measured on the volar aspect of the left arm and the sacrum, while in the second group the amount of these two markers was measured immediately above the grade 1 pressure ulcer, at a 10 cm distance from the location of a pressure ulcer, where possible, and also on the left arm. The risk assessment score is taken into account in this study. Finally, IL-1α, IL-1RA and IL-8 were analysed and the total protein amount was determined.

7

2

Materials and method

2.1

Materials For the adsorbtion of the molecular mediators of skin inflammation Sebutape (CuDerm Corporation, Texas, USA) was used (figure 2.1). Sebutape is an adhesive patch which detects sebum (oil) production from the skin. Through the unique combination of an adhesive and micro-porous film, the sebum can be collected in a passive way. The advantage of this method is that application and removal of Sebutape Figure 2.1 Sebutape itself inflicts minimal damage to the epidermis. In this study, Sebutapes were used to collect IL-1α, IL-8 and IL-1RA and total protein contents from the skin surface.

2.2

Patients Informed consent was obtained from all the patients and the Local Medical Ethical Committee approved our methods and study before starting this research (Appendix C: METC approval). Patient confidentiality was assured and data handling and storage were confined to the author and executor of the research. The clinical study was conducted from January until April 2007 at the Catharina hospital in Eindhoven. On the advice of clinicians at the hospital and based on the pressure ulcer prevalence score list of 2005, three different wards were involved for this study; general surgery, orthopaedics and lung diseases. Within these wards the major focus of the study was on two groups of patients: 1. 33 hospitalised patients without any pressure ulcer (PU) 2. 18 hospitalised patients with a grade 1 pressure ulcer. This group is subdivided into 4 smaller groups: a. 8 patients with a grade 1 heel PU b. 6 patients with a grade 1 sacrum PU c. 3 patients with a grade 1 elbow PU d. 1 patient with a grade 1 PU on the ear Furthermore, a third group of 5 healthy young volunteers from the Eindhoven University of Technology was used in this study (hereafter referred to as the student group), as a standard, to compare their cytokine levels on the arm with all the hospitalised patients. All patients age varied between 20 to 80 years old and both genders were included in this study. As no difference between data from each gender was noted, data was pooled. In Appendix B5 the data of all hospitalised patients is shown, IL-1α concentration, TP level, risk score, age and genders. The main exclusion criteria of the study involved patients with extensive skin disease like psoriasis or eczema.

8

2.3

Sebutape sample collection The tapes were applied to the skin using a custom made ’pressure roller’ to press the Sebutape on the skin with a constant pressure (figure 2). Gloves were used to avoid cross contamination of skin proteins between the patient and the researcher. This ‘pressure roller’ has a hinge point with a spring between the roller and the end of the Figure 2.2 Pressure roller handle. When manual force was applied to the handle, the spring ensured that the roller was pressed down on the Sebutape, such that approximately a constant pressure was applied to Figure 2.2 Pressure roller the skin on each occasion. After two minutes of sebum collection, the tape was removed from the skin using tweezers to ensure that each sample was not crumpled or folded. After 30 minutes, the same set of measurements was performed on individual subjects. Each tape was placed on the bottom of a medium jar, with the adhesive side upwards. The jars were stored at -80 0C until analysis of cytokines and total protein was performed. Cytokine levels were measured at different locations on the human body in the three different groups using the Sebutape: 1. Hospitalised patients without a PU: a. the left arm b. the sacrum 2. Hospitalised patients with a grade 1 PU: a. the left arm b. on top of the grade 1 PU c. 10 cm from the PU 3. Healthy volunteers without a PU (students group): a. The left arm b. The right arm c. The sacrum Data from the sacrum was obtained because the sacrum is an at risk area for developing PU, whereas data from the volar aspect of the left arm was obtained as a control. The Sebutape was applied at 10 cm distance from the PU to examine any local spatial differences of the cytokine concentrations. For all hospitalised patients information on age, nutrition, medication etc were obtained from the CBO decubitus score list (Appendix C: page ll) with help of the nurses in the Catharina hospital.

2.4

Sebutape extraction Before analysing the IL-1α, IL-8 and IL-1RA concentration and total protein contents, the Sebutape must be processed in such a way that the cytokines, chemokines and proteins can be extracted from the tape. The extraction process for the Sebutapes was based on a previous study (Perkins et al. 2001) (Appendix A2).

9

Briefly, the tapes were thawed to room temperature and each tape was immersed in 2 ml PBS (phosphate buffered saline) for 1 hour. The tapes were then sonificated for 10 minutes at room temperature, vortexed for 2 minutes, mixed with a pipette tip and then re-frozen overnight in a -80 0C freezer. The morning of the immunoassay the tape extracts were thawed, vortexed for 1 minute, mixed with a pipette tip to recover the total extract from the tapes. The fluid from the jars was transferred to small vials, in which they were analysed for IL-1α, IL1RA, IL-8 and total protein.

2.5

Data collection

2.5.1

Cytokine assay methods The IL-1α, IL-1RA and IL-8 contents in the extracts were quantified using a specific enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) (M9318, CLB, Amsterdam, The Netherlands), the details of which are included in Appendix A3. Briefly, the ELISA assay employs the quantitative sandwich enzyme immunoassay technique. A monoclonal antibody specific for the interleukin has been pre-coated onto a Maxisorp immunoplate (Nalge Nunc international, Roskilde, Denmark). After overnight in the dark at room temperature the pre-coated plates were blocked with PBS/0.5% BSA and incubated for 1 hour at room temperature. Subsequently, the standard and samples were added into the wells. After incubation for 1 hour at room temperature and washing with PBS/0.005% Tween-20, a detection antibody was added. The plates were incubated with 1:10000 diluted streptavidin-HRP (M2032, Sanquin Reagnets, Amsterdam, The Netherlands) for a period of 30 minutes. The enzyme reaction was initiated by adding 0.2 mg/ml of o-phenylenediamine dihydrochloride in 0.11 M acetate and pH 5.5 0.03% hydrogen peroxide, colour develops in proportion to the amount of interleukin bound in the initial stage. After the colourdevelopment is terminated by the addition of stop solution, 2 M H2SO4, a micro-plate reader is used to determine the optical density of each well at 490 nm. The interleukin concentration in each of the samples wells was calculated using the absorption calibration curve. All antibodies and standards were purchased from R&D systems (Abingdon, United Kingdom), unless otherwise indicated.

2.5.2

Total protein assay method The total protein levels in the solution were determined using a QuantiPro BCA Kit (QPBCA, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). The protocol is included in Appendix A4. Briefly, the total protein assay is similar to the Lowry procedure, in that both rely on the formation of a Cu2+ -protein complex under alkaline conditions, followed by reduction of the Cu2+ to Cu1+. The amount of reduction is proportional to protein present. BCA forms a purple-blue complex with Cu1+ in alkanine environments. The QuantiPro Working reagent is prepared by mixing 25 parts of Reagent QA with 25 parts of Reagent QB. After Reagents QA and QB have been combined, 1 part of Reagent QC is added and mixed until it is uniform in color (green). The QuantiPro assay consists of mixing 1 part of a protein sample with 1 part of the prepared QuantiPro Working Reagent. A protein standard of a known concentration is taken into account which gives a linear response from 0.5 to 30 mg/ml. The QuantiPro assays were performed at 600C. Colour development of the sample solution, from green to purple in proportion to protein concentration, begins immediately. The absorbance at 562 nm was recorded with a plate reader and the protein concentration was determined by comparison to the standard curve.

10

2.6

Data analysis Cytokine data were expressed as IL levels in pictograms per millilitre solvent from each Sebutape. The data for the cytokine and chemokine concentrations over different body sites for different subjects were assumed to be non-normal in distribution. Accordingly the data were presented as box-and-whisker plots with median and quartiles. Comparisons of the data within the hospitalised patient (group 1 and 2) between two time points and between the different places were performed using the Wilcoxon Signed-Rank test. Furthermore, comparisons of the data from the left arm and from the sacrum from the three groups were performed using a Mann Whitney test, because of independent variables. Probability values were considered statistically significant at the 5 per cent level (p ≤0.05). Statistical tests were performed using SPSS software.

11

Results In Appendix B5, table B5.1 and B5.2, the data of all hospitalised patients is shown, IL-1α concentration, TP level, risk score, age and genders. The results of the pilot study with the students (group 3) are presented in Appendix B2. The pilot study with the students showed that the IL-1α values on the left and right arm are comparable. Therefore only data from the left arm was needed in the two patient groups (group 1 and 2) as a control. Patients from the different wards did not show any significant differences in cytokine levels (Appendix B5), therefore no distinction was drawn in the patient data between the three wards.

Hospitalised patients without a PU After analysing the levels of cytokines IL-1RA and IL-8, it appeared that these values were not found with the ELISA method. Hence, only IL-1α was present in the tape and the results of this cytokine for the two patient groups are presented in this chapter. In these results, time point 1 represents the cytokine levels of the first time the Sebutape is applied on a specific body location and time point 2, represents the cytokine levels half an hour later on that specific place. Figure 3.1 shows the IL-1α/TP levels on the arm and on the sacrum of the 33 patients without a pressure ulcer (PU) (group 1). No significant difference in IL-1α/TP levels on the sacrum was observed between time 1 and time 2. However, a highly significant difference was observed for the cytokine levels on the arm between time 1 and 2 (p < 0.01). Also very significant difference of the cytokine levels between the arm and the sacrum was observed for both time 1 (p < 0.01) and time 2 (p < 0.001).

Hospitalised patients without a PU (n = 33) 90

**

**

80 IL-1α / TP ratio [pg/µ g]

3

70 60

**

50 40 30 20 10 0 Arm Sacrum (time 1)

Arm Sacrum (time 2)

zFigure 3.1: Box-and-whisker plot of the IL-1α /TP levels of patients without a pressure ulcer.

12

Hospitalised patients with a PU The location of the pressure ulcers was not the same for all patients included in the study, as detailed in section 2.2. Therefore, it was not possible to compare absolute values of IL-1α between these locations. The location of the pressure ulcer influences the amount of IL-1α, since at different locations, different skin composition and structural features, such as number and activity of sweat glands. In figures 3.2 -3.5, the IL-1α/TP levels in pg/µg of the patients with a pressure ulcer (group 2) on different locations are shown. In all these graphs, red indicated the control arm values, blue the specific PU location and green the data 10 cm from this PU. Figure 3.2 represents the IL-1α/TP levels of the 6 patients with a PU on the sacrum. No significant difference is observed between the cytokine levels on the arm (red) and the sacrum (blue) at both time points, time 1 (p > 0.05) and time 2 (p > 0.05). Between the arm and at 10 cm distant of the sacrum, the differences were also not significant at either time point. However, there was a significant difference between the IL-1α/TP levels on the sacrum and at 10 distant from the sacrum at both time points, time 1 (p < 0.05) and time 2 (p < 0.05). No significant difference was observed in IL-1α/TP levels with time. Figure 3.3 shows the IL-1α/TP levels of the 3 patients with a PU on the elbow. No significant differences were observed between the IL-1α/TP levels on the arm and on the elbow at both time points. However, an increase in time of the IL-1α/TP level on the elbow can be observed compared to the arm At 10 cm distant of the elbow only 1 person was measured at 1 time point, thus precluding any statistical analysis. With pressure ulcer on the elbow

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

50

*

*

45 IL-1α / TP level [pg/ µ g]

IL-1α / TP level [pg/ µ g]

With pressure ulcer on the sacrum

40 35 30 25 20 15 10 5

Arm Sacrum 10 cm (time 1)

0

Arm Sacrum 10 cm (time 2)

Figure 3.2 Box-and-whisker plot of the IL-1α/TP levels of the 6 patients with PU at the sacrum

Arm

Elbow 10 cm (time 1)

Arm Elbow (time 2)

Figure 3.3 Box-and-whisker plot of the IL-1α/TP levels of the 3 patients with PU at the elbow

In Figure 3.4 the IL-1α/TP levels of the 8 patients with a PU on the heel are shown. No significant difference between the IL-1α/TP levels on the arm and on the heel can be observed in both time points. The IL-1α/TP levels on the arm are high compared to the other patients with a grade 1 PU on another location. However, there was a significant difference between the IL-1α/TP levels on the arm and at 10 cm distant at time 1 (p < 0.05), but not at time 2 (p > 0.05). No significant difference was observed between IL-1α/TP levels on the heel and at a 10 cm distance from the heel at both time points. In Figure 3.5 the levels of the single patient with a pressure ulcer on the ear is shown. No subsequent statistical analysis could be performed.

13

With pressure ulcer on the ear

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

50

*

45 IL-1α / TP level [pg/ µ g]

IL-1α / TP ratio [pg/µ g]

With pressure ulcer on the heel

40 35 30 25 20 15 10 5

Arm

Heel 10 cm (time 1)

Arm

0

Heel 10 cm (time 2)

Figure 3.4 Box-and-whisker plot of the IL-1α/TP levels of the 8 patients with PU at the heel

Arm Ear (time 1)

Arm Ear (time 2)

Figure 3.5 Box-and-whisker plot of the IL-1α/TP levels of the patient with PU at the ear

Comparison between the three groups for the arm and sacrum The arm was the only unloaded location where the Sebutape was attached for all three subject groups and thus the cytokine levels of the arm could be compared between groups (Figure 3.6). Furthermore the change in cytokine levels on the sacrum at these three groups could also be compared (Figure 3.7). For these comparisons, group 2, only included six subjects with a grade 1 PU on the sacrum. The total protein had not been measured in the student group and hence figures 3.6 and 3.7 indicate the IL-1α absolute concentrations in pg/ml. Figure 3.6 shows that the patients without a PU and with a grade 1 PU have an increased IL1α concentration compared to the students at both time points. The cytokine levels between students and patients without a PU in time point 1 show a highly significant difference (p < 0.001). A significant difference was also found between students and patients without a PU in time point 2 (p < 0.01). However, no significant differences were observed between the cytokine levels of the students and the patients with a PU for both time points. However, at time one an increasing trend of the concentration was observed for the patients with a PU compared to the students. By contrast, a decreasing trend was observed in the IL-1α concentration for patients with a PU compared to the patients without a PU. Figure 3.7 indicates an increasing trend of the cytokine concentration at the sacrum of the patients compared to the students. At both time points the differences were highly significant between the students and the patients without a PU. However, the only significant difference was evident between the students and patients with a PU at time 1, whereas no significant difference was evident in the cytokine levels of the students and the patients with a PU. At time 2, the IL-1α concentration of the patients with a PU showed a lower median value compared to the concentration at patients without a PU. Also evident in Figures 3.6 and 3.7 is the increased IL-1α concentration on the sacrum compared to the levels on the arm for the hospitalised patients.

14

IL-1α α level on the arm of 3 groups 500

**

**

400 350 300 250 200 150 100

**

400 350 300

**

250 200 150 100 50

50 0

*

450 IL-1α concentration [pg/ml]

IL-1α concentration [pg/ml]

450

IL-1α α level on the sacrum of 3 groups 500

0 Students Without With (time 1)

Students Without With (time 1)

Students Without With (time 1)

Figure 3.6 Box-and-whisker plot of the IL-1α concentration on the arm (people at the TU/e, patients in the hospital without a PU and with a PU at the sacrum)

Students Without With (time 2)

Figure 3.7 Box-and-whisker plot of the IL1α concentration on the sacrum (people at the TU/e, patients in the hospital without a PU and with a PU at the sacrum)

Normalised sacrum concentration Another way of presentation of the data involves normalisation of the sacrum values for the IL-1α concentration to those of the arm (the control site). This is appropriate as the arm levels are not equivalent for all three groups. To compare the increase of cytokine levels at the sacrum between these groups the sacrum levels were thus normalised to the corresponding values at the arm. In Figure 3.8 the ratio values of the three groups, namely, students (n = 5), patients without a pressure ulcer (n = 33) and patients with a pressure ulcer (n = 6), are shown. The dashed line represents the value of unity for which the sacrum and arm have the same levels. Between hospitalised patients without a PU and those with a PU, there was an increased trend of the sacrum/arm ratio evident at both time points. Normalised sacrum levels (3 groups, 2 times) 15

10

5

0

Students Without (time 1)

With

Students Without (time 2)

With

Figure 3.8 Box-and-whisker plot of the normalised sacrum levels for the three groups (dashed line at 1)

15

Age dependent cytokine levels To study the possible influence of age on the cytokine levels on the arm and on the sacrum of the three different groups, a cluster approach was adopted. Possible cluster formations of the IL-1α concentrations and age are shown in figures 3.9 and 3.10. The cluster formation of the 3 different groups (students (n = 5), without pressure ulcer (n = 33) patients with pressure ulcer on the sacrum (n = 6)) was examined. Figure 3.9 shows the cluster formation on the arm of the 3 different groups. The data corresponding to the younger students are clearly on the left site of the figure. The cluster of the students is evidently smaller than the cluster of the patients at the hospital. The cluster for patients with a PU is on the right side corresponding to the most elderly patients and appears to be smaller in size to the cluster of the patients without a PU. In figure 3.10 the cluster formation on the sacrum of the 3 different groups is shown. In figure 3.10 compared to 3.9 the cluster were organised at proximal the same age level (x value). The size of the clusters associated with both patient groups are increased (IL-1α concentration is higher) in figure 3.10 compared to figure 3.9, indicating a greater variability of values at the sacrum. Age versus IL-1α α concentration

Age versus IL-1α α concentration IL-1α concentration [pg/ml]

Without PU (Catharina)

400

With PU (Catharina) Students (TU/e)

300 200 100

IL-1α concentration [pg/ml]

500

500

400 300 200 100 0

0 0

20

40

60

80

0

100

20

40

60

80

100

Age

Age Figure 3.9 IL-1α concentration at the sacrum versus the age

Figure 3.10 IL-1α concentration at the sacrum versus the age

Risk score dependent cytokine levels Figure 3.11 and 3.12 show the Il-1α/TP level versus the risk score of patients with a pressure ulcer respectively on the arm and on the sacrum. The patients are distributed by risk score which was noted by filling in the CBO decubitus score list on the day the Sebutapes were applied. Table 1 shows an overview of the classification of the groups and group size. Risk score

Groups

<8 8-12 > 12

No risk Raised risk High risk

Amount of patients in the group 4 7 7

Table 1 Overview of classification of the risk score and group size.

