Baktériumok és gombák kolonizációja génmódosított (Bt-) és izogénes kontroll kukorica rizoszférájában

A G R O K É M I A É S T A L A J T A N 54 (2005) 1–2

189–202

Baktériumok és gombák kolonizációja génmódosított (Bt-) és izogénes kontroll kukorica rizoszférájában 1

BIRÓ BORBÁLA, 1VILLÁNYI ILONA, 1FÜZY ANNA és 2NAÁR ZOLTÁN

1

MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézet, Rhizobiológiai Kutatórészleg, Budapest 2 Eszterházy Károly Főiskola, Növénytani Tanszék, Eger

A genetikailag módosított Bt-kukoricában rovarölő hatású, bakteriális endotoxin termelődik, melyet a Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki-ból származó cry1Ab gén kódol. A toxin elsősorban egyes kártevő Lepidoptera fajok – mint a kukoricamoly (Ostrinia nubilalis) – ellen hatásos (HÖFTE & WHITELEY, 1989). Az irodalmi adatok tanúsága szerint a Bt-toxin nem csak a növényi szövetekben, hanem a kukorica gyökérváladékaiban is kimutatható mind in vitro, mind in vivo körülmények között (SAXENA & STOTZKY, 2000; SAXENA et al., 1999). Több vizsgálat is bizonyította, hogy a gyökérexudátummal távozó toxin nagyon gyorsan a talaj bizonyos részecskéihez (agyagásványokhoz, humuszsavakhoz) kötődik (CRECCHIO & STOTZKY, 2001). A szabad toxinfehérje a mikroorganizmusok által könnyen hasznosítható C- és N-forrás, ami a talajrészecskékhez kötődve a mikrobiális lebontásnak hosszan ellenáll, és inszekticid hatását akár hónapokon át megőrzi (CRECCHIO & STOTZKY, 2001; KOSKELLA & STOTZKY, 1997; TAPP & STOTZKY, 1995). A génmódosított szervezetekkel (GMO) kapcsolatosan számos európai biztonsági előírás létezik, amelyekről már korábban beszámoltunk (BIRÓ & ANTON, 2003). A Bt-toxin a talajban nagy mennyiségben felhalmozódva káros hatást gyakorolhat olyan nem célzott szervezetekre is, mint a hasznos talajállatok. A hatásvizsgálati tanulmányok többsége – szabványosítható volta és viszonylag könnyű kivitelezhetősége miatt – ezeknek a mikro- és mezofauna elemeknek a bevonását javasolja (FAO, 2001). Egyéb, lényeges követendő állapotjelző lehet még a módosított gén vertikális és horizontális elmozdulási képessége is (DRÖGE et al., 1998). A Bt-kukoricánál DARVAS és munkatársai (2003) a pollen terjedését, míg mások (POLGÁR et al., 2003) a védendő rovarfajok (pl. a nappali pávaszem) veszélyeztetettségét, vagy a gazda–parazitoid kölcsönhatások módosulását, illetve a talaj biológiai aktivitására, valamint ugróvillások terület- és táplálékválasztására gyakorolt hatását vizsgálták (BAKONYI et al., 2003). A gyökérrendszerben élő nem célzott, de a génmódosítás hatása alá került fauna-elemek melPostai cím: BIRÓ BORBÁLA, MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézet, 1022 Budapest, Herman Ottó út 15. E-mail: [email protected]

BIRÓ et al.

