BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni - Agustus 2013 yang meliputi kegiatan di lapangan dan di laboratorium. Pengambilan ikan cakalang (Katsuwonus pelamis) asap dilakukan di beberapa unit pengolahan ikan (UPI) di Provinsi Gorontalo yaitu UPI di Kecamatan Telaga, UPI di Kecamatan Tilango, UPI di Jalan Palma, dan UPI di Kecamatan Gentuma. Pada pelaksanaan penelitian ini, metode penelitian yang digunakan adalah metode observasi yang terdiri dari observasi dilapangan tempat pengambilan sampel dan observasi di laboratorium pengujian sampel. Pengujian sampel di laboratorium meliputi analisis kimia (kadar air dan histamin), uji organoleptik, dan mikrobiologi (ALT dan E. coli) dilakukan di Laboratorium Pembinaan dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP ) Provinsi Gorontalo. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat untuk pengujian ALT: timbangan, autoclave, inkubator, anaerobic jar, cawan petri, botol pengencer, alat penghitung koloni, stomacher, batang gelas bengkok, pipet gelas. Alat untuk pengujian E.coli: waterbath bertutup, stomacher, botol pengencer, tabung durham, cawan petri, tabung reaksi, timbangan dengan ketelitian, mikroskop, pipet atau pippetor 1ml, 5 ml dan 10 ml. Alat untuk pengujian histamin: corong dan botol filtrat contoh, homogenizer (blender), kertas saring kasar;plastik;karet pengikat, kolom resin;reservoar, labu takar, pipet volumetric, florometer, stirer-plate, tabung reaksi, timbangan analitis, waterbath. Alat untuk uji organoleptik: meja dan kursi pengujian, garpu dan sendok stainless steel, wadah, pisau, talenan. Alat untuk pengujian kadar air: blender, cawan porselin, alat penjepit/tang, desikator, sendok, timbangan analitik, oven vakum atau tidak vakum, saringan.
3.2.2 Bahan Bahan untuk pengujian ALT: Plate count
agar, Larutan Butterfield’s Phosphate
Buffered, gas pack dan indikator air anaerob. Bahan untuk pengujian E.coli: Brilliant Green Lactose Bile (BGLB), 2 % Broth, Lauryl Tryptose Broth (LTB), EC Broth, Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB ) agar, Tryptone Broth (TB) , MR-VP Broth, Simmon Citrate Agar, Pereaksi Kovacs, Pereaksi VP, Indikator MR, Pereaksi pewarnaan gram. Bahan untuk pengujian histamin: metanol, aquades, glasswool, NaOH, HCL, orto-ptalatdikarbosildehid (OPT), asam phospat (H3PO4), resin penukar ion jenis dowex, larutan stokc. Bahan utama penelitian adalah sampel ikan cakalang (Katsuwonus pelamis) dari beberapa unit pengolahan ikan (UPI) di Provinsi Gorontalo. 3.3 Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan dalam analisis data hasil penelitian adalah metode deskriptif. Penelitian deskriptif yaitu pencarian fakta dengan interpretasi yang tepat. Tujuan dari penelitian diskriptif adalah untuk membuat deskripsi, gambaran dan tulisan secara sistematis, faktual dan akuran mengenai fakta-fakta, sifat-sifat serta hubungan fenomena yang diselidiki (Nazir, 1983). Metode observasi dan wawancara langsung terhadap para responden yang ada di unit pengolahan ikan. Data tambahan mengenai ikan asap diperoleh melalui wawancara dengan kepala pengolah proses produksi, misalnya bahan bakar yang digunakan untuk pengasapan, waktu pengasapan, sanitasi dan higienis, dan proses pengolahannya dari penerimaan bahan baku sampai penyimpanan. Berdasarkan hasil observasi di lapangan, cara pengasapan ikan cakalang (Katsuwonus pelamis) ada yang menggunakan cara pengasapan panas dan ada yang menggunakan cara pengasapan dengan menggunakan asap cair. UPI pengolahan ikan asap di Kecamatan Pilohayanga menggunakan bahan bakar kayu lamtoro dengan lama pengasapan 5 jam. UPI pengolahan ikan asap di Kecamatan Tilango menggunakan bahan bakar sabut