16

In all risk groups the values are comparable. At the arm at time 1 there is a spread of IL1α/TP concentration at patients with a raised risk. Expected were a higher IL-1α concentration at the patients with a high risk score and the lowest IL-1α/TP level at patients with no risk. IL-1α α /TP spread on the riskscore at the sacrum (time 1)

IL-1α α /TP spread on the riskscore at the arm (time 1) 50

50

40

No risk Raised risk High risk

35 30 25 20 15 10 5

IL-1α / TP level [pg/ µ g]

IL-1α / TP level [pg/ µ g]

45

45

No risk Raised risk High risk

40 35 30 25 20 15 10 5 0

0

Riskscore

Figure 3.11 IL-1α/TP level at the arm versus risk score

Riskscore

Figure 3.12 IL-1α/TP level at the sacrum versus risk score

17

4

Discussion In the present study the IL-1α, IL-1RA and IL-8 concentrations and TP levels were determined at three different groups: - Group 1 consists of patients without a PU (n = 33) and the Sebutape is applied to the left arm and sacrum. - Group 2 consists of patients with a grade 1 PU and the Sebutape is applied to the left arm, on top of the grade 1 PU and at 10 cm distant from the grade 1 PU. Group 2 is divided in four smaller groups; patients with a grade 1 PU on the heel (n = 8), the sacrum (n = 6), the elbow (n =3) and the ear (n = 1). - Group 3 consists of students (n = 5). Appendix B2 shows the results of the student measurements. Perkins et al. found IL-1α/TP values between 5 and 15 pg/µg at a healthy forearm. The values in the present study are between 2 and 30 pg/µg, with some peaks up to 50 pg/µg. The little difference can be due to the fact that in the present study the healthy people are hospitalised patients without a PU. In the previous study, IL-1RA and IL-8 concentrations were reported on different locations of the skin. However, in the present study, no concentrations of IL-1RA and IL-8 were found. In this study the Sebutape is applied for 2 minutes on the skin, whereas Perkins et al. applied the Sebutape for only one minute on the skin. It could be that the levels of cytokine and chemokine change with time. From the present findings, it is proposed that the IL-RA and IL8 concentrations are only present in high concentrations in the first 60 s. and rapidly decrease thereafter. A further investigation of the temporal profiles is required to estimate the differences in optimum concentration for each of the selected cytokines and chemokines. A significant difference in IL-1α/TP levels on the arm of hospitalised patients without a PU at the two time points was observed. By contrast, comparable values were found for this cytokine level on the arm of hospitalised patients with a PU between the two time points and for the students. Additional measurements of the student group (Appendix B3 Figure B3.3) indicated a difference in IL-1α concentrations between the morning and afternoon. No statistical analysis is performed due to the small group. Larger number of patients with and without a PU and additional students need to be examined at more time points to provide an increased insight into the influence of time. Hospitalised patients show an increase of the IL-1α/TP level on the sacrum compared to the arm at both time points (Fig. 3.1 and 3.2). This increase is caused primarily by an increase in the IL-1α concentration, as the TP levels were constant at both the sacrum and the arm. This increase in IL-1α concentration may be caused by the fact that these patients are all ill and bedridden and they are regularly subjected to friction and pressure in the sacral are, particularly when they are lying on their back. Reviewing the four different groups of patients at the hospital with a PU (Figs. 3.2 – 3.5), only the patients with a grade 1 PU on the sacrum (Fig. 3.2) show an increase value of the IL1α/TP compared to the control site (arm) as well as at 10 cm distance of the grade 1 PU at both time points. This might be explained by the fact that the sacrum is a flat surface and it is an easy location to apply the Sebutape. Indeed most of the grade 1 ulcers at the sacrum were large enough to be covered by the whole Sebutape, whereas PU at the other locations were smaller and thus the Sebutape overlapped with intact skin areas. Patients with a grade 1 PU on the elbow revealed an increased IL-1α/TP value compared to the arm, however only at the first time point. Because the group of patients with a grade 1 PU

18

on the elbow and a grade 1 PU on the ear are small in number, with 3 and 1 patient respectively, no statistical analysis was possible. The data of patients with a PU on the heel showed a higher cytokine level on the arm compared to the level on the heel, whereas this trend was reversed with other locations (Fig. 3.4). During measurement on the grade 1 PU at the heel the tapes were not firmly attached to a site with a curved contour. This problem was also observed in pilot studies at the student group (Appendix B2). Therefore the Sebutape could not be considered to be covering the entire skin surface. Due to the curvature of the heel and its distinctive structural properties, the present method is not suitable for estimating accurately the cytokine and chemokine concentrations on the heel. It is obvious that the cytokine levels were locally increased. Only on top of the PU at the sacrum the cytokine levels were higher compared to a 10 cm distance from the PU. The sacrum is exposed to friction and pressure and clinical evidence shows that the sacrum is sensitive for developing a PU. Reviewing the IL-1α concentration at the arm and sacrum of patients without a PU, patients with a grade 1 PU and students (Fig. 3.6 and 3.7), two differences are evident. First, the values on the arm and sacrum were higher in patients without a PU and with a grade 1 PU compared to the students. A reason for this observation is that all people without a PU and with a grade 1 PU are in the hospital for treatment of pathologies/diseases. Thus these represent subjects who are already sick which may influence levels of the IL-1α concentration. The second difference is that for patients with a grade 1 PU and patients without a PU there was an increased IL-1α/TP value on the sacrum compared to the arm (figure 3.6 and 3.7),whereas for the students there was no difference between the IL-1α concentration on the arm and the sacrum. Again a possible reason can be that all people in the hospital are ill. Patients in hospital are all bedridden and for that there is friction and pressure on the sacrum most of the time during the day. The sacrum of the student is unloaded for most of the time during the day. It is appropriate to normalise the IL-1α concentration to the arm to compare the results, because the cytokine levels of the arm are not the same between the groups (Fig. 3.8). By normalising, the sacrum/arm ratio at the students is almost unity; due to the fact the IL-1α concentration on the arm is comparable to the concentration on the sacrum. The highest sacrum/arm ratio is found at patients with a PU, followed by the ratio at patients without a PU is higher. It is not clear if the ratio at the patients with a grade 1 PU is higher because the IL1α concentration is higher at the sacrum or because the IL-1α concentration is lower at the arm of the patients without a PU. Figures 3.9 and 3.10 show the distribution of IL-1α concentration to the ages of the different groups. All groups exist of different aged people so it is actually not possible to compare the data between the groups. It is possible to compare the distribution of the IL-1α concentration at different locations (arm figure 3.9 and sacrum figure 3.10). A larger spread of the data points is visible at the sacrum compared to the arm. This can be explained by the fact that the arm is unloaded for most of the time. The sacrum on the other hand is, at patients in hospital who are most of the time bedridden, exposed to different amounts of friction and pressure all day in all patients.

19

5

Conclusion The objective of the present study was to measure the change of cytokine and chemokine concentrations in patients without a pressure ulcer and patients with a grade 1 pressure ulcer. The present study demonstrates that: • • • • • • •

•

It is possible to detect IL-1α concentration through the stratum corneum for both healthy people without a PU and hospitalised patients with and without a grade one PU. However, IL-RA and IL-8 can not be detected with the Sebutape. It is possible to determine the basal IL-1α level of people using the presented method. More experiments must be done to investigate the time dependency. No relation was found between IL-1α concentrations and age or risk score. The Sebutape can be used to measure the IL-1α concentrations on top of a grade 1 PU at the sacrum, the elbow and the ear. However, this method is not suitable for measurement of the cytokine level on the heel. There is a locally increasing trend of the IL-1α/TP level at patients with a grade 1 PU on the sacrum compared to the left arm. There is a significant difference between the IL-1α/TP levels on the sacrum and at 10 cm distance from the sacrum A significant difference is observed between the IL-1α/TP level on the arm and the grade 1 PU at the elbow at time 1. However, no significant change was found at time 2 at the elbow and on the ear compared to left arm. Hospitalised patients without a PU also show an increase of the cytokine level on the sacrum compared to the left arm. So due to friction and pressure on the skin the IL-1α/TP level is influenced.

20

6

Recommendations This study provides the first insight in the cytokine and chemokine levels on the skin of different people. It is clear that there is a difference between people but the insight in the levels can be expanded as follows. •

• •

•

•

In this study only the IL-1α concentration is visible after attaching Sebutape for 2 minutes on the skin. Perkins et al. can detect the IL-1RA and IL-8 concentration. It would be wise to find out the trend of the cytokines and chemokines after different times of attaching the tape. So there is an optimal time of attaching the tape and all the cytokines and chemokines are visible Take more time for the clinical measurement. A lack of time resulted in the fact that fewer patients could be included in the research. Because the variability of IL-1α on the people there is a large error on the mean. Only look at people with pressure ulcers on one location on the body. This is because the IL-1α is local. At different sides on the body the skin structure can differ, there are more or less sweat glands and other characteristics of the skin that can influence the cytokine concentration. It is essential to take the right control group. For this study 3 different groups were reviewed, students at the TU/e, patients without a PU and patients with a PU at the Catharina hospital. The students are aged lower compared to the patients in the hospital. It is better to compare the two groups in the hospital with people from an old people’s home or a home for the elderly. Get more insight in the patient data. A follow up if they are developing a pressure ulcer or not. This can be a reason of extreme values.

Approach in the hospital • Because it was difficult to find enough patients it is wise to include more wards than the three used in the present study. • More involvement of the nurses. In the present study the nurses are the persons who have to report the patients with a PU. You have to stimulate them so that they are active in reporting patients with PU. Future vision • Besides the three cytokines and chemokines which are reviewed in the present study there maybe other proteins which attach to the Sebutape. By mass spectrometry or other techniques it is possible to define all the proteins and maybe there is another interesting protein, cytokine or chemokine. • In the future it would be wise to combine the values of different cytokines and chemokines because only looking at one protein is not enough to determine if there is a risk on developing PU. • Developing of a biosensor which can scan the skin on different cytokines chemokines or other proteins which are present in the skin. The biosensor gives a score after scanning the skin. If this is above a threshold the patients are not at risk for developing a PU.

21

7

Bibliography Bours,G.J.J.W., Halfens,R.J.G., Berger,M.P.F., Huijer Abu-Saad,H., & Grol,R.T.P.M. (2003) Development of a model for case-mix adjustment of pressure ulcer prevalence rates. Med.Care, 41, 4555. Bronneberg,D., Bouten,C.V.C., Oomens,C.W.J., van Kemenade,P.M., & Baaijens,F.P.T. (2006) An in vitro Model System to Study the Damaging Effects of Prolonged Mechanical Loading of the Epidermis. Annals Of Biomedical Engineering, 34, 506-514. Dutch Institute of Health Care Improvement [CBO] 2002. Utrecht. Available from: URL: http://www.cbo.nl/product/richtlijnen/folder20021023121843/decubitus2002.pdf Coquette,A., Berna,N., Vandenbosch,A., Rosdy,M., De Wever,B., & Poumay,Y. (2003) Analysis of interleukin-1alpha (IL-1alpha) and interleukin-8 (IL-8) expression and release in in vitro reconstructed human epidermis for the prediction of in vivo skin irritation and/or sensitization. Toxicol.In Vitro, 17, 311-321. Corsini,E. & Galli,C.L. (1998) Cytokines and irritant contact dermatitis. Toxicol.Lett., 102-103, 277282. Gibbs,S., Vietsch,H., Meier,U., & Ponec,M. (2002) Effect of skin barrier competence on SLS and water-induced IL-1alpha expression. Exp.Dermatol., 11, 217-223. Harris,I.R., Yee,K.C., Walters,C.E., Cunliffe,W.J., Kearney,J.N., Wood,E.J., & Ingham,E. (1995) Cytokine and protease levels in healing and non-healing chronic venous leg ulcers. Exp.Dermatol., 4, 342-349. L.Schoonhoven (2002) Prediction of pressure ulcers: problems and prospects. Lee,R.T., Briggs,W.H., Cheng,G.C., Rossiter,H.B., Libby,P., & Kupper,T. (1997) Mechanical deformation promotes secretion of IL-1 alpha and IL-1 receptor antagonist. J.Immunol., 159, 50845088. Nixon J, McGough A. Principles of patient assessment: Screening for pressure ulcers and potential risk. In: Morison M, editor. The prevention and treatment of pressure ulcers. Mosby, 2001 55-74 Peirce,S.M., Skalak,T.C., & Rodeheaver,G.T. (2000) Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat. Wound.Repair Regen., 8, 68-76. Perkins,M.A., Osterhues,M.A., Farage,M.A., & Robinson,M.K. (2001) A noninvasive method to assess skin irritation and compromised skin conditions using simple tape adsorption of molecular markers of inflammation. Skin Res.Technol, 7, 227-237. Roose J, Mittal V, Degenholtz H, Castle N, Mulsant B.H, Nace D, Rubin F.H, (2006) Pressure ulcer prevention in black and white nursing home residents. Adv. Skin Wound. Care, 9, 262-268 Schoonhoven,L., Haalboom,J.R.E., Bousema,M.T., Algra,A., Grobbee,D.E., Grypdonck,M.H., Buskens,E., & prePURSE study group.The prevention and pressure ulcer risk score (2002) Prospective cohort study of routine use of risk assessment scales for prediction of pressure ulcers. BMJ, 325, 797.

22

Trengove,N.J., Stacey,M.C., MacAuley,S., Bennett,N., Gibson,J., Burslem,F., Murphy,G., & Schultz,G. (1999) Analysis of the acute and chronic wound environments: the role of proteases and their inhibitors. Wound.Repair Regen., 7, 442-452. Uchi,H., Terao,H., Koga,T., & Furue,M. (2000) Cytokines and chemokines in the epidermis. J.Dermatol.Sci., 24, S29-S38. Welss,T., Basketter,D.A., & Schroder,K.R. (2004) In vitro skin irritation: facts and future. State of the art review of mechanisms and models. Toxicol.In Vitro, 18, 231-243.

23

Appendix A: Protocols used for this study A1: Protocol: Sebutape extracting Materials • • • • • • • • •

Pipette tips Gloves Tissues Timer Vortex Sonification bath Jars Freezer -800C Micro tubes

Reagents •

PBS

Actions -

Store the Sebutape in jars (“mediumpotjes”) in –80oC freezer Thaw tapes to room temperature Add 2 ml of PBS Immerse in PBS for 1 hour in room temperature (be sure the tapes are fully immersed and not stick to the bottom of the jar) Sonificate tapes for 10 minutes in room temperature water bath Vortex contents for 2 minutes and mix with pipette Re-freeze overnight at –80oC Thaw extracts Vortex contents for 1 minute and mix with pipette Don’t remove the tapes from the jars (tweezers may contaminate the solution), but transfer some fluid (600µl) from the jars to micro tubes. Prepare standards and reagents as instructed in the ELISA protocol Follow ELISA protocol

24

A2: Protocol: Pilot study healthy volunteers Requirements / materials -

6 volunteers who are Monday, Wednesday and Friday present at the TU/e Space for measurements Mattress 135 pieces of Sebutape 135 medium jars (for storage of the Sebutape) Space in the -800 C freezer Gloves Napkins Alcohol to clean the tweezers after usage Tweezers Alarm clock Ruler Ice

Actions •

•

Sebum measurement. On the forehead the amount of sebum will be measured with special Sebutape facial sebum measuring. Place: Forehead Time: 5 seconds Cytokine measurement with Sebutape on 4 different places of the body. 1. On the sacrum (sensitive for decubitus) Place: In the middle of the two dimples of the sacrum Time: 2 minutes 2. On the left fore-arm Place: 10 cm distance of the wrist Time: 2 minutes 3. On the right fore-arm (symmetry on the body of the cytokine concentration) Place: 10 cm distance of the wrist 4. On the right heel (sensitive for decubitus) Time: 2 minutes

The Sebutape will be installed with a ‘pressure-roller’. After the two minutes the tape was removed from the skin with tweezers. Each tape was placed flat on the bottom of a medium jar, the adhesive side upwards. The jars were stored at -800 C till analysis of cytokines and total protein could be performed.

