BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója A kapszaicinre érzékeny, Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1-et (TRPV1) expresszáló érzőidegvégződések hármas funkcióval rendelkeznek: afferens, valamint lokális és szisztémás efferens funkciójuk is van. A klasszikus afferens működés során a kapszaicinnel vagy egyéb stimulánssal izgatott szenzoros idegvégződések a központi idegrendszer felé közvetítenek idegaktivitást, ennek következtében alakul ki a fájdalomérzet, a nocicepció. Emellett az aktivált perifériás idegvégződésből neurotranszmitterek szabadulnak fel, amelyek vazodilatációt okoznak. Ilyen mediátor a kalcitonin génrokon peptid (CGRP), mely értágulatot vált ki, illetve a tachikininek, például a P-anyag (substance P, SP) vagy a neurokinin A (NKA), melyek plazmafehérje-kiáramlást idéznek elő és aktiválják a gyulladásos sejteket. Ez adja a lokális efferens funkciót [61,116], aminek következtében kialakul a neurogén gyulladás [39,115]. A neurogén gyulladásnak jelentős szerepet tulajdonítanak számos betegség patomechanizmusában, például a reumatoid artritisz, asztma bronchiale, pszoriázis, ekcéma, kontakt dermatitisz, gyulladásos bélbetegségek és gyulladásos szembetegségek esetén [60,114]. Jelenleg nincs forgalomban egyetlen olyan gyógyszercsoport készítménye sem, ami hatékonyan tudná gátolni egy gyulladással járó betegség neurogén komponensét [39]. Az intézet kutatócsoportjának munkája során derült fény arra, hogy ugyanezen aktivált szenzoros idegvégződésekből az előzőekben felsorolt gyulladáskeltő neuropeptideken kívül szomatosztatin is felszabadul, amely a keringésbe jutva szisztémás gyulladásgátló és fájdalomcsillapító hatásokkal rendelkezik. Ez az érző idegvégződések harmadik, szisztémás efferens funkciója [38,41,111,112], amit az endokrin és parakrin hatás mintájára Szolcsányi professzor szenzokrin hatásnak nevezett el [110]. Szenzoros neuropeptidek 1. Fájdalom- és gyulladáskeltő hatású neuropeptidek A kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronokból stimulálás hatására felszabaduló neuropeptidek egyik csoportja a tachikininek. Ide sorolható a neurokinin A, a neurokinin B (NKB), és a P-anyag. Élettani hatásukat G-proteinhez kapcsolt neurokinin receptorokon fejtik ki, amiket NK1, NK2 és NK3 receptor névvel illetünk. A P-anyag érpermeabilitást fokozó hatását az NK1 receptoron keresztül fejti ki, ami főként a posztkapilláris venulák falán, makrofágok és limfociták membránján, polimorfonukleáris sejteken, hízósejteken található meg [11,80,89]. Ezekből adódóan plazmaprotein-kiáramlást vált ki és hatással van a limfociták proliferációjára, a hízósejtek aktivációjára, a T-sejt kemotaxisára, a neutrofil granulociták akkumulációjára is [29]. Az NKA főként simaizom-kontrakciót vált ki, erőteljes plazmafehérje-kiáramlást idéz elő, valamint gyulladásos sejteket – neutrofil granulocitákat, limfocitákat, makrofágokat - stimulál az NK2 receptoron keresztül [17] főként a periférián, de a központi idegrendszerben is. Az NKB-t megkötő NK3 receptor pedig főként a központi idegrendszerben, valamint perifériás idegvégződéseken fordul elő [27,63]. A 37 aminosavból álló kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) felfedezése Amara és munkatársai nevéhez fűződik [2]. Egymástól kevéssé eltérő két formája az αCGRP és a βCGRP, melyek biológiai hatásaikat Gs-fehérjéhez kapcsoltan működő CGRP1 és CGRP2 receptorokon fejtik ki [66,73,124]. A CGRP egy családba sorolható a kalcitoninnal, az amilinnal és az adrenomedullinnal [85]. Erős vazodilatátor hatással rendelkezik, ami főképp a CGRP1 receptoron keresztül valósul meg. A CGRP fokozza ugyanis az adenilát-cikláz aktivitást, aminek következtében intracellulárisan megnő a cAMP mennyisége, ami aktiválja a protein kináz A-t, aminek hatására megnyílnak az ATP-függő K+-csatornák. A folyamat eredménye az érsimaizom relaxációja [23,32,46]. Neurogén gyulladásban az érpermeabilitás fokozását azonban nem közvetlenül, hanem a P-anyag működésének befolyásolásával fejti ki [10]. Emellett komplex immunmodulátor funkciója van, csökkenti a proinflammatorikus citokinek termelődését, fokozza az antinociceptív interleukin-10 (IL-10) felszabadulását makrofágból, stimulálja a granulocita akkumulációt [4].
1
2. Fájdalom- és gyulladásgátló hatású neuropeptidek A szomatosztatin, vagy más néven szomatotropin (growth hormone, GH) felszabadulását gátló faktor (somatotropine release inhibitory factor, SRIF), 14 illetve 28 aminosavból álló ciklikus peptid formában fordul elő a szervezetben [9]. Megtalálható a központi és a perifériás idegrendszerben [79,90], a gasztrointesztinális traktusban, a hasnyálmirigyben, a vesében, a mellékvesében, a pajzsmirigyben, gyulladásos sejtekben, ivarszervekben [42,91,122]. A szomatosztatin gátló hatást gyakorol számos endokrin hormon szekréciójára, a gasztrointesztinális motilitásra, az emésztőnedv termelésére, tumorsejtek proliferációjára. Szerepet játszik továbbá kognitív funkciókban, jelentőségét számos pszichiátriai és neurológiai kórképben igazolták [128]. Élettani hatásait saját receptoraihoz kötve fejti ki. Eddig öt Gi-proteinhez kapcsolt szomatosztatin receptor altípust klónoztak egérben, patkányban, illetve emberben, amiket rendre sst1, sst2, sst3, sst4 és sst5 névvel illettek [81]. Ezt az öt sst receptor altípust két csoportra lehet osztani: a SRIF1 csoporthoz tartoznak az sst2, sst3 és sst5 receptorok, míg a SRIF2 csoportba soroljuk az sst1 és sst4 receptorokat [45,82]. Az irodalom szerint az endokrin hatást a SRIF1 csoportba tartozó receptor altípusok közvetítik [87]. Elsősorban munkacsoportunk eredményei azt mutatják, hogy a fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő hatás a másik csoporthoz, vagyis az sst1 és sst4 receptorokhoz köthető [40,82,83,110]. A hipofízis adenilát cikláz-aktiváló polipeptidet, a PACAP-ot (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide) eredetileg birka hipotalamuszból izolálták [68]. A szekretin-glukagon-vazoaktív intesztinális peptid (VIP) család tagja [95,97,136]. Két formája létezik: a szervezetben 90%-ban előforduló 38 aminosavból álló PACAP-38, és a 27 aminosavból álló PACAP-27. Patkányban a legnagyobb koncentrációban a hipotalamuszban és a herében fordul elő [3], megtalálható ugyanakkor a központi idegrendszer többi területén és a perifériás idegrendszerben is, a hátsó gyöki ganglionok egyes szenzoros neuronjain [21,70,78]. Expresszálódik továbbá endokrin mirigyekben [67,129], az ivarszervekben [99,100], a gasztrointesztinális traktusban [33], a légzőrendszerben [69], a bőrön [75]. A PACAP rendkívül sokrétű feladatot lát el a szervezetben, szabályozza a neurotranszmitterek felszabadulását [64], értágulatot, illetve bronchodilatációt okoz, fokozza a bélmotilitást, növeli egyes hormonok koncentrációját a vérben [31], szabályozza a sejtproliferázist, az apoptózist gátolja [126]. Fiziológiai hatásait speciális receptorokhoz kötődve fejti ki. Két kötőhely típust mutattak ki PACAP- és VIP-kötő képességük alapján. Az I-es típusú kötőhelyhez a PACAP mindkét formája nagy affinitással kötődik, a VIP viszont csak alig [28,55,106]. A II-es típusú kötőhelyhez a PACAP és a vazoaktív intesztinális peptid is hasonló affinitással kötődik, ezen belül viszont két altípust is elkülönítenek, a szekretinhez való affinitás szerint [121,127]. A receptorokat később a kötőhelyek szerkezete alapján klónozták és rendre PAC1, VPAC1 és VPAC2 receptornak nevezték el [34]. Nocicepció, hiperalgézia, allodinia, fájdalom A Nemzetközi Fájdalom Társaság meghatározása szerint a nociceptív fájdalom olyan pszichofiziológiai jelenség, szubjektív érzéskvalitás, amelynek két jól definiálható komponense különíthető el. Neurobiológiai eleme a nocicepció (a fájdalmas stimulus percepciója, szenzoros tapasztalat), ami állatkísérletesen is vizsgálható, míg az affektív komponens (a fájdalom emocionális megélése) megítélésérére csak az ember képes. A különféle állatkísérletes modellekben vizsgálható nocicepció mechanikai (érintési), termális (hővel kiváltott) vagy kémiai (kapszaicin, formalin, ecetsav, stb.) ingerek hatására keletkezik. Az interoceptív területekről (zsigerekből, savós hártyákból) eredő viszcerális fájdalom vizsgálatára alkalmas egérben az ecetsavval, magnézium-szulfáttal vagy fenilkinonnal kiváltott vonaglási teszt. Az exteroceptív régiókból származó szomatikus fájdalom például egérben és patkányban is a formalin teszttel vizsgálható. Az alapvetően nem fájdalmas stimulus hatására kialakuló érzékenység-fokozódást allodiniának, míg az enyhe fájdalmat kiváltó inger hatására fokozódó fájdalomérzetet hiperalgéziának nevezzük. Mechanikai vagy termális allodinia és hiperalgézia is
2
jelentkezhet gyulladás vagy különféle eredetű (traumás, toxikus) centrális/perifériás idegi sérülés következtében, amely a spino-talamo-kortikális pályarendszer bármely szintjén kialakulhat [119]. A perifériás idegsérülésből, illetve működéscsökkenésből adódó traumás neuropátiás fájdalom kísérletesen a nervus ischiadicus részleges szoros lekötésével [96], az egész ideg laza lekötésével [5] vagy az L5 gerincvelői ideg lekötésével [50] modellezhető. Új fájdalomcsillapító-gyulladáscsökkentő gyógyszerek kifejlesztésének szükségessége Új fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztésének preklinikai fázisában a vegyületek hatásának, hatásosságának meghatározása nem könnyű feladat, mivel kizárólag a nocicepció vizsgálata lehetséges a nemzetközi irodalomban elfogadott állatmodellekben és vizsgálati módszerekkel. A neuropátiás fájdalom egyetlen forgalomban lévő gyógyszercsoporttal (antiepileptikumok, opiátok, antidepresszánsok, lidokain) sem kezelhető kielégítő módon. Jellemző, hogy összehasonlítási értéknek azt a számot használják (number needed to treat: NNT), mely megadja, hogy hány beteget kell kezelni ahhoz, hogy az elsőben 50%-os fájdalomcsillapítás jöjjön létre [119]. A több száz éve ismert és széles körben használatos klasszikus nem-szteroid gyulladáscsökkentők, fájdalomcsillapítók, amelyek mind a ciklooxigenáz enzimet gátolják, így a prosztaglandin szintézist csökkentik, a neuropátiás fájdalmat és a gyulladás neurogén komponensét nem csökkentik. Az opioid származékok, amelyek áttörést jelentettek a tumoros fájdalom csillapításában, ugyancsak másodlagos terápiás szerek neuropátiás állapotokban. A szteroidok nagy dózisban gátolják ugyan a neurogén gyulladást, de sokféle, súlyos mellékhatásuk (gasztrointesztinális vérzések, fekély, cukorbetegség, elhízás, stb.) miatt hosszabb távon nem lehet őket alkalmazni. Nagy szükség van ezért alapvetően új hatásmechanizmusú, elsősorban közvetlenül az érzőideg-végződések szintjén ható fájdalomcsillapítók, gyulladáscsökkentők kifejlesztésére. Ennek érdekében számos nocicepció modellt állítottunk be munkacsoportunkban, és vizsgálati módszerek széles skáláját sajátítottam el PhD-munkám során.
CÉLKITŰZÉSEK PhD-munkám során a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződésekből felszabaduló peptid mediátorok neurohumorális „szenzokrin” gyulladásgátló és antinociceptív hatásainak mechanizmusát és receptoriális hátterét, illetve fizikai úton történő aktiválhatóságát vizsgáltam állatkísérletes modellekben, három konkrét kérdésfelvetés kapcsán. I. Célunk volt a szomatosztatin 4 receptor (sst4) szerepének vizsgálata különböző in vivo gyulladás- és fájdalommodellekben. Az sst4 receptorra szelektíven ható agonistával, a J-2156 kódjelű nem-peptid szerkezetű vegyülettel végeztünk kísérleteket akut és krónikus kísérleti elrendezésekben, patkányban és egérben. Ezen vizsgálatok kapcsán feladatom volt olyan in vitro sejttenyésztési módszer kidolgozása az irodalmi adatok alapján, amely alkalmas izolált peritoneális makrofágok citokin termelésére ható vegyületek rutinvizsgálatára. II. A PACAP-38 kimutatható a kapszaicinre érzékeny szenzoros neuronokban, és előzetes vizsgálatainkkal igazoltuk, hogy a perifériás végződésekből stimuláció hatására felszabadul. A nocicepcióban betöltött szerepére vonatkozóan a rendelkezésre álló ellentmondásos irodalmi adatok kizárólag a központi idegrendszerre fókuszálnak. Ebből kiindulva jelen kísérleteinkben a PACAP-38 perifériás hatásait vizsgáltuk különféle nocicepció modellekben. III. Több állatkísérletes modellben vizsgáltam egy optimalizált paraméterekkel rendelkező sztatikus mágneses teret biztosító készülék segítségével, hogy ez a fizikai behatás kivált-e mérhető antinociceptív hatásokat. Vizsgáltam azt is, hogy a jelenségben lehet-e potenciális szerepe a kapszaicin-érzékeny peptiderg idegvégződéseknek.
3
I. A SZOMATOSZTATIN SST4 RECEPTORON SZELEKTÍVEN HATÓ AGONISTA J-2156 ANALGETIKUS HATÁSA AKUT ÉS KRÓNIKUS GYULLADÁS- ÉS FÁJDALOMMODELLEKBEN Az endogén szomatosztatin terápiás alkalmazását akadályozza annak rendkívül sokrétű előfordulása a szervezetben, széles hatásspektruma, és nagyon rövid (3 percnél kevesebb) plazma féléletideje [122]. Helyette viszont stabil, a szenzoros idegvégződések és számos gyulladásos sejt sst4 receptorain szelektíven ható szintetikus agonisták új terápiás lehetőséget nyújthatnak a gyulladáscsökkentésben és a fájdalomcsillapításban. Ezen agonisták nagy előnye, hogy nem rendelkeznek a szomatosztatin sst2, sst3 és sst5 receptorai által közvetített endokrin hatásokkal. Sst4/sst1 receptor agonista molekula a ciklikus heptapeptid szerkezetű TT-232, amelynek széleskörű antinociceptív hatását számos korábbi kísérletünk igazolta [37,38,41,83]. Jelen kísérleteinket egy sst4 receptor-altípushoz szelektíven, nagy affinitással kötő szomatosztatin agonistával, a J-2156 kódjelű vegyülettel végeztük, amit a finn Juvantia Pharma gyárában szintetizáltak. A J-2156 nempeptid, szulfonamido-peptidomimetikum, pontos kémiai szerkezete (1’S,2S)-4-amino-N-(1’-karbamoil-2’feniletil)-2-(4’’-metil-1’’-naftalén-szulfonilamino)-butánamid. Nagyságrendileg nanomoláris affinitással kötődik az emberi szomatosztatin sst4 receptorhoz, ami a natív szomatosztatin kötődési affinitását is meghaladja, valamint közel 400-szoros szelektivitást mutat az sst4-hez az emberben megtalálható másik négy szomatosztatin receptor-altípushoz viszonyítva [25]. A receptor-aktivációt jelző ciklikus AMP-tesztben a natív szomatosztatin-14-hez vagy szomatosztatin-28-hoz hasonlóan teljes agonistaként működött. Egy másik G-protein-aktivációs funkcionális tesztben 2,5-szer erősebb válaszokat adott, mint a natív szomatosztatin. Ezen tulajdonságai alapján e molekulát a „szuperagonista” jelzővel illették [25]. További in vitro vizsgálatok igazolták, hogy a J-2156 kódjelű vegyület ismételt alkalmazása sem okoz deszenzibilizációt, ami tovább növeli e molekula terápiás alkalmazásának lehetőségeit [24].
I.1. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Állatok Kísérleteinket Balb/c, CD1 egereken, valamint Wistar, Lewis patkányokon végeztük el, amelyeket a Pécsi Tudományegyetem Központi Állatházában tenyésztettünk és tartottunk apatogén környezetben 24-25°C-on, normál élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. Formalinnal kiváltott akut szomatikus kemonocifenzív viselkedés vizsgálata Balb/c egerek bal hátsó lábának talpi részébe 50 µl 2,5%-os formalin-oldatot injektáltunk, ami az állatban nocifenzív reakciót vált ki két fázisban. Az első fázis, ami 0-5. percig tart, a formalin közvetlen kemonociceptív hatására jön létre. A második fázis, ami a 20. percben kezdődik és körülbelül a 45. percig tart, főként akut gyulladásos reakciók következménye [123]. A nocicepciót a talpnyalogatással eltöltött idővel, másodpercben fejeztük ki mindkét fázisban. A J-2156-ot a formalin-adás előtt 20 perccel intraperitoneálisan injektáltuk három különböző dózisban (1, 10 és 100 µg/kg). A talp mechanonociceptív küszöbének mérése traumás mononeuropátia modellben A nervus ischiadicus egyoldali részleges lekötése a végtag mechanonociceptív küszöbének csökkenését idézi elő [96]. Wistar patkányokat elaltattunk, az egyik oldali nervus ischiadicust a combon kipreparáltuk, majd az ideg 1/3-1/2-ed részét óvatosan elválasztottuk és lekötöttük, végül a sebet bezártuk. A műtétet követően az állatokat 7 napig hagytuk felépülni. A Randall-Selitto-teszt méréseket Ugo Basile Analgesimeterrel végeztük a műtét előtt és a műtétet követő 7. napon, ami kiválóan alkalmas a mechanikai fájdalomküszöb-csökkenés (mechanikai hiperalgézia) meghatározására [83]. A J-2156-ot három különböző dózisban (1, 10 és 100 µg/kg i.p.) adtuk a mérés előtt 20 perccel.
4
Freund-adjuvánssal kiváltott krónikus gyulladás vizsgálata A krónikus ízületi gyulladást komplett Freund-adjuváns (CFA: complete Freund’s adjuvant; 1 mg/ml hővel elölt Mycobacterium tuberculosis paraffinolajos szuszpenziója) faroktőbe, valamint intraplantárisan történő adásával (100-100 µl) váltottuk ki Lewis patkányokban. A szisztémás hatás fokozása érdekében a faroktőbe történő CFA-adást a következő napon megismételtük, ezt a napot tekintjük a kísérlet első napjának. Funkcionális méréseinket CFA adás előtt és azt követően 21 napon keresztül végeztük. A kísérlet végén a tibiotarzális ízületekből szövettani metszeteket készítettünk és morfológiai értékelés történt. A J-2156 két dózisát (1 és 10 µg/kg i.p.) napi háromszor injektáltuk az állatoknak a teljes kísérleti periódus alatt már a CFA-adás megkezdésével egyidőben. A talp érintési érzékenységének mérése A talp érintési érzékenységét Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometerrel mértük. Ez valójában egy módosított, digitalizált von Frey-készülék. A mért adatokat a kezdeti kontroll értékekhez viszonyítottuk, a gyulladás hatására kialakuló küszöbcsökkenést (allodinia) százalékban fejeztük ki. A lábduzzadás mérése A lábtérfogat mérésére alkalmas műszerünk az Ugo Basile Plethysmometer volt. A mérési adatokat a kezdeti értékekhez viszonyítottuk, a lábtérfogatnövekedést (ödémaképződést) százalékban fejeztük ki. Szövettani metszetek készítése és értékelése A kísérlet végén a tibiotarzális ízületeket kimetszettük, megfelelő eljárással dekalcináltuk, dehidráltuk őket. Ezek után a mintákat paraffinba ágyaztuk, majd mikrotómmal 5-7 µm-es szeletekre vágtuk és végül hematoxilin-eozin eljárással megfestettük [38]. A metszeteken látható gyulladásos elváltozásokat egy kísérleteinktől független patológus értékelte, előre megadott paraméterek alapján pontozva az egyes mintákat. Minden esetben egy 0-3-ig terjedő skálán történt a pontozás, ahol a legjelentősebb elváltozást jellemeztük 3-assal. Az egyes mintákra adott pontokat összeadtuk, így minden mintára, ezáltal pedig minden kezelési csoportra egy-egy összetett artritisz pontszámot kaptunk [132]. Carrageeninnel kiváltott akut lábduzzadás vizsgálata Wistar patkányok hátsó lábának talpába injektáltunk 100 µl 3%-os carrageenin-oldatot, amellyel kevert típusú, neurogén és nem-neurogén komponensekből álló gyulladásos reakciót idéztünk elő lokálisan [20,84]. A lábduzzadás a harmadik órában éri el maximumát [8], ezért a méréseket anyagadás előtt és anyagadás után 60, 120 és 180 perccel végeztük. A carrageenin-adás előtt 15 perccel az állatok egyegy csoportját oldószerrel, valamint 1, 10 és 100 µg/kg i.p. J-2156-oldattal kezeltük. Mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata patkány talpbőrében Wistar patkányok mindkét hátsó végtagját akutan denerváltuk, vagyis a nervus saphenust és a nervus ischiadicust átvágtuk 30 perccel a kísérletet megelőzően, megakadályozva ezzel a mustárolaj nociceptív hatásából adódó központi idegrendszeri reflexválaszokat. A lábháti bőrt 1%-os, paraffinolajban oldott mustárolajjal bekentük. Az ennek következtében kialakuló plazmafehérjekiáramlás mértékét Evans kék akkumuláció módszerével határoztuk meg. Tíz perccel a mustárolajjal történő kenés előtt 50 mg/kg Evans kék festéket adtunk intravénásan. Húsz perccel a gyulladás kiváltását követően az állatokat elvéreztettük, a kékült lábháti bőrterületeket kimetszettük, tömegüket megmértük, festéktartalmukat formamidban extraháltuk. A kioldódott festék mennyiségét 620 nm-en spektrofotométerrel határoztuk meg, amely a plazmakiáramlás, vagyis a gyulladás mértékével egyenesen arányos. A kapott értékeket µg festék/g nedves szövet formában fejeztük ki. A kontroll állatcsoportnak a J-2156 oldószerét, a kezeltnek J-2156-ot adtunk több dózisban (0,5-100 µg/kg)
5
intraperitoneálisan 20 perccel a gyulladás kiváltása előtt. A hatásidőtartam megállapításához a mustárolaj-kenés előtt 2 és 6 órával is adtuk i.p. a J-2156 10 µg/kg dózisát. Mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata egérfülön Balb/c egereket elaltattunk, majd 10-10 µl 1%-os, paraffinolajban oldott mustárolajat kentünk ecsettel fülük mindkét oldalára. A mustárolaj akut neurogén gyulladást idéz elő a kezelt felületen. A fülek vastagságát mikrométerrel mértük meg anyagadás előtt és négy alkalommal a három órás mérés során. A kialakult fülödémát a kezdeti értékekhez viszonyított százalékban fejeztük ki. A J-2156 három dózisát (10, 50 és 100 µg/kg), illetve oldószerét intraperitoneálisan adtuk az állatoknak 15 perccel a mustárolajkezelés előtt. Peritoneális makrofágok in vitro stimulálásával felszabaduló IL-1β mennyiségének mérése CD1 egereket kezeltünk lipopoliszachariddal, LPS-sel (300 µl i.p., 300 µg/ml). Négy órával az injektálás után az állatokat dekapitáltuk és kivéreztettük. A hasüreget ezután átmostuk 2,5 ml jéghideg tápoldattal, majd a hasüregi folyadékot begyűjtöttük. A sejttenyésztő lemez minden lyukába 800 µl RPMI-t (benne 80 µl BSA) és 100 µl hasűri folyadékot pipettáztunk. Kétféle tenyésztést állítottunk össze a gyulladásos sejtek stimulálására: az egyik esetben 1-1 µl 1 µg/ml LPS-oldatot, a másik esetben 1-1 µl 25 ng/ml-es forbol-12-mirisztát-13-acetát-oldatot (PMA) és 1-1 µl 1 µg/ml ionomicin-oldatot mértünk a lyukakba. Ezután mindkét összeállítás egyik felében 100 µl fiziológiás sóoldat, másik felében 100 µl J-2156 négyféle koncentrációjú oldatának (0,1, 1, 10 és 100 µg/ml) hozzáadásával vizsgáltuk a citokinfelszabadulás változását. A mintáinkban termelt IL-1β mennyiségét szendvics ELISA módszerrel és spektrofotométerrel (450 nm-en) határoztuk meg. Statisztika A formalin tesztben, a mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladásban, és a két mechanonocicepciót vizsgáló modellben eredményeink értékeléséhez nem-parametrikus Mann-Witney U-tesztet, a szövettani eredmények értékeléséhez Kruskal-Wallis tesztet, az in vitro modellben Student-féle t-próbát, a lábduzzadás eredmények értékeléséhez pedig módosított Bonferroni t-teszttel kiegészített egyutas ANOVA-tesztet használtunk. Minden esetben a különböző csoportok közötti eredmények összehasonlításakor a *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak.