190

lett hiányosak ismereteink a gyökérváladékokkal (exudátumokkal) nagy menynyiségben a talajba kerülő Bt-toxin mikrobiológiai, rizobiológiai hatásáról. Ezek a váladékok a már ismert rizoszféra-effektus miatt közvetlenül is befolyásolhatják a különféle mikroorganizmusok számát és összetételét, vagy az aktivitásukat a vegetációs időszak folyamán. A toxintermelésen túl a genetikai manipuláció hatására a növényi anyagcsere is módosulhat, ezáltal a kiáramló C- és Nforrások mennyisége és minősége is eltérhet. Ezért a különféle hatástanulmányok célja lehet ezeknek az indirekt hatásoknak a nyomon követése. A talajmikrobiológia klasszikus módszereivel a kitenyészthető mikroorganizmusok mennyisége mellett a növény–mikroba kapcsolat alakulását a mikroszimbionta baktériumok (Azospirillum sp., Rhizobium sp.) mellett az arbuszkuláris mikorrhiza gombák (AMF) jelzik a leginkább. A Trichoderma nemzetségbe tartozó szaprotróf gombák számbavételét indokolja az a tény, hogy gyakorlatilag minden talajban előfordulnak (DOMSCH et al., 1980) és nagy szerepük van az elhalt növényi anyagok lebontásában is. Célunk a fentieknek megfelelően a Bt-toxint termelő transzgénikus és a Bttoxint nem termelő izogénes kukorica gyökérrendszerének mikrobiológiai jellemzése, gyökérexudátumaiknak a rizoszféra mikrobióta reprezentáns képviselőire kifejtett hatásvizsgálata volt. Az összehasonlító értékelések során a gyökérbelsőtől (endoriza) távolodva a gyökérfelszín (rizoplán), majd a külső rizoszféra néhány mikrobiológiai (rizobiológiai) tulajdonságát vizsgáltuk egy vegetációs időszak során. Anyag és módszer 2001-ben több mintavételi időpontban gyűjtöttünk talaj- és gyökérmintát transzgénikus (Bt) és izogénes (kontroll) kukorica termőterületről az MTA Növényvédelmi Kutatóintézet Kísérleti Állomásán (Budakeszi). Az izogénes (DK440) és a transzgénikus (DK440BTY) fajtákat a Monsanto bocsátotta rendelkezésünkre. Az izogénes és a Bt-kukorica rizoszférájából származó talajszelvényeket a növények 4–6 leveles fejlettségi állapotában, illetve címerhányáskor, valamint a vegetációs időszak végén vizsgáltuk. Mintavételenként 3–3 db, 1–1 kukoricatövet tartalmazó 20×20×20 cm-es talajszelvényt dolgoztunk fel. A talajmintákat homogenizáltuk. A belső rizoszférában található endofiták, a szimbionta arbuszkuláris mikorrhiza gombák (AMF) kolonizációjának a megállapításához 1–2 g-nyi friss hajszálgyökér-mintát gyűjtöttünk minden kukoricatőről, melyeket a vizsgálatokig 70%-os alkoholban tároltunk. Ezt követően a gyökereket 15%-os KOHoldatban 40 percig forrásponton derítettük, anilinkék festékben 30 percig állni hagytuk, majd tejsavban fixáltuk a korábban leírtak szerint (BIRÓ et al., 2000). A kolonizáció és a gomba működőképességének meghatározását Trouvelot

Génmódosított kukorica rizobiológiai tulajdonságai

191

módszere alapján végeztük 100-szoros nagyítás mellett (TROUVELOT et al., 1986). A hifák, vezikulumok és arbuszkulumok jelenlétét, ill. mennyiségét növényenként 30 gyökérszegmentben határoztuk meg, és ebből kalkuláltuk a mikorrhizációs kolonizáció intenzitását az adott gyökérszakaszban, vagy a teljes gyökérrendszerben leíró F%, vagy M% értéket, valamint az arbuszkuláltságot hasonló módon kifejező a% és A% értékeket. A gyökérfelszín mikrobiológiai tulajdonságait a gyökérhez tapadt 1–1 g talajmintából határoztuk meg és 1 g száraz talajra konvertáltuk. Ennek során hígítási sort készítettünk, majd 4 hígítási tagból 3-féle szelektív táptalajon telepszámlálással határoztuk meg néhány kitenyészthető mikroorganizmus-csoport számát. A heterotróf és a spórás mikroorganizmusokhoz Nutrient táptalajt, az oligotrófokhoz ugyanennek a Nutrient közegnek a 100-szorosan higított változatát (HORVÁTH, 1980) használtuk, a mikroszkopikus gombák mennyiségét pedig Martin agaron (MARTIN, 1950) határoztuk meg. A gyökérrendszerben található mikroorganizmusok össz-aktivitását fluoreszcein-diacetát (FDA) hidrolízissel mutattuk ki SCHNÜRER és ROSSWALL (1982), valamint ADAM és DUNCAN (2001) módszerei szerint. Ennek során 2 g légszáraz talajmintát újranedvesítettünk és 1 hétig termosztátban inkubáltunk. Ezután a talajt fluoreszcein-diacetát hozzáadásával 7,6-os pH-jú foszfátpufferben 2 órán át 30 °C-on rázattuk. A 2 óra elteltével a reakciót aceton hozzáadásával leállítottuk. Ezután a szuszpenziókat lecentrifugáltuk (3000 fordulat/perc), és a keletkezett fluoreszceint spektrofotométerrel 490 nm-en mértük, majd értékeléskor egységnyi (1 órai) időmennyiségre adtuk meg. A külső rizoszféra mikrobakomponensei közül a szabadon élő Trichoderma gombák számát és faji összetételét határoztuk meg. Ehhez 25–25 talajszemcsét helyeztünk Trichoderma-szelektív táptalajra, majd 10 napos inkubáció után a kifejlődött telepeket burgonya-dextróz agarra oltottuk ki (SZEGI, 1979). Az izolátumok azonosítása makro- és mikromorfológiai jellemzőik alapján történt BISSET (1984, 1991a,b,c, 1992) és RIFAI (1969) közlése alapján. Ennek megfelelően 6 Trichoderma faj jelenlétét ellenőriztük: T. atroviride, T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. virens és T. viride. A teljes rizoszféra vizsgálatánál minden esetben 3–3 párhuzamos mintát vettünk. A statisztikai analízishez szükséges szóráshomogenitás és normalitás eléréséhez a mikrobiológiai paramétereket transzformáltuk: a csíraszámokon logaritmikus átalakítást, míg a mikorrhizációs százalékértékeken arcsin transzformációt végeztünk. Az eredményeket kéttényezős varianciaanalízisnek vetettük alá, majd a párhuzamos minták átlagértékeit és a szórást ábrázoltuk 95%-os megbízhatósági szinten.

