BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK A növények, mint ahogy minden élőlény, életük során számos káros környezeti hatásra (szárazság, hőmérséklet-változás, légszennyeződés, kórokozókkal történő fertőződés, stb.) reagálnak. A hatás erősségétől függően látható vagy mérhető stressz szimptómák jelennek meg a növényeken. Nehéz meghatározni az egyes környezeti tényezők hatásának a stressz kiváltásához elegendő szintjét, ahol az anyagcsere-folyamatok stressz anyagcsere-folyamatokba váltanak át (Elstner és Osswald, 1994). A stressz anyagcsere-folyamatok általában oxidatív reakciókkal jellemezhetők. Az „oxidatív stressz” meghatározással gyakran találkozhatunk a szabad gyökökkel foglalkozó szakirodalomban, annak definícióját azonban kevesen fogalmazzák meg. Sies (1991), aki „Oxidative Stress” c. könyvével ezt a kifejezést a tudományos fogalomtárba bevezette, lényegretörően fogalmazta meg, mit is jelent az oxidatív stressz: ez nem más, mint a prooxidánsok és az antioxidánsok között fellépő, a prooxidánsok javára történő egyensúlyeltolódás, amely akár károsodáshoz is vezethet. A prooxidánsok, azaz az oxigén aktív formái (ezután OAF) részben szabad gyökök, mint pl. a szuperoxid (O2•-), és a hidroxil gyök (OH•), amelyek párosítatlan (extra) elektronnal rendelkeznek, illetve olyan molekulák, amelyek reakcióik során szabad gyök képzésére képesek, mint pl. a hidrogén-peroxid (H2O2) és a szingulett oxigén (1O2 ). Ezek a gyökök és molekulák a molekuláris oxigénből sorozatos redukcióval keletkeznek és elektronszerkezetüket tekintve átmenetet képeznek a legoxidáltabb dioxigén és a legredukáltabb állapotú víz között. Az oxidatív stresszt kiváltó, rendkívül reakcióképes szabad gyökök és prooxidáns tulajdonságú molekulák a sejt szinte bármilyen molekulájában kárt tehetnek, beleértve a ribonukleinsavakat, fehérjéket, lipideket. Ez a folyamat többnyire akkor következik be, ha az OAF-nak gyors, nagy mennyiségű átmeneti képződése kikerül a biokémia reakciók ellenőrzése alól. A növényi sejtek azonban több antioxidáns tulajdonságú molekulával rendelkeznek az OAF-ot termelő folyamatok szabályozására és az OAF méregtelenítésére (Van Kuijk et al., 1987). Ide tartoznak a kismolekulájú nem enzimatikus antioxidánsok 1
(aszkorbát, glutation, E-vitamin, stb.), az egyes enzimek (szuperoxid-dizmutáz, aszkorbát-peroxidáz, dehidroaszkorbát-reduktáz, glutation S-transzferáz, glutationreduktáz, kataláz, peroxidáz stb.), valamint több összetett enzimrendszer, amely képes hatékonyan védelmezni azokat a sejtalkotókat, amelyekben lokalizáltak. A szabad gyökökkel és antioxidánsokkal foglalkozó kórélettani szakirodalom mindeddig elsősorban a hiperszenzitív reakcióra, inkompatibilis gazda-parazita kapcsolatok vizsgálatára koncentrált, és csak érintőlegesen foglalkozott a kompatibilis kapcsolatokban betöltött szerepükkel. Különösen hézagosak az ismereteink az oxigén aktív formáival egyensúlyt tartó antioxidánsok ilyen irányú vonatkozásait illetően. Célunk többek között ezen hiányosság megszüntetése. Előzetes elgondolásunk alapján az oxigén aktív formáinak a nekrotikus