25

A3: Protocol: ELISA Detection of IL-8, IL-1α α and IL-1RA Last update by Jolet Sonsma on 15-05-2006 Quantities are suited to coat 3x96-wells plates Materials • • • • • • • • • • • • • •

Pipette tips Multipipette Micronic tubes PH-meter Flow stirrers Balance Mouthpiece Gloves Safety glasses Parafilm Tissues Timer Microplate reader 3x96-wells ELISA plates

Reagents • • • • • • • • • • • • • • •

Na2CO3.H2O (Caution, this chemical is irritating!) NaHCO3 (Caution, this chemical is irritating!) BSA (stored at 4°C) PBS PBS concentrated MiliQ water Tween 20 1M HCL (if not present, prepare by 10 times diluting concentrated HCL (10M) in water. Caution: Always add the HCL to the water; don’t do this the other way round! This chemical is corrosive) 5M NaOH (if not present, prepare by carefully dissolving 50gram NaOH in 250ml water. Caution: don’t add all the NaOH at the same time, because it will generate heat! This chemical is irritating and corrosive) Sodium acetate trihydrate Streptavidine poly-HRP O-phenylene diamine diHCL (Caution: always wear glasses, gloves and a mouthpiece when you are weighing this chemical. This chemical is very toxic, irritating and carcinogenic!) H2O2 (Caution: this chemical is corrosive!) 2M H2SO4 (if not present, prepare by adding 53.3ml concentrated H2SO4 to 446.7ml H2O. Caution: don’t do this the other way round! This chemical is corrosive) Antibodies: stored in aliquots at -30°C

26

Day 1 1. Prepare coating buffer Coating buffer: 0.1M sodium carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6) Prepare buffer A: dissolve 1.41g Na2CO3.H2O in 50ml MQ water (store at 4°C) Prepare buffer B: dissolve 0.42g NAHCO3 in 50ml MQ water (store at 4°C) Make 3 aliquots of 10 ml coatings buffer: Per aliquot add 2.8 ml buffer A to 7.2ml buffer B and mix thoroughly 2. Prepare coating solution Coating solution: monoclonal antibody diluted in coating buffer • • •

2.5 µg/ml IL-1RA: 25µl IL-1RA stock (1mg/ml) (MAB280, black tubes) + 10 ml coating buffer 2.0 µg/ml IL-1alpha: 40µl IL-1alpha stock (500µg/ml) (MAB200, black tubes) + 10ml coating buffer IL-8: 50µl IL-8 stock (kit, red tubes) + 10 ml coating buffer

3. Pipette 100µl of the appropriate coating solution into each well of a 96-wells plate (coat at least two lanes per plate for standard solutions and one lane per plate for dilution buffer according to layout) 4. Incubate overnight at room temperature in the dark. Cover plates with parafilm. 5. Prepare wash buffer Wash buffer: PBS/0.005% Tween Add 4500 ml distilled water to 500 ml concentrated PBS and add 250µl Tween20

Day 2 6. Prepare block buffer Block buffer: PBS/BSA 0.5% Add 2.5 gram BSA to 500 ml PBS (store at 4°C) 7. After overnight incubation: shake off excess liquid and be sure plates are as dry as possible 8. Pipette 140µl block buffer to each well and cover plates with parafilm. Incubate 1 hour at room temperature in the dark (longer incubation times will not affect results) 9. Prepare dilution buffer

27

Dilution buffer: PBS/0.5%BSA/0.005%Tween Add 5µl Tween20 to 100 ml block buffer (store at 4°C)

10. Prepare standard dilutions Dilute the appropriate recombinant antibody in dilution buffer. Prepare dilutions in an empty micronic tube. • • •

4000pg/ml IL-1RA: 20µl IL-1RA stock (100ng/ml)(280RA, green tubes) + 480µl dilution buffer 1000pg/ml IL-1alpha: 5µl IL-1alpha stock (100ng/ml)(200LA, green tubes) + 495µl dilution buffer 1500pg/ml IL-8: 75µl IL-8 stock (10ng/ml)(kit, black tubes) + 425µl dilution buffer

11. Add 250µl of the standard dilution to the next micronic tube containing 250µl dilution buffer and repeat this step. Mix thoroughly between steps. By repeating these steps you will create the next dilutions: IL-8 dilutions: 1500
750
375
187.5
93.75
46.88
23.44
11.72pg/ml IL-1alpha dilutions: 1000
500
250
125
62.5
31.25
15.93
7.81pg/ml IL-1 RA dilutions: 4000
2000
1000
500
250
125
62.5
31.25 pg/ml 12. Prepare sample dilutions Dilute samples in dilution buffer: Add 40µl sample to a micronic tube containing 360µl dilution buffer. Mix thoroughly and add 40µl to the next row micronic tubes containing 360µl dilution buffer. Sample dilutions are now 1, 10 and 100 times. 13. After incubation is complete: shake off excess liquid after and be sure plates are as dry as possible 14. Add 100µl of the standards/samples to each well off the right plate. Add 100µl dilution buffer to the first row 15. Incubate 1 hour at room temperature in the dark. Cover plates with parafilm 16. Prepare biotinylated antibody dilutions Dilute the appropriate biotinylated antibody in dilution buffer: • • •

200ng/ml IL-1RA
40µl IL-1RA stock (50µg/ml)(BAF280, red tubes) + 10 ml dilution buffer 12.5ng/ml IL-1alpha
2.5µl IL-1alpha stock (50µg/ml)(BAF200, red tubes) + 10 ml dilution buffer IL-8
100µl IL-8stock (kit, yellow tubes) + 10 ml coating dilution buffer

28

17. After incubations are complete, wash plates 4 times with wash buffer. Shake off excess liquid and be sure plates are as dry as possible 18. Add 100µl of the appropriate biotinylated antibody to each well of the right plate 19. Cover plates and incubate 1 hour at room temperature in the dark 20. Prepare conjugate solution: Add 5µl Streptavidine poly-HRP stock (1mg/ml) to 50ml dilution buffer 20. Turn on the plate reader (plate reader needs to warm up for approx 60 min.) 21. After incubations are complete, wash plates 4 times with wash buffer. Shake off excess liquid and be sure plates are as dry as possible 22. Add 100µl conjugate solution to each well 23. Cover the plates with parafilm and incubate 30 minutes at room temperature in the dark 24. Prepare acetate buffer Acetate buffer: 0.11M pH 5.5 Dissolve 0.75gram acetate (sodium acetate trihydrate) in 50 ml H2O and adjust the pH level to pH 5.5 by the addition of 1M HCL (store at 4°C). Do not store the acetate buffer longer than 2 weeks 25. Prepare substrate solution Substrate solution: Add 0.010 gram O-phenylene diamine diHCL to 50ml 0.11M acetate buffer and add 500µl H2O2 (prepare this substrate solution always fresh) 26. Prepare stop solution Sulfuric acid solution 2M: Add 53.3 ml concentrated H2SO4 to 446.7ml H2O. Caution: don’t do this the other way round! 27. After incubations are complete, wash plates 4 times with wash buffer. Shake off excess liquid and be sure plates are as dry as possible 28. Add 100µl substrate solution to each well and incubate until the 4th standard from the highest concentration begins to develop yellow color 29. Stop the reaction with 50µl 2M sulfuric acid. Color will turn orange 30. Measure optical density at 490nm by use of the ELISA reader

29

31. Use standard curves to determine sample concentrations Plate layout Dilution

Sample

Sample

Sample

buffer

1x

10 x

100 x

standard

Sample

Sample

Sample

1x

10 x

100x

30

standard

Sample

Sample

Sample

1x

10x

100x

A4: Protocol: BCA assay Materials • • • • • • • •

Pipette tips Gloves Tissues Timer Epjes Oven 600C 96 wells plate Plate reader

Reagents • • • •

QuantiPro Buffer (QA) consisting of sodium carbonate, sodium tartate, and sodium bicarbonate in 0.2 M NaOH, pH 11.25 QuantiPro Buffer (QB) consisting a 4% bicinchonicnic acid solution, pH 8.5 Copper (II) sulfate (QC), Pentahydrate 4% Solution (C2284) consisting a 4% copper (II) sulfate, pentahydrate solution Protein Standard Solution (PSS) consisting of 1.0 mg/ml bovine serum albumin (BSA) in 0.15 M NaCl with 0.05% sodium azide as a preservative

Actions -

-

Thaw your samples. If you have to prepare dilutions, dilute the samples in PBS. Prepare the BCA-solution: 25 parts of QA+ 25 parts of QB + 1 part of QC Prepare the BSA: 100 µl PSS with 1.9 ml deionized distilled water Prepare the BSA standard series: o 0 µg/ml: 0 µl BSA + 500 µl PBS + 500 µl BCA solution o 0.5 µg/ml: 5 µl BSA + 495 µl PBS + 500 µl BCA solution o 5 µg/ml: 50 µl BSA + 450 µl PBS + 500 µl BCA solution o 10 µg/ml: 100 µl BSA + 400 µl PBS + 500 µl BCA solution o 20 µg/ml: 200 µl BSA + 300 µl PBS + 500 µl BCA solution o 30 µg/ml: 300 µl BSA + 200 µl PBS + 500 µl BCA solution Prepare your samples: 500 µl BCA solution + 500 µl samples Incubate for 1 hour at 60ºC in the oven. Transfer 200 µl of the content of the tubes into the 96 wells plate Measure the absorbance at 562 nm in the plate reader. Determine the total level of protein in the samples using the standard curves, correct for the dilution factor.

31

Appendix B: Different pilot for this study B1: Pilot: Extraction efficiency Objective The objective of this pilot is to optimise the extraction method of Perkins et al. Method To determine the efficiency of the measurement method ‘spike experiments’ were carried out. By spiking, a known amount of cytokines (50, 100 and 200 pg/ml) was applied on the Sebutape. The tapes were dried under controlled nitrogen stream. After treating the tapes according to Appendix B1 (Protocol: Sebutape extracting), the concentration of the final solution should be 50, 100 and 200 pg/ml. Research was done to find the optimal method so the efficiency is near the 100%. The current protocol which was used by Jeroen de Schrijver was checked in some points. Three pilots were done to find the optimal method: 1. Different solution to solve the interleukin in. In this first spike experiment the best solvent for IL-1α has to be found. Currently PBS was used, but this leaves behind a solved salt drop, which can block the pore of the Sebutape. The question rises if it was better to use water. After solving the IL-1α in the fluids the concentration was measured. A better efficiency of IL-1α is found in PBS. So for further experiments PBS was used. 2. Different extraction solutions were checked. The medium jars, in which the Sebutape were stored, did not have the protection layer. This can prevent the proteins to attach to the inner side of the jar. Currently PBS was used. In this spike experiment it was investigated if dilution buffer was a better extraction solution than PBS. Dilution buffer contains tween, which can wash the proteins from the inner side of the jar. The efficiency of the experiment using the dilution buffer was better than the one where PBS was used. However this dilution buffer cannot be used in this study because it contains the protein BSA. Another experiment was done to determine the total amount of proteins and the presence of BSA will influence the outcome. 3. The third pilot was to check the step in which the tapes were stored in the freezer. In the current protocol the tapes were stored in the freezer at a temperature of –80oC. At this low temperature it could be possible that some proteins were damaged. In the third experiment the effect of storing the jars in the freezer is compared to storing them in a fridge. The results of this spike experiment were presented in figure.

32

Efficiency of IL-1α concentration in% + st. dev.

Spike experiment 160 140 120 100

Fridge Freezer

80 60 40 20 0 50 pg/ml

100 pg/ml

200 pg/ml

Applied IL-1α concentration

Figure B1.1 Result of spike experiment with fridge step and freezer step

In figure B1.1the x-axis shows the applied (known) concentration of IL-1α and the y-axis shows the reaming amount of IL-1α. The y-axis is in percentage of the applied amount. The efficiency of IL-1α remaining by using the freezer to store the tapes approaches the 100%. Using the fridge to store the tapes an amount of IL-1α perishes, the efficiency is round 80%. From the results it can be concluded that using the freezer will give the best results.

33

B2: Pilot: Basal interleukin level of healthy volunteers (students group) Objective The objective of this pilot is to get an idea of the basal cytokine and chemokine behaviour (IL-1α, IL-1RA and IL-8) at different parts of the body, on different times of the day and on 3 different days in a week. Methods A pilot study was done with healthy volunteers at the Technical University in Eindhoven. Measurements on six healthy volunteers at the age of 25 to 32 were done (3 men and 3 women) according to the protocol: Pilot study healthy volunteers (Appendix A2). The basal levels of IL-1α, IL-1RA and IL-8 were determined with this pilot. During 3 days 2 times a day (morning and afternoon) and at 4 different spots of the body (heel, sacrum, left – and right arm) the cytokine and chemokine levels were measured. Results & discussion  On the healthy volunteers there was no IL-1RA and IL-8 present. Only the change in IL-1α was visible.  The calibration curve starts at the concentration of 7,81 pg/ml. All the values below this were less accurate but were included in the results.  Person 4 appears to have psoriasis and is excluded from the study.  There was symmetry over the body; the concentrations of IL-1α at the left and right arm were comparable, Figure B2.1. The concentrations on the left and right arm on a particular time, morning day 1, were shown. The dashed lines make the relation between time 1 and 2 visible. There was no statistical significant between the left and right arm.

IL-1α concentration

IL-1α α morning day 1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Person 1 Person 2 Person 3 Person 5 Person 6

Left arm

Right arm

Place on the body Figure B2.1 IL-1α concentration on the left and right arm at 5 different people at the TU/e

 In most cases the concentration on the heel was below the threshold of 7.81 pg/ml. The mean value of the heel on the different day’s was 4.4 ± 3.6 pg/ml at the first day, 4.4 ± 2.3 pg/ml at the second day and 13.5 ± 10.2 pg/ml on the third day (Figure B2.2). This method was not applicable to the heel. Firstly, the tape were not firmly

34

attached because of the curvature of the heel and secondly because the stratum corneum on the heel is much thicker then on other parts of the body.

Mean of IL-1α α concentration place and day IL-1α concentration (pg/ml) mean + SEM

50 45 40 35 30

Day 1 Day 2

25 20 15 10 5 0

Day 3

Left arm

Heel

Sacrum

Figure B2.2 Mean and SEM of the IL-1α concentration of 5 people at the TU/e at different place and day.

 Over the body the concentration a variation in IL-1α was visible. Comparing left arm with sacrum the mean values of the persons during day 1, 2, and 3 were respectively: left arm 19.9 ± 17.3 pg/ml sacrum 23.3 ± 17.8 pg/ml; left arm 15.8 ± 12.8 pg/ml sacrum 26.7 ± 21.3 pg/ml; left arm 21.6 ± 21.9 pg/ml sacrum 16.7 ± 13.7 pg/ml. After calculating there was no statistical significant between the left arm and the sacrum.  During the day there was variability. In Figure B2.3 the purple bars (afternoon) were most of the time higher than the blue bars (morning). So there was an increase of IL1α concentration in the afternoon. This was also visible by all other 3 persons. There was a trend between the morning and afternoon. The measurements were done in the summer time at 300C.

35

IL-1α concentration (pg/ml)

IL-1α α concentration over the body (person 2) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Day 1 morning Day 1 afternoon Day 2 morning Day 2 afternoon Day 3 morning Day 3 afternoon

Left arm

Right arm

Heel

Sacrum

Figure B2.3 IL-1α concentration of person 2 at different place and during the week (morning, afternoon of the 3 days)

 IL-1α concentration between different people. In Figure B2.4 the IL-1α concentration of four different peoples on the left arm is shown. There is a spread in IL-1α concentration between people. On person 1 the values are the lowest, at person 5 there spread of the IL-1α concentration on the arm at the six different measurement points.