BIRÓ et al.

192

Eredmények A belső rizoszféra (endoriza) szimbiotikus struktúrái Az 1. ábrán az arbuszkuláris mikorrhiza gombák kolonizációját mutatjuk be a 2001. évi vegetációs időszak három mintavételi időpontjában. Megállapítható, hogy a júniusi (1.) mintavétel során (1A. ábra) az AM gombák infekciós értékei (F%, M%) jelentősen kisebbek voltak a Bt-kukorica rizoszférájában. Ugyanezt a tendenciát mutatja az arbuszkulumoknak az egész gyökérrendszerre viszonyított mennyisége (A%) is. Az augusztusi (2.) és októberi (3.) mintavételek (1B. és 1C. ábra) esetében a mikorrhizáltság alakulásában a kontroll- és a Bt növény (GMO) között eltérések nem mutatkoztak, a varianciaanalízis azonban összesített hatásban szignifikáns különbséget jelzett. Az AM gombák kolonizációs értékei ugyanakkor mindkét növénynél kisebb szinten jelentek meg a vegetációs időszak közepén (aug.) és végén (okt.) történt mintavételkor. A legkisebb nyárvégi értékeket az őszi időszak magasabb mikorrhizás infekciója követi. Megfigyelhető továbbá, hogy az arbuszkulumok mennyisége – azaz a növény gombától való függősége a nyári erősebb környezeti stressz-körülmények között – az infekciós gyakorisági értékekhez (F%, M%) viszonyítva nagyobb. A mikorrhiza gomba és a gazdanövény között tehát dinamikus kölcsönhatás van mind a Bt-, mind az izogénes kontrollkukorica rizoszférájában. A kezdeti időszakban a génmódosítást követő kolonizáció-csökkenést az infekció bekövetkezése utáni további időpontokra a génmódosított növény is képes volt kompenzálni, kiegyenlíteni. Az arbuszkuláris mikorrhiza gombák ilyen infekciós hátrányát az általunk nem vizsgált gyökérbe lépési pontok csekélyebb száma is mutathatja (M. GIOVANETTI személyes közlése szerint). Ez is alátámasztotta a N2-kötő rhizobiumoknál már korábban kimutatott tényt, hogy a szimbionta mikroorganizmusok a szimbiózis létrejötte után védve vannak és bizonyos környezeti, talaj- és klimatikus körülmények között azonos szintű működésre képesek a kezdeti infekciós hátrány ellenére is. A gyökérfelszín (rizoplán) mikrobiális aktivitása A 2001. évi vegetációs időszakban három alkalommal vettünk talajmintákat a génmódosított (Bt) és az izogénes kontrollkukorica gyökérfelszíni talajából. Ennek során néhány kitenyészthető mikrobacsoport 1 g száraz talajra viszonyított csíraszámát ellenőriztük szelektív táplemezek segítségével. Vizsgáltuk a HEAL és munkatársai (1996), valamint a KARLEN és munkatársai (1997) által az ökoszisztémák működőképességét leginkább jelző r, k, és l stratégiával jellemzett heterotrófok, oligotrófok és spórások számát, valamint a KÁTAI (1998) szerint javasolt mikroszkopikus gombák mennyiségét is a növényi rizoszférában.

Génmódosított kukorica rizobiológiai tulajdonságai

193

A A M F (% ) K o n t ro ll

1 00

GMO

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 F

M

a

A

B A M F (% ) 1 00

K o n t ro ll

GMO

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 F

M

a

A

C A M F (% ) 1 00 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

K on t ro ll

F

M

a

GMO

A

1. ábra Az arbuszkuláris mikorrhiza gombák (AMF) kolonizációs (F%, M%, a% és A%) értékeinek alakulása génmódosított Bt kukorica (GMO) és izogénes kontrollnövények rizoszférájában a vegetációs időszak 3 mintavételi időpontjában 2001-ben A. június, B. augusztus, C. október

BIRÓ et al.

