Balogh Zoltán TOXI-COOP Zrt 2011.
A nagy eleink Dr. Cholnoky Eszter 1928 - 1987. Dr. Kállai László
1927 – 2007.
Laboratóriumi állatok történelme röviden Kr.e. 2-3000 évvel Rattus norvegicus vagy
Oryzomys spp. (O. paluistris) Sigmodon spp. (S. hispidus) Kr.u. XVIII. sz. : Háziállatok kutya, ló, baromfik XIX. sz. : Egér, patkány fajták, törzsek 1957 – 61. Talidomid-botrány: nyúl, beagle 1967. Dr. Kállai László -Gödöllő LATI Napjaink: gyorstesztek, kb. 28000 egér, több ezer patkány fajta
• 1968-tól LATI folyamatosan növeli kapacitását • 1978. Veszprém NEVIKI már több száz beagle-t
használ évente • 1987. LATI meghaladta az évi 1 millió állat előállítását • 1990. Rendszerváltás- 2-300 000 állat felhasználás/év • 2000. A felhasználás visszaáll az 1994. szintre • 2011. Soha nem lesz 1 millió db/év, de mindig lesz
állatfelhasználás
A Laboratóriumi állatok tenyésztése
Beszélünk:
állat tartásról: etetünk, itatunk, gondozunk szaporításról: sokszorosítjuk az állományt tenyésztésről: genetikai alapot használjuk
A laborállatok genetikája Fenotípus - külső, megjelenési forma
Genotípus + környezeti hatás= Fenotípus változása a modifikáció 1. rendszertelenül ható : magaslati vvt szám növekedés 2. rendszeresen ismétlődő: a szőrzet évszakonként szín és tömöttség változása, 3. maradandó változás: fiatalkori alultápláltság, öregedés Genotípus – gén készlet határozza meg, belső tulajdonságokat meghatározó tényező
A genotípus – az állandóságra, az ismétlődésre törekszik az öröklődési szabályok szerint A változás történhet: Spontán Tenyésztés során Biotechnológiai módszerekkel
Genetikai alapfogalmak, emlékeztető - ♂ Mars pajzsa és dárdája nőstény - ♀ Vénusz tükre Mitózis: testi sejtosztódás fázisok: pro-,meta-,ana-, telofázis Meiozis: ivarsejtek keletkezése, fél kromoszóma garnitúra. A profázis további öt fázisra bontható. Gén: L. Johansen (1886-1955) 1906-ban nevezi el (egy tulajdonság DNS szakasz) Lókusz: A gén effektív helye a kromoszómán. Allél:Ugyan azon a lókuszon helyeződő gének csoportja. Alél pár: anyai és apai allélek
Ivar jelölése : hím
Korai anafázis: A centroszómák a pólusokhoz rendeződtek. A világoskék kromoszómák szétváltak.
Prometafázis
Metafázis
Korai anafázis
Telofázis
Thomas Hunt Morgan Born: 25 September 1866, Lexington, KY, USA Died: 4 December 1945, Pasadena, CA, USA 1910.A gének meghatározott helyen vannak a kromoszómákon Columbia – Drosophila melanogaszter 1933. Nobel-díj
Wilhelm Ludvig Johannsen
Born
3 February 1857 (1857-02-03)
Died
11 November 1927 (1927-11-11) (aged 70)
Elsinore, Denmark
Copenhagen, Denmark Nationality Danish
Homológ kromoszóma: Azon kromoszómák, amik
azonos lókuszon, azonos génpárokat tartalmaznak Mutáció: Genetikai változás - gén - kedvező - kedvezőtlen - közömbös - kromoszóma: Down-kór, Crossing –ower - genom: poliploidia Homozigóta: minden allélpár azonos információt Heterozigóta: eltérő információt tartalmaz
Öröklés menetek Johann Gregor Mendel : 1822 – 1884. Ágoston rendi szerzetes. Szudétanémet. Csak a képességek örökléséről beszélhetünk: A tulajdonságok kialakulásához a környezeti hatás is szükséges. (genotípus + környezeti hatás = Fenotípus)
Gregor Johann Mendel (born 22nd July 1822, died 6th January 1884)
Mendeli alaptörvények 1.