tünetek kialakításában kulcsfontosságú szerepe van. A nekrotikus tünetek kialakulása sokszor elengedhetetlen az indukált rezisztencia formák kiváltásában, bár vizsgálatok alátámasztják, hogy a HR nem oka csak velejárója a rezisztenciának (Cole et al., 2001; Bendahmane et al., 1991). Céljaink megvalósítása érdekében több vírus és növény kapcsolatát vizsgáltuk. Az oxigén aktív formái közül a szuperoxid gyök, a hidrogén-peroxid valamint a mono-dehidroaszkorbát gyök változásait kísértük figyelemmel. Az antioxidánsokon belül a szuperoxid-dizmutáz, kataláz, peroxidáz, glutation-reduktáz, glutation S-transzferáz, aszkorbát, aszkorbátperoxidáz, és dehidroaszkorbát-reduktáz volt vizsgálatunk tárgya. A következő kérdésekre kerestük a választ: • Milyen szerepet játszanak az oxigén aktív formái a nekrotikus tünetek kialakításában ? • Van-e szerepük a klorotikus tünetek megjelenésében, és ha igen, milyen ? • Milyen az antioxidáns kapacitás a nekrózist és klorózist kifejező szövetekben ? • A lokális és szisztemikus klorózis különbözik-e az antioxidáns kapacitás szempontjából? • A különböző kórokozókkal indukált szisztemikus szerzett rezisztencia során hogyan változik az antioxidánsok kapacitása? 2
ANYAG ÉS MÓDSZER Kísérleteinkben a következő növényeket alkalmaztuk: Xanthi-nc dohányt (Nicotiana tabacum L. cv Xanthi-nc), amely rendelkezik a Nicotiana glutinosa dohányból származó N génnel, így a dohány mozaik vírus nekrotikus
léziókat
képez
a
növényen.
A
Xanthi-nc
dohány
genetikai
transzformációjával előállított transzgénes NahG-10 dohánytörzset, amely magas szinten termeli a Pseudomonas putida baktériumból származó nahG gén által kódolt szalicilsav-hidroxiláz enzimet. A szalicilsav-hidroxiláz a szalicilsavat katechollá (1,2-dihidroxi-fenol) alakítja, ezért a NahG képtelen felhalmozni a szalicilsavat. Kísérleteinkbe a 8-10 hetes kort elért növényeket vontuk be. A Chenopodium quinoa Wild. a libatopfélék (Chenopodiaceae) családjába tartozik, a vírusdiagnosztikában gyakran alkalmazott növény. A kísérleteket 6-8 hetes, 6 lombleveles fejlettségi állapotú növényeken végeztük. Az uborkanövények (Cucumis sativus L., Regal csemegeuborka fajtajelölt, Agroveritas Kft.) az uborka mozaik vírussal szemben toleránsak. A növényeket 10 napos szikleveles állapotban, valamint 20 napos 2 lombleveles fejlettségi állapotban alkalmaztuk a kísérletekben. Az itt felsorolt növényeket üvegházban neveltük normál körülmények között (16 h természetes megvilágítás / 8 h sötét periódus, 20-25ºC hőmérsékleten). A vizsgálatokban a következő vírusokat alkalmaztuk: A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus, TMV) U1-es törzsét, a dohány nekrózis vírust (tobacco necrosis necrovirus, TNV), a cukkini sárga mozaik vírus, ZYMV-10-el jelölt törzsét, (zucchini yellow mosaic potyvirus, ZYMV), az uborka mozaik vírus U264-es törzsét (cucumber mosaic cucumovirus, CMV) és a chenopodium mozaik vírust (sowbane mosaic sobemovirus, SoMV). Az egyes vírusokat a nekik megfelelő tesztnövényeken tartottuk fenn, az inokulációknál Sörensen puffert alkalmaztunk. A tízhetes Xanthi és NahG növényeket a TMV U1 törzsével fertőztük. Először a sziklevél fölötti negyedik és ötödik valódi levelet fertőztük, hogy indukáljuk a 3