80

IL-1α α concentration on the left arm during the week

IL-1α concentration (pg/ml)

70 60 50 40 30 20 10 0

Person 1 Person 2 Person 3 Person 5

Figure B2.4 IL-1α concentration on the left arm of 4 different persons and the 6 different time points (day one, two and three in the morning and afternoon)

36

Morning day 1

Person 1

Person 2

Person 3

Person 4

Person 5

Person 6

Age

26

32

26

27

27

29

Left arm Right arm Heel Sacrum

8,15 3,99 1,61 5,01

32,21 28,84 1,21 25,55

38,83 32,56 0,0 22,02

5,79 0,75 0,38 40,97

20,76 16,76 0,75 4,98

63,53 50,59 0,0 13,79

10,91 12,05 0,75 7,06

32,89 44,24 0,76 42,05

26,95 23,61 0,59 16,80

10,34 5,08 3,80 56,24

52,57 54,60 7,38 18,36

57,07 47,11 8,83 35,22

6,91 6,43 14,01 9,83

26,41 29,71 3,39 33,12

15,19 12,18 3,59 8,34

4,65 3,80 3,18 10,86

4,86 8,58 3,80 10,60

14,63 7,14 4,01 10,60

8,43 7,62 5,91 20,90

51,86 52,93 3,25 93,64

19,57 12,89 2,00 9,88

6,20 6,28 3,00 32,60

18,91 17,30 3,01 38,32

15,69 12,58 2,75 19,01

3,02 3,01 6,19 11,71

26,41 11,67 1,28 26,06

11,37 13,81 3,25 15,37

5,44 6,03 7,84 25,49

22,86 9,72 7,53 10,68

19,57 16,03 5,45 12,64

5,73 9,41 7,23 15,69

30,14 38,25 6,03 51,31

23,98 30,14 7,53 36,61

8,18 8,77 11,67 13,65

77,35 15,75 6,62 19,93

Afternoon day 1 Left arm Right arm Heel Sacrum Morning day 2 Left arm Right arm Heel Sacrum Afternoon day 2 Left arm Right arm Heel Sacrum Morning day 3 Left arm Right arm Heel Sacrum Afternoon day 3 Left arm Right arm Heel Sacrum

Table B2.1 IL-1α concentration of the students group at different time, day and location

37

B3: Pilot: Cytokine and chemokine level after loading a healthy volunteer Objective The objective of this pilot study was to determine whether or not the cytokine and chemokine concentration were increased on a self made pressure ulcer.

Method A pilot study was set up to imitate a grade 1 pressure ulcer by a healthy volunteer at the Technical University in Eindhoven. For 6 hours three different cups were applied on the under arm of the volunteer near the elbow. At the first two methods the cup was fixed with tape and the last method was performed with a tie. The person was allowed to work with the cup on it.

Figure B3.1 Fanta lemon cup fixed with a tie on the arm

Results and discussion  The shape of the cup is important to get an optimal pressure ulcer. Three different cups were used (Figure B3.2). Only by using the fanta lemon cup the there was a round fully red spot visible. The other cups only get a round red circle at the edge of the cup. The edge of the fanta lemon cup is round like in Fig. B3.2. So only the results of the fanta lemon cup were shown (Figure B3.3)

Figure B3.2 Two different cups which are used

 It is better to use bandage or a tie instead of tape. Tape will damage the skin after relieving. With bandage it can be possible to fix the pressure so the results of several tests can be compared. For now the results were only an indication if there is a increase of cytokines and chemokines after loading.  The results of the pilot study were shown in Figure B3.3.

38

IL-1α α concentration IL-1α concentration (pg/ml)

350 300

IL-1alpha concentration after pressure

250 Mean IL-1alpha concentration (controle)

200 150 100 50 0 0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

Time (min)

Figure B3.3 Course of the IL-1α concentration after 6 hours loading on the arm of a healthy volunteer

Immediately after removing the pressure and removing the cup Sebutape was applied for two minutes. After half a minute the next tape was applied and so on for eight times (blue line). Also a control, a non loading part of the under arm, was taken into account (red line). An increase of IL-1α concentration was visible. In time the concentration will decrease until a steady state is reached. This pilot indicates that after loading there was a visible increase of IL-1α concentration measurable. The method with Sebutape can demonstrate alterations in the IL-1α concentration on the skin surface caused by loading.

39

B4: Pilot: AZM In the Academic Hospital in Maastricht (AZM) a pilot study was done under direction of dr.Schaper. This pilot involves a research to Charcot neuro-osteo-arthropathie (Charcot in this report). Charcot is a rare but important invalidated complication of diabetes mellitus. At a rough estimate 0.15%-2.5% of the Diabetic patients develop Charcot. Charcot is a neurogen inflammatory process that in the acute stadium pictures a red, warm swollen foot which ended in bone destruction and bone fragmentation. The final result is mostly a seriously deformed foot with decreased function. The pathogenesis is not known but probably multifactoral. One factor is that according to studies Charcot is closely associated with autonomous neuropathy by diabetic. The research at the AZM is to look if there is an excessive inflammatory response by patients were the anti-inflammatory activity is failed. A little external trauma through injection of Candida Albicans (a mould) is simulated. Candida Albicans is injected in different concentrations on the upper arm and foot instep. The research is done by patients with a Charcot foot in previous history and by three control groups: healthy people, patients with diabetic mellitus type II with neuropathy (pnp+) and patients with diabetic mellitus type II without neuropathy (pnp-). In Maasticht they want to determine if the response on the foot instep is higher by patients who in previous history develop Charcot in comparison to patients without Charcot. Objective The objective of our part is to determine if cytokine and chemokine concentration changes at the different spot where the mould is injected. And finally look if it is possible to make a dose response curve. Method A pilot was done with one person from each group (one with Charcot in history and the three control groups). Sebutape was applied for 2 minutes, 24 hours after injecting the mould. On the arm and foot 5 tapes were applied: one the spots were the different concentrations were injected and one near the spots as a control. Results and discussion  One ELISA is done, so there was place for 36 different samples on the plate. From the healthy person only the highest concentration and the control are analysed.  Figure B4.1 and B4.2 show the result of the IL-1α concentration on the arm and foot. The dashed line presents the dose response curve. The dots at the right are the results of the control place without a mould injection at the foot and arm. In both figures B4.1 and B4.2 the IL-1α concentration at the person with Charcot is the highest value. The IL-1α concentration on the arm at the person with Charcot increases with the increase in the doses of mould which is injected, while the control place of the Charcot patient is low.  In Figure B4.3 and B4.4 the result of the IL-1RA concentration on the arm and foot were shown. The IL-1RA concentration of the patient with neuropathy is to low to detect at the arm and at the foot. The IL-1RA concentration of the patient without neuropathy on the arm is to low to detect. Both figures show a decrease in the IL-1RA concentration at the Charcot patient and the pnp - patients by increase of the doses. At the foot as well as the arm the control place of the Charcot patient is high.  At Charcot patients an increase of the IL-1α concentration a decrease of IL-1RA is visible. This is expectable because IL-1RA is the antagonist of IL-1RA.

40

IL-1α α (arm)

IL-1α α (foot)

400

400 350

300

pnp +

250

charcot

200

pnp -

150 100 50

IL-1α concentratie

IL-1α concentratie

350

300 250

pnp +

200

charcot

150

pnp -

100 50

0 0,1

0,2

0,6

1

0

Controle

0,1

Dose

B4.1 Dose response curve of the IL-1α concentration on the arm of three different patients. The right dots is the control spot where no injection is done.

0,2

0,6 Dose

IL-1RA (arm)

IL-1RA (foot) IL-1RA concentration

IL-1α concentratie

250 200 150

Charcot

100 50 0 0,2

0,6

Controle

B4.2 Dose response curve of the IL-1α concentration on the sacrum of three different patients. The right dots is the control spot where no injection is done.

300

0,1

1

1

Controle

250 200 150

Charcot

100

Pnp -

50 0 0,1

Dose

B4.3 Dose response curve of the IL-1RA concentration on the arm of the patient with Charcot. The right dot is the control spot where no injection is done.

300

0,2

0,6

1

Controle

Dose

B4.4 Dose response curve of the IL-1RA concentration on the sacrum of the patient with Charcot. The right dot is the control spot where no injection is done.

41

B5: Data tables: Measurements at the Catharina hospital In table B5.1 data of the hospitalised patients with a grade 1 PU are shown and in B5.2 the data of hospitalised patients without a PU are shown. The patients code is first the ward (LZ, O, AG) second with a PU (D) or without a PU (Z) third the number of the patients at the ward.

Hospitalised patients with a grade 1 PU

Table B5.1 Data table of IL-1α concentration in pg/ml, TP level in mg/ml, IL-1α/TP, gender, risk score and age of hospitalised patients with a grade 1 PU.

42

Hospitalised patients without a PU

Table B5.2 Data table of IL-1α concentration in pg/ml, TP level in mg/ml, IL-1α/TP, gender, risk score and age of hospitalised patients without a PU.

43

Appendix C: Medical Ethical approval

a

Bijlage C.1 C.2 C.3 C.4 C.5 C.6 C.7

- Aanmeldingsformulier - ABR-formulier - Onderzoeksprotocol - Informatiebrief voor de proefpersonen - Toestemmingsformulier - Decubitus score lijst - Bewijs dekking aansprakelijkheid van de onderzoeker - Lijst van deelnemende centra met hoofdonderzoekers

b

C1: Aanmeldingsformulier Lokale toetsing Medisch Wetenschappelijk Onderzoek

1.

Titel van het onderzoek: Een objectieve maat voor het niet invasief aantonen van graad 1 decubitus Codenummer: Versie / datum van het onderzoek: Versie 1, 26-10-2006

2.

Betreft het een gewijzigde versie of een vervolgstudie op een reeds eerder door de METC beoordeeld protocol?

3.

Onder wiens leiding wordt het onderzoek in dit ziekenhuis uitgevoerd? Naam: Dr. G. Krekels Afdeling / Discipline: Dermatologie Functie: Dermatoloog In dienst van: Catharina Ziekenhuis Eindhoven

4.

Door wie wordt het onderzoek feitelijk uitgevoerd? Naam: M.T.C. van der Lans Afdeling / Discipline: Biomedisch Technologie, Technische Universiteit Eindhoven Functie: Afstudeerder van de master Medical Engineering aan de TU/e In dienst van: Technische Universiteit Eindhoven

5.

Wordt gelijktijdig ander wetenschappelijk onderzoek uitgevoerd waardoor het welslagen van het onderzoek en van andere onderzoeken bemoeilijkt kan worden?

nee

6.

Zijn er voldoende patiënten beschikbaar uit de normale populatie die de instelling bezoekt?

ja

7.

Hoeveel patiënten worden in het CZE geincludeerd?

66

8.

Is er een goede achterwacht bij afwezigheid van de onderzoeker?

Ja

9.

Is er voldoende gekwalificeerd ondersteunend personeel beschikbaar?

Ja

10.

Leidt de inzet van het ondersteunende personeel tot stagnatie in de reguliere zorgverlening? Wie zorgt voor het inlichten van het personeel? Emmy Dijkmans, verpleegkundige wond en decubitus consulent Marieke van der Lans, uitvoerder van het onderzoek

nee

Zijn alle voor de uitvoering van het onderzoek benodigde faciliteiten beschikbaar?

ja

11.

12.

nee

c

13.

Leidt de inzet van de benodigde faciliteiten niet tot stagnatie in de reguliere zorgverlening?

nee

14.

Bij medicatie onderzoek: Zijn er afdoende afspraken gemaakt met de apotheek? Eventuele geneesmiddelen verstrekking in het kader van het onderzoek vindt plaats onder eindverantwoordelijkheid van de ziekenhuisapotheker!

N.V.T.

15.

Indien er sprake is van een onderzoek waar gebruikt wordt gemaakt van straling, N.V.T zijn er afdoende afspraken gemaakt met de radiologie, radiologen en zo nodig de stralingscommissie?

16.

Zijn er afdoende afspraken gemaakt met verdere eventueel betrokken afdelingen: Handtekening

17.

Apotheek:

N.V.T……………….

Functieafdeling:

N.V.T……………….

Laboratorium:

N.V.T……………….

Nucleair geneeskunde:

N.V.T……………….

Radiologie:

N.V.T……………….

Vaatlaboratorium:

N.V.T…………………

Verpleegafdeling:

N.V.T.……………….

Overige:

N.V.T……………….

Apparatuur Heeft de Klinisch fysische dienst de apparatuur die in het kader van het onderzoek wordt gebruikt in/nabij de proefpersoon in orde en veilig bevonden? Dat wil zeggen de apparatuur die niet volgens de gangbare procedures zijn gecontroleerd door hen.

N.V.T. (er zal geen apparatuur gebruikt worden)

d

Formulier voor medisch-ethische beoordeling en registratie

B2. Houdt het onderzoek verband met een eerder door een erkende METC of door de CCMO beoordeelde studie of is het onderzoek reeds eerder bij een erkende METC ter beoordeling voorgelegd?

ABR-formulier, versie februari 2006 Onderzoeksdossiernummer ABR Nummer 15165 Versie

04

Jaar

07

Dossiernummer

NL15165.060.06

Reden voor Versie

Veranderen van verrichter

ja, het onderzoek houdt verband met – of is het vervolg op – een eerder beoordeelde studie Status

Definitief

Status per 08-01-2007

ja, het onderzoek is eerder ter beoordeling aan een erkende METC of de CCMO voorgelegd (stuur kopie besluit mee) nee Commissie Niet-erkende METC

A. Sectie - Openbaar maken gegevens medisch wetenschappelijk onderzoek A1. De CCMO streeft naar meer transparantie over (de beoordeling van) medischwetenschappelijk onderzoek met mensen, geslachtscellen, embryo's en foetussen in utero. De verrichter (opdrachtgever/sponsor) kan hier aangeven toestemming te verlenen voor de openbaarmaking van de antwoorden op de vragen gemarkeerd met een wereldbol en de samenvatting bij dit formulier via de CCMO-website, dan wel de openbaarmaking te weigeren: de verrichter verleent de CCMO toestemming voor de bovengenoemde openbaarmaking de verrichter verleent de CCMO géén toestemming voor de bovengenoemde openbaarmaking B. Sectie - Administratief B1. Betreft het onderzoek met geneesmiddelen (inclusief gentherapie, somatische celtherapie, GGO's, zie verdere toelichting) als bedoeld in de Wet medisch-wetenschappelijk onderzoek met mensen (WMO)?

ja nee

e

B3. Is het protocol reeds door een andere instantie op zijn wetenschappelijke aspecten beoordeeld?

ja (stuur kopie van beoordeling mee) nee B4. Is het protocol (nog) in een ander openbaar trial register geregistreerd?

ja nee B5. Naam indiener/contactpersoon voor de oordelende toetsingscommissie Achternaam indiener/contactpersoon Titel en voorletters Tussenvoegsel Type Organisatie/Bedrijf Organisatie/Bedrijf

Lans B.Sc. M.T.C. van der Universiteiten Anders, nl.

Voer naam Organisatie/Bedrijf in Afdeling Intern adres Adres Postcode en plaats Land Telefoon Fax E-mail

Technische Universiteit Eindhoven Biomedische Technologie Den Dolech 2 5612 AZ Eindhoven Nederland 0648382889 [email protected]

Objectieve maat voor het niet invasief aantonen van graad 1 decubitus C3. Trefwoorden (maximaal 4, plaats elk trefwoord op een aparte regel) C3a. In het Engels Cytokinen Chemokinen Sebutape Doorligwonden

B6. Is de indiener werkzaam bij de opdrachtgever/sponsor (verrichter) van het onderzoek? C3b. In het Nederlands Ja

Nee

Type Organisatie/Bedrijf Organisatie/Bedrijf Adres Postcode en plaats Land Telefoon Fax E-mail C. Sectie - Onderzoek C1. Volledige titel van het onderzoek C1a. In het Engels Objective marker to non invasively detect grade 1 decubitus C1b. In het Nederlands

Cytokine Chemonkine Sebutape Pressure ulcers C4. Beschrijf het belang van het onderzoek en de beoogde toepassing van de resultaten (verwijs eventueel naar de relevante pagina's in het protocol). Het vinden van een geschikte objectieve maat om eenvoudig aan te tonen of patiënten behoren tot de groep met een verhoogd risico voor het krijgen van doorligwonden of niet (pagina 4 van het protocol) C5. Wat is de hoofdvraagstelling van het onderzoek? Hebben de patiënten met graad 1 decubitus een verhoogde cytokinen en chemokinen concentratie C6. Betreft het onderzoek een multicenter-onderzoek?

