BÍLKOVINY
` Kvantitativní Kvantitativní stanovení stanovení bílkovin lkovin
- hrubá bílkovina - čistá bílkovina - travitelná bílkovina ` Stanovení Stanovení aminokyselinové aminokyselinového slož složení ení bílkovin lkovin - esenciální aminokyseliny - reaktivní kyseliny - limitující aminokyseliny
STANOVENÍ HRUBÝCH BÍLKOVIN 1. NEPŘÍMÉ METODY založené na stanovení anorganického dusíku v mineralizátu a následném výpočtu celkového obsahu organického dusíku obecně průměrný obsah dusíku v proteinech: 16 % 100 f = = 6,25 16
1
* Stanoví se další dusíkaté (nebílkovinné) látky: amoniak, aminokyseliny, peptidy, močovina Æ riziko nadhodnocení nadhodnocení výsledků sledků * Přepočet na dominující protein závisí na jeho aminokyselinovém složení Přepočítávací faktory: Mléko + mléčné výrobky: 6,30 Mouka: 5,83 Sojové boby: 5,71 Vejce, maso: 6,25
A. KJELDAHLOVA METODA 1. Rozklad (dehydratace, mineralizace) organické organické hmoty n
C
NH2 + m H2SO4
t katalyzátor
CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
protein
katalyzátory: Se + K2SO4 K2SO4 + CuSO4 TiO2 + CuSO4 ZnO2 + CuSO4 další látky: sírany alkalických kovů, H2O2
2. Stanovení amoniaku uvolněného z hydrolyzátu
(i) uvolnění amoniaku z (NH4)2SO4 v mineralizátu: mineralizátu: Î ALKALIZACE (NH4+ Æ NH3 ) (ii) ii) izolace volného amoniaku ze zalkalizovaného mineralizátu: mineralizátu: Î DESTILACE
Destilační přístroj podle Parnas-Wagnera
2
(iii) iii) Stanovení amoniaku v destilátu Î TITRACE makro- a semimikrometody, automatizace
Alkalimetrická titrace - jímání do H2SO4 (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O 2 NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Indikátory: - methylčerveň - Tashirův indikátor (methylčerveň methylenová modř)
Acidimetrická Acidimetrická titrace (Winklerova metoda) - jímání do kyseliny borité
6 NH3 + 2 H3BO3 → 2 (NH4)3BO3 2 (NH4)3BO3 + H2SO4 → 3 (NH4)2SO4 + H3BO3
Indikátor: methylčerveň Možnosti eliminace nebílkovínných interferencí: preciptace proteinů trichloroctovou kyselinou (tekute vz.) v dialýza gelová filtrace
ZHODNOCENÍ KJELDAHLOVY METODY & • • • • •
vhodná pro všechny typy potravin přímá metoda – není není třeba př příprava vzorku robustní, spolehlivá vhodná i pro nerozpustné proteiny mezinárodně akceptovaná metoda
' • toxické, korozivní páry • toxické či drahé katalyzátory
3
Difuzní Conwayova metoda Conwayova nádobka
• Jodometrická titrace 2 H2SO4 + 5 KI + KIO3 → 3 I2 + K2SO4 + 3 H2O 3 I2 + 6 Na2S2O3 → 3 Na2S4O6 + 6 NaI
Indikátor: škrobový maz
B. METODY NEVYUŽ NEVYUŽÍVAJÍ VAJÍCÍ KE STANOVENÍ STANOVENÍ AMONIAKU V MINERALIZÁ MINERALIZÁTU DESTILACE
Titrační stanovení amonných solí podle Hanuše
2 (NH4)2SO4 + 6 CH2=O → C6H12N4 + 2 H2SO4 + 6 H2O hexamethylentetramin H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O Indikátor: fenolftalein
Spektrofotometrické stanovení - Nesslerova metoda NH3 + NaOH + 2 K2HgI4 → HgI3NH2 + 4 KI + NaI + H2O
- Berthelotova metoda OH + NH 3 + 2 NaClO
O
N indofenol
OH + 2 NaCl + 2 H 2O
Elektrochemické stanovení Iontově selektivní metody
4
2. PŘÍMÉ METODY (bez mineralizace) DUMASOVA METODA Princip: Pyrolýza (1000°C, katalyzátor CuO) v atmosféře bohaté na O2, redukce oxidů dusíku na N2 Æ stanovení dusíku (po selektivní absorbci ostatních produktů pyrolýzy) s využitím tepelně vodivostního detektoru
ZHODNOCENÍ DUMASOVY METODY & • nevyžaduje agresivní chemikálie, prostá škodlivých emisí • přímá metoda – není není třeba př příprava vzorku • Rychlá (minuty) • možnost plné automatizace
' •
riziko nadhodnocení výsledků (dusík může pocházet také z jiných zdrojů) • nákladné přístroje Potenciál nahradit Kjeldahlovu metodu
Titrační metody ª Přímá alkalimetrická titrace (stanovení dusíku amidů aminokyselin) R-CONH2 + NaOH → R-COONa + NH3 - nespecifická, využitelná jen pro čisté preparáty ª Formolová titrace (stanovení dusíku 2 - aminokyselin) - jen pro koncové aminokyseliny
5
Spektrofotometrické metody ª Přímá spektrofotometrie v ultrafialové ultrafialové oblasti absorbční maxima : 180 - 220 nm ( peptidové vazby) 280 nm (aromatické a heterocyklické aminokyseliny zvl. tyrosin a tryptofan)