rezisztenciát a felső levelekben. Két héttel később az immár ellenállóvá lett hatodik és hetedik levelet fertőztük. A fertőzött növényeket a mérések folyamán azokhoz a kontroll növényekhez hasonlítottuk, melyek leveleit a kísérlet beállításakor csapvízzel kezeltünk. A C. quinoa növényeket négy különböző vírussal fertőztük, TNV-vel, mely lokális nekrózisokat okoz a növényen, TMV-vel, mely szintén lokális nekrózist okoz, de kialakulásának ideje hosszabb, ZYMV-vel, mely lokális klorózist okoz, valamint SoMV-vel, mely szisztemizálódik a növényben, mozaik tünetet okozva. A hat lombleveles fejlettségi állapotú növények harmadik és negyedik levelét fertőztük, a felülfertőzéseket pedig egy hét elteltével az ötödik, hatodik levélszinten végeztük, a kórokozó mindig TNV volt. A nyolcnapos uborkanövényeken a következő vírusfertőzéseket végeztük el: TNVlokális nekrózisokat okoz a növényen, ZYMV-szisztemikus klorózist, míg a CMV mozaik tünetek okoz, azonban ez utóbbi az uborka rezisztenciája miatt nem jelenik meg a növényeken. A felülfertőzéseket itt is TNV-vel végeztük, a két fertőzés között hét nap telt el. Szalicilsav (2-hidroxi-benzoesav) nátriumsójának 800 µM töménységű vizes oldatával, fecskendő segítségével telítettük a sejtközötti járatokat. A kontroll leveleket csapvízzel injektáltuk. Analitikai módszerek: A mono-dehidroaszkorbát gyök (MDA•) elektronspin rezonancia spektroszkópiás (ESR) meghatározását Hideg et al. (1997) módszere alapján végeztük. Az MDA• szinteket X-sávú (kb. 9,2-9,6 GHz) ESR abszorpcióként Bruker EC-106 spektrométerrel
detektáltuk
az
MDA•-ből
képződő
duplett
jel
alacsony
térerősséghez tartozó csúcsánál. A kísérleti feltételek a következők voltak: 9,35 GHz mikrohullámú frekvencia, 2mW teljesítmény valamint 100 kHz-es modulációs frekvencia, 0,1 mT modulációs amplitúdó, 1 másodperces integrálási idő mellett. Az MDA gyök relatív koncentrációit az alacsony térerősséghez tartozó derivált jel magasságából kaptuk meg. 4
A sejthalál kimutatása Evans-kék biológiai indikátor 0,5 %-os vizes oldatával Baker és Mock (1994) alapján végeztük. A hidrogén-peroxid specifikus festéssel történő kimutatására 3,3’-diaminobenzidin 0,1%-os vizes oldatát (pH 3,8) használtuk (Thordal-Christensen, 1997). A szuperoxid kimutatására p-nitrotetrazólium (NBT) kék indikátort használtunk Doke (1983) szerint, a 10mM-os Na-foszfát pufferben 0,1 % NBT-t és 10 mM NaN3-ot oldva. A levélminták színtelenítéséhez 0,15 % triklór-ecetsavat tartalmazó kloroform:etanol 1:5 aranyú elegyét alkalmaztuk. A hidrogén-peroxid mérésére használt módszer a xilenol narancs festék reakcióján alapul, mely spektrofotométerrel detektálható (Marre et al., 1998). A mintához 1:1 arányban festéket tartalmazó elegyet adtunk, majd 25 oC-on 45 percig inkubáltuk. Az extinkciót 560 nm-en mértük, ismert hidrogén-peroxid mennyiségekkel kalibrációs görbét készítettünk. A sejtmentes enzimkivonatok fehérjetartalmát Bradford (1976) módszere alapján határoztuk