Uniformitás – az F1 nemzedék egyforma
2.
Gaméták tisztasága – egy allélpár csupán egyik tagja lehet jelen egy gamétában
3.
Hasadás – az öröklődési tényezők párosával öröklődnek, de szétválnak a gamétákban
4. Tulajdonságok független öröklődése – a szétvált
tulajdonságok az utódokban szabadon újrakombinálódnak
Mendeli törvények kiegészítése, finomítása
Domináns Intermedier Reciprok keresztezés – mitokondriális öröklés Különleges vagy kriptointermedier – ua. mint a domináns, de jel utal a keresztezésre Feltételes dominancia – intermedier, de pl. hőmérséklet függő Mozaik megjelenés Változó dominancia Poliméria – poligén tulajdonságok Pleiotropia –egy gén több irányban hat Episztázis – hiposztázis hatás – egyik gén egyáltalán nem enged érvényre jutni, tiltó gének
A tenyésztés alapjai Ismerni szükséges - A populáció és az egyedek genetikai hátterét - A célt amit el kívánunk érni - A tulajdonságok átöröklődő képességét : h² - A módszereket - Az összefüggéseket
Átörökítő képesség= h² Öröklődhetőségi együttható = h² érték. hereditabilitas A populáció egy tulajdonságának egyik generációról a másikra átörökítésének valószínűsége genetikai variancia
h² = ------------------------------lehet vagy
fenotipusos variancia 0 – 1 0 - 100 %
Néhány tulajdonság átöröklődési képessége Rosszul öröklődő: 0 - 0,3 Közepesen öröklődő: 0,3 - 0,6 Jól öröklődő: 0,6 - 1
Ember testmagassága Egér farok hossz Egér alom nagyság Drosophila hasi szőr száma Seregély fészekalj méret
0,65 0,40 0,20 0,50 0,20
A szelekció a tenyésztés alapja Szelekció = kiválogatás 1. Természetes 2. Mesterséges
Továbbtenyésztési hányad = csak azok a tenyészállatok, amik részt vesznek a következő generáció létrehozásában. Meghatározza: A tulajdonság h² értéke A populáció fenotipusos varianciája (mennyire változatos)
Szelekciós nyomás: célirányos és folyamatos tevékenység Fenotipusos Genotípusos Direkt Indirekt Tandem Kontra stb. Minél több szempont szerint szelektálunk: fordítottan arányos az előrehaladás
Rendszerint hatnak a tulajdonságok egymásra: Genetikai korrelációk Fenotipikus korrelációk
Pl. genetikai: poliméria, pleiotropia, episztázis,hiposztázis hatások fenotipusos: testtömeg - szaporaság
Hardy – Weinberg szabály Két allél előfordulási gyakorisága egy populációban – panmixia esetén - egyensúlyban van. p2 + pq + q2 = 1
Punett- tábla a géngyakoriság számításához Apa ♂♂ frekvencia frekvencia
Anya ♀♀
pA
qa
pA
qa
gén
A
a
A
AA
Aa
p2A
pAqa
Aa pAqa
aa q2a
a
A háromféle genotípus frekvenciája tehát: Genotípus: Génfrekvencia:
AA p2A
Aa aa 2pAqa q2a
Genetikai sodródás= drift Egy zárt populációban a heterozigóta genotípus csökken a homozigóta allélok gyakorisága pedig nő. Pl.: egyensúly esetén 25% AA, 50% Aa és 25% aa a gyakoriság míg a rokonpárosodás hatására az AA és az aa genotípus akár 100 – 100 % is lehet.
F-érték, beltenyésztési hányados Wright-féle képlet (1921.) Apai vagy anyai gaméták homozigozitását fejezi ki.