ZHODNOCENÍ PŘÍMÉ SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY
& • jednoduchá a rychlá • nedestruktivní, nevyžaduje činidla
' • malá citlivost (0.05 – 5 mg) • nespecifická, interferují UV absorbující látky zvl. složky nukleových kyselin • velká závislost na aminokyselinovém složení
ª Biuretová metoda koordinační vazba mědi (II) na peptidové vazby v alkalickém prostředí: O
O 2
NH2
C
NH2
C
C NH NH + Cu 2+
Cu
NH C O
NH2
NH2 C
NH + 2 H +
NH C O
Spektrofotometrická detekce komplexu (540 nm)
6
ZHODNOCENÍ BIURETOVÉ METODY
& • jednoduchost, vysoká vysoká prů průsaznost • aminokyseliny neruší neruší stanovení stanovení
' • malá malá citlivost (0.05 - 5 mg) • interferuje amoniak a ně některé které detergenty
ªLowryho metoda redukce Folin - Ciocalteuova činidla (směs fosfomolybdenové a fosfowolframové kyseliny) bílkovinami na komplexy molybdenové modři (abs. max. 745 - 750 nm) oxidace tyrosinu, tryptofanu a v menší míře cystinu, cysteinu a histidinu vázaných v peptidovém řetězci
ZHODNOCENÍ LOWRYHO METODY
& • velmi citlivá citlivá (50 – 100x cilivě cilivější než než biuretová biuretová metoda)
' • rozdí rozdíly v barvě barvě komplexu v zá závislosti na typu proteinu • interferuje řada slouč sloučenin např např. redukují redukující cukry • Vyž Vyžaduje izolaci proteinů proteinů vhodná vhodná jako mikrometoda, mikrometoda, je vš však má málo robustní robustní (použ (použití ití hlavně hlavně v biochemii)
7
ª Reakce s organickými barvivy měří se snížení absorbance roztoku barviva po precipitaci jeho komplexu s bílkovinami
sulfonovaná barviva: Oranž G a GG, aminočerň 10 B aj. - iontové i hydrofobní interakce s proteinem
ZHODNOCENÍ METODY ZALOŽENÉ NA ADSORBCI BARVIV
& • • • • •
vysoká vysoká citlivost rychlost snadná snadná automatizace meziná mezinárodně rodně akceptovaná akceptovaná metoda vhodná vhodná při vý vývoji alternativní alternativních metod
' • adsorpce komplexu na sklo • závislost rozsahu interakce na aminokyselinové aminokyselinovém slož složení ení • nestandardnost šarž arží barviva
ª Infračervená spektrometrie měření absorbance tekutých vzorků v infračervené oblasti (např. 1548 cm-1 - absorbce peptidové vazby) nebo reflektance tuhých vzorků v blízké infračervené oblasti spektra ¾ nedestruktivní metoda, není nutná úprava vzorku, rychlá
8
3. IMUNOCHEMICKÉ METODY ELISA (enzyme(enzyme-linked immunosorbent assay) assay) ª stanovení alergenních proteinů soji, arašídů, gliadinu atd. ª stanovení vaječné a mléčné bílkoviny Seznam alergenních složek potravin (Vyhláška č.113/2005 Sb.)
Princip stanovení ª Vazba mezi antigenem (protein) a protilátkou (antibody) ª Spektrofotometrická příp. vizuální detekce (po přídavku činidel)
analyt
analyt
ANTIBODY
ZHODNOCENÍ IMUNOCHEMICKÉ METODY
& • rychlé stanovení • vysoce specifické • kvalitativní i kvantitativní analýza • komerčně dostupné kity
' • křížová reaktivita Æ falešně pozitivní výsledky
9
4. DALŠÍ FYZIKÁLNÍ METODY ¾ ¾ ¾ ¾
Refraktometrické metody Turbidimetrické metody Metody elektronové spektroskopie Polarografické metody
STANOVENÍ ČISTÝCH BÍLKOVIN oddělení: • srážením
ªtrichloroctovou kyselinou (např. stanovení bílkovin v mléce – ČSN EN ISO 8968-5)
ª taninem • dialýzou • gelovou filtrací
STANOVENÍ TRAVITELNÝCH BÍLKOVIN hydrolýza: • pepsinem (pH 1, 38 °C), • trypsinem (pH 8, 38 °C)
10
STANOVENÍ FRAKCÍ BÍLKOVIN A. Elektroforéza ` kapilární (CE) ` za podmínek denaturace (SDS-PAGE/acid urea PAGE) ` za nativních podmínek (PAGE) ` isoelektrická fokusace (IEF)
SDS-PAGE - sodium dodecyl (lauryl) sulfatePolyacrylamide gel electrophoresis
B. Chromatografická frakcionace ` gelová filtrace
velikost a tvar molekuly ` ionexová
velikost náboje v daném elektrolytu ` reverzní fáze
hydrofóbní interakce
B. Membránové procesy
• Ultrafiltrace • Nanofiltrace • Reverzní osmóza separace na základě velikosti molekul (semipermeabilní membrány)
11
Využití membránových procesů • Ultrafiltrace, nanofiltrace zkoncentrování roztoků proteinů (např. zkoncentrování mléka před výrobou sýrů) • Reverzní osmóza odstranění vody, solí nebo jednoduchých cukrů z roztoků proteinů
12