I.2. EREDMÉNYEK A J-2156 hatása a formalinnal kiváltott akut nocifenzív reakcióra A formalin teszt első fázisában a J-2156 hatástalannak bizonyult. Az akut gyulladásos folyamatok következtében kialakuló második szakaszban közel háromszorosára emelkedett a nocifenzív viselkedés időtartama az oldószerrel kezelt kontroll csoportban, amelyre azonban a J-2156 szignifikáns és dózisfüggő gátló hatást gyakorolt. A J-2156 hatása a mechanikai hiperalgéziára traumás mononeuropátia modellben A nervus ischiadicus részleges lekötésével kialakult neuropátiás hiperalgéziát a legkisebb dózisú (1 µg/kg i.p.) J-2156-kezelés az oldószerhez hasonlóan nem befolyásolta. A két nagyobb (10 és 100 µg/kg i.p.) J-2156-dózis a hiperalgéziát szignifikánsan csökkentette, azonban dózis-hatás összefüggés nem volt megfigyelhető. A J-2156 hatása a komplett Freund-adjuvánssal kiváltott gyulladásos mechanikai allodiniára A kontroll csoportban a CFA-injekció érintési érzékenység fokozódást okozott, ami szinte változatlanul fennmaradt a 21 napos kísérlet ideje alatt. Ezzel szemben a J-2156-tal kezelt állatcsoportok mindkét vizsgált dózis (1 és 10 µg/kg i.p.) esetén jelentősen kisebb mértékű mechanikai allodiniát mutattak.
6
A J-2156 hatása a komplett Freund-adjuvánssal kiváltott lábduzzadásra A lábak térfogata az oldószerrel kezelt csoportban jelentős ödémaképződést mutatott, ami a teljes 21 napos kísérlet alatt végig fennmaradt. A J-2156 szinte az összes mérési napon mindkét dózisban (1 és 10 µg/kg i.p.) szignifikánsan csökkentette az ödémát, dózis-hatás összefüggést nem tapasztaltunk. A J-2156 hatása az ízületi szövettani elváltozásokra Az összetett szövettani pontszám a kontroll csoportban 6,6±0,7. A teljes kísérlet alatt a napi háromszori J-2156-kezelés jelentősen csökkentette az elváltozásokat, az 1 µg/kg-os dózisnál az összetett artritisz pontszám 2,86±0,86, a 10 µg/kg-os dózisnál 4,5±0,56 értékre csökkent. A J-2156 hatása a carrageeninnel kiváltott lábduzzadásra A kontroll csoportban a carrageenin intraplantáris adása után egy órával 32%, két órával 30%, három órával pedig 27% lábduzzadást tapasztaltunk. Ezt mindhárom dózisú (1, 10 és 100 µg/kg i.p.) J-2156 szignifikánsan csökkentette, a gátló hatás azonban ebben a modellben sem dózisfüggő. A J-2156 hatása mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata patkány talpbőrében A J-2156 hat különböző i.p. dózisa (0,5 és 100 µg/kg között) 20 perccel a gyulladás kiváltása előtt beadva szignifikáns, de nem dózisfüggő módon gátolta a mustárolajjal előidézett gyulladást patkány lábháti bőrében. A 10 µg/kg J-2156 gátló hatása 2 és 6 óra múlva is szignifikánsnak bizonyult. A J-2156 hatása mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata egérfülön A kontroll csoportban a fül nagy mértékben megduzzadt 3 órával a mustárolajjal történő kenés után. A J-2156 mindhárom dózisával (10, 50, 100 µg/kg i.p.) történő előkezelés két, illetve három órával a kenés után szignifikánsan csökkentette a mustárolajjal kiváltott fülduzzadást. A 20. percben szignifikáns gátlást csak az 50 µg/kg dózisú J-2156 adásakor tapasztaltunk. Dózis-hatás összefüggés ebben a modellben sem volt kimutatható. A J-2156 hatása peritoneális makrofágok in vitro stimulálásával felszabaduló IL-1β−mennyiségre A sejttenyésztés eredményeképpen kapott IL-1β mennyiségében az LPS- és a PMA-stimulálás között semmilyen eltérést nem tapasztaltunk. A kontrollhoz képest a J-2156-tal való kezelés csökkentette a citokin-termelést az 1 és 10 µg/ml-es oldatok esetében, a 0,1 µg/ml-es oldatnak nem volt hatása, a 100 µg/ml-es oldat hatására pedig megemelkedett az IL-1β mennyisége.
7
I.3. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK Jelen eredményeink azt igazolják, hogy a peptidomimetikus J-2156, ami a szomatosztatin sst4 receptorhoz nagyfokú specifitással és nagy affinitással kötődő agonista, képes hatékonyan gátolni a nocifenzív reakciót klasszikus akut kemonocicepció modellben (formalin teszt) egérben, valamint két különböző krónikus fájdalommodellben (adjuváns-indukálta fájdalom és traumás mononeuropátia) patkányban. Hatékonyan gátolta továbbá az akut gyulladást patkánytalpban és egérfülön. A vegyület antiinflammatorikus hatása az in vitro sejttenyésztésben is megmutatkozott, koncentrációfüggő módon gátolta a stimulált peritoneális makrofágok IL-1β-termelését. A J-2156-tal végzett egyéb kísérleteinkben azt tapasztaltuk, hogy ez az agonista hatékonyan gátolt különböző gyulladásos folyamatokat is patkányban, valószínűleg részben a neurogén komponensért felelős P-anyag és CGRP szenzoros idegvégződésekből történő felszabadulásának gátlásán keresztül. E peptidfelszabadulást gátló mechanizmust izolált tracheán korábban egyértelműen bizonyítottuk [36]. Mivel szelektíven csak az sst4 receptoron fejti ki hatását, így adásakor elmaradnak a szomatosztatin agonistáknál tapasztalt gyakori endokrin mellékhatások, mint a növekedési hormon, a glukagon, az inzulin felszabadulásának gátlása, ezek ugyanis főként az sst2, sst3 és sst5 receptor-altípusokhoz (SRIF2 receptorcsalád) kapcsolhatók [131]. Kísérleteinkben bebizonyítottuk tehát, hogy ez a molekula több modellben antinociceptív, antiallodiniás és gyulladásgátló hatásokkal rendelkezik. Bár az sst4 receptor pontos lokalizációjára vonatkozóan kevés irodalmi adat áll rendelkezésre [82], ezen agonistával nyert funkcionális adatok alapján valószínű, hogy e gátló hatások magukon az érzőideg-végződéseken, valamint az érfali endotélsejteken és a gyulladásos sejteken lévő sst4 receptor-aktiváción keresztül valósulnak meg. Ez utóbbira direkt in vitro bizonyítékot a peritoneális makrofágok IL-1β-termelésének gátlásával szolgáltattunk az általam kidolgozott kísérleti elrendezésben. Eredményeink alapján a szomatosztatin sst4 receptor gyógyszerfejlesztési szempontból kiváló target lehet, és stabil, szelektív sst4 agonisták új, ígértes utakat nyithatnak meg a fájdalomcsillapítás és a gyulladásos folyamatok neurogén komponensének kezelése terén.
8
II. A HIPOFÍZIS ADENILÁT CIKLÁZ-AKTIVÁLÓ POLIPEPTID-38 (PACAP-38) ELTÉRŐ PERIFÉRIÁS HATÁSAI PATKÁNY ÉS EGÉR FÁJDALOMMODELLEKBEN A 38 aminosavból álló hipofízis adenilát cikláz-aktiváló polipeptid (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide, PACAP-38) a vazoaktív intesztinális peptid (VIP), szekretin és glukagon család tagja. Először birka hipotalamuszából izolálták [68]. Nagy mennyiségben fordul elő a központi idegrendszerben és az endokrin szervekben. Szenzoros neuropeptidként tartják számon, mivel megtalálható a gerincvelő hátsó szarvában [18,19], a hátsó gyöki ganglionokban [69,70], a kapszaicinérzékeny szenzoros neuronok perifériás végződéseiben [26,139], például az ízületi tokot ellátó érző rostokban [125]. E morfológiai és molekuláris biológiai adatokon túl előzetes saját eredményeink azt is igazolták, hogy a kapszaicin-érzékeny rostokból a PACAP-38 stimuláció hatására in vitro és in vivo is felszabadul [35,72]. Ezen eredmények alapján feltételezhető volt, hogy a PACAP részt vesz a nociceptív folyamatokban, azonban ezt az elképzelést rendkívül kevés funkcionális adat támasztotta alá. Az összes erre irányuló in vivo kísérletben a PACAP központi idegrendszeri hatásait vizsgálták, és meglehetősen ellentmondásos eredményekre jutottak [98]. Az intratekálisan adott PACAP gátolta a nociceptív reflexműködést [140] és a gyulladás következtében kialakuló nocicepciót [77,137,139]. Intracerebroventrikulárisan adva a PACAP a formalin teszt korai fázisában analgetikus hatásúnak, míg a késői fázisban pronociceptívnek bizonyult [98]. Másrészről azonban a központi idegrendszerbe adott PACAP dózisfüggő módon csökkentette a hőküszöböt a talpban, és szerepet játszott a nociceptív stimulus hátsó szarvba történő közvetítésében, elsősorban N-metil-D-aszpartát (NMDA) receptorokon keresztül [76]. A PACAP Gs/q-proteinhez kötött receptorokon fejti ki hatásait. A PAC1 receptor specifikusan a PACAP-ot köti, míg a VPAC1/VPAC2 receptorok azonos affinitással rendelkeznek a VIP és a PACAP iránt. Mindhárom receptortípust leírták neuronokon, simaizomsejteken és számos gyulladásos sejten [18,104,127,142]. Korábbi vizsgálataink igazolták, hogy a PACAP-38 gátolja proinflammatorikus és pronociceptív szenzoros neuropeptidek, P-anyag és CGRP, kapszaicin-érzékeny érzőidegek végződéseiből kémiai és elektromos téringerléssel kiváltott felszabadulását in vitro [72]. In vivo gátolta továbbá az akut neurogén és nem-neurogén gyulladásos folyamatokat patkányban és egérben egyaránt [38,72]. Ezen eredményeink erősítik azt a feltevést, hogy a PACAP-nak szerepe lehet a nocicepció perifériás folyamataiban. Mivel a PACAP-38 perifériás nociceptív folyamatokban betöltött hatásaira vonatkozóan nem állt rendelkezésre adat, jelen kísérletsorozatunkban azt vizsgáltuk, hogyan hat a lokálisan/szisztémásan adott PACAP akut viszcerális és szomatikus nocifenzív viselkedésben, gyulladásos és neuropátiás mechanikai hiperalgéziában, valamint enyhe hőtraumával kiváltott termális hiperalgéziában.
II.1. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Állatok A kísérleteket Wistar patkányokon, valamint CD1 egereken végeztük, amiket rendre a Pécsi Tudományegyetem Központi Állatházában, illetve a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet állatházában tartottuk standard, apatogén környezetben 24-25°C-on, normál élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. Formalinnal kiváltotta akut szomatikus nocicepció vizsgálata Wistar patkányok egyik hátsó lábának talpába 50 µl 2,5%-os formalin-oldatot injektáltunk. Patkányok e tesztben az egerektől eltérő mintázatú elhárító viselkedést mutatnak, nemcsak lábnyalásokat, hanem jellegzetes emelgetéseket is végeznek. Ezért ebben a modellben a nocifenzív reakció mértékét a kezelt láb emelgetésének számából és nyalogatásának időtartamából számított összetett fájdalompontszám segítségével határoztuk meg a következő módon: összetett fájdalompontszám=(lábemelések száma+lábnyalogatás időtartamának kétszerese)/vizsgálati időtartam [130]. Formalin-adás előtt 5 9
perccel az állatokat intraplantárisan kezeltük 100-100 µl fiziológiás sóval, illetve 2 µM PACAP-38-al. A PAC1 és VPAC receptorok szerepének vizsgálatára külön állatcsoportokban a PACAP-38 (50 µl, 4 µM) adása előtt 5 perccel tízszeres mennyiségben (50 µl, 40 µM) két különböző antagonistát injektáltunk intraplantárisan: a PAC1 receptor-szelektív M65 kódjelű vegyületet [1], illetve a VPAC1/VPAC2 receptorokon ható [D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP-et [104]. Kontrollként itt is fiziológiás sóldatot használtunk. Enyhe hőtraumával kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata Wistar patkányok fájdalmas hőküszöbét emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel határoztuk meg [7]. A készülék a fájdalmas hőküszöb meghatározására alkalmas. Az állatokat elaltattuk, és egyik hátsó lábukat konstans hőmérsékletű, 51°C-os, tehát már enyhe hőtraumát kiváltó hőmérsékletű vízfürdőbe merítettük 20 másodpercre. A kezelés után 10 és 20 perccel az állatok hőküszöbét újra meghatároztuk, hogy meggyőződjünk a termális hiperalgézia kialakulásáról. A 20 perces mérés után 100-100 µl fiziológiás sót, illetve 2 µM PACAP-38-at injektáltunk intraplantárisan az állatoknak. Az anyag hatását a hőküszöb-értékekre 10 percenként mértük. A termális hiperalgéziát az adott időpontban mért küszöbértékek hőtrauma előtti kontroll értékeihez viszonyított százalékban adtuk meg. Ebben a modellben is vizsgáltuk a PACAP-hatásban a receptorok szerepét. Öt perccel a PACAP-38 (50 µl, 4 µM) adása előtt egy állatcsoport 50 µl 40 µM PAC1 receptor-szelektív antagonista M65-oldatot, egy másik állatcsoport olyanekkora dózisú VPAC1/VPAC2 receptorokon ható antagonista [D-p-ClPhe6,Leu17]-VIP-oldatot kapott intraplantárisan. Kontrollként oldószert, fiziológiás sóoldatot adtunk. Carrageeninnel kiváltott gyulladásos mechanikai allodinia vizsgálata Wistar patkányok egyik hátsó lábának talpába 50 µl 3%-os carrageenin-oldatot injektáltunk. A carrageenin kevert típusú akut gyulladásos reakciót vált ki a talpban, ami maximumát anyagadás után 3 órával éri el [8]. A méréseket ezért anyagadás előtt, valamint 120 és 180 perccel utána végeztük. A mechanikai érzékenységet ennél a modellnél szintén Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometerrel mértük. A PACAP-38 2 µM koncentrációjú oldatából (fiziológiás sóoldatban oldva), illetve oldószeréből 100-100 µl-t az egyes mérések előtt 5 perccel adtuk intraplantárisan. Az eredményeket a carrageeninadás előtti kontroll küszöbökhöz viszonyítva százalékban fejeztük ki. A PACAP-38 hatásának vizsgálata a mechano-és termonociceptív küszöbökre Patkányban a PACAP-38 intraplantáris adása (100 µl, 2 µM) előtt és 10 perccel utána a mechanonociceptív küszöböt Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometerrel, a termonociceptív küszöböt pedig emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mértük. Ecetsavval kiváltott akut viszcerális nocicepció vizsgálata vonaglási teszttel A viszcerális kemonocicepciót CD1 egereken váltottuk ki 200 µl 3%-os ecetsav-oldat intraperitoneális adásával. A peritoneum kémiai izgatásának hatására alhasi izomösszehúzódások, úgynevezett vonaglások következnek be, amelyek tipikus nocifenzív viselkedésnek tekinthetők [22,52,57]. A vonaglásokat az anyagadást követően 20 percig számoltuk. A PACAP-38-at (100 µg/kg), illetve a fiziológiás sóoldatot 30 perccel az ecetsavval való kezelés előtt szubkután adtuk az egereknek. Mechanikai hiperalgézia vizsgálata traumás mononeuropátiában A műtéthez az egereket elaltattuk. Az egyik oldali nervus ischiadicust az állat combján kipreparáltuk, majd az ideg 1/3-1/2-ed részét óvatosan elválasztottuk, szorosan lekötöttük, majd a sebet bezártuk. A nervus ischiadicus egyoldali részleges lekötése a végtag spontán fájdalmát és mechanonociceptív küszöbének csökkenését idézi elő [96]. A műtétet követően az állatokat 7 napig hagytuk felépülni. A mechanikai hiperalgézia értékét újra Ugo Balise Dynamic Plantar Aesthesiometerrel mértük a műtétet követő 7. napon. A mérési eredményeket a kontrollhoz viszonyítva, százalékosan fejeztük ki. A PACAP-
10
38 két dózisát (10 és 100 µg/kg), illetve oldószerét intraperitoneálisan adtuk 30 perccel a mérések előtt az állatoknak. A térdízület primér afferenseinek elektrofiziológiai vizsgálata Ez a kísérletsorozat nem munkacsoportunkban, hanem egy kollaboráció keretein belül a Calgary Egyetem Élettani és Biofizikai Intézetében történt. Wistar patkányok térdízületében 100-100 µl 2-2% kaolin- és carrageenin-injekcióval akut szinoviális gyulladást váltottak ki. A femur középső részére illesztett sztereotaxikus kerethez csatlakozó rögzítő segítségével a csípőízületet immobilizálták, a lábat standard rotációt kiváltó készülékhez kapcsolták. Végül a végtag közepén hosszanti metszést ejtettek, a térdízület feletti bőrlebenyeket egy „O” alakú keretre felvarrták és a keletkezett medencét meleg paraffinolajjal töltötték ki. A nervus saphenust átvágták, a proximális idegcsonk axonkötegeiről platina elektróddal vezették el az elektromos aktivitásokat. A vezetési sebességet a beidegzett terület elektromos ingerlését követő latencia mérésével határozták meg. A három, egyenként 10 másodperces mozgásciklus alatt mért idegaktivitások átlaga adta a kontrollt. A PACAP-38 lokális alkalmazása a saphenus artériába történő bolus-injekcióval történt két dózisban (100 µl 0,2 és 2 µM) . Ezt követően vizsgálták az afferens idegaktivitást, az egyes rotációk hatására létrejövő akciós potenciálok számát mérték, és a PACAP-38-kezelés mellett kialakuló afferens aktivitást a kontroll értékekhez viszonyított százalékban adták meg. Statisztika A termális és mechanikai hiperalgézia/allodinia adatait Dunnett-féle poszt teszttel kiegészített egyutas ANOVA-teszttel értékeltük. Az elektrofiziológiával nyert adatokat kétutas ANOVA-teszttel értékeltük ki. A formalin és vonaglási tesztek értékelését Student-féle t-próbával végeztük. Minden esetben a különböző csoportok közötti eredmények összehasonlításakor *p<0,05 és **p<0,01 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak.
II.2. EREDMÉNYEK Intraplantáris PACAP-38 hatása a formalinnal kiváltott akut nocifenzív viselkedésre Az első fázisban a nocifenzív viselkedést jelző összetett fájdalompontszám a kontroll csoporthoz képest az intraplantáris PACAP-38-kezelést kapott csoportban szignifikánsan kisebb volt. A második fázisban az akut gyulladásos folyamatok következtében kialakuló nocifenzív viselkedést szintén szignifikánsan gátolta a lokálisan alkalmazott PACAP-38. A PAC1 receptor-szelektív antagonista M65-előkezelés nem befolyásolta a PACAP-38 gátló hatását egyik fázisban sem. A VPAC1/VPAC2 receptor antagonista [Dp-Cl-Phe6,Leu17]-VIP sem csökkentette a PACAP-38 gátló hatását a direkt kemonociceptív fázisban, ezzel szemben szinte teljesen megszüntette az antinociceptív hatást az akut gyulladás fázisában. Intraplantáris PACAP-38 hatása enyhe hőtraumával kiváltott termális hiperalgéziára Az 51°C-os enyhe hőtrauma utáni 10. és 20. percben mért hőküszöbök jelentősen lecsökkentek és a 60 perces kísérleti periódus alatt végig szinte változatlanul fennmaradtak. A PACAP-38 talpba történő adása az utolsót kivéve minden mérési időpontban szignifikánsan gátolta a hőtraumával kiváltott hiperalgéziát. A PAC1 receptor antagonista M65 kódjelű vegyülettel történő előkezelés hatására nem változott a PACAP-38 antihiperalgéziás hatása egyik mérési pontban sem, a VPAC1/VPAC2 receptorantagonista [D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP ezzel szemben minden mérési időpontban szignifikánsan nagyobb küszöbcsökkenést váltott ki. Intraplantáris PACAP-38 hatása a carrageeninnel kiváltott mechanikai allodiniára A carrageenin hatására az oldószerrel kezelt állatoknál a 2. és 3. órában is mechanonociceptív küszöbcsökkenést tapasztaltunk. A PACAP-38-al kezelt állatokban azonban mindkét mérési időpontban szignifikánsan kisebb küszöbcsökkenés volt megfigyelhető. 11
Intraplantáris PACAP-38 hatása a mechano- és termonociceptív küszöbökre A PACAP-38 önmagában nincs hatással sem a mechano-, sem a termonociceptív küszöbökre. A PACAP-38 perifériás hatása az akut viszcerális kemonocicepcióra Szubkután injektált PACAP-38 hatására a viszcerális kemonocifenzív viselkedés a kontroll csoporthoz képest kevesebb vonaglásban nyilvánult meg, tehát a PACAP e modellben egérben is antinociceptív hatást fejtett ki. A PACAP-38 hatása neuropátiás mechanikai hiperalgéziára A műtétet követő 7. napra jelentős mechanikai hiperalgézia alakult ki az egerek talpában, amelyet i.p. adott PACAP-38 egyik dózisa sem volt képes szignifikánsan csökkenteni, így ebben a modellben a PACAP hatástalannak bizonyult. A PACAP-38 perifériás hatása a gyulladt térdízület afferens aktivitására A kaolin-carrageenin-injekció hatására a térdízület átmérője szignifikánsan megnövekedett. A vizsgált rostokban a PACAP-38 lokális adása átmeneti, de szignifikáns aktivitás-fokozódást okozott. Ez a szenzitizáló hatás dózisfüggő, mivel a kisebb dózis nem okozott mechanoszenzitivitás-változást az ízületi afferenseken.