Fx = ∑ ﴾0,5n+n’+1 x (1 + Fa)﴿ Fx=beltenyésztési együttható n és n’= anya és apa közös ősök közötti generációk száma Fa a közös ősök beltenyésztési együtthatója ∑= összeg jel, a többszöri rokonság kiszámításakor
Egyszerűsített képlet F = 1/(8m) + 1/(8f) ♂ m = hím egyedek száma (nem rokon) ♀ f = nőivarú egyedek száma (nem rokon)
A beltenyésztési hányados alakulása eltérő tenyésztési eljárások esetén
Kis laboratóriumi emlősök felosztása genetikai alapjuk, előállításuk szerint (egér, patkány, hörcsög, tengerimalac) A felhasznált állatok genetikailag és a környezetükben
csak a vizsgálat céljául kijelölt beavatkozás tekintetében van eltérés (Issekutz 1886-1979). „ Ceteris paribus” = „egyébként egyformák” Legyen a kísérlet, vizsgálat ismételhető, tehát olyan,
amit nem érdemes megismételni (Kállai 1927-2007)
A beltenyésztett törzs (Inbred strain) A nevezés szigorúan kötött: =
strain
nem beltenyésztett állomány fajta populáció =
stock
beltenyésztett
törzs
Beltenyésztés - rokontenyésztés 1) Beltenyésztés – zárt populáción belüli párosítás
Az angol inbreeding szó a laborállat tudomány terminus technikusává vált pedig a helyesebb szó a 2) Rokontenyésztés – egymással rokon egyedeket párosítunk igen szoros : 4-6 generáción belül azonos ősök többször szerepelnek. Vagy : édestestvérek, szülőutódok szoros : nagybácsi-unokahúg, unokatestvérek mérsékelt: távoli, 5.,6. rendű rokon párosodik
Inbred törzs a laborállatoknál Legalább 20 generáción keresztül édestestvér vagy
szülő – ivadék párosításával létrehozott törzs Egy vonalas tenyésztési rendszerben Törzskönyvezve Monitorozva Szelektálva
Tulajdonságai, jellemzői Az F-érték (beltenyésztési együttható) min.98,4 % A populáció izogén A populáció homozigóta Mutációra hajlamos Környezetre változékonyabb
Inbred törzs nevezéktana 1 – 4 betűből álló szimbólum: T, CBA, Balb Törzs neve után egy „/” jel: CBA/Ca, Balb/c A törtvonal után a tenyésztő intézet nevének rövid jele
C3H/He, C57Bl/6J, amit megelőz a törzs alvonalának száma DBA/2, DBA/1 Rövidített név: jellemző betűk a névből Ha dajkaságban nevelkedett: a fostered=dajkált jelét „f” használjuk. C57BL/6J f C3H/He
F₁ hibridek Két inbred törzs keresztezése Minden egyede izogén 2. Sok gén tekintetében homozigóta 3. Heterozigóta minden olyan lókuszon, ahol a szülők eltérő géneket hordoztak Az F₁ hibrid egyedeket tovább párosítani tilos! (Mendel 3, 4. törvénye) 1.
F₁ hibridek elnevezése Szigorúan kötött Előre írjuk a ♀ törzs rövid nevét Utána közvetlenül a ♂ törzs rövid nevét Balb/c (=C) ♀ X CBA ♂ hibrid utód neve = CCBA F1 C57BL/6 (B6) ♀ X DBA/2 (D2) ♂ hibrid utód neve = B6D2 F1 Pl.:
Csak inbred törzseket használunk F₁ hibrid előállításra Hibrid vigor kihasználása Heterozigóta , de izogén a populáció A hibrid mindkét létrehozójának szövetét befogadja Outbred fajtával tilos de DBA/ 2 keresztezése outbred
fajtával : színgének alapján genetikai vizsgálat
Koizogén – kongén törzsek 1. Koizogén: ha az izogén alvonal csak egyetlen allél egyetlen gén tekintetében tér el .