Objectieve maat voor het niet invasief aantonen van graad 1 decubitus nee C2. Verkorte titel van het onderzoek/acroniem C2a. In het Engels Objective marker to non invasively detect grade 1 decubitus

ja - alleen in Nederland ja - internationaal binnen de Europese Unie ja - internationaal ook buiten de Europese Unie

C2b. In het Nederlands

f

C12. Op welke pagina van het onderzoeksprotocol wordt een onderbouwing gegeven van het aantal proefpersonen/(rest)embryo's/foetussen in utero?

* ja namelijk nee

10 C8. Wie is/zijn medisch verantwoordelijk voor de proefpersonen die deelnemen aan het onderzoek Dr. Gertruud Krekels dermatoloog in het Catharina Ziekenhuis Eindhoven en Emmy Dijkmans verpleegkundig wond en decubitus consulent C9. In welk centrum/welke centra (incl. huisartsenpraktijken) in Nederland wordt het onderzoek uitgevoerd? Geef per centrum op: aantal proefpersonen, naam hoofdonderzoeker, naam onafhankelijk arts.

C13. Onderzoeksgebied

etiologie organisatorisch/zorgonderzoek diagnostiek preventie

Centrum Informatie

therapie Centrum

Proefpersonen Hoofdonderzoeker

Catharina-ziekenhuis

66

Marieke van der Lans

Onafhankelijk

veiligheid

arts Simone van der Geer

C10. Betreft het onderzoek met:

werkzaamheid farmacokinetiek farmacodynamiek bio-equivalentie

mensen geslachtscellen (rest-)embryo's foetussen in utero C11. Beoogd totaal aantal proefpersonen/(rest)embryo's/foetussen in utero: C11a. In Nederland 66

dosis-respons farmacogenomics farmaco-economie anders namelijk C14. Type onderzoek

observationeel onderzoek zonder invasieve metingen observationeel onderzoek met invasieve metingen

g

productcode interventie-onderzoek

Is het geneesmiddel geregistreerd in Nederland ?

fase I (a)

ja - voor de te bestuderen indicatie/dosering

fase II (b) fase III (c)

ja - voor een andere indicatie/dosering namelijk

fase IV (d) overige onderzoeken waarbij geneesmiddelen worden toegepast (e) niet van toepassing

specialiténaam generieke naam productcode Is het geneesmiddel geregistreerd in Nederland ?

C16a. Geneesmiddel (max. 5) namelijk specialiténaam generieke naam productcode Is het geneesmiddel geregistreerd in Nederland ?

nee ja - voor de te bestuderen indicatie/dosering ja - voor een andere indicatie/dosering namelijk

nee ja - voor de te bestuderen indicatie/dosering ja - voor een andere indicatie/dosering namelijk

specialiténaam generieke naam productcode Is het geneesmiddel geregistreerd in Nederland ?

nee

andere indicatie/dosering specialiténaam

ja - voor de te bestuderen indicatie/dosering

generieke naam productcode

ja - voor een andere indicatie/dosering namelijk

Is het geneesmiddel geregistreerd in Nederland ?

C16b.

ja - voor een andere indicatie/dosering namelijk specialiténaam generieke naam

Vaccin, namelijk: In het Engels: In het Nederlands:

nee ja - voor de te bestuderen indicatie/dosering

h

nee

C16c. Radiofarmaceutisch geneesmiddel, namelijk: In het Engels: In het Nederlands: C16d. Opiumwetmiddelen in farmaceutische vorm ter behandeling van verslaafden, namelijk:

In het Engels: In het Nederlands:

ja

C16e. Somatische celtherapie Oorsprong van de cellen

nee autoloog ja

allogeen C16f.

nee

Genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) Vermeld organisme waarvan GGO is afgeleid bacterie virus anders namelijk C16g.

gedeeltelijk namelijk C19. Is er sprake van (nog) een andere interventie dan met geneesmiddelen zoals bedoeld in de Wet Medisch Wetenschappelijk Onderzoek met Mensen (zie toelichting)?

Gentherapie Type gentherapie in-vivo gentherapie

Ja

ex vivo gentherapie Type vector niet-virale vector (bijv. plasmide) virale vector anders namelijk

C16h. Xenogene celtherapie onderzoek, vermeld dier van oorsprong

Nee C19a. Medisch hulpmiddel, namelijk In het Engels: In het Nederlands: Sebutape (Manufactured under U.S. Patent 4.532.937)

wie is de fabrikant ? heeft het hulpmiddel een CEmarkering en identificatienummer?

In het Engels In het Nederlands

nee risicoclassificatie hulpmiddel: klasse I

C16i.

klasse IIa

Antisense-oligonucleotiden onderzoek, namelijk: In het Engels In het Nederlands

klasse IIb

C16j. Andere interventie, namelijk: In het Engels: In het Nederlands:

i

ja ja - voor andere toepassing

C16i. Interferentie RNA, namelijk: In het Engels In het Nederlands

CuDerm Coorporation Dallas

klasse III Bij medisch hulpmiddel zonder CEmarkering: is het hulpmiddel goedgekeurd (voor gebruik in het

ja (voeg rapport bij)

onderhavige onderzoek) door een technische/instrumentele dienst van de instelling?

nee niet van toepassing namelijk

C19b. Operatie, namelijk In het Engels: In het Nederlands:

patiënten op dezelfde afdeling zonder aantoonbare graad 1 decubitus

C21. Betreft het een gerandomiseerd onderzoek?

C19c. Psychosociale interventie, namelijk In het Engels: In het Nederlands: C19d. Voeding(stoffen), namelijk In het Engels: In het Nederlands:

ja nee namelijk open enkelblind

C19e. Bewegingstherapie, namelijk In het Engels: In het Nederlands:

dubbelblind parallel

C19f. interventie met radioactieve straling, namelijk In het Engels: In het Nederlands:

cross-over

C19g.

anders Blootstellingsonderzoek (bijv pesticidenonderzoek), namelijk In het Engels: In het Nederlands:

C19h. andere interventie , namelijk In het Engels: In het Nederlands: C20. Is/zijn er (een) controlegroep (en)?

C22. Op welke klasse(n) van aandoeningen heeft het onderzoek betrekking (maximaal 3)

hartaandoeningen congenitale, familiaire en genetische aandoeningen bloed- en lymfestelsel aandoeningen

j

ja

zenuwstelsel aandoeningen

nee

oogaandoeningen

ja, geneesmiddel

evenwichtsorgaan- en ooraandoeningen

ja, placebo

ademhalingsstelsel-, thorax- en mediastinumaandoeningen

C24. Beoogde start- en einddatum van het onderzoek maagdarmstelselaandoeningen nier- en urinewegaandoeningen huid- en onderhuidaandoeningen epidermale en dermale aandoeningen skeletspierstelsel- en bindweefselaandoeningen

C24a. Start Datum (dd-mm-jjjj) C24b. Eind Datum (dd-mm-jjjj) D. Sectie - Proefpersonen

20-12-2006 01-07-2006

D1. Is er een proefpersonenverzekering conform de WMO-eisen afgesloten of wordt aan de oordelende toetsingscommissie ontheffing gevraagd?

endocriene aandoeningen voedingsstoornissen en metabole ziekten

proefpersonenverzekering is afgesloten bij verzekeringsmaatschappij

infecties en parasitaire aandoeningen

ontheffing van de verzekering wordt gevraagd

letsels, intoxicaties en verrichtingscomplicaties neoplasmata, benigne, maligne en niet-gespecificeerd (incl cysten en poliepen) chirurgische en medische verrichtingen

niet van toepassing - onderzoek valt onder de Embryowet en niet onder de WMO Verzekeringsmaatschappij namelijk D2. Gezonde proefpersonen en/of patiënten

bloedvataandoeningen algemene aandoeningen en aandoeningen op de plek van toediening

Gezonde proefpersonen Aantal

zwangerschap, perinatale periode en puerperium Patiënten Aantal

sociale omstandigheden immuunsysteemaandoeningen lever- en galaandoeningen voortplantingsstelsel- en borstaandoeningen

66

D3. Welke specifieke populaties worden voor deelname aan het onderzoek benaderd? Patiënten op de afdeling algemene chirugie, longziekten en orthopedie (dit is overlegd door Emmy Dijkmans met de afdelingshoofden).

psychische stoornissen overig, namelijk

D4. Voornaamste inclusiecriteria

C23.Geef twee synoniemen voor de aandoening die bestudeerd wordt, waarvan tenminste één lekenterm. In het Nederlands:

k

Doorligwonden, decubitus

D4b. In het Nederlands 1. Een groep patiënten met een graad 1 doorligwond (11 per afdeling). 2. Een groep patiënten zonder aanwezige doorligwonden (11 per afdeling).

D5. Voornaamste exclusiecriteria nee D5b. In het Nederlands Patiënten met uitgebreide huidaandoeningen zoals psoriasis of eczeem worden geëxcludeerd van het onderzoek en patiënten met enkel graad 1 decubitus op de hiel (pagina 12 protocol)

D11. Waaruit bestaat de vergoeding voor de proefpersonen?

geen vergoeding D6. Bij welke categorie proefpersonen wordt het onderzoek uitgevoerd (meerdere antwoorden mogelijk)

reiskosten financiële vergoeding (in Euro’s)

18 jaar of ouder en wilsbekwaam (ga naar vraag D10) 18 jaar of ouder en wilsonbekwaam (ga naar vraag D7) 12 t/m 17 jaar en in staat tot het geven van geïnformeerde toestemming (ga naar vraag D8)

andere vergoeding Vergoeding namelijk

€

D12. Is deze vergoeding afhankelijk van bepaalde voorwaarden, bijvoorbeeld het voltooien van (een deel van) het onderzoek?

12 t/m 17 jaar en niet in staat tot het geven van geïnformeerde toestemming (wilsonbekwaam) (ga naar vraag D7) jonger dan 12 jaar (ga naar vraag D8 )

ja (motiveer) nee

mensen met een verstandelijke handicap mensen met een psychiatrische aandoening mensen met een dementieel syndroom mensen met een verminderd bewustzijn anders namelijk D10. Verkeren (sommige) proefpersonen in een afhankelijkheidssituatie ten opzichte van de onderzoeker of degene die de deelnemers werft? (lees de toelichting voor voorbeelden wanneer er sprake kan zijn van een afhankelijkheidssituatie)

ja

l

niet van toepassing namelijk E. Sectie - Voor- en nadelen E1. Wordt er bij dit onderzoek een rechtstreeks therapeutisch effect beoogd bij de proefpersonen / patiënten?

ja (therapeutisch onderzoek) nee (niet-therapeutisch onderzoek) E1b. Zo nee, kan deelname op een andere manier ten goede komen aan de proefpersoon?

ja (motiveer)

nee namelijk niet van toepassing namelijk E2. Waaruit bestaat de belasting van het onderzoek (en een eventueel daaraan voorafgaande keuring) voor de proefpersonen?

Op het wel of niet aanwezig zijn van graad 1 decubitus

venapunctie arteriepunctie

Tijdbeslag

per bezoek 30 minuten totaal eenmalig totale duur van de studie voor 30 minuten de individuele proefpersoon

E3. Worden de proefpersonen in verband met het onderzoek in het ziekenhuis opgenomen of wordt een opname verlengd?

ja - het verblijf het ziekenhuis/instituut wordt in verband met het onderzoek verlengd

intraveneuze injectie intra-arteriële injectie subcutane injectie intramusculaire injectie intra- of periarticulaire injectie liquorafname

ja - ze worden voor het onderzoek in het ziekenhuis/instituut opgenomen nee E3a. Zo ja,

biopsie hoe lang hoe vaak

dag(en) extra maal

E4. Beschrijf in hoeverre proefpersonen worden onderworpen aan handelingen dan wel een gedragswijze krijgen opgelegd, zoals vragenlijst, interviews, lichamelijk/psychologisch onderzoek, ontzegging, dieet (voor invasieve ingrepen: zie vraag E6) Er zal een vragenlijst afgenomen worden (decubitus-score-lijst van het Catharina Ziekenhuis) en er zal op maximaal 3 plaatsen gedurende 2 minuten Sebutape aangebracht worden. E5. Worden de proefpersonen getest op bepaalde aandoeningen/condities?

ja (motiveer)

m

scopie

catheterisatie onderzoek met stralenbelasting andere ingrepen E7. Welke maatregelen zijn genomen om (eventuele) risico’s van de bijkomende ingrepen te vermijden en nadelige gevolgen te beperken? Er zitten geen risico's aan de ingreep. De Sebutape plakt nauwelijks dus kan pijnloos verwijderd worden. E8. Hoe is de spreiding van de ingrepen in de tijd, met name afname van bloed en ander lichaamsmateriaal (verwijs eventueel naar de flow chart in het protocol)?

2 of 3 keer wordt de Sebutape voor 2 minuten op de huid aangebracht. nee E9. Geef aan welke risico’s er voor proefpersonen zijn verbonden aan deelname aan het onderzoek.

niet van toepassing F. Sectie - Informatie en privacy

Er zijn geen echte risico's. (in de 30 minuten zal de vragenlijst afgenomen en wordt 2 of 3 keer voor 2 minuten Sebutape op de huid aangebracht worden). E9a. Geef op grond van uw eigen afweging aan waarom het uitvoeren van het onderzoek, in het licht van de belasting en/of risico’s die voor proefpersonen aan deelname verbonden zijn, gerechtvaardigd is? Er zitten geen risico's en het is nauwelijks belastend voor de patiënt. E10. Indien het onderzoek bij minderjarige en/of wilsonbekwame proefpersonen wordt uitgevoerd en geen direct therapeutisch effect wordt beoogd: waarom kunnen belasting en risico's als minimaal worden beschouwd? (Verwijs eventueel naar de relevante pagina's in het protocol.)

niet van toepassing E11. Kan de eventuele therapie na beëindiging van het onderzoek worden voortgezet?

F1. Hoe worden de proefpersonen geworven en door wie (onderzoeker, behandelend arts, andere persoon) wordt de proefpersoon/wettelijke vertegenwoordiger geïnformeerd en om toestemming gevraagd? Wanneer het personeel van de afdeling een patiënt met graad 1 decubitus tegen komen dan wordt Marieke vd Lans en/of Emmy Dijkmans gewaarschuwd. Deze zullen de patiënten informeren en vraag voor toestemming om bij hen het onderzoek uit te voeren. F2. Hoeveel bedenktijd krijgen de proefpersonen/wettelijke vertegenwoordigers om te beslissen over deelname? 1 dag F3. Wordt de huisarts, behandelend specialist en/of apotheker van de proefpersoon geïnformeerd over diens deelname aan het onderzoek?

ja (de proefpersoon dient hiervoor toestemming te geven) nee omdat

ja (motiveer) nee (motiveer) niet van toepassing in welk kader en voor hoelang? omdat E12. Heeft deelname aan het onderzoek voor de proefpersoon tot gevolg dat van de standaardbehandeling of -diagnostiek kan worden afgeweken of deze kan worden uitgesteld?

ja

n

F4. Worden persoonsgegevens gecodeerd?

ja nee omdat F4a. Zo ja, hoe is deze codering opgebouwd? Iedere afdeling heeft zijn eigen letter combinatie en er wordt onderscheid gemaakt tussen patiënten met en zonder graad 1 decubitus.

Binnen de groepen krijgt iedere patiënt een nummer, op volgorde van behandeling (als eerst behandeld nummer 1 als laatst nummer 11) naast het nummer zullen ook de 2 eerste initialen van de naam van de patiënt mee genomen worden. F4b. Wie heeft toegang tot de sleutel van deze code? Marieke van der Lans ja F4c. Wie hebben toegang tot de brondocumenten en eventuele andere tot de persoon herleidbare gegevens?

nee

Marieke van der Lans ja F5. Hoe wordt het lichaamsmateriaal gedurende het onderzoek bewaard?

in tot de proefpersoon herleidbare vorm

nee F7. Kunnen proefpersonen na afloop van het onderzoek opnieuw benaderd worden (bijvoorbeeld voor nader onderzoek of follow-up)?

in niet tot de proefpersoon herleidbare vorm (volledig geanonimiseerd) niet van toepassing F5c. Wie heeft/hebben toegang tot het materiaal gedurende het onderzoek? Marieke van der Lans F6. Wordt afgenomen lichaamsmateriaal na afloop van het onderzoek vernietigd?

ja nee (motiveer) niet van toepassing omdat

in tot de proefpersoon herleidbare vorm

o

ja nee

ja nee G. Sectie - Financieel G1. Door welke geldstroom wordt het onderzoek gefinancierd?

eerste geldstroom (Geld van Ministerie van OC&W aan universiteiten) tweede geldstroom (NWO of KNAW), namelijk: derde geldstroom (anders dan 1e of 2e geldstroom, zoals collectebusfondsen, Europese Unie, vakministeries of bedrijven), namelijk: Senter

G2. Wordt het onderzoek (mede) gefinancierd door de industrie/bedrijven?

ja - door de industrie/bedrijf zoals is opgegeven bij vraag B6 (opdrachtgever van het onderzoek) ja - (ook) door andere industrie/bedrijven dan de opdrachtgever

nee

H. Sectie - Publicatiebeleid H1. Zijn door de opdrachtgever/subsidiegever bepaalde voorwaarden gesteld aan het openbaar maken van de onderzoeksresultaten?

nee namelijk

ja (licht toe) nee

G3. Ontvangt de arts/onderzoeker persoonlijk (afgezien van zijn/haar normale salaris) een vergoeding voor de uitvoering van het onderhavige onderzoek?

ja

I. Sectie - Indiening en beoordeling I1. Selecteer de toetsingscommissie die het oordeel geeft in de zin van de WMO

nee

ja nee Zo ja, tussen welke partijen en personen is het contract afgesloten (evt contract bijsluiten)?