II.3. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK Bár a PACAP-38 jelenlétét a kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronokban korábban több fajban is leírták [69,70], csupán néhány meglehetősen ellentmondó adat utal a nociceptív folyamatokban betöltött szerepére, kizárólag a központi idegrendszeri hatásokra fókuszálva. Jelen kísérletsorozatunk szolgáltatja az első eredményeket a PACAP hatásairól a perifériás nocicepcióval kapcsolatban. Kísérletekkel bizonyítottuk, hogy a perifériásan adott PACAP-38 gátolja az akut szomatikus és viszcerális kemonocicepciót, a gyulladásos mechanikai allodiniát, és az enyhe hőtraumával kiváltott termális hiperalgéziát mind patkányban, mind egérben. Ugyanakkor nem befolyásolja a mechanikai hiperalgéziát traumás neuropátia egérmodelljében, sőt fokozza a gyulladt térdízületben a mechanikai stimulációval kiváltott afferens aktivitást. A PACAP Gs/q-proteinhez kapcsolt receptorokon fejti ki hatását, a PAC1-hez a PACAP jelentősen nagyobb affinitással kötődik, mint a VIP, míg a VPAC1/VPAC2 iránt mindkét neuropeptid ugyanakkora affinitással rendelkezik [54,104,127]. Bár e receptorok számos szignáltranszdukciós mechanizmushoz kapcsoltak, mindegyik folyamat neuronális aktivációhoz vezet. Ez a direkt mechanizmus jól alátámasztja az ízületi afferenseken elektrofiziológiai vizsgálattal nyert direkt szenzitizáló hatást. Az adjuvánssal kiváltott gyulladás hatására a hátsó gyöki ganglionban nagymértékben upregulálódó PACAP-nak potenciális szerepet tulajdonítottak a gyulladásos fájdalom folyamataiban [138]. A PACAP modulálja a gyulladásos és immunfolyamatokat is, a vizsgálatok jelentős része gyulladásgátló hatását igazolta és magyarázta azzal, hogy a PACAP képes gátolni gyulladásos citokinek (TNFα, IL-6, IL-12), kemokinek, transzkripciós faktorok és egyéb mediátorok termelését [13,51,58,62]. A PACAP gátolja továbbá a T-sejtek proliferációját, számos makrofág-funkciót, például a cAMP-függő, VPAC1 receptor aktiválta kemotaxist [14,15]. Korábban a mi munkacsoportunk is kimutatta, hogy gyulladásos folyamatokban nem csak a nem-neurogén sejtes, hanem az akut neurogén eseményeket is képes gátolni a PACAP szisztémás adása. Ezen kívül direkt in vitro bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy a PACAP-38 gátolja proinflammatorikus szenzoros neuropeptidek (P-anyag és CGRP) felszabadulását a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok perifériás végződéseiből, ami magyarázza kizárólag neurogén eredetű plazmaprotein-extravazációra gyakorolt gátló hatását [35]. A PACAP-38 kísérleteinkben tapasztalt antinociceptív és antihiperalgézikus hatásainak pontos celluláris mechanizmusa nem ismert, kísérleteinkben PAC1 és VPAC1/VPAC2 receptorokon ható
12
antagonistákkal egyértelműen kimutattuk, hogy a formalin teszt második fázisában, valamint a hőtraumával kiváltott termális hiperalgéziában tapasztalt gátló PACAP-hatások VPAC receptoron keresztül valósulnak meg. Valószínűleg nem a nociceptoron kifejtett direkt hatásról van szó, ezek a receptorok ugyanis Gs- és Gq-fehérjékhez kötötten működnek, vagyis különféle szignáltranszdukciós útvonalakhoz kapcsolódva növelik az intracelluláris cAMP-, valamint a Ca2+-szintet [54,127], vagyis neuronális stimulációt okoznak [105,117,118]. Ugyanakkor hízósejtekben, makrofágokban és granulocitákban a megnövekedett cAMP-szint gátolja gyulladásos mediátorok, citokinek felszabadulását [53,133]. A PACAP akut gyulladásmodellekben megfigyelt perifériás antinociceptív és antihiperalgézikus hatásait magyarázhatja a korábban már említett pronociceptív neuropeptidek, illetve egyéb fájdalomkeltő és szenzitizáló hatású molekulák (bradikinin, prosztaglandinok, leukotriének) sejtekből való felszabadulásának gátlása. Az a megfigyelésünk, hogy a lokálisan adott PACAP-38 önmagában nem befolyásolta sem a mechanikai, sem a termális nociceptív küszöböt, arra utal, hogy nincs hatással a feszültségfüggő Na+-csatornákra, vagyis az általa kifejtett perifériás antinocicepcióban helyi érzéstelenítő-szerű hatás nem játszik szerepet. A formalin I. fázisában kiugróan nagy mértékű antinociceptív PACAP-hatást mértünk. Ezt a hatást nem szüntette meg sem a PAC1 receptorra szelektív, sem a VPAC receptorokon ható antagonistákkal történő előkezelés, tehát ebben az esetben nem ezeken a receptorokon keresztül megvalósuló gátló hatásról beszélhetünk. Nem zárható ki ugyanakkor más, eddig ismeretlen gátló PACAP receptor létezése, más receptorokon (kannabinoid, opioid, esetleg szomatosztatin) kifejtett hatás [71]. A PACAP-38 viszcerális és szomatikus nocicepcióban megfigyelt gátló hatásával ellentétben patkány gyulladt térdízületi afferensein végzett elektrofiziológiai mérések szenzitizáló hatást bizonyítottak. A PACAP-38 aktiválja az ízületi tokban lévő szenzoros érzőideg-végződéseken található VPAC1/VPAC2 receptorokat is, ami az ízület mechanoszenzitivitásának fokozódásához vezet. A szenzitizáló hatás alapja a megemelkedett intracelluláris cAMP-szint, ami az adenilát cikláz, valamint a PKA aktiválásának következménye, de szerepe lehet a foszfolipáz C aktiválásának is e folyamatban [105,117,118]. Emberi mintákban kimutatták a VPAC receptort szinoviocitákon is [120], amik speciálisan az ízületben jelen lévő makrofág- és fibroblasztszerű sejtek, és amelyek gyulladásos mediátorok, prosztaglandin E2, IL-1 és TNFα szekréciójára képesek [141]. A szinoviális hízósejtekből felszabadul emellett hisztamin is, ami szintén fokozza az algogén hatást. Ismert tény, hogy a VIP képes hízósejt-degranulációt kiváltani [102], de nem zárható ki a PACAP szinoviocitákat és hízósejteket indirekt módon aktiváló hatása sem [65]. Nem találtunk eltérést a mechanikai hiperalgéziában a PACAP szisztémás adását követően egér mononeuropátiás modellben annak ellenére, hogy elektrofiziológiai bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a PACAP és a VIP növeli a hátsó szarvi neuronok aktivitását patkány mononeuropátiában [18]. Ezt a PACAP periférián adott válaszaival magyarázhatjuk, hiszen ez a 38 aminosavból álló polipeptid elég nagy ahhoz, hogy intraperitoneális adást követően ne tudjon bejutni a központi idegrendszerbe. Összefoglalva tehát elmondható, hogy ezek a kísérletek igazolják elsőként a periférián a PACAP-38 jelentős szerepét a fájdalomérzet közvetítésében. Ezek a hatások azonban a nociceptív folyamatok patomechanizmusától függően eltérőek lehetnek: a nociceptorokon kifejtett közvetlen hatás stimuláló, szenzitizáló, bizonyos gyulladásos folyamatokban azonban antinociceptív, antihiperalgézikus, antiallodiniás hatást tapasztaltunk, amelyet a VPAC receptorok közvetítenek. A PACAP perifériás nocicepcióban betöltött szerepének pontos molekuláris mechanizmusainak felderítéséhez további vizsgálatok szükségesek.
13
III. A SZTATIKUS MÁGNESES TÉR ANTINOCICEPTÍV HATÁSA ÉS A HÁTTÉRBEN ÁLLÓ MECHANIZMUSOK VIZSGÁLATA Számos korábbi eredmény igazolta a sztatikus mágneses tér (static magnetic field, SMF) hatásait különböző viselkedésmintázatokban és idegi működésekben, a lokomotoros aktivitás indukciójában [44], kondicionált ízaverzióban [74], vagy vesztibuláris aktivációban [103]. A sztatikus mágneses tér nociceptív folyamatokra gyakorolt hatásáról szóló kísérletek eredményei meglehetősen ellentmondásosak [12,16,43,49,86,88,101]. Az ellentmondó eredmények magyarázata lehet, hogy a kísérleteket különböző fajokon végezték, valamint hogy a kiváltott hatás függhet a mágneses tér eltérő tulajdonságaitól, másképpen beállított paramétereitől és a behatás időtartamától is. Az általunk használt sztatikus mágneses teret létrehozó készüléket dr. László János és munkacsoportja készítette, optimalizálta és validálta egér vonaglási tesztben [56]. A készülékben alul és felül elhelyezkedő mátrixok 5 mm sugarú, 10 mm magasságú, henger alakú neodímium-vas-bór (NdFeB) összetételű mágneseket tartalmaznak. Ezek a ritkaföldfém mágnesek rendelkeznek a legmagasabb indukció/tömeg aránnyal. Az egyedi mágnesek N50 fokúak, azaz jellemző értékük az 1.47 T remanens mágneses indukció. Minden egyes mágnes a szomszédaival ellentétes polaritású, továbbá a másik mátrixban vele szemben elhelyezkedő mágnessel egy tengelyű és megegyező irányú, ami a mágneses mező jellegzetes mintázatához vezet. Az így létrejött mágneses térre a továbbiakban az optimalizált sztatikus mágneses tér (oSMF) elnevezést használjuk [56]. A pontos mechanizmus, amellyel az SMF változatos hatásait kiváltja, egyelőre ismeretlen [59,94], bár felmerült az endogén opioiderg rendszer és egyes ioncsatornák vezetőképességének megváltoztatásának szerepe [48,92,93]. Számos eredmény alapján feltételezhető, hogy a gyenge sztatikus mágneses tér csökkenti az ideg ingerületvezetésének sebességét a Ca2+- és Na+-csatornák gátlásán keresztül [92,93,134]. A kapszaicin-érzékeny, TRPV1 receptort expresszáló szenzoros neuronok rendkívül fontos szerepet játszanak számos gyulladásos és fájdalommal járó folyamat kialakulásában. E neuronok aktivált végződéseiből olyan szenzoros neuropeptidek szabadulnak fel, mint a P-anyag vagy a CGRP, amelyek a központi idegrendszerben és a periférián is jelentős pronociceptív, proinflammatorikus hatásokkal rendelkeznek [60,109]. Ezzel szemben, az ugyanezen idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin a szisztémás keringésbe jutva a test távolabbi pontjain képes gyulladásgátló és fájdalomcsillapító hatást kifejteni. A TRPV1 receptor olyan nem-szelektív kation-csatorna, amelyet számos inger, például exogén vanilloidok (kapszaicin vagy reziniferatoxin, RTX), fájdalmas hőmérséklet, protonok és endogén anyagok (bradikinin, leukotriének, lipoxigenáz termékek) képes aktiválni [107,109]. Ismételt, nagy dózisú TRPV1 receptor agonistával (kapszaicin vagy RTX) történő előkezeléssel a kapszaicin-érzékeny neuronok működése szelektíven gátolható, ez a deszenzibilizáció [6,39,113]. A TRPV1 receptor tartós aktivációja következtében jelentős mértékben megnövekedik az intracelluláris Ca2+-koncentráció, ami a mitokondriumokban Ca2+-felhalmozódáshoz és következményes duzzadáshoz vezet, a sejtműködés károsodását is okozva [108]. Kísérleteinkben az oSMF hatásait vizsgáltuk akut viszcerális és szomatikus kemonocicepcióra, akut gyulladásos nocifenzív reakciókra és mechanikai hiperalgéziára. Vizsgálatsorozatunk másik része a megfigyelt antinociceptív, antihiperalgéziás hatás mechanizmusának és a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok ezen folyamatokban betöltött szerepének vizsgálatára irányult.
III.1. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Állatok A kísérleteket Balb/c, illetve CFLP egereken végeztük. Előbbieket a Pécsi Tudományegyetem Központi Állatházában, utóbbiakat a Semmelweis Egyetem Állatházában standard, apatogén környezetben tartottuk 24-25°C-on, étellel és vízzel ad libitum ellátva.
14
Optimalizált sztatikus mágneses tér A sztatikus mágneses teret létrehozó készüléket egy keret és egy abba illeszkedő műanyag ketrec alkotja, amelyben az egerek szabadon mozognak. A bevezetőben részletesen jellemzett mágneses mátrixok a keretben, a ketrec alatt és felett helyezkednek el. Vonaglási teszt A viszcerális nocicepciót CFLP egereken váltottuk ki 200 µl 0,6%-os ecetsav-oldat, illetve 2%-os MgSO4-oldat intraperitoneális adásával [135]. A peritoneum kémiai izgatására adott tipikus nocifenzív reakció az alhasi izmok összehúzódása, az úgynevezett vonaglás. A vonaglásokat az anyagadástól számított 0-5, 5-20 és 20-30 perces intervallumokban külön-külön számoltuk. Az egereket a kísérlet előtt 5 perccel tettük a ketrecbe és ott is tartottunk végig a teljes kísérlet alatt. Az egyik ketrecet optimalizált mágneses térbe helyeztük, a másikat kontrollként használtuk. Reziniferatoxinnal kiváltott mechanikai hiperalgézia vizsgálata Balb/c egerek bal hátsó lábának talpába injektáltunk 20 µl 0,1 µg/ml TRPV1 receptor agonista RTXoldatot. Méréseinket az RTX-injekció előtt és 30 perccel utána végeztük Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometerrel. A hiperalgéziát a kezdeti kontroll értékekhez viszonyítva százalékban fejeztük ki. Az egyik csoport állatait RTX-adás előtt 5 perccel az oSMF-be helyeztük és mérésig ott is tartottuk, a másik csoport állatait nem tettük ki a sztatikus mágnes tér hatásainak. Formalinnal kiváltott akut nocifenzív viselkedés vizsgálata Balb/c egerek bal hátsó lábába intraplantárisan 50 µl 2,5%-os formalin-oldatot injektáltunk. A formalin két fázisban vált ki nocifenzív reakciót az állatokban, elsőként egy direkt kemonociceptív hatás jelentkezik, ami körülbelül 5 percig tart (I. fázis), utána pedig beindulnak a gyulladásos folyamatok, amik a második fázist adják a 20-45. perces intervallumban [123]. A nocifenzív reakció mértékét mindkét fázisban a kezelt láb emelgetésének és nyalogatásának összesített ideje alapján határoztuk meg [8]. Anyagadás előtt 5 perccel az állatokat az oSMF-be helyeztük, és ott is tartottuk a kísérlet végéig. Az oSMF-mérések mellett párhuzamosan kontroll méréseket is végeztünk, azok az állatok nem voltak mágneses térben. Carrageeninnel kiváltott gyulladásos mechanikai hiperalgézia vizsgálata Balb/c egerek egyik hátsó lábának talpába 50 µl 3%-os carrageenin-oldatot injektáltunk. A carrageenin kevert típusú akut gyulladásos reakciót vált ki a talpban, ami maximumát anyagadás után 3 órával éri el [8]. A méréseket ezért carrageenin-adás előtt és 3 órával utána végeztük. A mechanikai érzékenységet ennél a modellnél is Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometerrel határoztuk meg. A hiperalgéziát a kezdeti kontroll értékekhez viszonyítva, százalékban fejeztük ki. Az egyik csoport állatait carrageeninadás előtt 5 perccel az oSMF-be helyeztük és a mérés végéig ott tartottuk, a másik csoport állatait nem tettük ki a sztatikus mágneses tér hatásának. A kapszaicin-érzékeny afferensek inaktiválása reziniferatoxin-előkezeléssel A kapszaicin-érzékeny primér szenzoros neuronok működését szelektíven blokkolhatjuk az ultrapotens TRPV1 receptor agonista RTX nagy dózisainak ismételt adásával. Öt nappal az utolsó kezelést követően, amikor már nem kellett számolnunk az RTX akut izgató hatásaival, az állatokkal elvégeztük a formalin tesztet, és vizsgáltuk a carrageeninnel kiváltott akut gyulladásos mechanikai hiperalgéziát. Rotarod teszt Ugo Basile Accelerating Rotarod készülékkel azt is megvizsgáltuk, hogy befolyással van-e az oSMFexpozíció az egerek koordinációjára és motoros működésére [47]. Az állatok a dob tetején kapaszkodnak a készülék indításakor és igyekeznek forgás közben is a dob tetején megkapaszkodni. A mérésnek akkor van vége, amikor az állat leesik a dobról a készülék alatt található pedálra. A rotarod
15
tesztet elvégeztük az oSMF-ben való tartózkodás előtt és 30 perccel utána is. Minden mérést háromszor ismételtünk meg és ezeknek az átlagait használtuk fel az eredmények értékeléséhez. Statisztika Mérési eredményeink értékeléséhez módosított Bonferroni t-teszttel kiegészített egyutas ANOVAtesztet használtunk, ahol minden esetben a különböző csoportok közötti eredmények összehasonlításakor *p<0,05 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak.
III.2. EREDMÉNYEK Az oSMF hatása az akut viszcerális kemonocicepcióra Az oSMF-ben lévő egerek vonaglásának száma a kontroll csoporthoz képest mindhárom periódusban szignifikáns csökkenést mutatott az ecetsavval kiváltott nocifenzív reakció esetében. A MgSO4-oldat i.p. injekciója ennél kisebb mértékű nocifenzív reakciót okozott. Az oSMF hatására a vonaglások száma ebben a modellben is csökkent, ami a második és harmadik intervallumban szignifikáns gátlást jelent a kontroll értékekhez képest. Az oSMF hatása a reziniferatoxinnal kiváltott mechanikai hiperalgéziára Az RTX intraplantáris injekciója kontroll állatokban fél órával a beadás után jelentős mértékben csökkentette a mechanonociceptív küszöböket. Ugyanez az RTX-adás az oSMF-ben tartott állatokban szignifikánsan gátolta a TRPV1 receptor aktivációjával kiváltott mechanikai hiperalgéziát a talpban. Az oSMF hatása a formalinnal kiváltott akut szomatikus nocicepcióra A formalin teszt első fázisában a kontroll csoportban lévő egerek nocifenzív viselkedéséhez képest az oSMF-kezelés szignifikánsan alacsonyabb értékeket produkált. A második fázisban is jelentősen kisebb volt az oSMF-ben tartott állatoknál a nocifenzív viselkedés, mint a kontroll ketrecben lévőknél. Az oSMF hatása a carrageeninnel kiváltott akut nocifenzív viselkedésre RTX-előkezelt állatokban A kontroll csoportban a carrageenin-adást követő harmadik órában jelentős hiperalgéziát mértünk. Azokban az egerekben, amiket a mérés előtt oSMF-ketrecbe helyeztünk, szignifikánsan kisebb küszöbcsökkenés volt tapaszalható. Az RTX-előkezelt állatcsoportban csökkent ugyan a mechanonociceptív küszöb, az eltérés azonban nem szignifikáns sem a kontroll, sem az oSMF-kezelt állatcsoportban. Az oSMF hatása a formalinnal kiváltott akut nocifenzív viselkedésre RTX-előkezelt állatokban Azoknál az állatoknál, amelyeknél RTX-előkezelést alkalmaztunk a kísérlet előtt 5 nappal, a kapszaicinérzékeny afferensek működését inaktiváltuk. A kontroll csoportban a korábbi kísérletsorozathoz hasonlóan alakul a nocifenzív viselkedés formalin hatására. Az oSMF előzőekben tapasztalt antinociceptív hatása a kapszaicin-érzékeny rostok inaktiválása után elmaradt mindkét fázisban. Az oSMF hatása az egerek koordinációjára és motoros működésére Az állatok egy részét 30 percig az oSMF hatásának tettük ki, míg egy másik csoportot kontroll ketrecben tartottunk. A kezelés előtt és után is elvégeztük a rotarod tesztet mindkét csoporton. Sem a csoportok között, sem az egyes csoportok kezelés előtti és kezelés utáni értékei között nem tapasztaltunk szignifikáns eltéréseket.
16
III.3. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK Fenti eredményeink azt mutatják, hogy az oSMF antinociceptív, antihiperalgéziás hatásokkal rendelkezik többféle egérmodellben. Az oSMF gátolta mind az ecetsavval, mind a MgSO4-tal kiváltott akut viszcerális kemonocicepciót, amely hatás kifejezettebb volt az ecetsavval kiváltott vonaglási tesztben. Ez a különbség valószínűleg e kémiai anyagok eltérő fájdalomkeltő mechanizmusában keresendő: a MgSO4 által okozott nocifenzív reakció elsősorban kemonociceptorok direkt stimulálásával jön létre, míg az ecetsav-indukálta vonaglás akut gyulladásos folyamatok eredménye [30]. A formalin tesztben az I. fázisban direkt kemonociceptív hatás jelentkezik, a másodikban már akut gyulladásos reakciók következményeképpen fellépő nocifenzív viselkedést láthatunk. A kontroll csoportokban az RTX-előkezelés az I. fázisban nem, de a II. fázisban jelentősen csökkent reakciókat eredményezett, amely azt igazolja, hogy a kapszaicin-érzékeny szenzoros idegvégződésekből aktiváció hatására felszabaduló szenzoros neuropeptidek (például a P-anyag, CGRP) szerepet játszanak a formalinnal kiváltott akut gyulladásos reakció kialakulásában. Az oSMF formalinnal kiváltott nocifenzív reakciókat gátló hatása elmaradt a kapszaicin-érzékeny rostok reziniferatoxinnal történő inaktiválása után. Az I. fázisban az oSMF antinociceptív hatásának hátterében a kapszaicin-érzékeny idegvégződésekbe történő Na+-beáramlás és a következményes akciós potenciál kialakulásának gátlása állhat. A II. fázisban tapasztalt gátló hatásban azonban az oSMF hatására a kapszaicinérzékeny afferensekbe történő csökkent Ca2+-beáramlás és a neurogén gyulladásos reakciót kiváltó szenzoros neuropeptidek csökkent felszabadulása is szerepet játszhat. Ezt a teóriát alátámasztják azon irodalmi adatok, amelyek az SMF Ca2+- és Na+-áramokat gátló és ezeken keresztül a neuronális excitabilitást csökkentő hatásaira vonatkoznak [92,93,134]. A carrageenin intraplantáris adást követően lábduzzadást és mechanikai hiperalgéziát okoz [8]. Ebben a folyamatban számos neurogén és nem-neurogén komponens vesz részt, amelyet gyulladásos neuropeptidek, citokinek és ciklooxigenáz termékek közvetítenek [20,84]. A neurogén komponensek e patomechanizmusban betöltött nem kitüntetett szerepére utal, hogy bár a carrageeninnel kiváltott mechanikai hiperalgézia kisebb volt az RTX-előkezelést kapott állatcsoportban, a különbség nem volt szignifikáns mértékű. Az oSMF ebben a modellben is jelentős mértékben gátolta a gyulladás következtében kialakuló mechanikai hiperalgéziát a kontroll csoportban, azonban szinte hatástalan volt az RTX-előkezelt állatokban. Az oSMF csökentette továbbá a TRPV1 receptor agonista RTX intraplantáris adása következtében kialakuló gyulladásos mechanikai hiperalgéziát. Az RTX proinflammációs neuropeptideket szabadít fel az érintett területen, amelyek lokális neurogén gyulladást és a mechanonociceptív küszöb csökkenését idézik elő az állat talpában. Az SMF jelentősen csökkenti a kapszaicin–érzékeny szenzoros idegvégződésekbe történő kation-áramlást, amely gátolja a szenzoros proinflammatorikus és pronociceptív neuropeptidek felszabadulását. Mindemellett azonban az oSMF centrális szenzitizációt gátló hatása és csökkent szinaptikus transzmisszió sem zárható ki. Kihangsúlyozandó, hogy a 30 percig tartó oSMF-expozíció nem befolyásolta a mozgáskoordinációt és a motoros aktivitást. Mindezekből megállapíthatjuk, hogy az oSMF-expozíció több egérmodellben is jelentős gátló hatást gyakorolt a nociceptív reakciókra. Bár a pontos hatásmechanizmus egyelőre nem ismert, a kapszaicinérzékeny szenzoros idegvégződéseknek fontos szerepük van ezen antinociceptív és antihiperalgéziás hatások közvetítésében, hiszen e rostok inaktivációja után a tapasztalt gátló hatás elmaradt. Ennek hátterében a Ca2+- és Na+-áramok blokkolása állhat, ami az akciós potenciál gátlását, valamint a mitokondriumok elégtelen működését eredményezi [92,93,134].