194

Az 1. táblázat adatai szerint az első vegetációs időszakban a transzgénikus, Bt-toxin tartalmú és az izogénes növények gyökérfelszínén nem találtunk különbséget a vizsgált, kitenyészthető mikrobacsoportok abundanciájában egyik mintavételi időpontban sem. 1. táblázat Néhány kitenyészthető mikrobacsoport számának alakulása génmódosított Bt kukorica (GMO) és izogénes kontrollnövények gyökérrendszerében 3 mintavételi időpontban (1)

Kukorica a) Kontroll b) GMO c) Átlag d) SzD5% a) Kontroll b) GMO c) Átlag d) SzD5% a) Kontroll b) GMO c) Átlag d) SzD5% a) Kontroll b) GMO c) Átlag d) SzD5%

(2)

június

Mintavételek 2001-ben augusztus október

A. Heterotróf, r stratégisták (CFU log10·g-1 talaj) 7,54 7,27 7,66 7,74 7,31 7,45 7,77 7,34 7,25 7,62 7,56 7,05 7,72 7,14 7,61 7,66 7,36 7,35 7,68 7,33 7,40 0,22 B. Oligotróf, k stratégisták (CFU log10·g-1 talaj) 8,03 7,68 7,81 8,14 7,47 10,53 8,35 7,82 7,74 8,06 7,75 7,83 7,92 8,21 10,33 8,15 7,64 9,73 8,11 7,76 9,00 0,88 C. Spórások, l stratégisták (CFU log10·g-1 talaj) 6,83 6,45 6,35 6,75 6,23 6,45 6,79 6,29 6,39 6,47 6,18 6,57 6,42 6,50 6,50 6,61 6,39 6,52 6,65 6,34 6,46 0,12 D. Mikroszkopikus gombák (CFU log10·g-1 talaj) 5,33 4,27 4,68 5,02 3,86 4,71 5,15 4,54 4,58 5,32 4,16 4,89 5,14 4,40 4,73 4,94 4,52 4,82 5,15 4,29 4,74 0,24

(3)

(4)

Átlag

SzD5%

7,48 0,18 7,45

8,17 1,08 8,40

6,50 0,10 6,46

4,68 0,21 4,77

Génmódosított kukorica rizobiológiai tulajdonságai

195

A 2. ábra az összmikrobás enzimaktivitás fluoreszcein-diacetát (FDA) hidrolízissel kimutatható értékeit mutatja a növénynövekedés három jellemző időszakában: 4–6 leveles korban, címerhányáskor, illetve a vegetációs időszak végén. Megállapíthatjuk, hogy a Bt-toxin tartalmú génmódosított kukorica rizoszférájában a tavaszi és az őszi mintavétel során szignifikánsan nagyobb F DA 1 60

k o n t ro ll

1 40

GM O

1 20 1 00 80 60 40 20 0 1

2

3

2. ábra A génmódosított Bt kukorica (GMO) és az izogénes (kontroll) kukorica gyökérrendszerében fluoreszcein-diacetát (FDA) analízissel kimutatható összenzimatikus aktivitás (μg fluoreszcein·g-1 talaj·óra-1) alakulása a 2001-es vegetációs év 3 mintavételi időpontjában: 1. június, 2. augusztus és 3. október

enzimaktivitást találtunk, mint az izogénes töveknél. A három mintavételi időszak átlagos értékei is nagyobbnak adódtak [FDA = 113,5 és 88,5 μg fluoreszcein·g-1 értékben óránként] a Bt- és a kontrollkukoricánál (SzD5% = 15,81). Ezek alapján valószínűsítjük, hogy a génmódosított kukorica gyökérexudátumainak mennyiségi vagy minőségi változása következhet be, amely egyfajta rizoszféra-effektusként pozitív hatást gyakorol a mikroorganizmusokra és katabolikus az aktív anyagcserét jelző enzimaktivitásra. A Trichoderma gombák száma és mennyisége a külső rizoszférában A Trichoderma gombák a talaj–növény rendszerek általános képviselői. Jól ismert tulajdonságuk a növényi kórokozó gombákkal szembeni antagonista aktivitásuk, aminek eredményeként az endoszimbionták működőképeségét is befolyásolhatják. Ezért tesztszervezetként való bevonásuk indokolt. A 2. táblázat az első vegetációs időszak tavaszi és őszi mintavételi időpontjában gyűjtött talajmintákból a különféle Trichoderma fajok előfordulási gyakoriságát mutatja be. Megállapítható, hogy a kontroll- és génmódosított kukorica rizoszférájának Trichoderma összetétele szignifikánsan nem különbözött, de a tavaszi és őszi mintavétel között szezonális ingadozásokat regisztrálhattunk.

BIRÓ et al.