Per patiënt of proefpersoon (bedragen in euro's)

Commissie METC Catharina Ziekenhuis (Eindhoven) J. Sectie - Aanvullende opmerkingen Aanvullende opmerkingen K. Sectie - Samenvatting Titel onderzoek Objectieve maat voor het niet invasief aantonen van graad 1 decubitus

Het gehele onderzoek (bedragen in euro's) € € G4. Heeft/hebben de onderzoeker(s) gedurende de afgelopen vijf jaar op een of andere wijze een persoonlijke financiële relatie (gehad) met de verrichter/sponsor van het huidige onderzoek?

ja (licht toe)

p

Achtergrond van het onderzoek: In een onderzoek toonde Schoonhoven et al. aan dat de voorspellende waarde van de huidige risico scorelijsten beperkt is, 30% van de patiënten met decubitus in ziekenhuizen worden ten onrechte ingedeeld in een laagrisico groep. De behoefte aan een betere manier om risico patiënten op te sporen, is dan ook hoog. Een eerste stap in de richting van een verbeterde risicoanalyse is het vaststellen van een objectieve maat voor vroegtijdige detectie van decubitus.

Huidonderzoek aan de Technische Universiteit Eindhoven richt zich op het meten van schademarkers van de huid, stoffen die vrijkomen als gevolg van mechanische belasting vóór het optreden van zichtbare weefselschade. Men richt zich vooral op cytokine en chemokine, eiwitten die door cellen uitgescheiden worden om een ontstekingsreactie tot stand te brengen als eerste response op cel- en weefselschade. In een in vitro modelsysteem van de bovenste laag van de huid, de epidermis, bekeken we het tot expressie komen van deze eiwitten. Uit deze studies is gebleken dat aanhoudende mechanische belasting leidt tot een toename in de uitscheiding van cytokinen en chemokinen. Op de Technische Universiteit in Eindhoven is een niet-invasieve methode ontwikkeld om deze cytokinen en chemokinen ook aan de oppervlakte van de huid te meten. Dit is door het aanbrengen van Sebutape op de huid. Doel van het onderzoek: Om vast te stellen of cytokinen en chemokinen geschikt zijn als objectieve maat voor de vroegtijdige detectie van decubitus, dient als ‘proof of principle’ onderzocht te worden of de concentratie van deze eiwitten is verhoogd bij beginnende decubitus wonden. Het doel van de huidige pilot studie is dan ook het meten van de cytokinen en chemokinen concentratie bij patiënten met en zonder graad 1 decubitus. Onderzoeksopzet: Bij een groep patiënten met graad 1 decubitus zal: 1. De risicoscorelijst voor decubitus worden afgenomen. 2. Op 3 verschillende plaatsen gedurende 2 minuten Sebutape geplakt worden, op de rode huid, 50 mm van de rode huid verwijderd en op de linker arm. Bij een groep patiënten zonder graad 1 decubitus zal: 1. De risicoscorelijst voor decubitus worden afgenomen. 2. Op 2 verschillende plaatsen gedurende 2 minuten Sebutape geplakt worden, op de stuit en op de linker arm. Onderzoekspopulatie: In overleg met Emmy Dijkmans is gekozen om het onderzoek op de volgende 3 afdelingen te doen: Algemene chirugie, longziekten en orthopedie. Emmy heeft met de afdelingshoofden gesproken en deze hebben aangegeven dat ze mee willen werken. Aan de hand van voorafgaande metingen met gezonde proefpersonen is met een power analyse bepaald dat er een patiëntengroep van 11 patiënten noodzakelijk is (pagina 10 van het protocol). Primaire onderzoeksvariabelen/uitkomstmaten: De gemiddelde IL-1alfa concentratie bij gezonde proefpersonen is gemiddeld 20.7

q

+/- 17.5 pg/ml. Uit eerder onderzoek is gebleken dat na scheren van de huid de de concentratie IL-1alfa verdubbeld, hier gaan we voor ons onderzoek ook vanuit. Voor de andere cytokinen en chemokinen (IL-1RA, IL-8 en TNF-alfa) verwachten we bij patienten met graad 1 decubitus een meetbare waarde te zien. Secundaire onderzoeksvariabelen/uitkomstmaten (indien van toepassing): De decubitus score na het afnemen van de vragenlijst. Waarbij de volgende groepen te onderscheiden zijn: 1. Niet verhoogd risico, score onder de 8 punten 2. Verhoogd risico, score tussen de 8 en 12 punten 3. Extra verhoogd risico, score hoger dan 12 punten Na het analyseren van de Sebutape zullen de concentraties IL-1RA, IL-1alfa, IL-8 en TNF-alfa bepaald worden in pg/ml Omschrijving en inschatting van belasting en risico (indien van toepassing): Totale belasting zal 30 minuten zijn. In deze tijd wordt een vragenlijst afgenomen en zal of 2 of 3 keer voor 2 minuten Sebutape op de huid worden aangebracht worden. ONDERTEKENING De verrichter en indiener verklaren hierbij: a.

het formulier (en samenvatting) volledig en naar waarheid te hebben ingevuld;

b.

de antwoorden op de vragen uit het ABR-formulier niet in strijd zijn met het bijbehorende onderzoeksdossier en onderzoekscontract Naar waarheid getekend, door de door de indiener verrichter (=opdrachtgever) …………… datum Handtekening

…………… datum Handtekening

naam functie

naam functie

Gertruud Krekels Dermatoloog, voorzitter decubituscommissie Catharina

Marieke van der Lans Afstudeerder bij de master Medical Engineering

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Een objectieve maat voor het niet invasief aantonen van graad 1 decubitus

Onderzoeksteam Hoofd onderzoekers: M.T.C. van der Lans, B.Sc. en Dr. ir. C.W.J. Oomens Technische Universiteit Eindhoven, Biomedische Technologie Laboratorium voor Biomechanica en Tissue Engineering P.O. box 513, 5600 MB, Eindhoven e-mail: [email protected] [email protected] Co-auteurs en deelnemers: D. Bronneberg, M.Sc., Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhoven Dr. ir. A. Stekelenburg, Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhoven Prof. dr. D.L. Bader, Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhoven Prof. dr. ir. F.P.T. Baaijens, Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhoven Dr. G. krekels, Dermatologie, Catharina Ziekenhuis Eindhoven E Dijkmans, Verpleegkundig wond en decubitus consulent Catharina Ziekenhuis Eindhoven

r

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Samenvatting In een onderzoek toonde Schoonhoven et al. aan dat de voorspellende waarde van de huidige risico scorelijsten beperkt is, 30% van de patiënten met decubitus in ziekenhuizen worden ten onrechte ingedeeld in een laagrisico groep. De behoefte aan een betere manier om risico patiënten op te sporen, is dan ook hoog. Een eerste stap in de richting van een verbeterde risicoanalyse is het vaststellen van een objectieve maat voor vroegtijdige detectie van decubitus. Huidonderzoek aan de Technische Universiteit Eindhoven richt zich op het meten van schademarkers van de huid, stoffen die vrijkomen als gevolg van mechanische belasting vóór het optreden van zichtbare weefselschade. Men richt zich vooral op cytokine en chemokine, eiwitten die door cellen uitgescheiden worden om een ontstekingsreactie tot stand te brengen als eerste response op cel- en weefselschade. In een in vitro modelsysteem van de bovenste laag van de huid, de epidermis, is gekeken naar het tot expressie komen van deze eiwitten. Uit deze studies is gebleken dat aanhoudende mechanische belasting leidt tot een toename in de uitscheiding van cytokinen en chemokinen. Op de Technische Universiteit in Eindhoven is een niet-invasieve methode ontwikkeld om deze cytokinen en chemokinen ook aan de oppervlakte van de huid te meten. Dit is door het aanbrengen van Sebutape op de huid. Om vast te stellen of cytokinen en chemokinen geschikt zijn als objectieve maat voor de vroegtijdige detectie van decubitus, dient als ‘proof of principle’ onderzocht te worden of de concentratie van deze eiwitten is verhoogd bij beginnende decubitus wonden. Het doel van de huidige pilot studie is dan ook het meten van de cytokinen en chemokinen concentratie bij patiënten met en zonder graad 1 decubitus. Aan de hand van voorafgaande metingen met gezonde proefpersonen is met een power analyse bepaald dat er een patiëntengroep van 11 patiënten noodzakelijk is. De opzet van het onderzoek zal zijn dat er op 3 verschillende plaatsten (op de rode huid, 50 mm van de rode huid en de linker arm) gedurende 2 minuten Sebutape aangebracht worden. Bij patiënten zonder graad 1 decubitus zal de Sebutape op 2 plaatsen geplakt worden (op de linker arm, ter controle en op de stuit, meest voorkomende plek voor decubitus). De patiënten worden gevraagd om gedurende een half uur de te plakken plaats te ontlasten zodat daarna nog een keer op dezelfde plaats de tapes geplakt worden. Ook zal bij beide groepen een risicoscorelijst voor decubitus afgenomen worden. Het onderzoek zal eenmalig gebeuren en zal per persoon een uur in beslag nemen. Omdat de Sebutape nauwelijks plakt zal de patiënt hier absoluut geen hinder van ondervinden. De tapes zullen geanalyseerd worden met behulp van ELISA in het laboratorium van de Technische Universiteit in Eindhoven op de aanwezigheid van IL-1α, IL-1RA, IL-8 en TNF-α concentratie per plaats en per persoon in pg/ml.

s

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Inhoud Samenvatting ....................................................................................................................................s 1

Inleiding .......................................................................................................................... u 1.1 Decubitus classificatie .................................................................................... v 1.2 Cytokinen en chemokinen .............................................................................. v 1.2.1 IL-1α, IL-1β, IL-1RA ............................................................................... w 1.2.2 IL-8............................................................................................................ w 1.2.3 TNF-α........................................................................................................ w 1.3 Wetenschappelijke onderbouwing.................................................................. x 1.3.1 Sebutape ..................................................................................................... x 1.3.2 Rendement van meetmethode..................................................................... y 1.3.3 Basaal niveau van de verschillende cytokinen en chemokinen .................. y 1.3.4 Power analyse............................................................................................. z

2

Het doel van het onderzoek.........................................................................................bb

3

Uitvoering van het onderzoek ......................................................................................cc 3.1 Patiënten groep ..............................................................................................cc 3.1.1 Inclusie criteria ..........................................................................................cc 3.1.2 Exclusie criteria .........................................................................................cc 3.2 Benaderen van het personeel en de patiënten ................................................cc 3.3 Behandeling van de patiënt........................................................................... dd 3.4 Aanbrengen van de Sebutape........................................................................ dd 3.5 Bewerken en analyseren van de Sebutape .....................................................ee

4

Rapportage .....................................................................................................................ff

Referenties ..................................................................................................................................... gg Brief voor de patiënten .................................................................................................................hh Toestemmingsformulier................................................................................................................kk Decubitus scorelijst Catharina....................................................................................................... ll Bewijs dekking aansprakelijkheid van de onderzoeker ..........................................................mm Lijst van deelnemende centra met hoofdonderzoeker ...............................................................nn

t

11-12-2006 (versie 2)

1

Confidentieel

Inleiding Decubitus kan volgens de CBO-richtlijn Decubitus (2002) omschreven worden als weefselversterf, veroorzaakt door de inwerking op het lichaam van druk-, schuif-, en wrijvingskrachten of een combinatie daarvan. Deze wonden zijn pijnlijk en moeilijk te behandelen. De prevalentie van decubitus in academische en algemene ziekhuizen bedraagt momenteel zo’n 15% en in verpleeghuizen 24% (Bours et al. 2003). Naast het menselijke leed vormt decubitus een grote kostenpost voor de gezondheidszorg. In 1999 werd meer dan 700 miljoen van het totale budget van de gezondheidszorg besteed aan het behandelen en voorkomen van decubitus of aan het verlengen van het ziekenhuisverblijf voor wondbehandeling (Health Council of the Netherlands. Pressure Ulcers. 1999. Publication no. 1999/23). Indien effectieve preventieve maatregelen, dat wil zeggen maatregelen gericht op het verminderen van druk-, schuif-, en wrijvingskrachten, op tijd genomen worden, zou het in theorie mogelijk moeten zijn de meeste decubitus letsels te voorkomen of in ernst te beperken (Schoonhoven et al. 2002). Preventieve maatregelen zijn echter duur en arbeidsintensief, en zouden daarom alleen toegepast moeten worden als patiënten daadwerkelijk risico lopen op het ontwikkelen van decubitus. Dit besef heeft dan ook geleid tot het ontstaan van de huidige risicoscorelijsten, zoals de Norton, Braden en Waterlow schalen, om hoogrisico patiënten op te sporen. Deze risicoscorelijsten zijn echter deels subjectief en hebben een relatief zwakke wetenschappelijke onderbouwing. Recentelijk heeft Schoonhoven et al. aangetoond dat de voorspellende waarde van deze lijsten beperkt is, 30% van de patiënten met decubitus in ziekenhuizen worden nog steeds gemist, dat wil zeggen ten onrechte ingedeeld in een laagrisico groep (Schoonhoven et al. 2005). De behoefte aan een betere manier om risico patiënten op te sporen, is dan ook hoog. Een eerste stap in de richting van een verbeterde risico analyse is het vaststellen van een objectieve maat voor vroegtijdige detectie van decubitus. Huidonderzoek aan de Technische Universiteit Eindhoven richt zich op het meten van schademarkers van de huid, stoffen die vrijkomen als gevolg van mechanische belasting vóór het optreden van zichtbare weefselschade. Op dit moment wordt er gebruik gemaakt van een in vitro modelsysteem van de huid om deze schademarkers te bepalen. We richten ons hierbij op schademarkers die in de bovenste laag van de huid, de epidermis, tot expressie komen en die aan het oppervlakte van de huid te meten zijn. De groep van schademarkers waar we ons momenteel op richten zijn de zogenaamde cytokinen en chemokinen. Dit zijn kleine eiwitten die door cellen uitgescheiden worden om een ontstekingsreactie tot stand te brengen als eerste response op cel- en weefselschade. Om vast te stellen of deze cytokinen en chemokinen daadwerkelijk gebruikt kunnen worden voor vroegtijdige detectie van decubitus zijn we een samenwerking aangegaan met het Catherina ziekenhuis in Eindhoven. In een pilotstudie wensen we aan te tonen of de uitscheiding van cytokinen en chemokinen aan de huid is verhoogd bij patiënten met graad 1 decubitus. Op de Techische Universiteit in Eindhoven is een niet-invasieve methode ontwikkeld om deze cytokinen en chemokinen aan het oppervlakte van de huid te meten. Deze methode bestaat uit het aanbrengen van tapes op de huid. Deze tapes absorberen cytokinen en chemokinen uit de huid en kunnen vervolgens weer pijnloos van de huid worden verwijderd. De huidige meetmethode is vooral bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Indien kan worden aangetoond dat cytokinen en chemokinen geschikt zijn als objectieve maat voor het aantonen van graad 1 decubitus, zal deze meetmethode worden verbeterd. Wellicht zal er dan in samenwerking met de industrie een biosensor ontwikkeld worden die klinisch toepasbaar is.

u

11-12-2006 (versie 2)

1.1

Confidentieel

Decubitus classificatie De EPUAP (European Pressure Ulcer Advisory Panel) en het kwaliteitsinstituut voor de gezondheidszorg CBO onderscheiden 4 graden van decubitus. Graad 1 Graad 2

Graad 3

Graad 4

Niet wegdrukbare roodheid van de intacte huid. Verkleuring van de huid, warmte oedeem en verharding zijn andere kenmerken. Oppervlakkig huiddefect van de opperhuid (epidermis), al dan niet met aantasting van de huidlaag daaronder (lederhuid, of dermis). Het effect manifesteert zich als een blaar of een oppervlakkige ontvelling. Huiddefect met schade of necrose van de huid en onderhuids weefsel (subcutis). De schade kan zich uitstrekken tot het onderliggende bindweefsel vlies (fascie). Uitgebreide weefselschade of weefselversterf (necrose) aan spieren, botweefsel of ondersteunende weefsels, met of zonder schade aan de opperhuid (epidermis) en lederhuid (dermis).