17
ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 1. A szelektív sst4 szomatosztatin receptor agonista J-2156 segítségével bizonyítékokat szolgáltattunk e receptor fájdalomcsillapító (antiallodiniás/antihiperalgéziás) és gyulladásgátló szerepére különféle egér- és patkánymodellekben. Külön kiemelendő, hogy e vegyület mindkét fajban hatékonyan gátolta a neurogén gyulladást is, amely szerepet játszik sokféle gyulladásos kórkép kialakulásában és súlyosbodásában, és amelyre jelenleg egyetlen hatékony kezelési mód sem áll rendelkezésre. Nagy jelentőséggel bír továbbá, hogy ez az sst4 receptor agonista csökkentette a mechanikai allodiniát traumás neuropátiában, amelyre a klasszikus nem-szteroid és opioid szerkezetű fájdalomcsillapítók hatástalanok. Bár bizonyos neuropátiás fájdalomállapotok kezelésében az utóbbi években egyes antiepileptikumok és antidepresszánsok jelentős előrelépést jelentettek, e kórképek terápiája még mindig nem megoldott probléma. Jelen kísérleteinkkel tehát elsőként sikerült azonosítanunk egy szenzoros idegvégződéseken és gyulladásos sejteken egyaránt expresszálódó célmolekulát, az sst4 receptort, amelyen szelektíven ható, stabil, elsősorban nempeptid szerkezetű agonisták alapvetően új hatásmechanizmusú, széles spektrumú gyulladásgátló és fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztésére nyújthatnak lehetőséget. 2. Jelen eredményeink az elsők a PACAP-38 nociceptív folyamatokra kifejtett perifériás hatásaira vonatkozóan. Bár térdízületben egyrost-elvezetéses elektrofiziológiai vizsgálatok a lokálisan alkalmazott PACAP-38 VIP-hez hasonló szenzitizáló hatását bizonyították, számos, elsősorban gyulladásos egér- és patkánymodellben periférás antinociceptív és antihiperalgéziás hatást tapasztaltunk, amelyeket a VPAC receptorok közvetítenek. Ennek a látszólagos ellentmondásnak magyarázata lehet az a tény, hogy a PACAP receptorainak aktivációja következtében a megnövekedett intracelluláris cAMP-szint neuronokon excitációt okoz ugyan, de gyulladásos sejteken csökkenti a gyulladáskeltő mediátorok, citokinek felszabadulását. Mindezek alapján a nocicepcióra kifejtett eredő gátló hatás nagy valószínűséggel nem az idegvégződéseken megvalósuló direkt hatás eredménye, hanem a gyulladásgátló mechanizmuson alapuló indirekt hatás. Ezen eredmények gyakorlati jelentőségének és a PACAP-ban rejlő gyógyszerfejlesztési perspektíváknak a felderítése még további vizsgálatokat igényel. 3. A dolgozat harmadik részében a farmakológiai megközelítéseken túl egy alternatív fájdalomcsillapító lehetőség, a sztatikus mágneses tér állatkísérletes vizsgálatának eredményeit foglaltam össze. A készülék paramétereinek előzetes optimalizálása után az ezzel előállított oSMF antinociceptív és antihiperalgetikus hatásúnak bizonyult különféle egér nocicepció modellben. A tapasztalt gátló hatás mechanizmusában egyértelműen igazoltuk a kapszaicinérzékeny érzőrostok szerepét. Bár a pontos molekuláris folyamatok felderítése még további vizsgálatokat igényel, valószínűsíthető ezen afferenseken lévő feszültségfüggő ioncsatornák (Na+, Ca2+), esetleg a TRPV1 receptor/kationcsatorna működésének oSMF-kiváltotta gátlása. E mechanizmusokon keresztül az oSMF feltehetően akadályozza az akciós potenciál kialakulását és terjedését, valamint csökkenti a pronociceptív neuropeptidek felszabadulását. A mágneses tér ilyen irányú felhasználása érdekes új irányokat mutathat a fájdalomcsillapító terápiában.
18
[1] Abad C, Gomariz RP, Waschek JA (2006). Current Topics in Medicinal Chemistry 6: 151-163. [2] Amara SG, Jonas V, Rosenfeld MG, Ong ES, Evans RM (1982). Nature 298: 240-244. [3] Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C (1991).Endocrinology 129: 2787–2789. [4] Barnes PJ (2001). Allergy 56: 928-936. [5] Bennett GJ (1993). Muscle & Nerve 16: 1040-1048. [6] Bevan S, Szolcsányi J (1990). Trends in Pharmacological Sciences 11: 330-333. [7] Bölcskei K, Horváth D, Szolcsányi J, Pethő G (2007). European Journal of Pharmacology 564: 80-87. [8] Bölcskei K, Helyes Zs, Szabó Á, Sándor K, Pethő G, Elekes K, Almási R, Pintér E, Szolcsányi J (2005). Pain 117: 368376. [9] Brazeau P (1986). American Journal of Medicine 81: 8-13. [10] Cao T, Pintér E, Al-Rashed S, Gerard NP, Hoult R, Brain S (2000). Journal of Immunology 164: 5424-5429. [11] Cao T, Gerard NP, Brain SD (1999). American Journal of Physiology 277: 476-481. [12] Choleris E, Del Seppia C, Thomas AW, Luschi P, Ghione S, Moran GR, Prato FS (2002). Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences 269: 193-201. [13] Delgado M, Leceta J, Ganea D (2003). Journal of Leukocyte Biology 73: 155-164. [14] Delgado M, Munoz-Elias EJ, Gomariz RP, Ganea D (1999a). Journal of Immunology 162: 1707-1716. [15] Delgado M, Munoz-Elias EJ, Gomariz RP, Ganea D (1999b). Journal of Immunology 162: 4685-4696. [16] Del Seppia C, Mezzasalma L, Choleris E, Luschi P, Ghione S (2003). Behavioural Brain Research 144: 1-9. [17] de Swert KO, Joos GF (2006). European Journal of Pharmacology 533: 171-181. [18] Dickinson T, Fleetwood-Walker SM (1999).Trends in Pharmacological Sciences 20: 324-329. [19] Dickinson T, Mitchell R, Robberecht P, Fleetwood-Walker SM (1999). Neuropharmacology 38: 167-180. [20] Doi Y, Minami T, Nishizawa M, Mabuchi T, Mori H, Ito S (2002). Neuroreport 13: 93-96. [21] Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996). Brain Research 721: 233–237. [22] Eckhardt ET, Cheplovitz F, Lipo N, Govier WM (1958). Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 98: 186-188. [23] Edvinsson L, Fredholm BB, Hamel E, Jansen I, Verrecchia C (1985). Neuroscience Letters 58: 213-217. [24] Engström M, Savola JM, Würster S (2006). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316: 1262-1268. [25] Engström M, Tomperi J, El Darwish K, Ahman M, Savola JM, Würster S (2005). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 312: 332-338. [26] Fahrenkrug J, Hannibal J (1998). Neuroscience 83: 1261-1272. [27] Frossard N, Advenier C (1991). Life Sciences 49: 1941-1953. [28] Gottschall PE, Tatsuno I, Miyata A, Arimura A (1990). Endocrinology 127: 272-277. [29] Grant A (2002). Inflammopharmacology 9: 403-420. [30] Gyires K, Torma Z (1984). Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie 267: 131-140. [31] Hamelink C, Tjurmina O, Damadzic R, Young WS, Weihe E, Lee HW, Eiden LE (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 461-466. [32] Han SP, Naes L, Westfall TC (1990). Calcitonin gene-related peptide is the endogenous mediator of nonadrenergicnoncholinergic vasodilation in rat mesentery. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 255: 423-428. [33] Hannibal J, Ekblad E, Mulder H, Sundler F, Fahrenkrug J (1998). Cell and Tissue Research 291: 65–79. [34] Harmar AJ, Arimura A, Gozes I, Journot L, Laburthe M, Pisegna JR, Rawlings SR, Robberecht P, Said SI, Sreedharan SP, Wank SA, Waschek JA (1998). Pharmacological Reviews 50: 265–270. [35] Helyes Zs, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, Márk L, Pintér E, Tóth G, Elekes K, Szolcsányi J, Reglődi D (2007). Peptides 28: 1847-1855. [36] Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Sándor K, Elekes K, Szabó Á, Pozsgai G, Keszthelyi D, Kereskai L, Engström M, Würster S, Szolcsányi J (2006). British Journal of Pharmacology 149: 405-415. [37] Helyes Zs, Pintér E, Szolcsányi J (2005). Drugs of the Future 30: 1-9. [38] Helyes Zs, Szabó Á, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi Á, Kereskai L, Kéri Gy, Szolcsányi J (2004). Arthritis & Rheumatism 50: 1677-1685. [39] Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J (2003). Current Medicinal Chemistry 2: 191-218. [40] Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Than M, Oroszi G, Horváth A, Szolcsányi J (2001). British Journal of Pharmacology 134: 1572-1579. [41] Helyes Zs, Than M, Oroszi G, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Szolcsányi J (2000). Neuroscience Letters 278: 185-188. [42] Hofland LJ, Lamberts SW (1996). Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism 10: 163-176. [43] Hong CZ, Shellock FG (1990). Magnetic Resonance Imaging 8: 65-69. [44] Houpt TA, Pittmann DW, Barranco JM, Brooks Eh, Smith JC (2003). Journal of Neurosciences 23: 1489-1505. [45] Hoyer D, Bell GI, Berelowitz M, Epelbaum J, Feniuk W, Humphrey PP, O'Carroll AM, Patel YC, Schonbrunn A, Taylor JE (1995). Trends in Pharmacological Sciences 16: 86-88. [46] Hughes SR, Brain SD (1994). British Journal of Pharmacology 111: 425-430. [47] Jones BJ, Roberts DJ (1968). Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie & Pharmakologie 259: 211. [48] Kavaliers M, Ossenkopp KP (1994). Biological effects of electric and magnetic fields. Sources and mechanisms 205240. Editors: Carpenter DO, Ayrapetyan S. Academic Press, New York.
19
[49] Kavaliers M, Ossenkopp KP, Hirst M (1984). Physiology & Behavior 32: 261-264. [50] Kim SH, Chung JM (1992). Pain 50: 355-363. [51] Kojima M, Ito T, Oono T, Hisano T, Igarashi H, Arita Y, Kawabe K, Coy DH, Jensen RT, Nawata H (2005). Pancreas 30: 62-70. [52] Koster R, Anderson M, de Beer EJ (1959). Federation Proceedings 18: 412. [53] Kuehl FA Jr, Zanetti ME, Soderman DD, Miller DK, Ham EA (1987). American Review of Respiratory Disease 36: 210213. [54] Laburthe M, Couvineau A, Tan V (2007). Peptides 28: 1631-1639. [55] Lam HC, Takahashi K, Ghatei MA, Kanze SM, Polak JM, Bloom SR (1990). European Journal of Biochemistry 193: 725–729. [56] László J, Reiczigel J, Székely L, Gasparics A, Bogár I, Bors L, Rácz B, Gyires K (2007). Bioelectromagnetics 28: 615627. [57] Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW (2001). Pharmacological Reviews 53: 597-652. [58] Leceta J, Gomariz RP, Martinez C, Abad C, Ganea D, Delgado M (2000). Annals of the New York Academy of Sciences 921: 92-102. [59] Lockwood DR, Kwon B, Smith JC, Haupt TA (2003). Physiology & Behavior 78: 635-640. [60] Maggi CA (1995). Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Progress in Neurobiology 45: 1-98. [61] Maggi CA, Meli A (1988). General Pharmacology: The Vascular System 19: 1-43. [62] Martinez C, Abad C, Delgado M, Arranz A, Juarranz MG, Rodriguez-Henche N, Brabet P, Leceta J, Gomariz RP (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 1053-1058. [63] Massi M, Panocka I, de Garo G (2000). Peptides 21: 1597-1609. [64] May V, Beaudet MM, Parsons RL, Braas KM (2000). Annals of the New York Academy of Sciences 921: 186-194. [65] McDougall JJ, Barin AK (2005). British Journal of Pharmacology 145: 104-113. [66] McLatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown J, Thompson N, Solari R, Lee MG, Foord SM (1998). Nature 393: 333-339. [67] Mikkelsen JD, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen PJ, Olcese J, McArdle C (1995). Journal of Neuroendocrinology 7: 47– 55. [68] Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH (1989). Biochemical and Biophysical Research Communications 164: 567-574. [69] Moller K, Zhang YZ, Hakanson R, Luts A, Sjölund B, Uddman R, Sundler F (1993). Neuroscience 57: 725–732. [70] Mulder H, Uddman R, Moller K, Zhang YZ, Ekblad E, Alumets J, Sundler F (1994). Neuroscience 63: 307–312. [71] Muller JM, Debaigt C, Coursaud S, Montoni A, Pineau N, Meunier AC, Janet T (2007).Peptides 28: 1655-1666. [72] Németh J, Reglődi D, Pozsgai G, Szabó Á, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs (2006). Neuroscience 143: 223230. [73] Njuki F, Nicholl CG, Howard A, Mak JC, Barnes PJ, Girgis SI, Legon S (1993). Clinical Science (London, England 1979) 85: 385-388. [74] Nolte CM, Pittmann DW, Kalevitch B, Henderson R, Smith JC (1998). Physiology & Behavior 63: 683-688. [75] Odum L, Petersen LJ, Skov PS, Ebskov LB (1998). Inflammation Research 47: 488–492. [76] Ohsawa M, Brailoiu GC, Shiraki M, Dun NJ, Paul K, Tseng LF (2002). Pain 100: 27-34. [77] Onou T, Shimizu T, Sakamoto H, Higashi M, Kanmura Y, Miyata A (2007). Journal of Molecular Neuroscience 33: 339. [78] Parsons RL, Rossignol TM, Calupca MA, Hardwick JC, Brass KM (2000). Annals of the New York Academy of Sciences 921: 202-210. [79] Parsons JA, Erlandsen SL, Hegre OD, McEvoy RC, Elde RP (1976). Journal of Histochemistry and Cytochemistry 24: 872-882. [80] Patacchini R, Maggi CA (2001). European Journal of Pharmacology 429: 13-21. [81] Patel YC, Greenwood MT, Panetta R, Demchyshyn L, Niznik H, Srikant CB (1995). Life Sciences 57: 1249-1265. [82] Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J (2006). Pharmacology & Therapeutics 112: 440-456. [83] Pintér E, Helyes Zs, Németh J, Pórszász R, Pethő G, Than M, Kéri Gy, Horváth A, Jakab B, Szolcsányi J (2002). Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 366: 142-150. [84] Poole S, Cunha FQ, Selkirk S, Lorenzetti BB, Ferreira SH (1995). British Journal of Pharmacology 115: 684-688. [85] Poyner DR, Sexton PM, Marshall I, Smith DM, Quirion R, Born W, Muff R, Fischer JA, Foord SM (2002). Pharmacological Reviews 54: 233-246. [86] Prato FS, Robertson JA, Desjardins D, Hensel J, Thomas AW (2005). Bioelectromagnetics 26: 109-117. [87] Raynor K, Reisine T (1992). Critical Reviews in Neurobiology 6: 273-289. [88] Reeser JC, Smith DT, Fischer V, Berg R, Liu K, Untiedt C, Kubista M (2005). Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 86: 565-570. [89] Regoli D, Boudon A, Fauchere JL (1994). Pharmacological Reviews 46: 551-599. [90] Reichlin S (1983). New England Journal of Medicine 309: 1495-1501. [91] Reubi JC, Laissue JA, Waser B, Steffen DL, Hipkin W, Schonbrunn A (1999). Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 84: 2942-2950.
20
[92] Rosen AD (2003). Cell Biochemistry and Biophysics 39: 163-173. [93] Rosen AD (1996). Biochimica et Biophysica Acta 1148: 149-155. [94] Saunders R (2005). Progress in Biophysics & Molecular Biology 87: 225-239. [95] Segre GV, Goldring SR (1993). Trends in Endocrinology and Metabolism 4: 309–314. [96] Seltzer Z, Dubner R, Shir Y (1990). Pain 43: 205-218. [97] Sherwood NM, Krueckl SL, McRory JE (2000). Endocrine Reviews 21: 619-670. [98] Shimizu T, Katahira M, Sugawara H, Inoue K, Miyata A (2004). Regulatory Peptides 123: 117-122. [99] Shioda S, Nakai Y, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1996). Annals of the New York Academy of Sciences 805: 677– 683. [100] Shioda S, Legradi G, Leung WC, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1994). Endocrinology 135: 818–825. [101] Shupak NM, Hensel JM, Cross-Mellor SK, Kavaliers M, Prato FS, Thomas AW (2004). Neuroscience Letters 354: 3033. [102] Skofitsch G, Donnerer J, Petronijevic S, Saria A, Lembeck F (1983). Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 322: 153-157. [103] Snyder DJ, Jahng JW, Smith JC, Houpt TA (2000). Neuroreport 11: 2681-2685. [104] Somogyvári-Vígh A, Reglődi D (2004). Current Pharmaceutical Design 10: 2861-2889. [105] Spengler D, Waeber C, Pantaloni C, Holsboer F, Bockaert J, Seeburg PH, Journot L (1993). Nature 365: 170-175. [106] Suda K, Smith DM, Ghatei MA, Bloom SR (1992). Investigation of the interaction of VIP binding sites with VIP and PACAP in human brain. Neuroscience Letters 137: 19–23. [107] Szállási Á, Cruz F, Gepetti P (2006). Trends in Molecular Medicine 12: 545-554. [108] Szállási Á, Joó F, Blumberg PM (1989). Brain Research 503: 68-72. [109] Szolcsányi J (2004). Neuropeptides 38: 377-384. [110] Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs (2004). Hyperalgesia: molecular mechanisms and clinical implications 113-128. Editors: Handwerker HO, Brune K. IASP Press, Seattle. [111] Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E (1998a). British Journal of Pharmacology 123: 936-942. [112] Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J (1998b). British Journal of Pharmacology 125: 916-922. [113] Szolcsányi J (1993). Capsaicin in the study of pain 1-26. Editor: Wood JN. Academic Press London. [114] Szolcsányi J (1996). Progress in Brain Research 113: 343-359. [115] Szolcsányi J (1988). Agents and Actions 23: 4-11. [116] Szolcsányi J (1984). Antidromic Vasodilation and Neurogenic Inflammation 27-53. Editors: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F. Akadémiai Kiadó, Budapest. [117] Taiwo YO, Heller PH, Levine JD (1992). Neuroscience 48: 479-483. [118] Taiwo YO, Levine JD (1991). Neuroscience 44: 131-135. [119] Tajti J, Vécsei L (2006). Magyar Tudomány 167: 1191-1196. [120] Takeba Y, Suzuki N, Kaneko A, Asai T, Sakane T (1999). Arthritis & Rheumatism 42: 2418-2429. [121] Tatsuno I, Gottschall PE, Köves K, Arimura A (1990). Biochemical and Biophysical Research Communications 168: 1027–1033. [122] ten Bokum AM, Hofland LJ, van Hagen PM (2000). European Cytokine Network 11: 161-176. [123] Tjolsen A, Berge OG, Hunskaar S, Rosland JH, Hole K (1992). Pain 51: 5-17. [124] van Rossum D, Hanisch U, Quirion R (1997). Neuroscience and Biobehavioral Reviews 21: 649-678. [125] Uddman R, Grunditz T, Kato J, Sundler F (1998). Anatomy and Embryology 197: 273-282. [126] Vaudry D, Pamantung TF, Basille M, Rouselle C, Fournier A, Vaudry H, Beauvillain JC, Gonzalez BJ (2002). European Journal of Neuroscience 15: 1451-1460. [127] Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H (2000). Pharmacological Reviews 52: 269-324. [128] Vécsei L, Widerlöv E (1988). Acta Psychiatrica Scandinavica 78: 657-667. [129] Vígh S, Arimura A, Gottschall PE, Kitada C, Somogyvári-Vígh A, Childs GV (1993). Peptides 14: 59–65. [130] Watson GS, Sufka KJ, Coderre TJ (1997). Pain 70: 53-58. [131] Weckbecker G, Lewis I, Albert R, Schmid HA, Hoyer D, Bruns C (2003). Nature Reviews, Drug Discovery 2: 999-1017. [132] Weinberg A, Halpern M, Zahalka MA, Quintana F, Traub L, Moroz C (2003). Arthritis & Rheumatism 48: 846-853. [133] Weston MC, Peachell PT (1998). General Pharmacology 31: 715-719. [134] Wieraszko A (2000). Bioelectromagnetics 21: 175-182. [135] Witkin LB, Heuter CF, Galdi F, O’Keefe E, Spitaletta P, Plummer AJ (1961). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 133: 400-408. [136] Wray V, Kokoschke C, Nokihara K, Naruse S (1993). Biochemistry 32: 5832–5841. [137] Yamamoto T, Tatsuno I (1995). Neuroscience Letters 184: 32-35. [138] Zhang Y, Danielsen N, Sundler F, Mulder H (1998). Neuroreport 9: 2833-2836. [139] Zhang Y, Malmberg AB, Sjolund B, Yaksh TL (1996). Neuroscience Letters 207: 187-190. [140] Zhang Y, Sjolund B, Moller K, Hakanson R, Sundler F (1993). Neuroscience 57: 733-737. [141] Zheng YQ, Wei W, Dai M, Zhu L, Jia XY, Wang Y (2006). Acta Pharmacologica Sinica 27: 111-118. [142] Zhou CJ, Shioda S, Yada T, Inagaki N, Pleasure SJ, Kikuyama S (2002). Current Protein & Peptide Science 3: 423439.