196

2. táblázat Trichoderma fajok relatív gyakorisága a génmódosított kukorica (GMO) és az izogénes kontrollnövények rizoszférájában a 2001. évi tavaszi és őszi mintavételezéskor (1)

Trichoderma fajok T. atroviride T. hamatum T. harzianum T. koningii T. virens T. viride

(2) Tavaszi mintavételkor (3) Őszi mintavételkor GMOKontrollGMOKontroll(4) kukorica rizoszférájában

4,5 24,2 16,5 4,8 21,6 28,4

5,2 21,3 17,2 5,2 23,7 27,4

10,2 12,1 27,9 22,1 18,3 9,4

8,9 11,8 29,6 20,1 19,1 10,5

Ennek megfelelően a T. hamatum, T. virens, T. viride a tavaszi mintákban, a T. harzianum és a T. koningii pedig az őszi mintákban fordult elő leginkább. Megállapíthattuk tehát, hogy a génmódosítás hatására az első vegetációs időszakban kimutatható különbség a Bt kukorica külső rizoszférájában nem jelentkezett. A Trichoderma gombák faji összetétele a 6 faj előfordulásának (100%) arányában átlagosan a következőképpen alakult: T. atroviride: 6,7%, T. hamatum: 3,3%, T. harzianum: 16,7%, T. koningii: 20%, T. virens: 10%, T. viride: 43,3%. Az egyes izolátumok részleges morfológiai vizsgálatakor sem találtunk kimutatható elváltozásokat. A Trichoderma gombák, mint a növényi gyökérrendszer, a rizoszféra legtávolabbi tagjai, nem bizonyultak érzékenynek a génmódosításra a Bt kukorica tesztnövénynél a rövid távú, egyéves vizsgálati időszak alatt. Az eredmények értékelése A Bt-toxint termelő transzgénikus kukorica (GMO) és a Bt-toxint nem termelő izogénes (kontroll) kukorica gyökérrendszerének mikrobiológiai jellemzését, gyökérexudátumaiknak a rizoszféra mikrobiotára gyakorolt hatását vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a kétféle növény rizoszférájában a fluoreszceindiacetát hidrolízissel mért össz-mikrobiális aktivitás eltér: a transzgénikus kukorica esetében nagyobb értékek voltak megfigyelhetők az izogénes kukoricáénál. A kitenyészthető mikrobacsoportok csíraszáma ugyanakkor hasonló volt és szignifikáns különbség nem adódott. A mikrobiális össz-aktivitás enzimatikus mérése ily módon a telepszámlálásnál érzékenyebb módszernek bizonyult. Egy másik lehetséges magyarázat szerint a gyökérexudátumok hatása a kitenyészthető csíraszámok alakulására csak hosszabb távon valósulhat meg. Ilyen szempontból leginkább az olyan mikrobacsoportok (r, k, l stratégisták) folyamatos kitenyésztéses vizsgálata látszik célszerűnek, amelyek a talajminőség fontos biológiai indikátorai lehetnek (KARLEN et al., 1997; BIRÓ et al., 2002).

Génmódosított kukorica rizobiológiai tulajdonságai

197

Az össz-enzimaktivitás vizsgálatával megállapíthattuk, hogy a transzgénikus (Bt-toxint termelő) és az izogénes kukorica bizonyos fiziológiai tulajdonságai eltértek egymástól. Elvégzett vizsgálataink alapján ez az eltérés nem minősíthető sem hátrányosnak sem kedvezőnek, hanem az adott rövid időszakra vonatkozó összehasonlító értékelésnek. Irodalmi adatok szerint a Bt-toxint a talaj mikroorganizmusai képesek lebontani vagy tápanyagforrásként hasznosítani (CRECCHIO & STOTZKY, 2001; KOSKELLA & STOTZKY, 1997), ezért valószínűsítjük, hogy néhány mikrobacsoport abundanciája ennek következtében lett nagyobb. Ezen túlmenően az is közlésre került, hogy a toxin tisztított formában nem gyakorol káros hatást több mikrobacsoportra sem (SAXENA és STOTZKY 2001), mivel „nem célzott” szervezeteknek tekinthetők. Annak ellenére tehát, hogy nem találtunk különbséget a kitenyészthető mikrobacsoportok számában, az összmikrobás aktivitással a Bt- és a kontrollkukorica rizobiótája között mégis statisztikailag is igazolt különbség adódott. A közösségi mikrobiológiai analízisek DONEGAN és munkatársai (1995), valamint NIKOLAUSZ és munkatársai (2004) szerint is alkalmasabbak az összehasonlító értékelésekre. További vizsgálatok során több transzgénikus és izogénes növényi vonal tarlómaradványainak dekompozíciós vizsgálataiból kiderült, hogy a maradványokat kolonizáló közösségek fajösszetételében is különbségek adódtak. Ezek azonban inkább tulajdoníthatók egyéb (növényvonaltól függő), a genetikai manipuláció hatására bekövetkező fiziológiai eltéréseknek, mint a toxintermelésnek (DONEGAN et al., 1995). Ezt a hipotézist az általunk vizsgált transzgénikus és izogénes növények bizonyos beltartalmi értékeiben mért különbségek is alátámasztják (VILLÁNYI et al., 2003). A kimutatható hatások ellenére a kétféle növény rizoszférájának különböző mikrobacsoportokra vonatkozó abundanciájában nincs szignifikáns különbség SAXENA és STOTZKY (2001) szerint sem. Az össz-mikrobiális aktivitás és a mikorrhizációs kolonizáció megfigyelt különbségei ugyanakkor kialakulhattak a Bt kukorica eltérő, de a jelen dolgozatban nem vizsgált ökofiziológiai, élettani tulajdonságai miatt is. A génmanipuláció közvetlen és/vagy közvetett hatásainak eredményeképpen tehát a rizoszféra összetétele és működőképessége is módosulhat. A talaj- és rhizobiológiai tulajdonságok jelzett eltérései – a korábbi közlésünk szerint is (BIRÓ 2002) – eredményesen használhatók a környezeti állapot változásának vagy módosulásának megbízható detektálására az összehasonlító vizsgálatok során. Adataink ilyen meggondolásból hozzájárulhatnak a GM-növények környezeti hatásvizsgálati gyakorlatának a kialakításához is. Összefoglalás A Bacillus thuringiensis cry1Ab endotoxint termelő transzgénikus kukorica (DK440BTY) és izogénes, toxint nem termelő kukorica (DK440) rizoszféráját jellemeztük talajbiológiai eszközökkel, illetve összehasonlító értékelést végez-