De huidige studie is gericht op patiënten met graad 1 decubitus. 1.2

Cytokinen en chemokinen Cytokinen kunnen het best worden omschreven als kleine eiwitten (molecuulgewicht ca. 8-80 kDa) die een belangrijke rol spelen in ontstekingsreacties en in de immune afweer (immunologie). Cytokinen zijn signaalstoffen die handelen over kleine afstanden, in korte tijd en in kleine concentraties. Deze signaalstoffen werken door te binden aan specifieke receptoren op het celmembraan dat een cascade in gang zet, die resulteert in de inductie, versterking of remming van een aantal cytokine gereguleerde genen in de celkern. Uit in vitro studies van onze groep is gebleken dat aanhoudende mechanische belasting leidt tot een toename in de uitscheiding van cytokinen en chemokinen in de epidermis, de bovenste laag van de huid (Bronneberg et al. 2006). In deze studies is gebruik gemaakt van een in vitro model van de epidermis (EpiDerm). Dit model is vervaardigd door huid cellen (keratinocyten) op de bovenzijde van een poreus, flexibel membraan te zaaien. Nadat deze kweekjes worden blootgesteld aan lucht ontstaat er een gedifferentieerd, meerlagig model van de humane epidermis. Klinisch relevante drukken (0, 50, 75, 100, 150 en 200 mmHg) werden op de bovenzijde van dit model aangebracht in een belastingsapparaat. Deze drukken kunnen worden ervaren als een patiënt in bed ligt of zit. Na 24 uur belasten werd er een toename in interleukine 1 α (IL-1α), interleukine 1 receptor antagonist (IL-1RA), tumor necoris factor α (TNF-α), CXCL/IL-8 en gemeten, maar niet in CCL2/MCP-1, CXCL1/GRO-α en CCL-20/MIP3α. Een eerste toename in deze cytokinen en chemokinen was zichtbaar bij een druk van 75 mmHg en werd al gemeten vóór het ontstaan van structurele weefselschade. Deze cytokinen lijken dan ook geschikt voor het vroegtijdig detecteren van decubitus. In onze studies richten we ons op cytokinen en chemokinen die snel vrijkomen op het moment dat cellen en/of weefsel worden beschadigd. Bovendien zijn we voornamelijk geïnteresseerd in cytokinen en chemokinen die door keratinocyten worden geproduceerd en uitgescheiden. Omdat deze cytokinen en chemokinen wellicht aan het oppervlakte van de huid te meten zijn.

v

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Hieronder staat een klein arsenaal aan cytokinen en chemokinen (IL-1α, IL-1RA, IL-8 en TNF-α) beschreven die afkomstig zijn van keratinocyten in de epidermis. Zoals eerder beschreven bleek de uitscheiding van deze cytokinen en chemokinen verhoogd te zijn bij aanhoudende mechanische belasting in een in vitro model van de epidermis. Bovendien blijkt dat IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-8 en TNF-α vooral van belang zijn bij het acute faseproces van wondgenezing en dus snel worden gereguleerd bij cel en weefsel beschadiging (Uchi et al. 2000). 1.2.1

IL-1α, IL-1β, IL-1RA Interleukine-1 (IL-1, 31 kDa) is een multifunctionele cytokine die een sleutelrol speelt in het tot stand brengen van ontstekings- en immuunreacties (Uchi et al. 2000). Keratinocyten produceren zowel IL-1α, IL-1β als de receptor antagonist IL-1RA. IL1α en IL-1β hebben dezelfde biologische activiteit, maar worden verschillend door keratinocyten uitgescheiden. IL-1α wordt opgeslagen in keratinocyten en verlaat normaliter de epidermis bij het afschilferen van de huid. Echter zodra de epidermis beschadigd raakt, door bijvoorbeeld blootstelling aan chemicaliën of door weefsel vervorming, wordt IL-1α uitgescheiden (Lee et al. 1997) (Spiekstra et al. 2005). Deze cytokine start vervolgens een ontstekings- en immuunreactie onder andere door het stimuleren van de productie van andere cytokinen en chemokinen, waaronder IL-8 en TNF-α. De productie van IL-α wordt bovendien zelf gestimuleerd door TNF-α. IL1RA is een competitieve remmer van IL-1α. De activiteit van IL-1α wordt gereguleerd door de verhouding tussen IL-1RA en IL-1α. IL-β is bovendien alleen actief op het moment dat het geknipt wordt door een enzym dat afkomstig is van Langerhans cellen. Het merendeel van de IL-1 activiteit van keratinocyten wordt dan ook geleverd door IL1α, terwijl de IL-1 activiteit van Langerhans cellen wordt geleverd door IL-1β.

1.2.2

IL-8 Interleukin 8 (IL-8, 8 kDa) is een chemokine met een laag moleculair gewicht en bestaat uit een korte peptide keten. Het effect van IL-8 omvat neutrofile activiteit, chemotaxis (het ‘lokken’ van neutrofiele granulocyten, ontstekingscellen, naar plaatsen van ontsteking) en degranulatie (Uchi et al. 2000).

1.2.3

TNF-α Tumor Necrose Factor (TNF-α, 17 kDa) is een cytokine die adhesie moleculen op endotheelcellen en keratinocyten teweegbrengt, waardoor lymfocyten en neutrofielen uit het bloed worden aangetrokken (Uchi et al. 2000). De TNF-α productie door keratinocyten wordt gestimuleerd door IL-1α. En TNF-α stimuleert vervolgens weer de productie van IL-1α en IL-8. In de onderstaande tabel staan verschillende studies beschreven waarin cytokinen en chemokinen, o.a. IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-8 en TNF-α, worden gemeten bij patiënten met CVLU (chronic venous leg ulcers). Uit deze tabel blijkt dat de concentratie van cytokinen en chemokinen is verhoogd in chronische wonden, zoals decubitus.

w

11-12-2006 (versie 2)

Literatuur (Tian and Stacey 2003)

Waarin gemeten Kerartinocyten in epidermis (biopt) Zweet klier in dermis (biopt)

(Trengove et al. 2000)

Wondvocht

(Harris et al. 1995)

Wondvocht

Confidentieel

Cytokine Controle versus ulcer: Toename van IL-1α, IL-6 en TNF- α

Controle versus ulcer: Afname van IL-1α, IL-6, TNF- α Helende versus niet helende wond: IL-1α: 3x hoger bij niet helende wond IL-1β: 6x hoger bij niet helende wond TNF- α: 2x hoger bij niet helende wond Helende versus niet helende wond: IL-1α: 18,14 ± 7,61 versus 35,47 ± 36,47 pg/ml IL-1β: 2,48 ± 3,32 versus 5,35 ± 4,65 pg/ml

Meetmethode Immuno histochemical analyse

ELISA

ELISA

Tabel 1 Overzicht van gedrag van verschillende cytokines bij CVLU patiënten met een helende versus een niet helende wond.

1.3

Wetenschappelijke onderbouwing De cytokine concentraties uit tabel 1 zijn bepaald in een biopt of in het wondvocht. Perkins (Perkins et al. 2001) heeft aangetoond dat de cytokine concentratie ook niet invasief gemeten kan worden door middel van het aanbrengen van sebutape op intacte huid.

1.3.1

Sebutape Sebutape (CuDerm Corporation, Texas, USA) wordt oorspronkelijk gebruikt voor het bepalen van de hoeveelheid sebum (olie) op de huid. De Sebutape zorgt, door de unieke combinatie van een hechtende en micro-poreuse laag, dat sebum op een passieve manier wordt verzameld. (http://www.cuderm.com/products_sebutape_rd.php). Figuur 1 Sebutape

Met het onderzoek van Perkins (Perkins et al. 2001) is aangetoond dat niet alleen de sebum hoeveelheid maar ook de cytokine concentratie op de huid bepaald kan worden door middel van Sebutape. Perkins toonde aan dat de cytokine concentratie verschilt over het lichaam. Op het voorhoofd, het onderbeen en onderarm werd de hoogste concentratie IL-1RA en IL1α gemeten (Perkins et al. 2001). Deze lag tussen de 1 en de 10 pg/µg totaal eiwitten. Ook gebruikte Perkins Sebutape voor onderzoek naar de geïrriteerde huid. Bij het blootstellen van huid aan de zon bleek de verhouding IL-1α/IL-1RA 3 tot 6 keer verhoogd te zijn ten opzichte van plekken die niet aan de zon werden blootgesteld (Perkins et al. 2001). En uit onderzoek naar luieruitslag bij baby’s bleek er ook een duidelijke verhoging in de verhouding IL-1α/IL-RA meetbaar te zijn (Perkins et al. 2001).

x

11-12-2006 (versie 2)

1.3.2

Confidentieel

Rendement van meetmethode De meetmethode die gehanteerd wordt op de Technische Universiteit Eindhoven is gebaseerd op die van Perkins et al. en staat bescheven in bijlage Protocol bewerken van Sebutape. Om het rendement van deze methode te bepalen is er een zogenaamd ‘spiking’ experiment uitgevoerd. Hiervoor werd er een bekende hoeveelheid cytokine op Sebutapes aangebracht. Na het indrogen van de aangebrachte oplossing en het verwerken van de Sebutapes (bijlage: Protocol bewerken van Sebutape) diende de concentratie van de eindoplossing 50, 100 of 200 pg/ml te bedragen. Onderzocht is of en hoe de aangebrachte cytokinen concentratie overeenkwam met de werkelijke concentratie. De resultaten van dit onderzoek staan beschreven in figuur 2. De gehanteerde methode lijkt optimaal te functioneren aangezien er nagenoeg een rendement van 100% werd behaald (50 pg/ml: 93±24%, 100 pg/ml: 99±8% en 200 pg/ml:106±17%).

IL-1α (pg/ml) gemeten gemiddelde + st. deviatie

Evaluatie van methode 250 200 150 100 50 0 50 pg/ml

100 pg/ml

200 pg/ml

IL-1α aangebracht

Figuur 2 Spiking experiment. Gemeten cytokine concentratie (x-as) t.o.v. de werkelijke concentratie (y-as).

1.3.3

Basaal niveau van de verschillende cytokinen en chemokinen Om een idee te krijgen van de spreiding in de meetdata is het basale niveau van cytokinen en chemokinen aan de huid bepaald bij gezonde proefpersonen. Vijf gezonde proefpersonen in de leeftijd van 25 tot 32 jaar (2 mannen en 3 vrouwen) zijn in deze pilot studie onderzocht. In deze pilot is niet alleen het basale niveau van IL-1α, maar tevens dat van IL-1RA en IL-8 bepaald. Gedurende 3 dagen is er op 3 verschillende plaatsen op het lichaam (linker arm, hiel en de stuit) een meeting uitgevoerd. De resultaten van IL-1α staan weergegeven in figuur 3. Opvallend is de grote spreiding in de meetdata. Bovendien lijkt de concentratie van IL-1α plaatsafhankelijk te zijn. Op de hielen bleek de gemiddelde concentratie van IL-α aanzienlijk lager te zijn dan op de linker arm en de stuit. Dit afwijkende resultaat is deels te wijten zijn aan het feit dat het huidoppervlak op de hielen niet recht is waardoor de Sebutape niet goed kon worden aangebracht. Er is geen verschil te ontdekken tussen de IL-1α concentratie van de man en vrouw. De basale waarde van IL-1RA en IL-8 konden met de huidige analyse methode (bijlage: Protocol ELISA) echter niet gemeten worden.

y

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Gemiddelde IL-1a concentratie op plaats en dag

IL-1α concentratie (pg/ml) gemiddelde + st.deviatie

50 40 30

Dag 1

20

Dag 2 Dag 3

10 0 -10

Linker arm

Hiel

Stuit

Plaats

Figuur 3 Overzicht van de IL-1α concentratie (gemiddelde± STD) op verschillende plaatsen en dagen.

1.3.4

Power analyse In 2005 heeft Jeroen de Schrijver vanuit de Technische Universiteit Eindhoven een onderzoek gedaan in samenwerking met Philips. In dit onderzoek is met behulp van Sebutape gekeken wat het gedrag is van IL-1α voor en na het scheren. Resultaten van dit onderzoek zijn te zien in figuur 4. Hieruit blijkt dat direct na het scheren de IL-1α concentratie een verhoging heeft van 100%.

Figuur 4 IL-1α gedrag voor en na scheren

Dit gegeven en aan de hand van de resultaten verkregen uit de pilot studie met gezonde mensen is er een power analyse gedaan om de patiënten populatie te bepalen. Uit de

z

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

pilot study is berekend dat de gemiddelde waarde voor IL-1α 20,68 ± 17,46 pg/ml is. Voor de power analyse is gebruik gemaakt van de volgende formule (L.Sachs).

σ δ

n = F ⋅ ( )2 Met:

α = 0,05 π = 80% 2 F = 2 ⋅ (zα/2 − z π ) = 15.7 δ = 20,68 pg/ml (a.d.h.v. de resultaten van Jeroen de Schrijver zal de IL-1α concentratie verdubbelen (1.1.4)) σ = 17,46 pg/ml (standaard deviatie van linker arm en hiel (1.1.3))

Na berekenen geeft dit een n = 11.19 per groep. Voor huidige studie houden we een patiënten groep van 11 patiënten aan

aa

11-12-2006 (versie 2)

2

Confidentieel

Het doel van het onderzoek. Om vast te stellen of cytokinen en chemokinen geschikt zijn als objectieve maat voor de vroegtijdige detectie van decubitus, dient als ‘proof of principle’ onderzocht te worden of de concentratie van deze eiwitten is verhoogd bij beginnende decubitus wonden. Het doel van de huidige pilot studie is dan ook het meten van de cytokinen en chemokinen concentratie bij patiënten met en zonder graad 1 decubitus.

bb

11-12-2006 (versie 2)

3

Uitvoering van het onderzoek

3.1

Patiënten groep

Confidentieel

Aan de hand van de decubitus cijfers van het Catharina ziekenhuis in 2005 en in overleg met Emmy Dijkmans is besloten om op de afdelingen algemene chirurgie, longziekten en orthopedie te meten. Dit omdat op deze afdelingen in 2005 veel patiënten met decubitus waren.

3.1.1

Inclusie criteria Voor het uitvoeren van het onderzoek zal er gekeken worden naar twee patiënten groepen op drie verschillende afdelingen. 1. 2.

Een groep patiënten met een graad 1 doorligwond. Een groep patiënten zonder aanwezige doorligwonden. Dit als controle groep deze patiënten liggen in dezelfde omstandigheden als patiënten uit groep 1.

Een graad 1 doorligwond is te herkennen aan een niet wegdrukbare roodheid op de huid. De kleurverandering van de intacte huid houdt aan wanneer de druk verdwenen is. De huid is rood of donker van kleur het wordt niet bleek wanneer je er op drukt. De huid kan warm aanvoelen, kan hard zijn en licht gezwollen. 3.1.2

Exclusie criteria Patiënten met uitgebreide huidaandoeningen zoals psoriasis of eczeem worden geëxcludeerd van het onderzoek. Dit geldt voor patiënten die orale medicatie gebruiken voor hun aandoening en indien er vlak bij de plek waar te testen sprake is van eczeem of psoriasis. Patiënten met graad 1 decubitus op de hiel, dit omdat met deze methode de hiel niet mogelijk is om te meten.