21
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Würster S., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Analgesic effects of the somatostatin sst4 receptor selective agonist J-2156 in acute and chronic pain models. European Journal of Pharmacology 539(1-2): 71-75. 2006 (IF: 2.522. SCI: 4) Helyes Zs., Pintér E., Németh J., Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pozsgai G., Keszthelyi D., Kereskai L., Engström M., Würster S., Szolcsányi J.: Effects of the somatostatin receptor subtype 4 selective agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and inflammatory reactions in rodents. British Journal of Pharmacology 149(4): 405-415. 2006 (IF: 3.825, SCI: 6) Sándor K., Helyes Zs., Gyires K., Szolcsányi J., László J.: Static magnetic field-induced anti-nociceptive effect and the involvement of capsaicin-sensitive sensory nerves in this mechanism. Life Sciences 81(2): 97-102. 2007 (IF: 2.257) Sándor K., Bölcskei K., McDougall J.J., Schuelert N., Reglődi D., Elekes K., Pethő G., Pintér E., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Divergent peripheral effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on nociception in rats and mice. Pain, közlésre visszaküldve
EGYÉB EREDETI KÖZLEMÉNYEK 1. Szabó Á., Helyes Zs., Sándor K., Bite A., Pintér E., Németh J., Bánvölgyi Á., Bölcskei K., Elekes K., Szolcsányi J.: Role of TRPV1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 314(1): 111-119. 2005 (IF: 4.098, SCI: 12) 2. Bölcskei K., Helyes Zs., Szabó Á., Sándor K., Pethő G., Elekes K., Almási R., Pintér E., Szolcsányi J.: Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-deficient mice. Pain 117(3): 368-376. 2005 (IF: 4.309, SCI: 18) 3. Jakab B., Helyes Zs., Varga A., Bölcskei K., Szabó Á., Sándor K., Elekes K., Börzsei R., Pintér E., Pethő G., Németh J., Szolcsányi J.: Examination of the novel TRPV1 receptor antagonist JYL1421 (SC0030) in vitro and in vivo in the rat. European Journal of Pharmacology 517(1-2): 35-44. 2005 (IF: 2.477, SCI: 9) 4. Bellis E., Hajba L., Kovács B., Sándor K., Kollár L., Kokotos G.: Three generations of alpha,gamma-diaminobutyric acid modified poly(propyleneimine) dendrimers and their cisplatin-type platinum complexes. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 69(1-2): 151-161. 2006 (IF: 1.403, SCI: 1) 5. Helyes Zs., Elekes K., Németh J., Pozsgai G., Sándor K., Kereskai L., Börzsei R., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in endotoxin-induced airway inflammation in the mouse. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology 292(5): 1173-1181. 2007 (IF: 4.25, SCI: 3) 6. Elekes K., Helyes Zs., Németh J., Sándor K., Pozsgai G., Kereskai L., Börzsei R., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-induced airway inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse. Regulatory Peptides 141(1-3): 44-54. 2007 (IF: 2.422, SCI: 2) 7. Pozsgai G., Sándor K., Perkecz A., Szolcsányi Zs., Helyes Zs., S.D. Brain, Pintér E.: Topical acetone treatment induces neurogenic oedema on the sensitized mouse ear: an in vivo study using transient receptor potencial vanilloid 1 (TRPV1) receptor knockout mice. Inflammation Research 56: 459-467. 2007 (IF: 1.504) 8. Elekes K., Helyes Zs., Kereskai L., Sándor K., Pintér E., Pozsgai G., Tékus V., Bánvölgyi Á., Németh J., Szűts T., Kéri Gy., Szolcsányi J.: Inhibitory effects of synthetic somatostatin receptor subtype 4 agonists on acute and chronic airway inflammation and hyperreactivity in the mouse. European Journal of Pharmacology 578(2-3): 313-322. 2008 (IF: 2.376, SCI: 1)
22
NEMZETKÖZI KONGRESSZUSON BEMUTATOTT PREZENTÁCIÓK LISTÁJA 1. Pozsgai G., Helyes Zs., Szabó Á., Keszthelyi D., Németh J., Elekes K., Sándor K., Szolcsányi J., Pintér E.: Pharmacological investigation of a selective non-peptide somatostatin receptor type 4 agonist in vitro and in vivo. European Neuropeptide Club, 15th Annual Meeting, Riga, Lettország, 2005 (absztrakt: Neuropeptides 39(6), p.619., 2005. (IF: 2.15)) 2. Pintér E., Helyes Zs., Pozsgai G., Szabó Á., Keszthelyi D., Németh J., Elekes K., Sándor K., Szolcsányi J.: Characterization of anti-inflmmatory actions of a novel selective non-peptide somatostatin 4 receptor agonist in rodents. Summer Neuropeptide Conference, Miami Beach, Florida, USA, 2005 (absztrakt: Neuropeptides 40(2), p.156., 2005. (IF: 2.81)) 3. Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Inhibitory effect of the selective sst4 receptor agonist J-2156 on nocifensive behaviour in acute and chronic pain models of mice and rats. The 15th World Congress of Pharmacology, Beijing, China, 2006 (absztrakt:Acta Pharmacologica Sinica, 27(suppl 1), p.111., 2006. (IF: 1.12), SCI: 1) 4. Pintér E., Helyes Zs., Németh J., Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pozsgai G., Engström M., Würster S., Keszthelyi D., Szolcsányi J.: Anti-inflammatory effect of somatostatin receptor subtype 4 selective agonist J-2156 in rodents. The 15th World Congress of Pharmacology, Beijing, China, 2006 (absztrakt: Acta Pharmacologica Sinica 27(suppl 1), p.277., 2006. (IF: 1.12)) 5. Sándor K., Bölcskei K., Elekes K., Pintér E., Pethő G., Reglődi D. Szolcsányi J.,Helyes Zs.: Peripheral anti-nociceptive effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 in rats and mice. European Neuropeptide Club, 17th Annual Meeting, Santorini, Görögország, 2007 6. Pintér E., Sándor K., Helyes Zs., Pozsgai G., Szolcsányi J.: Somatostatin 4 (sst4) receptor mediates inhibitory effects on carrageenan-induced paw inflammation in rodents. European Neuropeptide Club, 17th Annual Meeting, Santorini, Görögország, 2007 7. Helyes Zs., Elekes K., Pozsgai G., Sándor K., Keszthelyi D., Kereskai L., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: Protective role of the somatostatin receptor subtype 4 (sst4) in endotoxin-induced airway inflammation: in vivo studies on gene-deficient mice. Second International Congress on Immune-Mediate Diseases: from Theory to Therapy, Moszkva, Oroszország, 2007 (absztrakt: Allergology and Immunology in Pediatrics 11 (suppl. 2), p.25., 2007) 8. Reglődi D., Németh J., Pozsgai G., Sándor K., Börzsei R., Bagoly T., Elekes K., Pintér E., Kiss P., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Effect of PACAP-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. 7th International Conference of Neuroimmunology, Rio de Janeiro, Brazilia, 2008
HAZAI KONGRESSZUSON BEMUTATOTT PREZENTÁCIÓK LISTÁJA 1. Helyes Zs., Szabó Á., Németh J., Jakab B., Bite A., Sándor K., Pintér E., Bánvölgyi Á., Szolcsányi J.: Kapszaicinérzékeny szenzoros idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin gyulladásgátló és fájdalomcsillapító hatása krónikus ízületi gyulladásos patkánymodellben. Magyar Élettani Társaság LXVIII. Vándorgyűlése, Pécs, 2004 2. Elekes K., Helyes Zs., Sándor K., Beck A., Kereskai L., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, hatásának vizsgálata szubakut légúti gyulladásos egérmodellben. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság IV. Konferenciája, Debrecen, 2004 3. Helyes Zs., Németh J., Elekes K., Keszthelyi D., Pozsgai G., Szabó Á., Sándor K., Pintér E., Szolcsányi J.: A szelektív szomatosztatin 4 (sstr4) agonista KD5621 farmakológiai vizsgálata in vitro és in vivo . Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Pécs, 2005 Poszterdíj 4. Pozsgai G., Helyes Zs., Szabó Á., Keszthelyi D., Németh J., Elekes K., Sándor K., Szolcsányi J., Pintér E.: Investigation of a selective non-peptide somatostatin receptor type 4 agonist in different inflammatory models. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság, a Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005 5. Elekes K., Helyes Zs., Sándor K., Bölcskei K., Almási R., Pozsgai G., Pintér E., Keszthelyi D., Szabó Á., Szolcsányi J.: A szelektív szomatosztatin 4 receptor (sst4) agonista J-2156 hatásának vizsgálata állatkísérletes fájdalommodellekben. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Siófok, 2005
23
6. Helyes Zs., Sándor K., Pintér E., Szabó Á., Elekes K., Keszthelyi D., Pozsgai G., Kereskai L., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J.: A szelektív szomatosztatin 4 receptor (sst4) agonista J-2156 gyulladásgátló és antinociceptív hatásának vizsgálata akut és krónikus gyulladásmodellekben . Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság V. Konferenciája, Debrecen, 2005 7. Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Az sst4 receptor szelektív agonista j-2156 hatásainak vizsgálata krónikus gyulladás és neuropáthia modellekben. A Magyar Farmakológiai Társaság Experimentális Szekciójának II. vándorgyűlése, Pécs, 2006 8. Helyes Zs., Pintér E., Németh J., Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pozsgai G., Keszthelyi D., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J.: Effects of the novel selective non-peptide somatostatin sst4 receptor agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and acute inflammatory reactions. A Magyar Farmakológiai Társaság Experimentális Szekciójának II. vándorgyűlése, Pécs, 2006 9. Sándor K., Bölcskei K., Elekes K., Pintér E., Pethő G., Reglődi D, Szolcsányi J., Helyes Zs.: Peripheral anti-nociceptive effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 in rats and mice. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Gyula, 2006 10. Helyes Zs., Pintér E., Sándor K., Pozsgai G., Szolcsányi J.: A szomatosztatin 4 receptor (sst4) gátló szerepe rágcsálókban carrageeninnel kiváltott gyulladásmodellekben. A Magyar Experimentális Farmakológia III. Szimpóziuma, Budapest, 2007 11. Helyes Zs., Sándor K., Elekes K., Bánvölgyi Á., Markovics A., Pintér E., Szolcsányi J.: A szomatosztatin sst4 receptor szerepének vizsgálata akut és krónikus gyulladásmodellekben egérben. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság és a Magyar Élettani Társaság LXXII. Vándorgyűlése Debrecen, 2008 (absztrakt: Acta Physiologica Hungarica)
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet mindazoknak, akik segítették a munkámat. Elsősorban köszönöm Dr. Helyes Zsuzsannának, témavezetőmnek, hogy bevezetett a kutatómunka világába, példát mutatva szakmai ismeretből, szorgalomból, fáradhatatlan lelkesedésből és lankadatlan optimizmusból. Köszönöm Dr. Pintér Erikának, hogy számos szakmai tanáccsal és baráti gesztussal járult hozzá kutatómunkám eredményességéhez. Köszönöm Dr. Szolcsányi János professzornak, a Neurofarmakológia program vezetőjének, hogy a képzésben részt vehettem, és hogy rendkívül jó szakmai észrevételeivel mindig megmutatta a helyes irányt. Köszönöm Dr. Barthó Loránd professzornak, a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet vezetőjének, hogy PhD-kutatóként az intézetben dolgozhattam. Külön köszönöm Perkecz Anikónak, aki évekig hűséges „padtársam” volt, elviselve ennek minden velejáróját, hogy baráti hozzáállásával és kíváló metszeteivel mindvégig segítette munkámat. Köszönöm Dr. Bölcskei Katának, aki tudományos szemléletével és a kísérletes munkában való jártasságával követendő példát mutatott, hogy bármikor fordulhattam hozzá segítségért, tanácsért. Köszönöm a kísérletes munkában nyújtott nélkülözhetetlen segítséget Góglné Katinak, Zádor Csillának, Ömböliné Dórinak, Zöldhegyi Máriának, Tékus Valériának, Dr. Pozsgai Gábornak, Dr. Elekes Krisztiánnak, Tóth Dánielnek, továbbá a diákkörösöknek: Markovics Adriennek, Borbély Évának, Keszthelyi Dánielnek. Köszönöm Dr. Bánvölgyi Ágnesnek a kiváló minőségű fotók elkészítését. Köszönöm az Immunológiai és Biotechnológiai Intézet munkatársainak, hogy hasznos útmutatást és elengedhetetlen segítséget nyújtottak az in vitro kísérletek beállításában. Köszönöm Dr. Kereskai Lászlónak a szövettani metszetek értékelését. Köszönöm Dr. László Jánosnak a sztatikus mágneses térrel kapcsolatos kooperációt. Köszönöm Dr. Reglődi Dórának a PACAP-al kapcsolatos kísérletekben nyújtott szakmai segítséget. Köszönöm Dr. Jason J. McDougall PACAP-os témakörben végzett kiegészítő kísérleteit. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családomnak, hogy szeretetükkel, türelmükkel, megértésükkel és töretlen bizalmukkal mindvégig támogattak.
24
INTRODUCTION, BACKGROUND OF THE RESEARCH The triple action of capsaicin-sensitive nociceptive nerve terminals Capsaicin-sensitive, Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1)-expressing sensory nerve terminals exert three actions: afferent, local and systemic efferent functions. The classical afferent activity is transmission of nociceptive information into the central nervous system, which leads to pain sensation. Besides this process, pro-inflammatory sensory neuropeptides, such as calcitonin generelated peptide (CGRP) and tachykinins (substance P: SP and neurokinin A: NKA) are released from these activated nerve endings, which induce vasodilation and plasma protein extravasation collectively called neurogenic inflammation in the innervated area. Furthermore, these sensory neuropeptides modulate inflammatory and immune cells [39,61,115,116]. These pro-inflammatory actions refer to the local efferent function of capsaicin-sensitive afferents. The neurogenic inflammatory component plays an important role in the pathological mechanism of several diseases, e.g. rheumatoid arthritis, asthma, psoriasis, ekzema, allergic contact dermatitis and inflammatory bowel diseases [60,114]. The presently available anti-inflammatory drugs are not able to inhibit the neurogenic processes of these inflammatory reactions, their pharmacotherapy is still not satisfactory [39]. The third, systemic efferent function of capsaicin-sensitive sensory nerves was discovered about 10 years ago in our research group. Several lines of evidence have been provided that besides the locally liberated pro-inflammatory neuropeptides, somatostatin is also released from the activated afferents, reaches the circulation and exerts systemic anti-inflammatory and analgesic actions [38,41,111,112]. This endogenous counter-regulatory mechanism of sensory nerve-derived somatostatin has been defined as its „sensocrine function” parallel to its well-known endocrine and paracrine actions [110]. Sensory neuropeptides 1. Pro-inflammatory and pro-nociceptive neuropeptides One group of pro-inflammatory sensory neuropeptides released from stimulated capsaicin-sensititve sensory neurons is called tachykinins, which includes substance P, neurokinin A and neurokinin B (NKB). They exert their effects via G protein-coupled neurokinin receptors, namely NK1, NK2, NK3. SP enhances vascular permeability via NK1 receptors mainly expressed on postcapillary venules, machrophages, limphocytes, polymorphonuclear and mast cells [11,80,89], which results in plasma protein extravasation, T cell proliferation, chemotaxis, activation of mast cells or neutrophil accumulation [29]. NKA induces smooth muscle contraction, plasma protein extravasation and stimulation of inflammatory cells (neutrophils, lymphocytes, macrophages) through NK2 receptor activation [17] in the periphery and the central nervous system. NKB binds to NK3 receptors, which is mainly present in the central nervous system and in some peripheral organs [27,63]. The 37 amino acid-containing CGRP was discovered by Amara and co-workers [2]. It exists in two variant forms, αCGRP and βCGRP both acting on Gs protein-coupled receptors called CGRP1 and CGRP2 [66,73,124]. CGRP belongs to the calcitonin/CGRP peptide family, other members of which are calcitonin, islet amyloid polypeptide and adrenomedullin [85]. They posess strong vasodilator effect mainly via CGRP1 receptor activation. Possible mechanism of CGRP-evoked vasodilation is activation of ATP-sensitive potassium channels by the protein kinase A, which is activated by the increased amount of intracellular cyclic AMP. This mechanism leads to relaxation of vascular smooth muscle cells [23,32,46]. Although CGRP itself does not induce directly vascular permeability, but potentiates the action of SP which makes this peptide important in the development of neurogenic inflammation [10]. Moreover, it has complex immuno-modulatory function, CGRP inhibits the secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-12) by macrophages, but facilitates the production of the anti-inflammatory IL-10 and enhances the granulocyte accumulation [4].
1
2. Anti-inflammatory and anti-nociceptive neuropeptides Somatostatin, also known as growth hormone (GH) or somatotropine release inhibitory factor (SRIF) is a 14 or 28 amino acid-containing cyclic peptide [9]. Somatostatin is widely distributed in the central and peripheral nervous systems [79,90], the a gastrointestinal tract, the pancreas, the lung, the adrenal and tyroid glands, inflammatory cells and gonads [42,91,122]. It inhibits the secretion of several hormons, the motility of the gastrointestinal tract, gastric/bowel juice secretion and the proliferation of tumor cells. Somatostatin modulates cognitive functions, its importance is proved in several neurological and psychiatric diseases [128]. Somatostatin exerts its physiological effects via Gi protein-coupled receptors. Five human somatostatin receptors have been cloned in mice, rats and humans, which are called sst1, sst2, sst3, sst4 és sst5 [81]. These five receptors can be divided into two different subgroups: the SRIF1 group comprises of sst2, sst3 and sst5, whereas the SRIF2 group contains sst1 and sst4 [45,82]. The endocrine functions are mediated via receptors of the SRIF1 group [87]. The anti-nociceptive and anti-inflammatory effects are related to the other group, SRIF2, which our research group focuses on [40,82,83,110]. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) was originally isolated from ovine hypothalamus [68]. PACAP is a member of the vasoactive intestinal peptide (VIP)/secretin/glucagon peptide family and exists in two forms: the 27 amino acid-containing PACAP-27 and the 38 amino acidcontaining PACAP-38, which is predominant in mammals [95,97,136]. Highest concentrations can be found in the hypothalamus and in the gonads [3, 99,100], but it is also expressed in other areas of the central nervous system, in sensory neurons of dorsal root ganglia [21,70,78], in endocrine glands [67,129], in the gastrointestinal tract [33], in the respiratory tract [69], and in the skin [75]. PACAP-38 has diverse actions in the central and peripheral nervous systems and also in peripheral tissues: it is reported to regulate cell proliferation and to promote apoptosis in tumor cells [126]. PACAP modulates the release of neurotransmitters [64], evokes vaso- or bronchodilation, enhances the gastrointestinal motility, increases hormone concentrations in the blood [31]. Two types of PACAP binding sites were evidenced in different tissues. Type I binding sites have high affinity for PACAP-38 and PACAP-27, but low affinity for VIP [28,55,106]. Type II binding sites have similar affinity for PACAP and VIP [121,127], in this group there are two subtypes based on the binding affinity to secretin. These receptors have been cloned and they are now called PAC1 and VPAC1/VPAC2, respectively [34]. Pain, nociception, hyperalgesia, allodynia According to the definition of the International Association for the Study of Pain nociceptive pain is a psycho-physiological phenomenon, a subjective sensory quality, which can be divided into two welldefined components. Its neurobiological component is nociception (perception of painful stimuli, sensory experience), which can be examined in animal experiments, while the affective component (emotional experience of the pain) can be evaluated only in humans. Nociception appropriate for examination in animal experiments is produced in response to mechanical (touch), thermal (heat) or chemical (capsaicin, formalin, acetic acid, etc.) stimuli. Acetic acid-, MgSO4- or phenylquinone-induced writhing test in the mouse is appropriate to study visceral pain originating from interoceptive areas (internal organs, pleura, peritoneum, pericardium). Somatic pain derived from cutaneous afferents can be examined with the formalin test both in rats and mice. Increased sensitivity in response to otherwise non-painful stimuli is determined as allodynia, while enhanced pain reaction induced by mild noxious stimuli is called hyperalgesia. Both mechanical and thermal allodynia as well as hyperalgesia can occur in inflammatory conditions, peripheral neuropathy of different origin (traumatic, toxic) or after neural damage on any level of the spino-thalamo-cortical system [119]. Partial tight ligation of the sciatic nerve [96], loose ligation of the whole nerve [5] or ligation of the L5 spinal nerve [50] serve as commonly used animal models for peripheral traumatic neuropathy.
2
Need for the development of novel analgesics and anti-inflammatory drugs Since only nociception can be studied in internationally accepted animal models of pain with the welldefined experimental techniques, determining the effect of novel analgesic drug candidates in the preclinical phase of drug development is not an easy task. The treatment of neuropathic pain is still an unresolved problem, the presently available drug groups (anti-epileptics, opiates, anti-depressants, lidocaine) do not provide satisfactory relief in most cases. The number needed to treat (NNT) value which shows the number of patients required to be treated with certain drugs so that 50% pain-relief could be achieved in the first one is used for comparison of the effect of these drugs [119]. The classical non-steroidal anti-inflammatory/analgesic drugs all act by inhibiting the cyclooxygenase enzyme and decrease prostaglandin synthesis. Although they have been used in the clinical practice for centuries, they are unable to affect neuropathic pain and the neurogenic components of the inflammatory processes. Opioids, which are very effective in cancer pain, can only be considered as second or third line drugs in certain neuropathic conditions such as postherpetic or trigeminal neuralgia, diabetic polyneuropathy [119]. High dose corticosteroids inhibit neurogenic inflammation, but due to a great range of severe side effects (gastrointestinal bleeding, ulcer formation, diabetes, obesity, etc.) they cannot be administered for longer time periods. Therefore, there is a particularly great need to find new targets and develop novel anti-inflammatory and analgesic drugs with different mechanisms of action which could act directly at the level of the sensory nerve terminals. For this reason we have introduced and developed several animal models of nociception in our laboratory and I have obtained expertise in a variety of examination techniques during my PhD work.
AIMS My PhD thesis deals with the mechanisms and receptorial background of peptide transmitters which are released from capsaicin-sensitive sensory nerves and mediate the neurohumoral „sensocrine” antiinflammatory and anti-nociceptive actions of these fibres and also focuses on the abilities for their physical activation in animal models. This work is built around the following three topics. I. Our aim was to investigate the role of the somatostatin receptor subtype 4 (sst4) in different in vivo models of inflammation and nociception. The effect of the selective sst4 receptor agonist J-2156 having a peptidomimetic structure was studied in acute and chronic experimental assessments both in rats and mice. Besides, on the basis of the literature I introduced an in vitro method in which we could routinely measure the cytokine production of isolated peritoneal macrophages in response to different stimulations and examine drug effects. II. The presence of PACAP-38 in capsaicin-sensitive sensory neurones has been established and our previous studies have proved that it is released from their peripheral terminals in response to stimulation. However, the available contradictory data concerning its role in nociceptive processes all focused on the central nervous sytem. Therefore, in the present series of experiments the peripheral actions of PACAP-38 was investigated in a variety of nociception models. III. With the help of a specific device producing a static magnetic field with optimized parameters we studied if this physical influence is able to induce measurable anti-nociceptive actions in different mouse models. Furthermore, the potential involvement of capsaicin-sensitive peptidergic fibres was also analyzed in the observed phenomenon.
3
I. ANALGESIC EFFECTS OF THE SOMATOSTATIN SST4 RECEPTOR SELECTIVE AGONIST J-2156 IN ACUTE AND CHRONIC INFLAMMATORY AND PAIN MODELS The therapeutic value of native somatostatin is limited by its broad range of effects and its short (3 minutes) plasma half life [122]. However, potent and stable somatostatin receptor agonists acting selectively on sst4 receptors on nociceptive nerve terminals could be promising for analgesic drug development. Main advantage of these agonists is the lack of endocrine effects mediated by somatostatin sst2, sst3 and sst5 receptors. The cyclic heptapeptide TT-232, a sst4/sst1 receptor agonists molecule has wide range of antinociceptive effects, which is supported by our earlier studies [37,38,41,83]. Our present experiments were performed on a sst4 receptor subtype selective, high affinity binding somatostatin agonist, compound J-2156, which is synthesized at Juvantia Pharma Ltd. (Finland). J-2156 is a non-peptide sulphonamido-peptidomimetic compound, its exact chemical structure is (1’S,2S)-4-amino-N-(1’carbamoyl-2’-phenylethyl)-2-(4’’-methyl-1’’-naphthalene-sulphonylamino)-butanamide. This molecule posesses nanomolar affinity to the human somatostatin receptor subtype 4 (sst4), which is a greater response of binding affinity than the native somatostatin’s, and is at least 400-fold selective for the sst4 receptor over any of the other four human somatostatin receptor subtypes [25]. In a cyclic AMP assay J2156, somatostatin-14 and somatostatin-28 all act as full agonists. In a G protein stimulation functional test J-2156 elicited a 2.5-fold higher response than the endogenous ligands somatostatin-14 and somatostatin-28. By these results J-2156 can be classified as a „superagonist” at human sst4 receptor [25]. Further in vitro experiments provided evidence that repeated application of compound J-2156 did not cause desensitization, which enhances the therapeutic value of this molecule [24].