kelapa dengan lama pengasapan 4-5 jam. UPI pengolahan ikan asap di jalan Palma menggunakan asap cair dengan lama pengasapan 3 jam. Selanjutnya, UPI pengolahan ikan asap di Kecamatan Gentuma menggunakan bahan bakar tempurung kelapa dan kayu lamtoro dengan lama pengasapan 4-5 jam. Pengambilan sampel ikan cakalang (Katsuwonus pelamis) asap dilakukan secara sampling yaitu pengambilan sampel ikan dari polulasi dilakukan secara acak. Sampel produk ikan cakalang (Katsuwonus pelamis) asap diambil dari 4 UPI di Propinsi Gorontalo. Sampel diambil berjumlah 6 ekor dari masing-masing pengolahan. Kemudian produk ikan cakalang asap yang terkumpul dimasukan dalam kantong plastik dibawa ke LPPMHP untuk diuji kimia : kadar air, histamin, uji organoleptik dan uji mikrobiologis: TPC dan E. Coli, berdasarkan Standar Nasional Indonesia. Penelitian dilakukan 2 kali ulangan. Alur penelitian secara umum dapat dilihat pada Gambar 3
Produk Pengolahan Ikan Asap Tradisional dari 4 UPI di Provinsi Gorontalo
Observasi
-
Observasi di Lapangan: Cara Pengasapan Bahan baku pengasapan waktu pengasapan Jenis asap yang digunakan
Uji Laboratorium: - Uji organoleptik - Kimia (Kadar air dan Histamin) - Mikrobiologis (E. Coli dan TPC)
Data Observasi di Lapangan
Data Hasil Uji Laboratorium
Analisis Deskriptif Gambar 3. Ilustrasi Bagan Alir Penelitian
3.4. Prosedur Kerja 3.4.1 Uji organoleptik (SNI 2725.1: 2009) Uji organoleptik merupakan pengujian secara subjektif dengan menggunakan indera manusia sebagai alat utama daya penerimaan terhadap makanan. Uji organoleptik dilakukan terhadap ikan cakalang (Katsuwonus pelamis) asap adalah uji hedonik. Parameter yang diuji meliputi kenampakan, tekstur, aroma dan rasa. Uji organoleptik skala hedonik dilakukan untuk mengetahui tingkat kesukaan konsumen terhadap suatu produk melalui penilaian terhadap beberapa atribut produk seperti kenampakan, aroma, rasa, dan tekstur. Menurut Badan Standardisasi Nasional (SNI 2725.1: 2009), skala penilaian organoleptik untuk produk ikan asap yaitu 1-9 dengan persyaratan mutu dan keamanan pangan minimal 7 (Lampiran 1). Kemudian sampel yang diujikan diberi kode secara acak dan panelis agak terlatih dengan jumlah 10-15 orang diminta memberikan penilaian. Tingkat kesukaan uji sensori adalah sebagai berikut: 9 : amat sangat suka 8 : sangat suka 7 : suka 6 : agak suka 5 : netral
4 : agak tidak suka 3 : tidak suka 2 : sangat tidak suka 1 : amat sangat tidak suka
3.4.2 Prinsip Kerja Kadar Air (SNI, 01-2354.2006) Prinsip analisis kadar air adalah air dan zat-zat menguap dihilangkan melalui pemanasan dengan oven tidak vakum pada suhu 105 oC dengan tekanan udara tidak lebih dari 100 mm Hg selama 16-24 jam. penentuan berat air dihitung secara gravimetri berdasarkan selisih berat contoh sebelum dan sesudah contoh dikeringkan. Pertama-tama contoh dilumatkan hingga homogen dan dimasukan dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan tertutup. Contoh di kondisikan pada suhu ruang dan dipastikan
contoh masih tetap homogen sebelum ditimbang, jika terjadi pemisahan antara cairan dan contoh maka diaduk ulang dengan blender sebelum dilakukan. 1. Oven dikondisikan pada suhu yang akan digunakan hingga mencapai kondisi stabil. 2. Contoh porselin kosong dimasukkan ke dalam oven minimal 2 jam. 3. Cawan kosong dipindahkan ke dalam desikator sekitar 30 menit sampai mencapai suhu ruang dan ditimbang bobot kosong (A g). 4. Contoh yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak ± 2 g ke dalam cawan (B g). 5. Cawan yang telah diisi dengan contoh dimasukkan ke dalam oven tidak vakum pada suhu 105°C, dengan tekanan tidak lebih dari 100 mm Hg selama 16-24 jam. 6. Contoh dipindahkan menggunakan alat penjepit ke dalam desikator selama ± 30 menit kemudian ditimbang (C g). 7. Pengujian dilakukan duplo (dua kali). Perhitungan kadar air adalah : BC % kadar air =
x 100 % BA
Keterangan: A = berat cawan kosong dinyatakan dalam g B = berat cawan + contoh awal, dinyatakan dalam g C = berat cawan + contoh kering, dinyatakan dalam g 3.4.3 Prinsip Kerja Histamin (SNI 2360-10:2009) Histamin diekstrak dari jaringan daging contoh menggunakan metanol dan sekaligus mengkonversi histamin ke dalam bentuk OH. Zat-zat histamin selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan senyawa OPT. Besarnya fluoresensi diukur secara fluorometri pada panjang gelombang exitasi 350 nm dan 444 nm. Pengukuran kadar histamin secara fluorometri terdiri atas beberapa tahapan sebagai berikut:
1). Tahap ekstraksi (preparasi sampel) Sampel sebanyak 10 g ditimbang kemudian ditambahkan dengan metanol sebanyak 50 ml lalu dihomogenkan dengan homogenizer kurang lebih 1-2 menit. Sampel yang sudah dihomogenkan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 60°C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Sampel yang sudah didinginkan tersebut dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan metanol sampai tanda tera dan dikocok agar homogen. Larutan sampel tersebut kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No.01. Hasil saringan tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer untuk pemurnian (clean up). 2). Persiapan resin Sebanyak 3 g resin ditimbang untuk setiap kolom dalam beaker glass 250 ml, kemudian ditambahkan 15 ml NaOH 2 N/g resin dan diaduk-aduk dengan magnetik stirer selama 30 menit. Cairan pada bagian atas dituangkan dan diulangi penambahan NaOH dengan jumlah yang sama. Resin selanjutnya dibilas dengan akuades sebanyak 3 kali dan disaring pada kertas saring Whatman No. 01 dan dicuci kembali dengan akuades. Resin harus disiapkan dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator. 3). Persiapan kolom resin (tahap clean up/elusi) Glasswoll dimasukkan dalam kolom resin setinggi kurang lebih 1,5 cm. Resin dimasukkan dalam kolom resin setinggi 8 cm dan volume air yang berada di atas resin dipertahankan kurang lebih 1 cm (diusahakan agar resin jangan sampai kering). Labu takar 50 ml yang sudah berisi 5 ml HCl 1 N diletakkan di bawah kolom resin guna menampung elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin. Hasil tampungan (elusi) tersebut kemudian dipisahkan untuk tahap pembentukan (pembacaan). 4). Pemurnian contoh
Filtrat sebanyak 1 ml dipipet dan dimasukkan dalam kolom resin dan kran kolom resin dalam posisi terbuka dan dibiarkan aliran menetes dalam labu takar 50 ml.
Akuades
ditambahkan pada saat tinggi cairan kurang lebih 1 cm di atas resin dan cairan dibiarkan berelusi hingga mencapai 50 ml labu takar. Hasil elusi selanjutnya dapat disimpan dalam refrigerator. 5). Persiapan pembacaan contoh, standar dan blanko Pertama-tama tabung reaksi 50 ml masing-masing untuk contoh, standar dan blanko disiapkan. Masing-masing 5 ml contoh (hasil elusi), standar dan blanko (HCl 0,1 N) dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut. Selanjutnya ditambahkan berturut-turut 10 ml HCl 0,1 N dan vortex, kemudian ditambahkan 3 ml NaOH 1 N vortex dan dalam waktu 5 menit harus sudah ditambahkan 1 ml OPT 1 % lalu divortex dan dibiarkan selama 4 menit. Campuran tersebut selanjutnya ditambahkan H3 P04 3 N dan divortex. Sampel sesegera mungkin dibaca dengan alat spektrofotometer. Nilai konsentrasi dan fluorosensi dari larutan standar dimasukkan dalam program regresi linier. Nilai fluorosensi contoh dimasukkan ke dalam persamaan regresi standar y= a + bx, dimana y = fluorosensi contoh, a = intercept, b= slope dan x = konsentrasi contoh yang akan dihitung. Konsentrasi histamin (µg/g) Keterangan : Ac ABPR Fp Fa W
= Areal contoh = Areal blanko = Faktor pengenceran = Volume akhir sampel = Berat contoh
3.4.4 Pengujian Escherichia coli (SNI 01-2332. 2006) Prinsip kerja dari pengujian Escherichia coli adalah menumbuhkan bakteri dalam suatu media cair dan perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Prosedur kerja pengujian E. coli adalah sebagai berikut:
1. Persiapan contoh Prosedur kerjanya sebagai berikut: contoh sebanyak 25 ml yang akan diuji dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phosphatase Buffered (BFP), selanjutnya dihomogenkan selama 2 menit. 2. Uji Pendugaan Escherichia coli Sampel yang sudah dihomogenkan dimasukkan ke dalam botol pengencer. Homogenet merupakan larutan dengan pengenceran 10-1. Kemudian dipipet 1 ml ke dalam pengenceran yang dijadikan pengenceran 10-2 dan dari pengenceran 10-2 dipipet ke dalam pengenceran 10-3. Sampel selanjutnya dipindahkan dengan menggunakan pipet steril sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam masing-masing 3 seri tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham, selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35°C. Gas yang terbentuk (positif) setelah inkubasi 24 jam diperhatikan, selanjutnya tabung-tabung yang negatif (tidak adanya gas) diinkubasikan kembali selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. 3. Uji Penegasan E.coli Tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang positif diinokulasikan kedalam tabungtabung Escherichia coli Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Tabung-tabung yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35°C. Tabung yang menghasilkan gas diperiksa dan dipisahkan. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Jumlah tabung yang positif ditentukan berdasarkan Angka Paling Memungkinkan (APM). 3.4.5 Pengujian Total Plate Count (TPC) (SNI 01-2332.3-2006) Prinsip kerja dari analisis TPC adalah perhitungan jumlah koloni bakteri yang ada di dalam sampel dengan pengenceran sesuai keperluan dan dilakukan secara duplo. Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptik untuk mencegah kontaminasi yang tidak diinginkan dan
pengamatan secara duplo dapat meningkatkan ketelitian. Jumlah koloni bakteri yang dapat dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 23-250 koloni. Cawan petri, tabung reaksi dan pipet sebelum digunakan disterilkan terlebih dahulu dalam oven pada suhu 180 oC selama 2 jam. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Setelah disterilisasi, untuk menjaga agar media tidak membeku suhu media dipertahankan pada 45-55 oC dalam penangas air. Pembuatan larutan pengencer dilakukan dengan cara melarutkan 8,5 gram NaCl dalam 1 liter aquades yang kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Sampel sebanyak 10 gram dihaluskan terlebih dahulu, kemudian dilarutkan ke dalam larutan pengencer steril yang telah berisi dengan volume mencapai 100 ml sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Dari larutan tersebut dipipet 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml larutan pengencer steril untuk memperoleh pengenceran 10-2. Demikian seterusnya sampai didapat pengenceran 10-5, disesuaikan dengan pendugaan tingkat kebusukan ikan cakalang asap pada saat pengamatan. Dari setiap tabung reaksi pengenceran tersebut diambil dengan menggunakan pipet sebanyak 1 ml selanjutnya dimasukkan ke dalam cawan petri yang sudah disterilkan. Setiap pengenceran dilakukan secara duplo. Kemudian setiap cawan tersebut digerakkan secara melingkar di atas meja supaya media NA merata. Setelah NA membeku, cawan petri diinkubasi dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 30 oC, cawan petri tersebut diletakkan secara terbalik dalam inkubator. Setelah masa inkubasi, koloni yang tumbuh pada cawan petri dihitung dengan jumlah koloni yang dapat diterima 25-250 koloni per cawan. Nilai TPC dapat dihitung dengan memakai rumus berikut:
∑C Rumus :
N= [(1 x n1) + (0,1x n2)] x (d)
Ket:
N ∑C n1 n2 d
= jumlah koloni produk dinyatakan dalam koloni per g = jumlah cawan pada semua cawan yang dihitung = jumlah cawan pada pengencer pertama yang dihitung = jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung = pengenceran pertama yang digunakan
3.5 Metode Analisa Data Hasil observasi lapangan diperoleh cara pengasapan, bahan baku pengasapan, lama pengasapan, dan bahan bakar yang digunakan sedangkan pengujian di laboratorium meliputi uji kadar air, histamin, uji organoleptik, TPC dan E. coli. Untuk mendapatkan informasi yang sesuai dengan tujuan penelitian, maka dilakukan analisa data pada uji kadar air, histamin, uji organoleptik dan TPC, E. coli. Hasil yang diperoleh dibahas secara deskriptif dan dibandingkan dengan SNI.