BIRÓ et al.

198

tünk egy vegetációs periódus három mintavételi időszakában. Telepszámlálásos módszerrel meghatároztuk néhány kitenyészthető mikrobacsoport (heterotrófok, oligotrófok, spórás mikrooganizmusok, szabadon élő N2-kötők és mikroszkopikus gombák) csíraszámát a rizoszféra talajában. Elvégeztük a mikrobiális összaktivitás vizsgálatát fluoreszcein-diacetát (FDA) hidrolízisének mérésével, illetve nyomon követtük a gyökérrendszer szimbiotikus struktúráinak, azaz az arbuszkuláris mikorrhiza gombák kolonizációjának a működőképességét is. A rizoszférához szorosan kapcsolódó talajrészben a szabadon élő szaprotróf Trichoderma gombák faji diverzitásának az alakulását ellenőriztük. Megállapítottuk, hogy a belső rizoszféra (endoriza) mikroszimbiontás kolonizációja az első mintavétel során (2001. június) szignifikánsan kisebb aktivitást mutatott, és csökkent a gomba működőképességét jelző arbuszkulumok menynyisége is. A további mintavételek során (2001. augusztus és október) azonban ezek a különbségek nem jelentkeztek, a szimbiózis működőképessége helyreállt. A varianciaanalízis azonban összesített hatásban szignifikáns különbséget jelzett. A gyökérfelszín kitenyészthető mikrobacsoportjainak csíraszámában nem adódott statisztikailag igazolható különbség a kétféle növény között. Az FDA módszerrel kimutatható össz-mikrobiális aktivitást ugyanakkor mindegyik mintavételnél nagyobbnak találtuk a Bt-kukorica rizoszférájában, amiből a fiziológiai tulajdonságok megváltozására következtettünk. A transzgénikus növény gyökérhatásának távolabbi részén, a külső rizoszférában a Trichodema gombák száma és faji összetétele csak szezonális változásokat mutatott, de nem különbözött szignifikánsan a génmódosított növénynél. Eredményeink jelzik a génmódosítás közvetett hatását a rizoszférában található „nem célzott” szervezetek összetételére vagy aktivitására, és felhívják a figyelmet a további, tartamjellegű vizsgálatok szükségességére is. A kutatásokat az OM „Biotechnológia” programja (BIO-0042/2000) támogatta. A rizodinamika módszertani és elméleti tanulmányozásához további támogatást az OTKA T0 46610 sz. projektje ad. Kulcsszavak: GMO, rizoszféra, Bt-toxin, mikorrhiza, Trichoderma, hatásvizsgálat Irodalom ADAM, G. & DUNCAN, H., 2001. Development of a sensitive and rapid method for the measurement of total microbial activity using fluorescein diacetate (FDA) in a range of soils. Soil Biol. Biochem. 33. 943–951. BAKONYI G. et al., 2003. Bt-toxint termelő kukorica (DK-440-BTY) hatása a talaj biológiai aktivitására, valamint ugróvillások terület- és táplálékválasztására. In: 49. Növényvédelmi Tudományos Napok. (Szerk.: KUROLI G. ) 37.