meg, marha szérum albumint használva standardként. A szuperoxid-dizmutáz kimutatásához elektroforézist nem denaturáló 10%-os lapgélen, Davis (1964) által leírt pufferrendszerrel végeztük. Az izoenzimeket Beuchamp és Fridovich (1971) negatív festési módszerével, riboflavin (0,6m M) és p-nitrotetrazólium kék (1mM) felhasználásával tettük láthatóvá. Enzimaktivitások fotometriás mérése során az aszkorbát-peroxidáz aktivitását Nakano és Asada (1981) módszere alapján, 0,25 mM aszkorbinsav és 0,5 mM hidrogén-peroxid felhasználásával hajtottuk végre. A dehidroaszkorbinsavreduktáz aktivitásának méréséhez (Asada, 1984) 20 µM dehidroaszkorbinsav és 40 µM redukált glutation oldatot használtunk. A glutation-reduktáz aktivitását Klapchek et al. (1990) módszere alapján mértük 0,1mM redukált nikotinamidadenin-dinukleotid foszfát és 0,6 mM oxidált glutation felhasználásával. A glutation S-transzferáz aktivitását Mauch és Dudler (1993) szerint 3,6 mM redukált glutation és 1 mM 1-klór-2,4-dinitro-benzol felhasználásával határoztuk meg. A kataláz aktivitását Aebi (1984) szerint 10 mM hidrogén-peroxidot 5
alaklmazva, a peroxidáz aktivitását Rathmell és Sequeira (1974) módszere alapján, 2 mM guajakol és 1,3 mM hidrogén-peroxid segítségével mértük. Az aszkorbinsav koncentrációját Wise és Naylor (1987) alapján fotometriásan mértük aszkorbát-oxidáz enzim felhasználásával. Isaken (1991) alapján történt a flavonoidok vizsgálata. A mintákat metanolban inkubáltuk, majd az így nyert növényi kivonatokat szilikagélen (Kieselgel 60, Merck, Németország) elválasztottuk. A kromatogramok kifejlesztéséhez a futtatóelegy etilacetát : ecetsav : hangyasav : víz - 100 : 11 : 11 : 27 (v/v) arányú elegye. A futtatást szárítás követte, majd a reagens felvitele a vékonyréteg-lapra. A reagens minden esetben az 1%-os metanolban oldott 2-aminoetil-difenil-bórsav (w/v) volt. A polifenolokat UV-fényben detektáltuk, minőségi meghatározásuk Rf értékeik alapján történt. A dohánylevelekben a TMV koncentrációját ELISA módszerrel mértük, Clark és Adams (1977) alapján.
6
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. A Xanthi-nc és NahG dohánynövények fertőzött leveleiben megnő a mono-dehidroaszkorbát gyök (MDA•) mennyisége, az emelkedés a kontrollhoz képest több százszoros. Az MDA• állandósult megnövekedése utal a gyök és az aszkorbáttá történő redukció közötti egyensúlyvesztésre. 2. E megnövekedett MDA• mennyiség nemcsak lokálisan, de szisztemikusan is észlelhető; a fertőzés helyétől távolabbi fertőzetlen levelekben ugyan kisebb, de a kontrollhoz képest szignifikáns, nagyobb ESR jelet mértünk. Ez a megfigyelés alátámasztja Alvarez et al. (1998) vizgálatait, miszerint a lokális fertőzés szisztemikus mikrooxidatív robbanást (burst) indukál a növény távolabbi fertőzetlen részeiben. Az MDA gyök szisztemikus felszaporodása a fertőzetlen levelekben azonos időben történik az alsó leveleken kifejlődő nekrotikus tünetek megjelenésével. 3. A fényben mért ESR jelek nagyobbak, mint a sötétben észleltek, különbségük azonban nem változott a fertőzött növényekben a kontroll növényekhez
viszonyítva.