2. Kongén: ha az izogén alvonal egyetlen allél egyetlen gén eltérése nem mutáció, hanem tenyésztés során bejuttatott gén Nevezéktana: a törzs neve (pl. Balb/c) kötőjel és kisbetűvel a bevitt gén neve (Balb/c-nu =szőrtelen) 3. Transgén:biotechnológiai eljárással DNS szakaszok genomba juttatása
Outbred stock Genetically undifined Nevezik: Nem beltenyésztett Kültenyésztett Fajta, populáció Szakszerűbb: Anizogén Heterozigóta (bár sokszor sok allélon homozigóta!)
Több allél tekintetében heterozigóta Hardy-Weinberg egyensúly minél nagyobb mértékben
fennmaradjon Genetikai drift minél kisebb. A beltenyésztési koefficiens növekedés maximum 0,01 vagy 1 % generációnként
Leggyakrabban alkalmazott tenyésztési módszerek 1. Random (találomra) tenyésztés
nem szabatos rendszer – a panmixia csak elméleti - az utódok eredete nem követhető 2. Rotációs rendszer – egyedi jelölés, szisztematikus, folytonos, törzskönyvezés. Egy-egy állat elhullása nagy probléma lehet. 3. Csoportos rotációs rendszer – több állat egy csoportban. Úgy járunk el mint a rotációs rendszernél
Falconer – Robertson féle Maximum Avoidance of Inbreeding (MAI) azaz a beltenyésztés maximális elkerülésének rendszere ♂
Hím x nőstény ♀ 1x2=1 3x4=2 5x6=3 7x8=4
♀
Nőstény x hím 2x1=5 4x3=6 6x5=7 8x7=8
A csoportok száma 2 vagy annak hatványa
♂
Zárt tenyészet – closed breeding Az induló állomány nem bővül új egyeddel - Beltenyésztés folyik de törekszünk az F-érték minimalizálására (beltenyésztési koefficiens):max. 0.01 - Wright - képlettel számoljuk az F-étéket - Figyelemmel kísérjük a drift-ot - 4. generáció után új névvel is elláthatjuk a fajtát
Nyitott tenyésztési rendszer opened breeding Rendszeresen új egyedekkel bővítjük a populációt A genetikai ellenőrzés (F-érték, drift) szükséges. Célja : eredeti állományhoz történő minél nagyobb mértékű megfelelés.
Outbred állomány elnevezése A fajta neve 2 – 4 nagy betű (6 is lehet): CD, NMRI,
WISTAR Megelőzi a tenyésztő nevének rövid jele: Hsd=Harlan He=Heston , Orl=Orleans, stb. A fajta nevét követheti a higiénés státuszra : BR, A fajta nevét a tenyésztő nevétől mindig kettőspont(:) választja el. Hsd Brl Han: WIST, Crl:WI BR stb.