I.1. EXPERIMENTAL MODELS AND METHODS Animals Experiments were performed on Balb/c, CD1 mice, and Wistar, Lewis rats bred and kept in the Laboratory Animal Center of the University of Pécs under standard pathogen free conditions at 24-25°C and provided with standard chow and water ad libitum. Investigation of formalin-induced acute somatic chemonocifensive behaviour Formalin (50 µl 2.5%) was injected intraplantarly into one hindpaw of Balb/c mice, which induced nocifensive reactions in two phases. Phase I (0-5 min) is thought to be due to a direct chemonociceptive effect of formalin. Phase II (20-45 min) is mainly mediated by inflammatory reactions [123]. Nocifensive behaviour was quantified in seconds by the duration of paw lickings in both phases. J-2156 was administered in 3 doses (1, 10 and 100 µg/kg) intraperitoneally 20 minutes prior to formalin-injection. Measurement of mechanonociceptive threshold of the paw in traumatic mononeuropathy Wistar rats were anaesthesized and the common sciatic nerve was exposed unilaterally high on the thigh, then 1/3-1/2 of the nerve trunk was carefully separated and tightly ligated, which causes a drop in the mechanonociceptive threshold [96]. The wound was closed and the animals were allowed to recover and survive for 7 days. Mechanonociceptive threshold of the hindpaws was determined with RandallSelitto-test (Ugo Basile Analgesimeter) before and 7 days after surgery, which is a reliable method for measuring mechanonociception in the partial sciatic nerve ligation model [83]. J-2156 was administered in 3 doses (1, 10 and 100 µg/kg i.p.) 20 minutes before measurements. Investigation of complete Freund’s adjuvant-induced chronic inflammation Complete Freund’s adjuvant (CFA: killed Mycobacterium tuberculosis suspended in paraffin oil, 1 mg/ml) was injected intraplantarly and into the tail’s root (100-100 µl) of Lewis rats. In order to enhance 4
systemic effects, an additional injection was given into the tail the following day, this was the first day of the experiment. Functional measurements were performed before and for 21 days after CFAadministration. At the end of experiments tibio-tarsal joints were cut, histological preparation and morphological evaluation has been made. J-2156 was given in two different doses (1 and 10 µg/kg i.p.) three times daily throughout the whole experimental period from the start of CFA-treatment. Measurements of mechanical touch sensitivity of the paw Mechanonociceptive thresholds was measured by Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometer, which is a modified electronic von Frey device. The results was compared to the initial control values, consequent allodynia was expressed in percent. Measurements of oedema formation Paw volume was measured with Ugo Basile Plethysmometer. Oedema formation was expressed in percentage compared to the initial control volumes. Histological preparation and evaluation At the end of the measurements tibio-tarsal joints were cut and decalcinated, dehydrated with adequate protocol. The samples were embedded in paraffin, then sectioned with microtome to 5-7 µm pieces and stained with hematoxylin and eosin [38]. Arthritic changes of each samples were scored with formally given parameters by a pathologist without knowledge of the treatments received. We used a grading scale of 0–3 for each parameter where the biggest score means the most serious changes. Mean scores were determined from each sections of the individual animals and composite score values of different experimental groups were calculated from these mean scores [132]. Investigation of carrageenan-induced oedema formation 3% carrageenan (100 µl) was injected into the plantar surface of one hindpaw of Wistar rats, which induced a local mixed-type inflammatory response with neurogenic and non-neurogenic components [20,84]. The oedema formation achieves its maximum in the third hour [8], so we have made our measurements before and 60, 120 and 180 minutes after injection. Three doses of J-2156 (1, 10 and 100 µg/kg) or saline was administered intraperitoneally 15 minutes prior to carrageenan injection. Investigation of mustard oil-induced acute neurogenic inflammation in the rat hindpaw skin Both hindlegs of Wistar rats were acutely denervated, the sciatic and the saphenous nerves were cut 30 minutes before the induction of inflammation to avoid mustard oil-induced central reflexes. Acute neurogenic inflammation in the paw skin was evoked by topical application of 1% mustard oil dissolved in paraffin oil. Extravasation of plasma albumin was measured by the Evans blue leakage method. Evans blue (50 mg/kg) was injected intravenously and neurogenic inflammation was induced 10 minutes later. Rats were exsanguinated 20 minutes after mustard oil application. The skin of the hindpaws was removed, weighed and the extravasated dye was extracted with formamide. The amount of the accumulated Evans blue, which quantitatively correlates with the intensity of plasma extravasation, was quantified with photometric determination at 620 nm. The results were expressed in µg dye/g wet tissue. Doses of J-2156 (0.5-100 µg/kg) or saline was administered intraperitoneally 20 minutes before induction of the inflammation. For determine the duration of action, J-2156 (10 µg/kg) was administered intraperioneally 2 or 6 hours before mustard oil-smearing. Investigation of mustard oil-induced acute neurogenic inflammation in the ear Balb/c mice were anaesthesized and 1% mustard oil dissolved in paraffin oil was smeared on both sides of the ears. The diameter of the ear was measured with an engineers’ micrometer before the treatment and four times during the 3 h-examination period. Oedema was expressed in percent compared to the
5
initial control values. J-2156 (10, 50 and 100 µg/kg i.p.) was administered 15 minutes before mustard oil-smearing. Animals of the control group were treated with the same volume of the solvent. Examination of IL-1β production of stimulated peritoneal macrophages in vitro CD1 mice were treated with lipopolysaccharide, LPS (300 µl i.p., 300 µg/ml). Four hours after the injection animals were decapitated and desanguinated. The abdomen was washed with 2.5 ml ice-cold medium and the peritoneal liquid was collected. 800 µl RPMI (with 80 µl BSA) and 100 µl peritoneal liquid was pipetted into each well of the cell culture plate. We have made two different settings for stimulating inflammatory cells: in one we pipetted 1-1 µl 1 µg/ml LPS to the medium, in the another 1-1 µl 25 ng/ml phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and 1-1 µl 1 µg/ml ionomycin was pipetted into each well. After that one half of each plate we have pipetted in 100 µl saline, the other half four different concentrations (0.1, 1, 10 and 100 µg/ml) of J-2156 (100 µl) was put in to examine the changes in cytokine-concentration. The amount of IL-1β produced by the samples were measured with sandwich ELISA method and determined with spectrophotometry at 450 nm. Statistical analysis Statistical evaluation of the formalin test, the mustard oil-induced acute neurogenic inflammation, and the two models investigating mechanonociception was analysed with non-parametric Mann-Witney Utest. For the histological changes Kruskal-Wallis test, for the in vitro model Student’s t-test, for the oedema formation one-way ANOVA followed by Bonferroni’s modified t-test was used. In all cases comparing the different groups *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 was considered to be significant.
I.2. RESULTS Inhibitory effect of J-2156 on formalin-induced acute nocifensive reactions in the mouse In phase I of formalin test (0-5 minutes) J-2156 proved to be ineffective, it did not influence the total duration of paw lickings. Meanwhile, in the second, acute inflammatory phase (20-45 minutes) J-2156 showed a significant and dose-dependent anti-nociceptive action. Anti-hyperalgesic effect of J-2156 in rat traumatic mononeuropathy model Partial ligation of the sciatic nerve resulted in a significant decrease of the mechanonociceptive threshold, which was not altered by either the 1 µg/kg i.p. dose of J-2156 or the solvent (saline). However, 10 and 100 µg/kg i.p. J-2156 significantly, but not dose-dependently decreased mechanical hyperalgesia. Inhibitory effect of J-2156 on CFA-induced inflammatory mechanical allodynia In control rats CFA-injection caused a marked decrease in mechanical touch sensitivity, which was maintained throughout the whole experimental period. Both doses of J-2156 (1 and 10 µg/kg i.p.) induced a significant inhibition on mechanical allodynia with only a moderate dose-reponse relationship. Inhibitory effect of J-2156 on CFA-induced oedema formation In the control, saline-treated, group paw swelling gradually increased and remained unchanged for the whole 3-week period. Both doses (1 and 10 µg/kg i.p.) of J-2156 significantly decreased oedema formation at almost every measurement point. However, dose-response correlation was not found. Inhibitory effect of J-2156 on histological changes The composite arthritis score for the saline-treated group was 6.6±0.7. The treament with J-2156 three times a day for 21 days markedly decreased the changes, the arthritis score was 2.86±0.86 in response to the 1 µg/kg i.p. dose, and 4.5±0.56 for the 10 µg/kg i.p. dose of J-2156. 6
Inhibitory effect of J-2156 on carrageenin-induced oedema formation Intraplantar injection of carrageenan induced 30, 32 and 27% paw swelling in control, saline-treated rats at 60, 120 and 180 minutes, respectively. This oedema was inhibited by pretreatment with 10 and 100 µg/kg J-2156 at each measurement points. This inhibitory effect was not dose-dependent in this model. Inhibitory effect of J-2156 on mustard oil-induced acute neurogenic inflammation in the paw skin Mustard oil applied to the paw skin induced a marked extravasation of plasma protein, assessed by leakage of Evans blue dye. This inflammation was inhibited non-dose-dependently by six different doses (between 0.1 and 100 µg/kg) of J-2156 injected 20 minutes before mustard oil. The significant inhibitory action of 10 µg/kg J-2156 lasted for 6 hours. Inhibitory effect of J-2156 on mustard oil-induced acute neurogenic oedema of the mouse ear In the control group ear thickness markedly increased within 3 hours in response to topical application of 1% mustard oil. All three doses of J-2156 pretreatment (10, 50 and 100 µg/kg i.p.) significantly diminished mustard oil-induced ear swelling after 2 and 3 hours, also. Only the effect of 50 µg/kg J2156 reached the level of statistical significance already at 20 minutes. Dose-dependency has not been found. Inhibitory effect of J-2156 on IL-1β release from in vitro stimulated peritoneal macrophages Both LPS and PMA stimulation of isolated mouse peritoneal macrophages induced similar IL-1β production. Compared to the control, saline-treated cells, pretreatment with 1 and 10 µg/ml J-2156 caused a sigificant decrease in the release of this cytokine. On the contrary, the 0.1 µg/ml concentration was uneffective and the highest concentration (100 µg/ml) surprisingly increased the IL-1β production.
I.3. SUMMARY AND CONCLUSIONS Our present results clearly demonstrate that the peptidomimetic compound J-2156, a highly somatostatin sst4 receptor selective agonist, was able to significantly inhibit nocifensive reactions in a conventional acute somatic chemonociception test (formalin) in mice, as well as in two different chronic pain models (adjuvant-induced chronic inflammation and traumatic mononeuropathy) in rats, indicating its broad-spectrum anti-nociceptive and anti-hyperalgesic/anti-allodynic effects in both species. It significantly inhibited acute inflammation in the rat hindpaw skin and in the mouse ear. The antiinflammatory effect of J-2156 has been shown in the in vitro cell stimulation assay, J-2156 inhibited IL1β production of isolated peritoneal macrophages in response to both LPS and PMA stimulation. Our earlier data showed that this agonist inhibited the release of SP and CGRP from stimulated sensory nerve terminals of the isolated rat trachea [36]. This mechanism is involved –at least partially- in the described anti-inflammatory and analgesic actions. Although only a few data are availabe on the exact localization of sst4 receptors [82], these functional results with J-2156 show that they are likely to be localized directly on the nerve terminals, vascular endothelial cells and inflammatory cells. This latter theory is supported by our in vitro data obtained on peritoneal macrophages. Since J-2156 acts selectively on sst4 receptor, it avoids the most common endocrine side effects of somatostatin agonists (inhibition of growth hormone, glucagon and insulin release) as these effects are mainly ascribed to SRIF1 receptor family [131]. This study provides several lines of evidence that the sst4 receptor is an excellent target for drug development. Therefore, stable, selective sst4 agonists can open promising perspectives for novel anti-inflammatory and analgesic drugs.
7
II. DIVERGENT PERIPHERAL EFFECTS OF PITUITARY ADENYLATE CYCLASEACTIVATING POLYPEPTIDE-38 (PACAP-38) ON NOCICEPTION IN RATS AND MICE Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP-38) is a member of the vasoactive intestinal peptide (VIP)/secretin/glucagon peptide family that was originally isolated from ovine hypothalamus [68]. Highest concentrations of PACAP are found in the nervous system and endocrine organs. PACAP serves as a sensory neuropeptide based on the presence of PACAP-like immunoreactivity in the superficial dorsal spinal horn layers, cell bodies [18,19] and peripheral terminals of capsaicin-sensitive primary sensory neurons [26,139]. Furthermore, PACAP and its receptors have been also detected in the dorsal horn of the spinal cord [69,70] as well as the articular capsule [125]. On the basis of these morphological and molecular biological results, PACAP has been suggested to be involved in pain transmission, but very few functional data are available to support this theory [35,72]. All in vivo experiments studying its role in nociception focused on its central effects and the results are contradictory [98]. Intrathecally injected PACAP inhibited spinal nociceptive reflexes [140] and inflammation-induced nociception [77,137,139]. Administration of PACAP intracerebroventricularly also resulted in analgesia in the early phase and algesia in the late phase [98]. On the other hand, central application of PACAP dose-dependently decreased paw withdrawal latencies induced by thermal stimulation and potentiated nociceptive transmission to the spinal dorsal horn by interacting primarily with N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors [76]. PACAP acts via Gs/q protein coupled receptors mainly associated with the adenylate cyclase and phospholipase C: the PAC1 receptor which specifically binds PACAP, and the VPAC1/VPAC2 receptors which have a similar binding affinity for PACAP and VIP. Both receptors have been described on neurons, smooth muscle cells and several inflammatory cells [18,104,127,142]. Our earlier data provided evidence that PACAP inhibits the release of pro-inflammatory/pro-nociceptive sensory neuropeptides: substance P (SP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) from peripheral terminals of capsaicin-sensitive nerves [72]. PACAP also inhibited acute neurogenic and nonneurogenic inflammatory processes in both mice and rats [38,72]. Based on these results it was tempting to assume that this peptide might be involved in peripheral mechanisms of nociception. Since there were no data available on the peripheral actions of PACAP-38 in nociceptive processes, the present study aimed at examining its effects on acute visceral and somatic nocifensive behaviors, as well as inflammatory and neuropathic mechanical allodynia and heat injury-evoked thermal hyperalgesia after local or subcutaneous/intraperitoneal administration in different rat and mouse models.
II.1. EXPERIMENTAL MODELS AND METHODS Animals Experiments were performed on Wistar rats and CD1 mice bred and kept under pathogen free conditions at 24-25°C and provided with standard chow and water ad libitum in the Department of Pharmacology and Pharmacotherapy and Laboratory Animal Center of the University of Pécs, respectively. Wistar rats used for the electrophysiology studies were kept at the Animal House of the University of Calgary under the same conditions. Investigation of formalin-induced acute somatic nocifensive behaviours 50 µl 2.5% formalin injected subcutaneously into the plantar surface of one hindpaw of Wistar rats induces nocifensive reactions which is different from the behaviour in mice: paw liftings can be observed beyond paw lickings. In this model nocifensive behavior was quantitatively evaluated by the duration of paw liftings and paw lickings, and “Composite Pain Score” (CPS=(1x duration of paw liftings+2x duration of paw lickings in seconds)/duration of examination period in seconds) was calculated [130]. PACAP-38 (2 µΜ, 100 µl) or its solvent (saline) was also injected intraplantarly 5 minutes before formalin administration. To study the involvement of specific receptors in the PACAP-induced effects, PAC1 8
receptor-selective M65 [1] or the VPAC1/VPAC2 receptor antagonist [D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP [104] was administered (40 µΜ 50 µl) into the plantar region 5 minutes prior to PACAP-38 (4 µΜ 50 µl). PACAP-induced effects as well as the action of the antagonists were evaluated by comparison to the solvent (saline)-treated control group. Measurement of mild heat injury-induced thermal hyperalgesia The noxious heat threshold of Wistar rats was determined with a recently validated [7] increasingtemperature water bath. The equipment is suitable for the determination of the behavioral noxious heat threshold of rats defined as the lowest temperature at which the animal withdraws its hindpaw immersed into the water bath. After control threshold measurements rats were anaesthesized and one of the hindpaws was immersed in a constant, 51°C hot water bath for 20 seconds in order to evoke a mild burn injury. Following recovery from anaesthesia, heat threshold determinations were repeated 10 and 20 minutes after heat injury to confirm the development of hyperalgesia. PACAP-38 (2 µM 100 µl) or the same volume of saline was administered intraplantarly after the 20-minute measurement which was followed by repeated heat threshold measurements at 10-minute intervals. Thermal hyperalgesia was compared in percent to the initial control values at each time point. For studying the involvement of specific receptors, PAC1 receptor-selective M65 or the VPAC1/VPAC2 receptor antagonist [D-p-ClPhe6,Leu17]-VIP was administered (40 µM 50 µl) into the plantar region 5 minutes prior to intraplantar PACAP-38 (4 µΜ 50 µl). Measurement of carrageenan-induced inflammatory mechanical allodynia 50 µl 3% carrageenan was injected into the plantar surface of one hindpaw of Wistar rats. Previous studies have revealed that this method is the most appropriate to study mechanosensitivity in inflammation models and that it reaches its maximum at 3 hours [8], so the measurements were performed before, 120 and 180 minutes after the induction of the acute inflammation. Mechanonociceptive threshold was determined by the Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometer. PACAP-38 (2 µM 100 µl) or the same volume of saline was administered intraplantarly 5 min before both measurements. The thresholds were compared to the initial control values and allodynia was expressed in percentage. Investigation of the effect of PACAP-38 on basal mechano- and thermonociceptive thresholds Before and 10 minutes after intraplantar injection of PACAP-38 (2 µM 100 µl) mechanonociceptive and thermonociceptive thresholds were measured in rats with dynamic plantar aesthesiometry and with increasing temperature water bath, respectively. Investigation of acute visceral chemonocifensive behaviours: acetic acid-induced writhing test Acetic acid (3% 200 µl) was injected intraperitoneally to CD1 mice to evoke abdominal constriction responses, which are typical nocifensive reactions [22,52,57]. The animals were placed in a transparent plastic box right after the challenge and their responses were counted during continuous observation for 20 minutes. PACAP-38 (100 µg/kg) or saline was administered subcutaneously 30 minutes before acetic acid treatment. Measurement of mechanical hyperalgesia in traumatic mononeuropathy The common sciatic nerve of anaesthesized mice was exposed unilaterally high in the thigh and 1/3–1/2 of the nerve trunk was carefully separated and tightly ligated. Then the wound was closed and the animals were allowed to survive for 7 days. Mechanonociception of the hindpaws was measured with dynamic plantar aesthesiometer and hyperalgesia was expressed in percent compared to the inital control values. PACAP-38 (10 or 100 µg/kg) or the solvent (saline) was administered intraperitoneally 30 minutes before measurement. 9
Electrophysiological measurement of primary afferents in the rat knee joint These experiments were performed in cooperation with the Department of Physiology and Biophysics, University of Calgary. Acute synovitis was induced in the right knee joint by intra-articular injection of 2% kaolin followed by 2% carrageenan, total injected volume was 200 µl. The hip joint was immobilised by attaching a specially designed clamp to the femur at mid-thigh and connecting it to a stereotaxic frame. The hindpaw was placed into a plastic boot and the knee joint was rotated. Finally, a longitudinal skin incision was made along the medial aspect of the hindlimb and the resulting skin flaps were secured to a metal “O” ring to create a pouch which was filled with warm paraffin oil. The saphenous nerve was cut distal to the knee joint to prevent sensory input from the hindpaw. Axon bundles of the proximal nerve stump were hooked over a platinum electrode and electrical activity in the nerve was recorded. The conduction velocity of the recorded nerve fibres was ascertained by measuring the latency to an evoked potential produced by electrically stimulating the receptive field. Initially, 3 movement cycles were performed to acquire control baseline nerve activity. 100 µl PACAP was administered in two doses (0.2 and 2 µM) to the knee by close intra-arterial injection via the saphenous artery. Then the number of action potentials/movement was determined and the percent change in afferent activity following PACAP administration was calculated compared to control. Statistics Data for thermal and mechanical hyperalgesia/allodynia were analysed by one-way ANOVA followed by Dunnett’s post test. For the electrophysiological data two-way ANOVA, for the formalin test and the writhing test Student’s t-test was used. In all cases *p<0.05 and **p<0.01 was considered to be significant.
II.2. RESULTS Inhibitory effect of intraplantar PACAP-38 on formalin-induced acute nocifensive behaviours Nocifensive behavior expressed as composite pain score (CPS) and calculated from paw lickings and liftings was significantly inhibited by intraplantar injection of PACAP-38 both in the early phase (0-5 minutes) referring to acute chemonociception and in the late phase (20-45 minutes) evoked by inflammatory reactions. Local administration of the selective PAC1 receptor antagonist M65 5 minutes prior to PACAP-38 into the plantar region did not alter the PACAP-induced anti-nociceptive effect in either phase. Meanwhile, pre-injection of the VPAC1/2 receptor antagonist [D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP abolished the PACAP-evoked inhibitory action on the CPS in phase II, but did not influence PACAP action in phase I. Inhibitory effect of intraplantar PACAP-38 on mild heat injury-induced thermal hyperalgesia Following the 51°C heat injury, the thermal thresholds dropped markedly, which maintained at an even level for at least 60 minutes. PACAP-38 administered after the 20-minute measurement markedly reduced heat injury-induced thermal hyperalgesia almost each time points as compared to the solventtreated group. Intraplantar injection of the selective PAC1 receptor antagonist M65 5 minutes prior to the same dose of PACAP-38 into the plantar region did not alter the PACAP-induced anti-hyperalgesic effect, but the VPAC1/2 receptor antagonist [D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP abolished the PACAP-evoked inhibitory action. Inhibitory effect of intraplantar PACAP-38 on carrageenan-induced mechanical allodynia We have found dropped mechanonociceptive thresholds in the control group 2 and 3 hours after carrageenan-injection. PACAP-38-treated group showed significant smaller changes in thresholds in both time points.
10
No effect of intraplantar PACAP-38 on mechano- and thermonociceptive thresholds Intraplanar administration of PACAP-38 did not influence either the basal mechano-, or the thermonociceptive thresholds. Peripheral inhibitory effect of PACAP-38 on acute visceral chemonociception Subcutaneously injected PACAP-38 evoked significantly less acetic acid-induced writhing movements compared to the saline-treated control group. In this visceral chemonociception model PACAP also exerted an anti-nociceptive effect. No effect of PACAP-38 on neuropathic mechanical hyperalgesia 7 days after nerve injury marked mechanical hyperalgesia developed in the hindpaw of mice, which was not inhibited significantly by any dose of the intraperitoneally injected PACAP-38. In this model PACAP38 proved to be uneffective. Sensitizing peripheral effect of PACAP-38 on afferent activity in inflamed knee joint Kaolin-carrageenan-injection resulted in a significant increase of knee joint diameter. In the examined fibres local administration of PACAP-38 caused a transient, but significant increase in the afferent activity. This sensitizing effect was dose-dependent, the smaller dose did not evoke changes in mechanosensitivity on joint afferents.