Génmódosított kukorica rizobiológiai tulajdonságai

199

BIRÓ B., 2002. Talaj- és rhizobiológiai eszközökkel a fenntartható növénytermesztés és a környezetminőség szolgálatában. Acta Agronom. Hung. 50. 77–85. BIRÓ B. & ANTON A., 2003. Génmódosított mikrobiális oltóanyagok és növények alkalmazásának európai jogszabályai. Agrokémia és Talajtan. 52. 487–492. BIRÓ, B., VILLÁNYI, I. & KÖVES-PÉCHY, K., 2002. Abundance and adaptation level of some soil microbes in salt-affected soils. Agrokémia és Talajtan. 50. 99–106. BIRÓ, B. et al., 2000. Interrelation between Azospirillum and Rhizobium nitrogen-fixers and arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosphere of alfalfa at sterile, AMF-free or normal soil conditions. J. Appl. Soil Ecol. 15. 159–168. BISSETT, J., 1984. A revision of the genus Trichoderma I. Section Longibrachiatum sect. nov. Can. J. Bot. 62. 924–931. BISSETT, J., 1991a. A revision of the genus Trichoderma. II. Infrageneric classification. Can. J. Bot. 69. 2357–2372. BISSETT, J., 1991b. A revision of the genus Trichoderma. III. Section Pachybasium. Can. J. Bot. 69. 2373–2417. BISSETT, J., 1991c. A revision of the genus Trichoderma IV. Additional notes on section Longibrachiatum. Can. J. Bot. 69. 2418–2420. BISSETT, J., 1992. Trichoderma atroviride. Can. J. Bot. 70. 639–641. CRECCHIO, C. & STOTZKY, G., 2001. Biodegradation and insecticidal activity of the toxin from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki bound on complexes of montmorillonite–humic acids–Al hydroxipolymers. Soil Biol. Biochem. 33. 573–581 DARVAS B. et al., 2003. A DK-440-BTY (yieldgard) Bt kukorica pollenjének hatása a nappali pávaszem, Inachis io lárvákra. In: 49. Növényvédelmi Tudományos Napok. (Szerk.: KUROLI G.) 45. DOMSCH, K. H., GAMS, W. & ANDERSON, T. H., 1980. Compendium of Soil Fungi. Vol. 1. Academic Press. London, UK. DONEGAN, K. K. et al., 1995. Changes in levels, species and DNA fingerprints of soil microorganisms associated with cotton expressing the Bacillus thuringiensis var. kurstaki endotoxin. Appl. Soil Ecol. 2. 111–124. DRÖGE, M., PÜHLER, A. & SELBITCHKA, W., 1998. Horizontal gene transfer as a biosafety issue: A natural phenomenon of public concern. J. Biotechnol. 64. 75–90. FAO, 2001. Handbook for Defining and Setting Up a Food Security Information and Early Warning System. FAO Agricultural Policy and Economic Development Series. Vol. 6. Rome. HEAL, O. W., STRUWE, S. & KJOLLER, A., 1996. Diversity of soil biota and ecosystem function. In: Global Change and Terrestrial Ecosystems. (Eds.: WALKER, B. & STEFEN, W.) 385–402. Cambridge Univ. Press. Cambridge. U.K. HORVÁTH S., 1980. Mikrobiológiai praktikum. Tankönyvkiadó. Budapest. HÖFTE, H. & WHITELEY, H. R., 1989. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol. Reviews. 53. 242–255. KARLEN, D. L. et al., 1997. Soil quality: a concept, definition, and framework for evaluation. Soil Sci. Soc. Am. J. 61. 4–10. KÁTAI, J., 1998. The effect of herbicides on the amount and activity of microbes in the soil. In: Soil Pollution. (Ed.: FILEP, GY.) 159–167. University of Agricultural Sciences. Debrecen.

200

BIRÓ et al.

KOSKELLA, J. & STOTZKY, G., 1997. Microbial utilization of free and clay-bound insecticidal toxin from Bacillus thuringiensis and their retention of insecticidal activity after incubation with microbes. Applied and Env. Microbiol. 63. 3561– 3568. MARTIN, J. P., 1950. Use of eciol rose bengal and streptomycin in the plate method for estimating soil fungi. Soil Sci. 69. 215–232. NIKOLAUSZ, M., MÁRIALIGETI, K. & KOVÁCS, G., 2004. Comparison of RNA- and DNA-based species diversity investigations in rhizoplane bacteriology with respect to chloroplast sequence exclusion. Journal of Microbiological Methods. 56. 365–373. POLGÁR A. L. et al., 2003. Transzgénikus kukorica hatása gazda/parazitoid (Plodia interpunctella/Venturia canescens) rendszerben. In: 49. Növényvédelmi Tudományos Napok. (Szerk.: KUROLI G.) 65. RIFAI, M. A., 1969. A revision of the genus Trichoderma. Mycological Papers. Commonwealth Mycol. Inst. Kew, Surrey, England. 116. 1–56. SAXENA, D. & STOTZKY, G., 2001. Bacillus thuringiensis (Bt) toxin released from root exudates and biomass of Bt corn has no apparent effect on earthworms, nematodes, protozoa, bacteria, and fungi in soil. Soil Biol. Biochem. 33. 1225–1230. SAXENA, D. & STOTZKY, G., 2000. Insecticidal toxin from Bacillus thuringiensis is released from roots of transgenic Bt corn in vitro and in situ. FEMS Microbiol. Ecol. 33. 35–39. SAXENA, D., FLORES, S. & STOTZKY, G., 1999. Insecticidal toxin in root exudates from Bt corn. Nature. 402. 480. SCHNÜRER, J. & ROSSWALL, T., 1982. Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure of total microbial activity in the soil and litter. Appl. Env. Microbiol. 43. 1256–1261. SZEGI J., 1979. Talajmikrobiológiai vizsgálati módszerek. Mezőgazdasági Könyvkiadó. Budapest. TAPP, H. & STOTZKY, G., 1995. Insecticidal activity of the toxins from Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki and tenebrionis adsorbed and bound on pure and soil clays. Appl. Environ. Microbiol. 61. 1786–1790. TOMBÁCZ E. & MAGYAR E., 2003. A GMO környezeti vizsgálat (GKV) helye és szerepe az engedélyezési eljárásban. In: 49. Növényvédelmi Tudományos Napok. (Szerk.: KUROLI G.) 77. TROUVELOT, A., KOUGHT, J. L. & GIANINAZZI-PEARSON, V., 1985. Mesure du taux de mycorhization VA d’un systéme radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In: Proc. Symposium Europeen sur les Mycorhizes. 217–221. INRA Paris. VILLÁNYI I. et al., 2003. Bt-toxint termelő és anyavonali kukorica dekompozíciójának és C:N arányának összehasonlító értékelése. In: 49. Növényvédelmi Tudományos Napok. (Szerk.: KUROLI G.) 81. Érkezett: 2005. március 7.