MDA•
Az
képződés
tehát
részben
visszavezethető a TMV által károsított sejtek kloroplasztiszaiban, az elektronoknak az oxigénre majd az aszkorbinsavra kerülésével, azonban a mért MDA• jelek nagyobb része független a fénytől, ami arra utal, hogy az OAF képződése nem köthető össze kizárólag csak a kloroplasztisszal. Az OAF keletkezésének helyei ugyanúgy lehetnek a mitokondriumok, a citoplazma, vagy az apoplaszt illetve a vakuolum is. 4. A TMV fertőzött szisztemikus szerzett rezisztenciával rendelkező levelekben alacsonyabb az MDA• akkumuláció. Ugyanakkor a NahG-ben, ahol a nekrotikus léziók kiterjedése nagyobb, az MDA• mennyisége is nő a
7
Xanthihoz képest. A rezisztenciával rendelkező levelekben mért alacsonyabb MDA• jel összefüggésben van a kisebb szövetnekrózissal. 5. Az elsődlegesen fertőzött sejtből kiindulva a nekrózis kifejlődése során a szuperoxid először csak néhány, a fertőzött sejttel szomszédos sejtben, majd később a fokozatosan táguló nekrózis körüli gyűrűben mutatható ki. A festődés gyűrűje megegyezik a vírus sejtről-sejtre terjedésének egyedi mintázatával. 6. A TNV körüli gyűrűből kiinduló hajszálerek is festődnek, ez a festődés specifikusan csak a fejlődő léziók környékén figyelhető meg, az elöregedett léziókra már nem jellemző. Ez arra utal, hogy a szuperoxid gyök képződése összefüggésben van a vírus terjedésével és ugyanakkor a nekrotikus tünetek kialakulásával is. 7. A szuperoxid gyök csak a nekrózist szenvedő sejtekben mutatható ki, és csak a nekrózissal járó gazda – parazita kapcsolatokat jellemzi, a lokális klorózis és mozaik tünetek esetén nem mutatható ki szuperoxid felhalmozódás. 8. A sejthalál (Evans-kék festődés) is csak a nekrózissal járó tüneteket jellemzi, a klorotikus tünetek esetében a nem tapasztaltuk a sejtek elhalását. 9. A hidrogén-peroxid termelődése nemcsak a gyűrűn belül figyelhető meg a nekrotikus kapcsolatoknál, hanem az erekben is, a lokális klorózis és a mozaik
tünetek
esetében
nem
mutatható
ki
hidrogén-peroxid
felhalmozódás kivétel ez alól a ZYMV és az uborka kapcsolata, ahol kisebb, de a kontrollhoz képest jelentős mértékű a hidrogén-peroxid felhalmozódása. 10.Az
antioxidáns
enzimek
aktivitásának
növekedése
lokálisan
szisztemikusan egyaránt az inkompatibilis kapcsolatokra jellemző. 8
és
11.A lokális és szisztemikus klorózis esetén az antioxidáns kapacitás nem a tünetek függvénye, hanem a kapcsolaté, azaz az abszolút kompatibilis kapcsolatot (SoMV / Ch. quinoa) nem jellemzik oxidatív folyamatok.
9
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBŐL KÉSZÜLT KÖZLEMÉNYEK Cikkek, tankönyvrészlet, teljes terjedelemben megjelent konferencia előadás Józsa, A. (1996): Vírusfertőzött növények antioxidáns enzimrendszere. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely, pp.11-16. Gullner, G., Fodor, J., Józsa, A., Gáborjányi, R., Király, Z. (1997): Responses of the ascorbate-glutathione cycle to necrotic virus infections in tobacco. Phyton, 37: 95-100. Fodor, J., Józsa, A., Király, Z. (1998): A növények „immunizálása”: új védekezési lehetőség a betegségek ellen. Növényvédelem 34:117-126. Józsa, A. (1998): Reaktív oxigén formák és antioxidánsok szerepe Chenopodium quinoa növények betegségtüneteinek kialakulásában. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely, pp.160-165. Józsa, A. (1999): Reaktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek. In: Horváth József és Gáborjányi Richard (Eds.): Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek. Mezőgazda Kiadó. pp.317-338. Gullner, G., Józsa, A., Gáborjányi, R., Kőmíves, T. (2000): Induction of glutathione S-transferase activity in tobacco leaves following two different virus infections. In: Proceedings of the 6th International Conference on Plant Diseases, Tours, France, Vol. 2, pp. 569-574. Fodor, J., Hideg, É., Kecskés, A., Király, Z. (2001): Monodehydroascorbate radical detected in virus-infected tobacco signals oxidative stress and systemic acquired resistance. Plant and Cell Physiol. (megjelenés alatt) Király, Z., Barna, B., Kecskés, A., Fodor, J. (2001): Role of down-regulation of antioxidants in increased susceptibility to viral necrotic symptoms and in the lack of systemic acquired resistance of the NahG transgenic tobacco. Plant Physiol. (2.elbírálás alatt)
10
Előadások, poszterek Gullner, G., Fodor, J., Józsa, A., Gáborjányi, R., Király, Z. (1996): Responses of the ascorbate-glutathione cycle to necrotic virus infections in tobacco. Oxygen, free radicals and environmental stress in plants. 2nd International Conf. of the Society for Free Radical Research. Vienna, Austria. Józsa, A., Király, Z., Gullner, G., Gáborjányi, R. (1996): Vírusfertőzött növények antioxidáns enzimrendszere. Növényvédelmi Fórum, Keszthely, p. 21. Fodor, J., Józsa, A., Gullner, G., Király, Z. (1997): Role of antioxidants in the induced plant resistance: results with a transgenic tobacco expressing the NahG gene. Stress of Life (Stress and Adaptation from Molecules to Man). International Congress of Stress Budapest, p.53. Józsa, A., Fodor J., Király, Z. (1997): A dohánymozaik és a higany-klorid indukálta szisztemikus szerzett rezisztencia összehasonlítása. Növényvédelmi Fórum, Keszthely, p. 26. Józsa, A., Fodor, J., Király Z. (1997): Comparison of systemic acquired resistance induced by mercuric chloride and tobacco mosaic virus. 9th Bilateral Meeting of the Institute of Plant Pathology and Plant Protection, Göttingen and Plant Protection Institute, Budapest, Mátraháza. Józsa A., Fodor J., Király Z. (1998): Reaktív oxigén formák és antioxidánsok vizsgálata Chenopodium quinoa növényeken. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest, p. 100. Józsa A., Fodor, J., Király, Z. (1998): Reaktív oxigén formák szerepe Chenopodium quinoa növények különböző betegségtüneteinek kialakulásában. Növényvédelmi Fórum, Keszthely, p. 22. Józsa, A., Fodor, J., Király, Z. (1998): Reaktív oxigén formák és antioxidánsok szerepének vizsgálata különböző tüneti kifejeződésű gazda-parazita kapcsolatokban. Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygyűlése, Miskolc. Gullner, G., Fodor, J., Józsa, A., Gáborjányi, R., Kőmíves, T. (1999): Differential changes of glutathione levels and glutathione S-transferase activities in compatible and incompatible plant virus interactions. The 13th John Innes Symposium, Norwich, p. 29. 11
Hideg, É., Fodor, J., Józsa, A., Király, Z. (1999): A mono-dehidroaszkorbinsav koncentrációja alkalmas a fertőzött növényt ért oxidatív stressz jellemzésére. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest, p. 103. Kálmán, D., Fodor, J., Pogány, M., Józsa, A. (1999): Antioxidáns enzimek aktivitás változásai rezisztencia növelő anyagok hatására és a vírusellenállóság kérdése. Növényvédelmi Fórum, Keszthely, p. 34. Gullner, G., Józsa, A., Gáborjányi, R., Kőmíves, T. (2000): Activation of glutathione-related defense reactions in virus-infected plants. Joint Meeting of COST Action 829 Working Groups I and III: Sulfur Metabolism and Crop Resistance to Pests. Graz, Austria. Abstract vol. p. 15. Király, Z., Fodor, J., Józsa, A., Barna, B. (2000): Systemic acquired resistance and the up-regulated antioxidant system. 4 th Int. Symp. Plant Pathology and Biotechnology, Hangzhou, China. Nov 5-9, Abstract.
12