II.3. SUMMARY AND CONCLUSIONS Although immunolocalization of PACAP-38 has been described in capsaicin-sensitive neurons [69,70], there are only few scattered data concerning its role in nociception focusing only on its central effects. This study provides the first results on the peripheral actions of PACAP-38 on nociceptive processes. We have shown that peripherally administered PACAP-38 inhibits acute somatic and visceral chemonociception, as well as inflammatory mechanical allodynia and heat injury-induced thermal hyperalgesia in both rats and mice. On the contrary, it did not alter neuropathic mechanical hyperalgesia in the mouse paw and even induced mechanical sensitization of rat knee joint afferents. PACAP acts on a family of three Gs/q protein-coupled receptors: the PAC1 receptor to which PACAP has much higher affinity than VIP, and the VPAC1/VPAC2 receptors to which both PACAP and VIP bind similarly [54,104,127]. These receptors are connected to Gs/Gq proteins, and although they are coupled the several signal transduction pathways, all mechanisms increase intracellular cAMP and Ca2+ concentration leading to neuronal activation. This mechanism underlies the direct sensitising effect of PACAP-38 on afferent fibres found in the knee joint with electrophysiological experiments, but contradicts the peripheral anti-nociceptive and anti-hyperalgesic actions we observed in other models. The strong upregulation of PACAP in dorsal root ganglia following adjuvant-induced inflammation suggests a role for this peptide in inflammatory pain conditions, particularly during chronic processes [138]. PACAP functions as an immuno-modulator and the majority of the studies report on its antiinflammatory actions [13,51,58,62] via inhibiting the production of inflammatory cytokines (TNFα, IL-6, IL-12), chemokines, transcriptional factors and other mediators [13,51,58,62]. PACAP also inhibits T cell proliferation, several macrophage-functions and chemotaxis in a VPAC1 receptor-mediated manner [14,15]. We have recently shown that not only the cellular, but also the acute neurogenic components of the inflammatory reactions are decreased by systemic PACAP application. We have also provided direct in vitro evidence that PACAP-38 inhibits the release of pro-inflammatory sensory neuropeptides (SP and CGRP) from the peripheral terminals of capsaicin-sensitive sensory fibres which serves as an explanation for its ability to decrease plasma protein extravasation of exclusively neurogenic origin [35]. Although the precise mechanism for the observed anti-nociceptive and anti-hyperalgesic actions of PACAP-38 is not known, our results with selective PAC1 and VPAC1/VPAC2 receptor antagonists clearly showed that the peripheral inhibitory actions in the second phase of the formalin test as well as 11
in the heat injury-induced thermal hyperalgesia model are mediated by the activation of VPAC receptors. This is not likely to be a direct inhibitory action on the nociceptors, since the increased intracellular cAMP and Ca2+ levels lead to neural stimulation [54,105,117,118,127]. Meanwhile, elevation of intracellular cAMP attenuates the release of inflammatory mediators from mast cells and granulocytes [53,133]. The observed peripheral anti-nociceptive and anti-hyperalgesic actions of PACAP in the acute inflammation-associated models might be explained by the decreased release of the pro-nociceptive neuropeptides as well as other sensitizing agents (bradykinin, prostaglandins, leukotriens, serotonin, etc.) from cellular sources. The finding that neither the basal mechanical nor the thermal nociceptive thresholds were altered by local PACAP injection suggests that it does not inhibit voltage-gated sodium channels, therefore local anaesthetic-like effect is not involved in these peripheral anti-nociceptive actions. Surprisingly, PACAP exerted a marked anti-nociceptive effect in phase I of the formalin test. This inhibition was not altered either by PAC1 or VPAC receptor antagonism, therefore, nonspecific, non receptor-mediated mechanisms are likely to be involved, but the existence of a presently unknown receptor for PACAP-38 or an overlapping action on other inhibitory receptors such as cannabinoid, opioid or somatostatin receptors cannot be excluded either [71]. In contrast to the observed inhibitory effects of PACAP-38 on visceral and somatic nociceptive reactions in the paw, in the acutely inflamed rat knee joint electrophysiological results clearly showed a sensitizing action. Thus, it is very likely that PACAP-38 also activates VPAC1/VPAC2 receptors located on nociceptive nerve terminals within the articular capsule which leads to enhanced joint mechanosensitivity. The intracellular mechanisms which could explain this sensitizing action might be related to cAMP accumulation in response to adenylate cyclase activation and enhanced protein kinase A activity, but phospholipase C activation can also be involved [105,117,118]. Besides these direct neural mechanisms of action, VPAC receptors have also been shown on human synoviocytes [120]. Fibroblast-like and macrophage-like synoviocytes are unique cells in the joints which are able to secrete several sensitizing inflammatory mediators including IL-1, PGE2 and TNFα [141]. Furthermore, histamine released from synovial mast cells also acts as an algogenic substance in the joints. Evidence has been given for the ability of VIP to cause mast cell degranulation [102]. Therefore, an indirect action of PACAP to activate synoviocytes and mast cells and inducing the release of sensitizing substances in the acutely inflamed joints is also possible [65]. We found no change in mechanical hyperalgesia after systemic administration of PACAP in mononeuropathy model, despite electrophysiological studies have shown its ability to enhance activity of dorsal horn neurons in rat experimental mononeuropathy [18]. Although in this model PACAP-38 was injected intraperitoneally., this large peptide is very unlikely to penetrate through the blood-brain barrier, so at the peripheral level its significance could not been supported. In conclusion, these results represent the first data for the peripheral actions of PACAP-38 on nociceptive transmission. These effects seem to be divergent depending on the mechanisms of nociceptor activation and the targets of PACAP actions. In acute visceral and somatic inflammatory pain models PACAP exerts anti-nociceptive, anti-hyperalgesic and anti-allodynic effects, while it causes mechanical sensitization in the acutely inflamed knee joint. Further studies are needed to completely elucidate both neural and non-neural factors in order to define the exact molecular mechanisms of PACAP effects on peripheral nociception.
12
III. STATIC MAGNETIC FIELD-INDUCED ANTI-NOCICEPTIVE EFFECT AND THE INVOLVEMENT OF CAPSAICIN-SENSITIVE SENSORY NERVES IN THIS MECHANISM The effects of static magnetic field (SMF) on several behavioural patterns and neural functions such as induction of locomotor activity [44], conditioned taste aversion [74], and vestibular activation [103] have been described recently. Data available on the actions of SMF on nociceptive processes are contradictory [12,16,43,49,86,88,101]. The reason for this contradiction might be differences between the species and the characteristics of the magnetic field (e.g. intensity) and the duration of the exposure. The SMF generating device used in the experiments was developed, optimized and validated by Dr. János László [56]. This device contains two matrices with permanent neodymium-iron-boron (NdFeB) cylindrical magnets (5 mm radius, 10 mm height) with alternating poles. These are the strongest rareearth metal magnets. The individual magnets has grade N50, their remanent magnetic induction is 1.47 T. Two adjacent individual magnets have altered polarity as well as in the opposite position in the matrix with the same axis and orientation. These parameters result in a characteristic pattern of the magnetic field, which is described as an optimized static magnetic field, oSMF [56]. Although the mechanisms by which SMF mediates its great variety of actions are unknown [59,94], modification of the endogenous opioidergic system and ion channel conduction properties have been suggested [48,92,93]. Several data indicate the ability of relatively weak SMF to diminish neural excitability by the inhibition of Ca2+ and Na+ currents [92,93,134]. As previously described, capsaicin-sensitive, TRPV1 receptor-expressing sensory nerves play an important role in several inflammatory and nociceptive processes via the release of proinflammatory/pro-nociceptive sensory neuropeptides such as SP and CGRP into the innervated area [60,109]. Meanwhile, somatostatin is also released from the capsaicin-sensitive subpopulation of primary afferents, reaches the circulation and it is able to elicit systemic anti-inflammatory and antinociceptive actions [38,82,111,112]. The TRPV1 receptor is a non-selective cation channel, which is activated by exogenous vanilloid compounds (e.g. capsaicin or resiniferatoxin: RTX), as well as noxious heat and several endogenous chemical stimuli, such as protons, bradykinin, and leukotriens produced in the inflamed tissues [107,109]. The function of capsaicin-sensitive primary sensory fibres can be selectively blocked by pretreatment with repeated high doses of TRPV1 agonists (capsaicin or RTX), this mechanism is called desensitization [6,39,113]. After repeated high doses of RTX treatment intracellular Ca2+ concentration increases and Ca2+ accumulates in the mitochondria evoking metabolic damage of the cells. This is accompanied by ultrastructural changes like disorganized, swollen mitochondria [108]. The aim of the present series of experiments was to elucidate the effects of oSMF exposure on acute visceral and somatic chemonociception, as well as on acute inflammatory nocifensive behaviours and inflammatory mechanical hyperalgesia in mice using an optimized SMF generating device. Furthermore, the involvement of capsaicin-sensitive sensory fibres in the oSMF-induced actions was also investigated.
III.1. EXPERIMENTAL MODELS AND METHODS Animals Experiments were performed on Balb/c and CFLP mice bred and kept under pathogen free conditions at 24-25°C and provided with standard chow and water ad libitum in the Laboratory Animal Center of the University of Pécs and in the Semmelweis University, respectively.
13
The optimized static magnetic field One matrix was positioned above and one below a special plastic cage, where the mice were placed. Mice in the control group were put into a similar cage without magnetic field exposure (sham box). The size of the cage was 140*140*46 mm (length*width*height). Writhing test Visceral nociception was elicited in CFLP mice by intraperitoneal injection of 200 µl 0.6% acetic acid or 2% MgSO4 [135]. As a result of chemical irritation of the peritoneum abdominal constrictions (writhing movements) were observed as typical nocifensive behaviours. Two or three mice were placed in the cage at the same time, the cage was put into the oSMF 5 minutes before the injection and the animals were left there throughout the whole experimental period. The number of writhings was counted during the 0-5, 5-20 and 20-30 minute time intervals. Mice in the control group were placed in the same box without oSMF. Resiniferatoxin-induced mechanical hyperalgesia Measurements were performed before and 30 minutes after subcutaneous injection of 20 µl ultrapotent TRPV1 receptor agonist RTX (0.1 µg/ml) into the plantar surface of the left hindpaw of Balb/c mice. Hyperalgesia in each mouse was expressed as percentage decrease of the mechanonociceptive thresholds compared to the control values. Mice were placed into the oSMF for 30 minutes directly before measurements. In the control group animals were placed into the same box without SMF. Formalin-induced acute nocifensive behaviour 50 µl 2.5% formalin injected subcutaneously into the plantar surface of one hindpaw of Balb/c mice induced nocifensive reactions in two phases, the first of which (0-5 minutes) is thought to be due to a direct chemonociceptive effect of formalin, while the second one (20-45 minutes) is mainly mediated by inflammatory reactions [123]. Nocifensive behaviour was quantitatively evaluated by the total duration of paw lickings in each examination period [8]. Mice were placed into the oSMF for 5 minutes before and throughout the whole experimental period. Animals in the control group were put into the same box without SMF. Carrageenin-induced inflammatory mechanical hyperalgesia 50 µl 3% carrageenan was injected into the plantar surface of one hindpaw of Balb/c mice. Mechanonociceptive threshold of the hindpaws was determined by Ugo Basile Dynamic Plantar Aesthesiometer as earlier described. Measurements were performed before and 3 hours after subcutaneous injection. Hyperalgesia was expressed in percent of the mechanonociceptive thresholds compared to the control values. Mice were placed into the SMF for 30 minutes before measurements. In the control group animals were placed into the same box without SMF. Desensitization of capsaicin-sensitive afferents with resiniferatoxin pretreatment The function of capsaicin-sensitive primary sensory fibres was selectively abolished by repeated pretreatment with high doses of TRPV1 agonist RTX (30, 70 and 100 µg/kg s.c. on three consecutive days 5 days before the study). RTX-pretreated mice were examined in the formalin test and the in the carrageenan-induced acute inflammation model. Rotarod test Mice were studied in Ugo Basile RotaRod device in order to examine if oSMF influences coordination or motor function [47]. Their RotaRod performance was measured by the duration of time (seconds) spent on the rotating drum. They were examined before and after they had been placed into oSMF or in the control group into the same box without SMF for 30 minutes. Each measurement was repeated 3 times and their means with standard errors (s.e.m.) were calculated. 14
Statistics For statistical evaluation of all data one-way ANOVA followed by Bonferroni’s modified t-test was used. In all cases comparing two different group *p<0.05 was considered to be statistically significant.
III.2. RESULTS Inhibitory effect of oSMF on acute visceral chemonocicepction Intraperitoneally injected MgSO4 induced less nocifensive behaviours than acetic acid. Exposure of mice to oSMF resulted in significantly fewer abdominal contractions evoked by 0.6% acetic acid compared to the control group. In the case of MgSO4 stimulation the oSMF-induced anti-nociceptive effect in the second and third examination periods also proved to be statistically significant, but the degree of the inhibition was smaller than in the case of acetic acid. Inhibitory effect of oSMF on resiniferatoxin-induced mechanical hyperalgesia The TRPV1 receptor agonist RTX decreased mechanical touch sensitivity of the hindpaw in the control group 30 minutes after its intraplantar injection. In mice which were placed into oSMF for the whole 30minute period between RTX administration and measurement, significantly smaller hyperalgesia developed than in animals kept in the control box. Inhibitory effect of oSMF on formalin-induced acute somatic nociception The number of intraplantar formalin-induced paw lickings were significantly smaller in mice placed into the oSMF 5 minutes before and during the whole examination period both in the early phase (0-5 minutes) of the test referring to direct chemonociception and in the late phase (20-45 minutes) evoked by acute inflammatory reactions. Inhibitory effect of oSMF on carrageenan-induced inflammatory mechanical hyperalgesia The mechanonociceptive threshold was measured 3 hours after carrageenan injection and compared to the initial, preinjection values. In mice which were placed into oSMF for a 30-minute period before measurement significantly smaller hyperalgesia developed compared to control animals not being in the magnetic field. Effect RTX-pretreatment on oSMF-induced anti-nociceptive action in the formalin test In mice which were pretreated with RTX 5 days before the formalin test in order to inactivate capsaicinsensitive sensory nerves, we found almost the same values as mesured in the study described above. However in that experiments oSMF had significant anti-nociceptive effects, in this case it did not induce significant inhibitory action in either phases. Effect RTX-pretreatment on oSMF-induced anti-hyperalgesic action in the carrageenan model Although in mice which were pretreated with RTX carrageenan-induced hyperalgesia was smaller, it did not prove to be statistically significant. The inhibitory action of oSMF observed in untreated mice was absent in the RTX-pretreated group. No effect of oSMF on motoric coordination and function in mice Placing the mice into oSMF for 30 minutes did not alter their RotaRod performance compared to the control group before and after being in the same box for the same time without SMF. No significant differences could be detected either between the two groups or between respective performances before and after the 30-minute period.
15
III.3. SUMMARY AND CONCLUSIONS These results demonstrate that acute exposure of mice to oSMF exerts inhibitory effects on visceral/somatic chemonociception and inflammatory nociception/hyperalgesia. The oSMF-induced inhibition was more pronounced on the abdominal writhing response evoked by acetic acid than by MgSO4. This difference might be explained by distinct pain-producing mechanisms of these chemicals: the nocifensive response elicited by MgSO4 may be due to direct stimulation of visceral chemonociceptors, while an acute inflammatory reaction is likely to be involved in the acetic acidinduced behaviour [30]. Phase I of the formalin test is due to the direct chemical stimulatory action of the compound, in phase II inflammatory mechanisms are involved [123]. Nocifensive reactions in phase II, but not in phase I were reduced in control (sham box-exposed) mice after selective inactivation of capsaicin-sensitive sensory fibres by RTX pretreatment. Therefore, SP and CGRP released from these nerves are likely to be involved in the development of this inflammatory reaction. The oSMF exposure diminished nocifensive behaviours in both phase I and phase II. The extent of the inhibition in the late phase was similar to that observed after RTX pretreatment. This inhibition was prevented after the destruction of peptidergic sensory fibres by RTX. One potential mechanism for the inhibition in phase I might be a direct inhibition of sodium influx and action potential generation at the level of capsaicin-sensitive nerve terminals. In the SMF-induced inhibitory effect in phase II decreased Ca2+ influx and consequently diminished sensory neuropeptide release mediating the local neurogenic inflammatory response can also be considered. This theory is supported by data on the ability of oSMF to diminish neural excitability by the inhibition of Ca2+ and Na+ currents [92,93,134]. Carrageenan produces a subacute local inflammation in which oedema and mechanical hyperalgesia reaches its maximum 3 hours after injection [8]. Both neurogenic and non-neurogenic mechanisms with several mediators such as inflammatory neuropeptides, cytokines and cyclooxygenase products are involved in this process [20,84]. Carrageenan-induced mechanical hyperalgesia was smaller, but not significantly decreased after RTX pretreatment, which suggests that capsaicin-sensitive nerves do not play a predominant role in this type of oedema formation. Similarly to the other models, SMF-exposure exerted a marked inhibitory action on this inflammatory mechanical hyperalgesia, which was also prevented after the destruction of peptidergic afferents by RTX pretreatment. SMF also diminished inflammatory mechanical hyperalgesia induced by intraplantar injection of the TRPV1 receptor agonist RTX. In response to the activation of this cation channel on capsaicin-sensitive sensory nerve terminals by RTX, pro-inflammatory neuropeptides such as SP and CGRP are released in the innervated area, which produce a local neurogenic inflammatory reaction in the plantar surface of the hindpaw with a consequent drop of the mechanonociceptive threshold. Since the development of mechanical hyperalgesia in this model involves peripheral mechanisms, one explanation for the antinociceptive action of oSMF might be the inhibition of activation-induced cation influx into the nerve terminals leading to a decreased release of pro-inflammatory/pro-nociceptive neuropeptides. This theory is supported by data on the ability of SMF to diminish neural excitability by the inhibition of Ca2+ and Na+ currents [92,93,134]. Besides this, neither inhibition of central sensitization nor decreased synaptic transmission can be excluded. Exposure of mice to oSMF for 30 minutes did not alter their RotaRod performance, therefore impairment of motor function cannot be considered as a factor influencing their nocifensive behaviours. In conclusion, this study is the first to provide experimental evidence for the involvement of capsaicinsensitive sensory nerves in the oSMF-induced anti-nociceptive action in different animal models. The mechanism is not completely known yet and precise elucidation of these processes needs further investigation.
16
SUMMARY OF THE NOVEL FINDINGS 1. With the help of the selective somatostatin sst4 receptor agonist J-2156 we have provided evidence for the anti-inflammatory and anti-allodynic/anti-hyperalgesic role of this receptor in a variety of mouse and rat models. It is particularly worth emphasizing that in both species this compound was able to effectively inhibit the neurogenic components of the inflammatory processes which are involved in the pathological mechanisms of several diseases and for the treatment of which the presently available drugs are not satisfactory. Furthermore, it is also important that this sst4 receptor agonist diminished mechanical allodynia in the traumatic neuropathy model, for which the classical non-steroidal analgesics or opioid compounds are ineffective. Although certain anti-epileptics and anti-depressants provided significant pain-relief in certain neuropathic pain conditions, the treatment of these problems is still not completely resolved. Our present findings are the first which identify and validate a novel target molecule, the sst4 receptor, expressed both on the sensory nerve terminals and inflammatory cells. Based on these data, stable, selective, primarily non-peptide agonists might open promising perspectives for the development of an effective, broad-spectrum anti-inflammatory and analgesic drug group with a completely new mechanism of action. 2. Our present findings are the first for the peripheral actions of PACAP-38 on nociceptive processes. Electrophysiological experiments showed sensitizing effect of locally administered PACAP-38 in the rat knee joint similarly to the previously described actions of VIP. On the contrary, in several, mainly inflammation-related rodent models we have found peripheral antinociceptive and anti-hyperalgesic effects of PACAP which are mediated through the VPAC receptors. This contradiction could be explained by the fact that increased intracellular cAMP level induced by VPAC receptor activation results in neuronal excitation, but diminishes the production and release of inflammatory mediators and cytokines. Therefore, the overall inhibitory action on nociception is not likely to be due to a direct effect on the sensory nerve terminals, but much more to an indirect mechanism via its anti-inflammatory actions. Evaluation of the practical significance of these findings as well as potential drug developmental perspectives of PACAP needs further investigations. 3. Besides the pharmacological approaches, in the third part of the work an alternative possibility for analgesic therapy was examined with the help of an optimized static magnetic field (oSMF). Exposure of mice to oSMF proved to be anti-nociceptive and anti-hyperalgesic in various mouse models of nociception and inflammatory hyperalgesia. The involvement of capsaicinsensitive sensory nerves was evidenced in the observed inhibitory action of oSMF. Although further studies are required to elucidate the precise molecular mechanism, inhibition of voltagegated cation channels (Na+, Ca2+) or the function of the TRPV1 receptor might be considered as potential effects. Through these actions, oSMF might inhibit action potential generation and propagation as well as the release of pro-nociceptive sensory neuropeptides. Understanding the static magnetic field-induced neuronal mechanisms could promote its therapeutical use and show interesting directions for non-pharmacological analgesic interventions.
17
[1] Abad C, Gomariz RP, Waschek JA (2006). Current Topics in Medicinal Chemistry 6: 151-163. [2] Amara SG, Jonas V, Rosenfeld MG, Ong ES, Evans RM (1982). Nature 298: 240-244. [3] Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C (1991).Endocrinology 129: 2787–2789. [4] Barnes PJ (2001). Allergy 56: 928-936. [5] Bennett GJ (1993). Muscle & Nerve 16: 1040-1048. [6] Bevan S, Szolcsányi J (1990). Trends in Pharmacological Sciences 11: 330-333. [7] Bölcskei K, Horváth D, Szolcsányi J, Pethő G (2007). European Journal of Pharmacology 564: 80-87. [8] Bölcskei K, Helyes Zs, Szabó Á, Sándor K, Pethő G, Elekes K, Almási R, Pintér E, Szolcsányi J (2005). Pain 117: 368376. [9] Brazeau P (1986). American Journal of Medicine 81: 8-13. [10] Cao T, Pintér E, Al-Rashed S, Gerard NP, Hoult R, Brain S (2000). Journal of Immunology 164: 5424-5429. [11] Cao T, Gerard NP, Brain SD (1999). American Journal of Physiology 277: 476-481. [12] Choleris E, Del Seppia C, Thomas AW, Luschi P, Ghione S, Moran GR, Prato FS (2002). Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences 269: 193-201. [13] Delgado M, Leceta J, Ganea D (2003). Journal of Leukocyte Biology 73: 155-164. [14] Delgado M, Munoz-Elias EJ, Gomariz RP, Ganea D (1999a). Journal of Immunology 162: 1707-1716. [15] Delgado M, Munoz-Elias EJ, Gomariz RP, Ganea D (1999b). Journal of Immunology 162: 4685-4696. [16] Del Seppia C, Mezzasalma L, Choleris E, Luschi P, Ghione S (2003). Behavioural Brain Research 144: 1-9. [17] de Swert KO, Joos GF (2006). European Journal of Pharmacology 533: 171-181. [18] Dickinson T, Fleetwood-Walker SM (1999).Trends in Pharmacological Sciences 20: 324-329. [19] Dickinson T, Mitchell R, Robberecht P, Fleetwood-Walker SM (1999). Neuropharmacology 38: 167-180. [20] Doi Y, Minami T, Nishizawa M, Mabuchi T, Mori H, Ito S (2002). Neuroreport 13: 93-96. [21] Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996). Brain Research 721: 233–237. [22] Eckhardt ET, Cheplovitz F, Lipo N, Govier WM (1958). Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 98: 186-188. [23] Edvinsson L, Fredholm BB, Hamel E, Jansen I, Verrecchia C (1985). Neuroscience Letters 58: 213-217. [24] Engström M, Savola JM, Würster S (2006). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316: 1262-1268. [25] Engström M, Tomperi J, El Darwish K, Ahman M, Savola JM, Würster S (2005). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 312: 332-338. [26] Fahrenkrug J, Hannibal J (1998). Neuroscience 83: 1261-1272. [27] Frossard N, Advenier C (1991). Life Sciences 49: 1941-1953. [28] Gottschall PE, Tatsuno I, Miyata A, Arimura A (1990). Endocrinology 127: 272-277. [29] Grant A (2002). Inflammopharmacology 9: 403-420. [30] Gyires K, Torma Z (1984). Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie 267: 131-140. [31] Hamelink C, Tjurmina O, Damadzic R, Young WS, Weihe E, Lee HW, Eiden LE (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 461-466. [32] Han SP, Naes L, Westfall TC (1990). Calcitonin gene-related peptide is the endogenous mediator of nonadrenergicnoncholinergic vasodilation in rat mesentery. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 255: 423-428. [33] Hannibal J, Ekblad E, Mulder H, Sundler F, Fahrenkrug J (1998). Cell and Tissue Research 291: 65–79. [34] Harmar AJ, Arimura A, Gozes I, Journot L, Laburthe M, Pisegna JR, Rawlings SR, Robberecht P, Said SI, Sreedharan SP, Wank SA, Waschek JA (1998). Pharmacological Reviews 50: 265–270. [35] Helyes Zs, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, Márk L, Pintér E, Tóth G, Elekes K, Szolcsányi J, Reglődi D (2007). Peptides 28: 1847-1855. [36] Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Sándor K, Elekes K, Szabó Á, Pozsgai G, Keszthelyi D, Kereskai L, Engström M, Würster S, Szolcsányi J (2006). British Journal of Pharmacology 149: 405-415. [37] Helyes Zs, Pintér E, Szolcsányi J (2005). Drugs of the Future 30: 1-9. [38] Helyes Zs, Szabó Á, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi Á, Kereskai L, Kéri Gy, Szolcsányi J (2004). Arthritis & Rheumatism 50: 1677-1685. [39] Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J (2003). Current Medicinal Chemistry 2: 191-218. [40] Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Than M, Oroszi G, Horváth A, Szolcsányi J (2001). British Journal of Pharmacology 134: 1572-1579. [41] Helyes Zs, Than M, Oroszi G, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Szolcsányi J (2000). Neuroscience Letters 278: 185-188. [42] Hofland LJ, Lamberts SW (1996). Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism 10: 163-176. [43] Hong CZ, Shellock FG (1990). Magnetic Resonance Imaging 8: 65-69. [44] Houpt TA, Pittmann DW, Barranco JM, Brooks Eh, Smith JC (2003). Journal of Neurosciences 23: 1489-1505. [45] Hoyer D, Bell GI, Berelowitz M, Epelbaum J, Feniuk W, Humphrey PP, O'Carroll AM, Patel YC, Schonbrunn A, Taylor JE (1995). Trends in Pharmacological Sciences 16: 86-88. [46] Hughes SR, Brain SD (1994). British Journal of Pharmacology 111: 425-430. [47] Jones BJ, Roberts DJ (1968). Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie & Pharmakologie 259: 211. [48] Kavaliers M, Ossenkopp KP (1994). Biological effects of electric and magnetic fields. Sources and mechanisms 205240. Editors: Carpenter DO, Ayrapetyan S. Academic Press, New York.