Génmódosított kukorica rizobiológiai tulajdonságai

201

Bacterial and Fungal Colonization in the Rhizosphere of Genetically Modified (Bt) and Isogenic Control Maize 1

B. BIRÓ, 1I. VILLÁNYI, 1A. FÜZY and 2Z. NAÁR

1

Rhizobiology Research Team, Research Institute for Soil Science and Agricultural Chemistry of the Hungarian Academy of Sciences, Budapest and 2 Department of Botany, Eszterházy Károly College, Eger (Hungary)

Summary The rhizosphere of transgenic maize (DK440BTY) producing Bacillus thuringiensis cry1Ab endotoxin and isogenic maize (DK440) producing no toxin was investigated using soil biology techniques and comparative evaluation at three sampling dates during a single vegetation period. The colony counting method was used to determine the germ number of culturable microbe groups (heterotrophs, oligotrophs, spore-forming microorganisms, free-living N-fixing organisms and microscopic fungi) in the soil of the rhizosphere. Total microbial activity was recorded using fluorescein-diacetate (FDA) hydrolysis and by measuring the functionability of symbiotic structures on the root system, i.e. the colonization of arbuscular mycorrhizal fungi. In the soil layer closely connected to the rhizosphere, the diversity of free-living saprotrophic Trichoderma fungi was monitored. The microsymbiotic colonization of the interior rhizosphere was found to exhibit significantly less activity at the first sampling date (June 2001) and there was a decline in the quantity of arbuscules indicative of the functionability of the fungus. At later sampling dates (August and October 2001), however, these differences were no longer observed, so the functionability of symbiosis had been restored. Nevertheless, analysis of variance indicated a significant difference for the total effect. No significant difference was observed between the two types of plant in the germ number of microbial groups culturable on the root surface. At the same time, the total microbial activity detected using the FDA method was higher at all sampling dates in the rhizosphere of Bt maize, suggesting changes in physiological traits. In the exterior rhizosphere, at a greater distance from the roots of the transgenic plants, the number of Trichoderma fungi and their species composition exhibited seasonal changes, but were not significantly different for the GM plants. The results indicate the indirect effect of genetic modification on the composition or activity of “non-targeted” organisms in the rhizosphere, and suggest the need for further, long-term experiments. Table 1. Changes in the number of culturable microbe groups in the root systems of GM and isogenic control maize plants at three sampling dates. (1) Maize. a) Control; b) GMO; c) Mean; d) LSD5%. (2) Sampling dates in 2001: June, August, October. (3) Mean. (4) LSD5%. A. Heterotrophs, r strategists (CFU log 10 g–1 soil). B. Oligotrophs, K strategists (CFU log 10 g–1 soil). C. Spore-forming microorganisms, L strategists (CFU log 10 g–1 soil). D. Microscopic fungi (CFU log 10 g–1 soil). Table 2. Relative frequency of Trichoderma species in the rhizospheres of GM and isogenic control maize plants at sampling dates in spring and autumn 2001. (1) Tricho-

202

BIRÓ et al.

derma species. (2) Spring sampling, (3) Autumn sampling. (4) In the rhizosphere of GM and isogenic control maize plants. Fig. 1. Colonization (F%, M%, a%, A%) values of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in the rhizosphere of GM and isogenic control maize plants at three sampling dates during the vegetation period in 2001. A. June. B. August. C. October. Fig. 2. Total enzymatic activity (μg fluorescein g–1 soil h–1) detectable with fluorescein diacetate (FDA) analysis in the root system of GM and isogenic control maize plants at three sampling dates during the vegetation period in 2001: 1. June. 2. August. 3. October.