Laboratóriumi állatok tartása Állatház
Állatházak felosztása 1)
2)
3)
4) 5)
Funkció szerint – tenyésztő - kísérleti - vegyes Higiénia szerint – nyitott „konvencionális” - MD minimal disease - SPF specifid pathogen free - VAF virus antibadi free - GF germ free Légnyomás szerint – kompressziós - depressziós - kiegyenlített Technológi szerint - egy folyosós - két folyosós, több folyosós Építészetileg - hagyományos -könnyűszerkezetű - konténeres
Zsilip - barier 1. Személy zsilip – átöltözés
- átöltözés + tusolás - átöltözés,tusolás+ hajmosás - átöltözés,tusolás, hajmosás+sebészi fertőtlenítés láb,kéz, aszeptikus öltözet, stb. lehet kényszerzuhanyzó bizalmon nyugvó
2) Anyag zsilip
- Áthatoló fertőtlenítés : ionizáló sugárkezelés hőkezelés –száraz 170°C,60 p - nedves 2,5 bár,125°C, 35 p mikrohullám 2 perc etilén-oxid - Felület fertőtlenítés - formaldehid 4 g/m³ - buktató-fürdő - hidrogénperoxid
Sterilezés és annak mikrobiológiai indikátorai sterilezés száraz hővel Hőmérséklet (oC)
idő (perc) légmozgással
195-205 175-185 155-165 135-145
10 25 45 nem ajánlott
légmozgás nélkül 35 60 120 180
sterilezés nedves hővel (autoklávozás)
hőmérséklet (ºC)
légnyomás (kPa: kg/cm2)
idő (perc)
134±2
205,9 ; 2,1
10
121±3
107,8; 1,1
20
Mikrobiológiai indikátorokban alkalmazott baktériumtörzsek módszer
mikroorganizmus
gőz
B.stearothermophilus
száraz hő
B.subtilis var.niger
gáz sugár
B.subtilis var.niger B.pumilus
Dr. Aigner Zoltán nyomán
3) Víz csírátlanítása - UV fénnyel - Hővel : Arnoldozás-Tyndalozás, autoklávozás, pasztőrözés stb. - Szűréssel 4) Levegő csírátlanítása-rendszerint szűréssel: (EU- 4, EU- 7, EU- 9 vagy G1, G2 …F1, F2…)minőségű szűrők
Légszűrők osztályozása Osztály
Tartomány
U
G1
<65%
R
G2
V
Jellemző részecskék
D
rovarok,textil szálak
E
65 - 80%
haj, szőr,
L
G3
80 - 90%
füst, hamu, cement por
Ő
A
G4
˃90%
F
F5
40 -60%
spórák, pollenek,
K
I
F6
60 - 80%
baktériumok, gombák
Ö
N
F7
80 - 90%
cement por
Z
F8
90 - 95%
olaj köd, korom, cigi füst
V
F9
˃95%
fémoxid füst
É
JACK filter nyomán
G
pollenek
O M
Klímatizálás Légszűrés: elő,- közép,- hepaszűrő Légnyomás: jó, ha 25-50 Pa (2,5 – 5,0 vízmm 1 vízmm = 1 m² 1 kg nyomóerő) Légáramlás: 0,2 m/sec Max. befújó felület függvénye Hőmérséklet: viszonylagos (17-27 °C) Páratartalom: relatív, általában adott (5°C harmat pont) Légcsere: kb. 10-szeres
Világítás, zaj Fény hullámhossza : nem érzékenyek a rágcsálók Fény ciklus: igen fontos! 12 óra világos, 12 óra sötét Fény intenzitása: 1 m-re a padozattól 300 lux (USA
szabvány 325 lux). Precíz munkához 500 lux. Zaj frekvencia: magas, akár ultrahangra is érzékenyek Zaj szint: 36 dB csend 65-85 dB klímazaj, 120 dB fájdalom küszöb (1000 Hz)
Alom Indirekt alom Direkt alom Rács (ujjon járó állatnál ellenjavallt: tengerimalac)
A direkt alom ne legyen: fertőzött vegyszeres poros legyen: száraz, nedvességmegkötő, gázmegkötő, pormentes, csíra és vegyszer mentes, olcsó, környezetbarát
Szagok, feromonok Ivari feromonok hiánya a nőstény ivarzását 2-3 nappal is eltolhatja
Férőhely, populáció denzitás A meghatározás dilemmái: m³ vagy m² ? Egy állat – több állat arányos? Kis testű-nagytestű állat arányos? Fajok közti eltérés? Ketrec felépítése, anyaga?
Több kutató : Lane-Petter Meeh Kállai Metabolic Body Size A = S0,75 = MBS Kállai által módosított Meeh-féle képlet: A = n0,85 x S0,75 x 10 A= szükséges minimális terület: dm2 n = ketrec populációjának egyedszáma: db S = az elhelyezni kívánt állatok súlya: kg