18
[49] Kavaliers M, Ossenkopp KP, Hirst M (1984). Physiology & Behavior 32: 261-264. [50] Kim SH, Chung JM (1992). Pain 50: 355-363. [51] Kojima M, Ito T, Oono T, Hisano T, Igarashi H, Arita Y, Kawabe K, Coy DH, Jensen RT, Nawata H (2005). Pancreas 30: 62-70. [52] Koster R, Anderson M, de Beer EJ (1959). Federation Proceedings 18: 412. [53] Kuehl FA Jr, Zanetti ME, Soderman DD, Miller DK, Ham EA (1987). American Review of Respiratory Disease 36: 210213. [54] Laburthe M, Couvineau A, Tan V (2007). Peptides 28: 1631-1639. [55] Lam HC, Takahashi K, Ghatei MA, Kanze SM, Polak JM, Bloom SR (1990). European Journal of Biochemistry 193: 725–729. [56] László J, Reiczigel J, Székely L, Gasparics A, Bogár I, Bors L, Rácz B, Gyires K (2007). Bioelectromagnetics 28: 615627. [57] Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW (2001). Pharmacological Reviews 53: 597-652. [58] Leceta J, Gomariz RP, Martinez C, Abad C, Ganea D, Delgado M (2000). Annals of the New York Academy of Sciences 921: 92-102. [59] Lockwood DR, Kwon B, Smith JC, Haupt TA (2003). Physiology & Behavior 78: 635-640. [60] Maggi CA (1995). Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Progress in Neurobiology 45: 1-98. [61] Maggi CA, Meli A (1988). General Pharmacology: The Vascular System 19: 1-43. [62] Martinez C, Abad C, Delgado M, Arranz A, Juarranz MG, Rodriguez-Henche N, Brabet P, Leceta J, Gomariz RP (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 1053-1058. [63] Massi M, Panocka I, de Garo G (2000). Peptides 21: 1597-1609. [64] May V, Beaudet MM, Parsons RL, Braas KM (2000). Annals of the New York Academy of Sciences 921: 186-194. [65] McDougall JJ, Barin AK (2005). British Journal of Pharmacology 145: 104-113. [66] McLatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown J, Thompson N, Solari R, Lee MG, Foord SM (1998). Nature 393: 333-339. [67] Mikkelsen JD, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen PJ, Olcese J, McArdle C (1995). Journal of Neuroendocrinology 7: 47– 55. [68] Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH (1989). Biochemical and Biophysical Research Communications 164: 567-574. [69] Moller K, Zhang YZ, Hakanson R, Luts A, Sjölund B, Uddman R, Sundler F (1993). Neuroscience 57: 725–732. [70] Mulder H, Uddman R, Moller K, Zhang YZ, Ekblad E, Alumets J, Sundler F (1994). Neuroscience 63: 307–312. [71] Muller JM, Debaigt C, Coursaud S, Montoni A, Pineau N, Meunier AC, Janet T (2007).Peptides 28: 1655-1666. [72] Németh J, Reglődi D, Pozsgai G, Szabó Á, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs (2006). Neuroscience 143: 223230. [73] Njuki F, Nicholl CG, Howard A, Mak JC, Barnes PJ, Girgis SI, Legon S (1993). Clinical Science (London, England 1979) 85: 385-388. [74] Nolte CM, Pittmann DW, Kalevitch B, Henderson R, Smith JC (1998). Physiology & Behavior 63: 683-688. [75] Odum L, Petersen LJ, Skov PS, Ebskov LB (1998). Inflammation Research 47: 488–492. [76] Ohsawa M, Brailoiu GC, Shiraki M, Dun NJ, Paul K, Tseng LF (2002). Pain 100: 27-34. [77] Onou T, Shimizu T, Sakamoto H, Higashi M, Kanmura Y, Miyata A (2007). Journal of Molecular Neuroscience 33: 339. [78] Parsons RL, Rossignol TM, Calupca MA, Hardwick JC, Brass KM (2000). Annals of the New York Academy of Sciences 921: 202-210. [79] Parsons JA, Erlandsen SL, Hegre OD, McEvoy RC, Elde RP (1976). Journal of Histochemistry and Cytochemistry 24: 872-882. [80] Patacchini R, Maggi CA (2001). European Journal of Pharmacology 429: 13-21. [81] Patel YC, Greenwood MT, Panetta R, Demchyshyn L, Niznik H, Srikant CB (1995). Life Sciences 57: 1249-1265. [82] Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J (2006). Pharmacology & Therapeutics 112: 440-456. [83] Pintér E, Helyes Zs, Németh J, Pórszász R, Pethő G, Than M, Kéri Gy, Horváth A, Jakab B, Szolcsányi J (2002). Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 366: 142-150. [84] Poole S, Cunha FQ, Selkirk S, Lorenzetti BB, Ferreira SH (1995). British Journal of Pharmacology 115: 684-688. [85] Poyner DR, Sexton PM, Marshall I, Smith DM, Quirion R, Born W, Muff R, Fischer JA, Foord SM (2002). Pharmacological Reviews 54: 233-246. [86] Prato FS, Robertson JA, Desjardins D, Hensel J, Thomas AW (2005). Bioelectromagnetics 26: 109-117. [87] Raynor K, Reisine T (1992). Critical Reviews in Neurobiology 6: 273-289. [88] Reeser JC, Smith DT, Fischer V, Berg R, Liu K, Untiedt C, Kubista M (2005). Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 86: 565-570. [89] Regoli D, Boudon A, Fauchere JL (1994). Pharmacological Reviews 46: 551-599. [90] Reichlin S (1983). New England Journal of Medicine 309: 1495-1501. [91] Reubi JC, Laissue JA, Waser B, Steffen DL, Hipkin W, Schonbrunn A (1999). Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 84: 2942-2950.
19
[92] Rosen AD (2003). Cell Biochemistry and Biophysics 39: 163-173. [93] Rosen AD (1996). Biochimica et Biophysica Acta 1148: 149-155. [94] Saunders R (2005). Progress in Biophysics & Molecular Biology 87: 225-239. [95] Segre GV, Goldring SR (1993). Trends in Endocrinology and Metabolism 4: 309–314. [96] Seltzer Z, Dubner R, Shir Y (1990). Pain 43: 205-218. [97] Sherwood NM, Krueckl SL, McRory JE (2000). Endocrine Reviews 21: 619-670. [98] Shimizu T, Katahira M, Sugawara H, Inoue K, Miyata A (2004). Regulatory Peptides 123: 117-122. [99] Shioda S, Nakai Y, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1996). Annals of the New York Academy of Sciences 805: 677– 683. [100] Shioda S, Legradi G, Leung WC, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1994). Endocrinology 135: 818–825. [101] Shupak NM, Hensel JM, Cross-Mellor SK, Kavaliers M, Prato FS, Thomas AW (2004). Neuroscience Letters 354: 3033. [102] Skofitsch G, Donnerer J, Petronijevic S, Saria A, Lembeck F (1983). Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 322: 153-157. [103] Snyder DJ, Jahng JW, Smith JC, Houpt TA (2000). Neuroreport 11: 2681-2685. [104] Somogyvári-Vígh A, Reglődi D (2004). Current Pharmaceutical Design 10: 2861-2889. [105] Spengler D, Waeber C, Pantaloni C, Holsboer F, Bockaert J, Seeburg PH, Journot L (1993). Nature 365: 170-175. [106] Suda K, Smith DM, Ghatei MA, Bloom SR (1992). Investigation of the interaction of VIP binding sites with VIP and PACAP in human brain. Neuroscience Letters 137: 19–23. [107] Szállási Á, Cruz F, Gepetti P (2006). Trends in Molecular Medicine 12: 545-554. [108] Szállási Á, Joó F, Blumberg PM (1989). Brain Research 503: 68-72. [109] Szolcsányi J (2004). Neuropeptides 38: 377-384. [110] Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs (2004). Hyperalgesia: molecular mechanisms and clinical implications 113-128. Editors: Handwerker HO, Brune K. IASP Press, Seattle. [111] Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E (1998a). British Journal of Pharmacology 123: 936-942. [112] Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J (1998b). British Journal of Pharmacology 125: 916-922. [113] Szolcsányi J (1993). Capsaicin in the study of pain 1-26. Editor: Wood JN. Academic Press London. [114] Szolcsányi J (1996). Progress in Brain Research 113: 343-359. [115] Szolcsányi J (1988). Agents and Actions 23: 4-11. [116] Szolcsányi J (1984). Antidromic Vasodilation and Neurogenic Inflammation 27-53. Editors: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F. Akadémiai Kiadó, Budapest. [117] Taiwo YO, Heller PH, Levine JD (1992). Neuroscience 48: 479-483. [118] Taiwo YO, Levine JD (1991). Neuroscience 44: 131-135. [119] Tajti J, Vécsei L (2006). Magyar Tudomány 167: 1191-1196. [120] Takeba Y, Suzuki N, Kaneko A, Asai T, Sakane T (1999). Arthritis & Rheumatism 42: 2418-2429. [121] Tatsuno I, Gottschall PE, Köves K, Arimura A (1990). Biochemical and Biophysical Research Communications 168: 1027–1033. [122] ten Bokum AM, Hofland LJ, van Hagen PM (2000). European Cytokine Network 11: 161-176. [123] Tjolsen A, Berge OG, Hunskaar S, Rosland JH, Hole K (1992). Pain 51: 5-17. [124] van Rossum D, Hanisch U, Quirion R (1997). Neuroscience and Biobehavioral Reviews 21: 649-678. [125] Uddman R, Grunditz T, Kato J, Sundler F (1998). Anatomy and Embryology 197: 273-282. [126] Vaudry D, Pamantung TF, Basille M, Rouselle C, Fournier A, Vaudry H, Beauvillain JC, Gonzalez BJ (2002). European Journal of Neuroscience 15: 1451-1460. [127] Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H (2000). Pharmacological Reviews 52: 269-324. [128] Vécsei L, Widerlöv E (1988). Acta Psychiatrica Scandinavica 78: 657-667. [129] Vígh S, Arimura A, Gottschall PE, Kitada C, Somogyvári-Vígh A, Childs GV (1993). Peptides 14: 59–65. [130] Watson GS, Sufka KJ, Coderre TJ (1997). Pain 70: 53-58. [131] Weckbecker G, Lewis I, Albert R, Schmid HA, Hoyer D, Bruns C (2003). Nature Reviews, Drug Discovery 2: 999-1017. [132] Weinberg A, Halpern M, Zahalka MA, Quintana F, Traub L, Moroz C (2003). Arthritis & Rheumatism 48: 846-853. [133] Weston MC, Peachell PT (1998). General Pharmacology 31: 715-719. [134] Wieraszko A (2000). Bioelectromagnetics 21: 175-182. [135] Witkin LB, Heuter CF, Galdi F, O’Keefe E, Spitaletta P, Plummer AJ (1961). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 133: 400-408. [136] Wray V, Kokoschke C, Nokihara K, Naruse S (1993). Biochemistry 32: 5832–5841. [137] Yamamoto T, Tatsuno I (1995). Neuroscience Letters 184: 32-35. [138] Zhang Y, Danielsen N, Sundler F, Mulder H (1998). Neuroreport 9: 2833-2836. [139] Zhang Y, Malmberg AB, Sjolund B, Yaksh TL (1996). Neuroscience Letters 207: 187-190. [140] Zhang Y, Sjolund B, Moller K, Hakanson R, Sundler F (1993). Neuroscience 57: 733-737. [141] Zheng YQ, Wei W, Dai M, Zhu L, Jia XY, Wang Y (2006). Acta Pharmacologica Sinica 27: 111-118. [142] Zhou CJ, Shioda S, Yada T, Inagaki N, Pleasure SJ, Kikuyama S (2002). Current Protein & Peptide Science 3: 423439.
20
ORIGINAL PAPERS RELATED TO THE THESIS Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Würster S., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Analgesic effects of the somatostatin sst4 receptor selective agonist J-2156 in acute and chronic pain models. European Journal of Pharmacology 539(1-2): 71-75. 2006 (IF: 2.522, SCI: 4) Helyes Zs., Pintér E., Németh J., Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pozsgai G., Keszthelyi D., Kereskai L., Engström M., Würster S., Szolcsányi J.: Effects of the somatostatin receptor subtype 4 selective agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and inflammatory reactions in rodents. British Journal of Pharmacology 149(4): 405-415. 2006 (IF: 3.825, SCI: 6) Sándor K., Helyes Zs., Gyires K., Szolcsányi J., László J.: Static magnetic field-induced anti-nociceptive effect and the involvement of capsaicin-sensitive sensory nerves in this mechanism. Life Sciences 81(2): 97-102. 2007 (IF: 2.257) Sándor K., Bölcskei K., McDougall J.J., Schuelert N., Reglődi D., Elekes K., Pethő G., Pintér E., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Divergent peripheral effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on nociception in rats and mice. Pain, submitted to re-revision
OTHER PAPERS 1. Szabó Á., Helyes Zs., Sándor K., Bite A., Pintér E., Németh J., Bánvölgyi Á., Bölcskei K., Elekes K., Szolcsányi J.: Role of TRPV1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 314(1): 111-119. 2005 (IF: 4.098, SCI:12) 2. Bölcskei K., Helyes Zs., Szabó Á., Sándor K., Pethő G., Elekes K., Almási R., Pintér E., Szolcsányi J.: Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-deficient mice. Pain 117(3): 368-376. 2005 (IF: 4.309, SCI: 18) 3. Jakab B., Helyes Zs., Varga A., Bölcskei K., Szabó Á., Sándor K., Elekes K., Börzsei R., Pintér E., Pethő G., Németh J., Szolcsányi J.: Examination of the novel TRPV1 receptor antagonist JYL1421 (SC0030) in vitro and in vivo in the rat. European Journal of Pharmacology 517(1-2): 35-44. 2005 (IF: 2.477, SCI: 9) 4. Bellis E., Hajba L., Kovács B., Sándor K., Kollár L., Kokotos G.: Three generations of alpha,gamma-diaminobutyric acid modified poly(propyleneimine) dendrimers and their cisplatin-type platinum complexes. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 69(1-2): 151-161. 2006 (IF: 1.403, SCI: 1) 5. Helyes Zs., Elekes K., Németh J., Pozsgai G., Sándor K., Kereskai L., Börzsei R., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in endotoxin-induced airway inflammation in the mouse. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology 292(5): 1173-1181. 2007 (IF: 4.25, SCI: 3) 6. Elekes K., Helyes Zs., Németh J., Sándor K., Pozsgai G., Kereskai L., Börzsei R., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-induced airway inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse. Regulatory Peptides 141(1-3): 44-54. 2007 (IF: 2.422, SCI: 2) 7. Pozsgai G., Sándor K., Perkecz A., Szolcsányi Zs., Helyes Zs., S.D. Brain, Pintér E.: Topical acetone treatment induces neurogenic oedema on the sensitized mouse ear: an in vivo study using transient receptor potencial vanilloid 1 (TRPV1) receptor knockout mice. Inflammation Research 56: 459-467. 2007 (IF: 1.504) 8. Elekes K., Helyes Zs., Kereskai L., Sándor K., Pintér E., Pozsgai G., Tékus V., Bánvölgyi Á., Németh J., Szűts T., Kéri Gy., Szolcsányi J.: Inhibitory effects of synthetic somatostatin receptor subtype 4 agonists on acute and chronic airway inflammation and hyperreactivity in the mouse. European Journal of Pharmacology 578(2-3): 313-322. 2008 (IF: 2.376, SCI: 1)
21
LIST OF PRESENTATIONS ON INTERNATIONAL CONGRESSES 1. Pozsgai G., Helyes Zs., Szabó Á., Keszthelyi D., Németh J., Elekes K., Sándor K., Szolcsányi J., Pintér E.: Pharmacological investigation of a selective non-peptide somatostatin receptor type 4 agonist in vitro and in vivo. European Neuropeptide Club, 15th Annual Meeting, Riga, Latvia, 2005 (abstract in Neuropeptides 39(6), p.619., 2005. (IF: 2.15)) 2. Pintér E., Helyes Zs., Pozsgai G., Szabó Á., Keszthelyi D., Németh J., Elekes K., Sándor K., Szolcsányi J.: Characterization of anti-inflmmatory actions of a novel selective non-peptide somatostatin 4 receptor agonist in rodents. Summer Neuropeptide Conference, Miami Beach, Florida, USA, 2005 (abstract in Neuropeptides 40(2), p.156., 2005. (IF: 2.81)) 3. Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Inhibitory effect of the selective sst4 receptor agonist J-2156 on nocifensive behaviour in acute and chronic pain models of mice and rats. The 15th World Congress of Pharmacology, Beijing, China, 2006 (abstract in Acta Pharmacologica Sinica, 27(suppl 1), p.111., 2006. (IF: 1.12) SCI: 1) 4. Pintér E., Helyes Zs., Németh J., Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pozsgai G., Engström M., Würster S., Keszthelyi D., Szolcsányi J.: Anti-inflammatory effect of somatostatin receptor subtype 4 selective agonist J-2156 in rodents. The 15th World Congress of Pharmacology, Beijing, China, 2006 (abstract in Acta Pharmacologica Sinica 27(suppl 1), p.277., 2006. (IF: 1.12)) 5. Sándor K., Bölcskei K., Elekes K., Pintér E., Pethő G., Reglődi D. Szolcsányi J.,Helyes Zs.: Peripheral anti-nociceptive effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 in rats and mice. European Neuropeptide Club, 17th Annual Meeting, Santorini, Greece, 2007 6. Pintér E., Sándor K., Helyes Zs., Pozsgai G., Szolcsányi J.: Somatostatin 4 (sst4) receptor mediates inhibitory effects on carrageenan-induced paw inflammation in rodents. European Neuropeptide Club, 17th Annual Meeting, Santorini, Greece, 2007 7. Helyes Zs., Elekes K., Pozsgai G., Sándor K., Keszthelyi D., Kereskai L., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: Protective role of the somatostatin receptor subtype 4 (sst4) in endotoxin-induced airway inflammation: in vivo studies on gene-deficient mice. Second International Congress on Immune-Mediate Diseases: from Theory to Therapy, Moscow, Russia, 2007 (abstract in Allergology and Immunology in Pediatrics 11 (suppl. 2), p.25., 2007) 8. Reglődi D., Németh J., Pozsgai G., Sándor K., Börzsei R., Bagoly T., Elekes K., Pintér E., Kiss P., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Effect of PACAP-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. 7th International Conference of Neuroimmunology, Rio de Janeiro, Brazilia, 2008
LIST OF PRESENTATIONS ON NATIONAL CONGRESSES 1. Helyes Zs., Szabó Á., Németh J., Jakab B., Bite A., Sándor K., Pintér E., Bánvölgyi Á., Szolcsányi J.: Kapszaicinérzékeny szenzoros idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin gyulladásgátló és fájdalomcsillapító hatása krónikus ízületi gyulladásos patkánymodellben. Magyar Élettani Társaság LXVIII. Vándorgyűlése, Pécs, 2004 2. Elekes K., Helyes Zs., Sándor K., Beck A., Kereskai L., Pintér E., Szabó Á., Szolcsányi J.: A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, hatásának vizsgálata szubakut légúti gyulladásos egérmodellben. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság IV. Konferenciája, Debrecen, 2004 3. Helyes Zs., Németh J., Elekes K., Keszthelyi D., Pozsgai G., Szabó Á., Sándor K., Pintér E., Szolcsányi J.: A szelektív szomatosztatin 4 (sstr4) agonista KD5621 farmakológiai vizsgálata in vitro és in vivo . Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Pécs, 2005 Poszterdíj 4. Pozsgai G., Helyes Zs., Szabó Á., Keszthelyi D., Németh J., Elekes K., Sándor K., Szolcsányi J., Pintér E.: Investigation of a selective non-peptide somatostatin receptor type 4 agonist in different inflammatory models. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság, a Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005 5. Elekes K., Helyes Zs., Sándor K., Bölcskei K., Almási R., Pozsgai G., Pintér E., Keszthelyi D., Szabó Á., Szolcsányi J.: A szelektív szomatosztatin 4 receptor (sst4) agonista J-2156 hatásának vizsgálata állatkísérletes fájdalommodellekben. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Siófok, 2005
22
6. Helyes Zs., Sándor K., Pintér E., Szabó Á., Elekes K., Keszthelyi D., Pozsgai G., Kereskai L., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J.: A szelektív szomatosztatin 4 receptor (sst4) agonista J-2156 gyulladásgátló és antinociceptív hatásának vizsgálata akut és krónikus gyulladásmodellekben . Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság V. Konferenciája, Debrecen, 2005 7. Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Az sst4 receptor szelektív agonista j-2156 hatásainak vizsgálata krónikus gyulladás és neuropáthia modellekben. A Magyar Farmakológiai Társaság Experimentális Szekciójának II. vándorgyűlése, Pécs, 2006 8. Helyes Zs., Pintér E., Németh J., Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pozsgai G., Keszthelyi D., Engström M., Wurster S., Szolcsányi J.: Effects of the novel selective non-peptide somatostatin sst4 receptor agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and acute inflammatory reactions. A Magyar Farmakológiai Társaság Experimentális Szekciójának II. vándorgyűlése, Pécs, 2006 9. Sándor K., Bölcskei K., Elekes K., Pintér E., Pethő G., Reglődi D, Szolcsányi J., Helyes Zs.: Peripheral anti-nociceptive effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 in rats and mice. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Gyula, 2006 10. Helyes Zs., Pintér E., Sándor K., Pozsgai G., Szolcsányi J.: A szomatosztatin 4 receptor (sst4) gátló szerepe rágcsálókban carrageeninnel kiváltott gyulladásmodellekben. A Magyar Experimentális Farmakológia III. Szimpóziuma, Budapest, 2007 11. Helyes Zs., Sándor K., Elekes K., Bánvölgyi Á., Markovics A., Pintér E., Szolcsányi J.: A szomatosztatin sst4 receptor szerepének vizsgálata akut és krónikus gyulladásmodellekben egérben. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság és a Magyar Élettani Társaság LXXII. Vándorgyűlése Debrecen, 2008 (abstract in Acta Physiologica Hungarica)
ACKNOWLEDGEMENTS I would like to express my gratitude to everyone who helped my work. First of all I would like to express my warmest thanks to my supervisor Dr. Helyes Zsuzsanna for introducing me into research, showing me example of diligence, professional and technical knowledge, optimism and tireless enthusiasm. I also thank Dr. Erika Pintér for her useful contributions to make my research work successful, and also for her professional advices and unforgettable friendship. I am most grateful to Prof. János Szolcsányi, the leader of Neuropharmacology PhD program, for rendering me to join his project and for always showing me the right directions in my research work. I thank the head of the Department of Pharmacology and Pharmacotherapy, Prof. Loránd Barthó for giving me the opportunity to work at the department as a PhD student. I would like to express my special thanks to Anikó Perkecz, my „laboratory room mate” for tolerating me as well as for her friendship, professional slides and for helping my work throughout several years. I am very grateful to Dr. Kata Bölcskei for helping me as much as possible with her technical, experimental and professional expertise and freindly advices. I also thank for the essential help in the experiments for Kati Gógl, Csilla Zádor, Dóra Ömböli, Mária Zöldhegyi, Valéria Tékus, Dr. Gábor Pozsgai, Dr. Krisztián Elekes, Dániel Tóth and our student research fellows: Adrienn Markovics, Éva Borbély and Dániel Keszthelyi. I also thank Dr. Ágnes Bánvölgyi for the perfect photos she took for me. I am grateful to all the people in the Department of Immunology and Biotechnology for helping me in the in vitro experiments. I would like to thank Dr. László Kereskai for evaluating and scoring the histological slides. I thank Dr. János László for the useful cooperation in the static magnetic field studies. I wish to thank Dr. Dóra Reglődi and Dr. Jason J. McDougall for the fruitful cooperation in the PACAP studies. Finally, I cannot be grateful enough to my family for encouraging and supporting me with their love, patience, tolerance, and tireless faith.
23