3.2

Benaderen van het personeel en de patiënten Emmy Dijkmans heeft met de betreffende afdelingshoofden, van de afdeling algemene chirurgie, longziekten en orthopedie, gesproken en deze hebben toestemming gegeven voor het uitvoeren van het onderzoek. Marieke van der Lans zal samen terzijde tijd met Emmy Dijkmans het personeel van de afdeling op de hoogte brengen. De patiënt zal door de Emmy Dijkmans en/of Marieke van der Lans gevraagd worden om mee te helpen aan het onderzoek. Dit zal mondeling gebeuren waarbij de patiënt een brief krijgt waarin alles rustig na te lezen is (bijlage: Brief voor de patiënten). Bij twijfel van de patiënt kan de onafhankelijk art, Simone van der Geer, geraadpleegd worden. Pas wanneer de patiënt heeft toegestemd zowel mondeling als door het ondertekenen van de toestemmingsverklaring (bijlage: Toestemmingsformulier) zal met het onderzoek gestart worden.

cc

11-12-2006 (versie 2)

3.3

Confidentieel

Behandeling van de patiënt Nadat de patiënt heeft aangegeven bereid te zijn om mee te werken aan het onderzoek zullen de volgende stappen ondernomen worden. Al de handelingen zullen door dezelfde persoon, Marieke van der Lans, uitgevoerd worden om de reproduceerbaarheid van de test te bevorderen.
Stap 1: Bij beide patiënten groepen zal eerst de al bestaande decubitus-scorelijst uit het Catharina-ziekenhuis worden afgenomen (bijlage: Decubitus scorelijst Catharina) het personeel is bekend met deze scorelijst. Ook is het een scorelijst ontwikkeld door het CBO en is 1 van de 4 meest gebruikt scorelijsten in Nederland.
Stap 2: Bij patiënten zonder een graad 1 doorligwond zal de Sebutape op 2 verschillende plaatsten op het lichaam aangebracht worden. Eén op de stuit omdat dit een gevoelige plaats is voor het ontstaan van decubitus en goed te meten, de tweede is op de linker onderarm als controle.
Stap 2: Bij patiënten met een graad 1 doorligwond zal de Sebutape op 3 verschillende plaatsen op het lichaam van de patiënt aangebracht worden. De eerste tape wordt op de rode huid aangebracht om de totale hoeveelheid cytokinen en chemokinen concentratie door decubitus te bepalen. De tweede tape wordt 50 mm proximaal van de rode plek vandaan aangebracht om te kijken in hoeverre de decubitus een lokale verhoging veroorzaakt. De derde tape wordt op de onderarm aangebracht als controle.
Stap 3: De handelingen die onder stap 2 genoemd zijn zullen een half uur later nog eens uitgevoerd worden. Gedurende dit half uur wordt de patiënt gevraagd om de plaats waar de Sebutape wordt aangebracht te ontlasten. Na het half uur zal op de zelfde plaatsen als onder stap 2 de Sebutape geplakt worden.

3.4

Aanbrengen van de Sebutape Gebruik twee pincenten en handschoenen om besmetting van huideiwitten te voorkomen. De Sebutape wordt licht aangebracht op de huid. Om de Sebutape bij elke patiënt met een constante druk aan te brengen wordt gebruik gemaakt van een ‘druk-roller’. De ‘druk-roller’ (figuur 5) heeft een scharnier punt met een veertje tussen het uiteinde van het handvat en het uiteinde waar de roller aan vast zit. Wanneer er kracht wordt uitgeoefend op het handvat zal Figuur 5 Druk-roller voor het aanbrengen van de Sebutape de veer er voor zorgen dat de roller iedere keer met dezelfde druk over het huidoppervlak rolt. Na twee minuten zal de tape van de huid verwijderd worden met een pincet en in een potje gedaan worden. De tape zal met de klevende kant naar boven liggen. Daarna zal het potje op droogijs bewaard worden. De tapes kunnen bewaard worden in een vriezer van -800C. In het geval van adverse events zal de Medisch-Ethische toetsingscommissie binnen 24 uur hiervan op de hoogte worden gebracht.

dd

11-12-2006 (versie 2)

3.5

Confidentieel

Bewerken en analyseren van de Sebutape De Sebutape zal eerst bewerkt worden zodat de cytokine loslaten van de tape. Dit gebeurt volgens het Protocol voor bewerken van Sebutape (bijlage: Protocol bewerken van Sebutape). Nadat de Sebutape bewerkt is kan begonnen worden met het analyseren van de cytokine concentratie met behulp van ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) (bijlage: Protocol ELISA). De analyse zal plaats vinden in het laboratorium van de Technische Universiteit Eindhoven.

ee

11-12-2006 (versie 2)

4

Confidentieel

Rapportage

De patiënten zullen door de hoofdonderzoeker (Marieke van der Lans) worden gecodeerd zodat ze anoniem verwerkt worden. Er zullen 3 afdelingen mee doen aan het onderzoek (algemene chirurgie (AG), longziekte (L) en orthopedie (O)) en op iedere afdelingen zullen twee groepen onderzocht worden (patiënten zonder decubitus (Z) en met graad 1 decubitus (D)). Per afdeling zullen de patiënt op volgorde van behandeling een nummer krijgen (1 tot 11) en de twee eerste initialen van hun naam. Allereerst worden de groepen bepaald door middel van een klinische blik. De patiënt worden zo ingedeeld in de controle groep zonder aantoonbare graad 1 decubitus of bij de patiënten groep (D) met aantoonbare graad 1 decubitus. Daarna worden de tapes geanalyseerd en zal de cytokine concentratie bepaalt worden. De concentraties IL-1RA, IL-1α, IL-8 en TNF-α zijn in pg/ml. De concentraties worden binnen een persoon vergeleken en zullen tussen groepen (patiënten zonder en patiënten met decubitus) vergeleken worden. Tevens wordt gekeken naar het verloop van de cytokine concentraties in de tijd. Analyse van het cytokinen en chemokine gedrag van een persoon en tussen de groepen en in de tijd zal bekeken worden met een ANOVA test. Ten slotte zal ter illustratie de score van de risicoscorelijst bekeken worden in hoeverre deze overeenkomt met de bevindingen van de klinische blik en de gemeten cytokine concentraties. De resultaten zullen een jaar na aanvang van het onderzoek in een wetenschappelijke rapportage aan de METC gepresenteerd worden.

ff

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Referenties

Bours,G.J.J.W., Halfens,R.J.G., Berger,M.P.F., Huijer Abu-Saad,H., & Grol,R.T.P.M. (2003) Development of a model for case-mix adjustment of pressure ulcer prevalence rates. Med.Care, 41, 45-55. Bronneberg,D., Bouten,C.V.C., Oomens,C.W.J., van Kemenade,P.M., & Baaijens,F.P.T. (2006) An in vitro Model System to Study the Damaging Effects of Prolonged Mechanical Loading of the Epidermis. Annals Of Biomedical Engineering, 34, 506-514. Bruce,A.,Mast, MD;Gregory S.,Schultz,PhD (1996) Interactions of cytokines, growth factors, and proteases in acute chronic wounds. Wound.Repair Regen., 4, 411-20. Harris,I.R., Yee,K.C., Walters,C.E., Cunliffe,W.J., Kearney,J.N., Wood,E.J., & Ingham,E. (1995) Cytokine and protease levels in healing and non-healing chronic venous leg ulcers. Exp.Dermatol., 4, 342-349. Lee,R.T., Briggs,W.H., Cheng,G.C., Rossiter,H.B., Libby,P., & Kupper,T. (1997) Mechanical deformation promotes secretion of IL-1 alpha and IL-1 receptor antagonist. J.Immunol., 159, 5084-5088. Perkins,M.A., Osterhues,M.A., Farage,M.A., & Robinson,M.K. (2001) A noninvasive method to assess skin irritation and compromised skin conditions using simple tape adsorption of molecular markers of inflammation. Skin Res.Technol, 7, 227-237. Schoonhoven,L., Grobbee,D.E., Bousema,M.T., Buskens,E., & prePURSE study group. (2005) Predicting pressure ulcers: cases missed using a new clinical prediction rule. J.Adv.Nurs., 49, 16-22. Schoonhoven,L., Haalboom,J.R.E., Bousema,M.T., Algra,A., Grobbee,D.E., Grypdonck,M.H., Buskens,E., & prePURSE study group.The prevention and pressure ulcer risk score (2002) Prospective cohort study of routine use of risk assessment scales for prediction of pressure ulcers. BMJ, 325, 797. Spiekstra,S.W., Toebak,M.J., Sampat-Sardjoepersad,S., van Beek,P.J., Boorsma,D.M., Stoof,T.J., von Blomberg,B.M.E., Scheper,R.J., Bruynzeel,D.P., Rustemeyer,T., & Gibbs,S. (2005) Induction of cytokine (interleukin-1alpha and tumor necrosis factor-alpha) and chemokine (CCL20, CCL27, and CXCL8) alarm signals after allergen and irritant exposure. Exp.Dermatol., 14, 109-116. Tian,Y.W. & Stacey,M.C. (2003) Cytokines and growth factors in keratinocytes and sweat glands in chronic venous leg ulcers. An immunohistochemical study. Wound.Repair Regen., 11, 316-325. Trengove,N.J., Bielefeldt-Ohmann,H., & Stacey,M.C. (2000) Mitogenic activity and cytokine levels in non-healing and healing chronic leg ulcers. Wound.Repair Regen., 8, 1325. Uchi,H., Terao,H., Koga,T., & Furue,M. (2000) Cytokines and chemokines in the epidermis. J.Dermatol.Sci., 24, S29-S38

gg

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Brief voor de patiënten Titel: Een objectieve maat voor het niet invasief aantonen van graad 1 decubitus

datum (maand, jaar) Geachte heer/mevrouw,

U bent gevraagd om mee te doen aan een klinisch medisch-wetenschappelijk onderzoek. In deze brief kunt u de informatie over dit onderzoek nog eens rustig nalezen, zodat u een weloverwogen beslissing kunt nemen. Waarom dit onderzoek? Om decubitus (doorligwonden) te voorkomen is het belangrijk om vroegtijdig in te schatten welke patiënten gevoelig zijn voor doorligwonden en welke niet. Op dit moment wordt deze indeling bepaald door een risicoscorelijst. Na onderzoek naar deze lijst is gebleken dat de voorspellende waarde in 30% van de gevallen niet betrouwbaar is. En patiënten verkeerd worden geclassificeerd. Vanuit de Technische Universiteit Eindhoven is een nieuwe techniek ontwikkeld waarmee risico patiënten mogelijk beter opgespoord kunnen worden. Deze techniek is gebaseerd op het aanbrengen van Sebutape op de huid. De Sebutape is gemaakt voor het opnemen verschillende stoffen op de huid. Voor dit onderzoek zijn we benieuwd naar de concentratie cytokine (eiwitten die vrijkomen bij ontstekingen) die op de huid aanwezig is. De werking van deze techniek moet nog nader onderzocht worden vandaar dit onderzoek. Mogelijk leidt dit tot een verbetering om gevoelige patiënten vroegtijdig te scheiden van minder gevoelige patiënten. De onderzoekers willen nagaan of de methode een indicatie kan geven of de patiënten wel of niet gevoelig is voor doorligwonden. Opzet van het onderzoek Er zullen ongeveer 66 patiënten aan het onderzoek deelnemen. Het onderzoek neemt eenmalig een half uur in beslag. De deelnemers zijn te verdelen in twee groepen. De ene groep patiënten met graad 1 doorligwonden. Dit zijn plekken op de huid die roodkleuren maar niet wegdrukbaar zijn. De andere groep bestaat uit patiënten zonder aantoonbare doorligwonden. Op deze manier kan het verschil van de cytokine niveaus van een patiënt zonder en met doorligwonden bepaald worden. Wat houdt dit onderzoek in? Bij beide patiënten groepen zal de al bestaande decubitus scorelijst uit het Catharinaziekenhuis worden afgenomen. Daarna zal bij patiënten zonder een graad 1 doorligwond Sebutape aangebracht worden op 2 verschillende plaatsten op het lichaam. De Sebutape zal na 2 minuten er weer afgehaald worden. Op de volgende plaatsten zal de tape aangebracht worden. 1. Op de stuit 2. Op de onderarm

hh

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Bij patiënten met een graad 1 doorligwond zal de Sebutape op 3 verschillende plaatsen op het lichaam van de patiënt aangebracht worden. De tape zal ook nu na 2 minuten er weer afgehaald worden. 1. Op de rode huid 2. 50 mm proximaal van de rode plek vandaan 3. Op de onderarm. Na het plakken van de Sebutape zal gevraagd worden gedurende een half uur de te plakken plaatsen te ontlasten. Na een half uur zal de Sebutape nogmaals 2 minuten op elke plek worden geplakt. Belasting en risico's Het aanbrengen van de Sebutape zal niet belastend voor u zijn. Het verwijderen van de tape is pijnloos. Eventuele voordelen Uw deelname kan in de toekomst voordeel opleveren voor andere patiënten. Meer kennis over het gedrag van de cytokine concentratie op de huid kan leiden tot verbeteringen in de behandeling van decubitus. Wanneer u afziet van deelname Wanneer u besluit niet aan het onderzoek mee te doen, zal dit geen consequenties hebben voor de behandeling waarvoor u daadwerkelijk opgenomen bent in het Chatarina ziekenhuis. Verzekering Het is niet nodig om voor dit onderzoek een extra WMO-verzekering af te sluiten. Hiervoor is door de Medisch-Etische Toetsingscommissie ontheffing verleend. Inzage gegevens, privacy Naast de onderzoeker zelf zijn ook nog enkele anderen bij het onderzoek betrokken, zoals begeleiders en toezichthouders. Voor het onderzoek is inzage in uw medisch dossier niet nodig. Resultaten van het onderzoek zullen anoniem verwerkt worden; uw naam zal er niet bij vermeld worden. Eventuele vergoedingen U kunt als deelnemer niet aanmerking komen voor een vergoeding Overige rechten U hebt voorafgaand aan en tijdens het onderzoek recht op tijdige en volledige informatie zodat u goed kunt beslissen of u aan het onderzoek wilt deelnemen. U beslist zelf over deelname aan het onderzoek. Wanneer u mee wilt werken dan vragen wij u een toestemmingsformulier te tekenen. Als u beslist om niet mee te doen, heeft dat geen enkel gevolg voor uw verdere behandeling. Wanneer u wel meedoet, kunt u op ieder moment stoppen, zonder opgaaf van redenen. De onderzoeker kan het onderzoek beëindigen wanneer daar medische redenen voor zijn. Vragen, klachten

ii

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Heeft u vragen, aarzel dan niet om deze aan Emmy Dijkmans te stellen: Functie: Verpleegkundig wond en decubitus consulent Telefoonnummer:040-2397158 Seinnummer:117774 (eerst proberen) . Het onderzoek zal onder toezicht van Gertruud Krekels uitgevoerd worden: Functie: Dermatoloog, Telefoonnummer:040-2397270 Seinnummer: 117276 Mocht u klachten hebben over de gang van zaken, maak deze dan ook kenbaar aan uw arts. Als (mogelijke) deelnemer aan dit onderzoek kunt u voor inlichtingen en advies ook terecht bij een onafhankelijke arts. Voor dit onderzoek is dit: Naam: Simone van der Geer-Rutten Functie: Arts-assistent in opleiding tot dermatoloog Tel.nr.: poli: 040-2397270 Sein:117278 Voor uitgebreidere informatie verwijzen wij u naar genoemde brochure: Gevraagd voor medisch-wetenschappelijk onderzoek. Wij hopen dat wij u met deze informatie van dienst zijn geweest. U kunt met uw vragen terecht bij de onderzoekers: Marieke van der Lans (06-48382889)

jj

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Toestemmingsformulier (informed consent) Ik verklaar hierbij op voor mij duidelijke wijze, mondeling en schriftelijk, te zijn ingelicht over de aard, doel, risico's en belasting van het onderzoek. Mijn vragen zijn naar tevredenheid beantwoord. De schriftelijke informatie met verzekeringsbijlage, behorend bij deze verklaring, is mij overhandigd. Ik stem geheel vrijwillig in met deelname aan dit onderzoek. Ik behoud daarbij het recht deze instemming weer in te trekken zonder dat ik daarvoor een reden behoef op te geven. naam: ...........................................................................

......................... (datum) ........................................................................... (handtekening)

Ik heb mondelinge en schriftelijke toelichting verstrekt op het onderzoek. Ik verklaar mij bereid nog opkomende vragen over het onderzoek naar vermogen te beantwoorden. Een eventuele voortijdige beëindiging van deelname aan dit onderzoek zal niet van invloed zijn op de behandeling. naam onderzoeker: ...........................................................................

..........................(datum) ........................................................................... (handtekening onderzoeker)

kk

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Decubitus scorelijst Catharina

ll

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Bewijs dekking aansprakelijkheid van de onderzoeker

mm

11-12-2006 (versie 2)

Confidentieel

Lijst van deelnemende centra met hoofdonderzoeker Technische Universiteit Eindhoven: Hoofdonderzoeker, indiener en verrichter van het onderzoek: Marieke van der Lans, Afdeling Biomedische Technologie P.O.box 513, 5600 MB Eindhoven [email protected] Hoofdonderzoeker, projectleider: C.W.J. Oomens Afdeling Biomedische Technologie P.O.box 513, 5600 MB Eindhoven [email protected] Catharina Ziekenhuis Eindhoven: Hoofdonderzoeker Dr. G. Krekels Afdeling Dermatologie Michelangelolaan 2 5602 ZA Eindhoven [email protected] Onafhankelijk arts Dr. S. van der Geer-Rutten Afdeling Dermatologie Michelangelolaan 2 5602 ZA Eindhoven [email protected]

nn