BAB II KAJIAN PUSTAKA
2.1
Epidemiologi Diabetes Melitus Tipe 2 Diabetes melitus (DM) adalah sindrom gangguan metabolisme yang
ditandai oleh hiperglikemia akibat salah satu dari defisiensi absolut sekresi insulin atau berkurangnya efektivitas biologis insulin, atau keduanya (Masharani dkk., 2004). DMT2 adalah tipe diabetes yang paling banyak dan terjadi pada sekitar 135 juta penduduk di seluruh dunia. DMT2 adalah penyebab kematian yang utama baik di negara maju maupun di negara berkembang, termasuk Indonesia. Pada penelitian di tujuh desa di Bali dengan situasi masyarakat yang berbeda, yaitu daerah pantai, pegunungan, daerah tujuan wisata, dan daerah urban, didapatkan prevalensi DMT2 sebanyak 5,1%. Sementara itu glukosa darah puasa terganggu atau impaired fasting glucose (IFG) didapatkan sebanyak 13,1% (Suastika dkk., 2011).
2.2
Faktor Genetik dalam Patogenesis Diabetes Melitus Tipe 2
Secara genetik, DM dapat bersifat monogenik dan poligenik. Gen yang terlibat dalam DMT2 lebih banyak bersifat poligenik sehingga lebih sulit diidentifikasi dan lebih sulit ditentukan. Bentuk poligenik dari DMT2 memiliki patofisiologi dan genetik yang kompleks, dan faktor lingkungan berperan penting. Manifestasi fenotipe DMT2 kompleks yang meliputi resisten terhadap aksi insulin di otot,
7
8
lemak, dan hati, defek sekresi insulin pada sel beta pankreas, dan peningkatan produksi glukosa hepatik (Buse dkk., 2011). Resistensi insulin di otot dan hati disertai dengan gangguan sekresi insulin dari sel beta pankreas merupakan inti dari gangguan yang terjadi pada DMT2, dan disebut sebagai triumvirate (DeFronzo, 2009). Pengertian faktor-faktor yang berperan pada patogenesis DMT2 berkembang dari tiga komponen menjadi delapan komponen dan disebut omnious octet, terdiri dari perubahan neurotransmitter di otak bersama dengan 7 komponen lain yaitu: resistensi insulin di otot dan di hati, gangguan sekresi insulin dari sel beta pankreas, peningkatan produksi glukagon dari sel alfa pankreas, penurunan efek inkretin, peningkatan lipolisis, dan peningkatan reabsorpsi glukosa di ginjal (DeFronzo, 2009).
2.2.1
Gen-gen yang diduga berkaitan dengan DMT2 Sejak tahun 2007 pemahaman tentang dasar genetik DMT2 meningkat
secara dramatis. Pada awalnya studi genetik didasarkan atas pendekatan melalui gen kandidat (candidate gene approach) dan linkage studies, yaitu menentukan regio DNA mikrosomal yang sama pada keluarga yang terkena. Pendekatan ini dapat mengidentifikasi gen-gen penting yang berkaitan dengan diabetes. Setelah GWAS, jumlah gen yang dapat diidentifikasi meningkat secara dramatis. GWAS mengidentifikasi genome pada kasus dan kontrol untuk menentukan SNP yang berasosiasi dengan penyakit. Pendekatan ini bergantung pada sejumlah faktor termasuk lengkapnya Human Genome Project, genotyping dari 3,8 juta SNP dan identifikasi haplotype-tagged SNP oleh International Hap Map Project, teknologi
9
genotyping yang digunakan, alat analisis serta metode interpretasi data dengan jumlah data yang begitu besar (Buse dkk., 2011). Studi yang dilaporkan Lyssenko dkk, 2008 memberi banyak informasi tentang gen-gen yang berkaitan dengan DMT2. Studi ini dilakukan di Swedia (16.061 orang dari Malmo Preventive Study atau MPP) dan Finlandia (2.770 orang dari The Botnia Study). Subyek diikuti selama 23,5 tahun dari fase awal saat glukosa darah normal. Sebanyak 2.201 (11,7%) dari sampel ini menjadi DMT2 pada akhir studi. Genotyping 16 SNP menunjukkan bahwa varian dari 11 gen (TCF7L2, PPARG, FTO, KCNJ11, NOTCH2, WFS1, CDKAL1, IGF2BP2, SLC30A8, JAZF1, dan HHEX) secara signifikan berasosiasi dengan risiko DMT2 tidak bergantung pada faktor risiko klinis. Faktor risiko klinis yang dinilai meliputi riwayat keluarga dengan DMT2, peningkatan indeks massa tubuh, peningkatan kadar enzim hati, dan riwayat merokok. Varian-varian yang diperiksa secara spesifik pada penelitian Lyssenko dkk., 2008 adalah sebagai berikut: TCF7L2 (rs7903146), KCNJ11 (rs5219), PPARG
(rs1801282),
CDKAL1
(rs7754840),
IGF2BP2
(rs4402960),
CDKN2A/CDKN2B (rs10811661), FTO (rs9939609), HHEX (rs1111875), SLC30A8
(rs13266634),
CDC123/CAMK1D
WFS1
(rs12779790),
(rs10010131), TSPAN8/LGR5
JAZF1
(rs864745),
(rs7961581),
THADA
(rs7578597), ADAMTS9 (rs4607103), dan NOTCH2 (rs10923931). Sebanyak 16 SNP yang diperiksa ini merupakan SNP yang konsisten berasosiasi dengan DMT2 berdasarkan studi potong lintang pada GWAS. Sebanyak 8 varian dari gen ini juga berasosiasi dengan gangguan fungsi sel beta. Varian gen yang paling memprediksi
10
progresi dari normal menjadi DMT2 adalah TCF7L2 (rasio odds atau RO 1,27; p=2,7×10−7), PPARG (RO 1,15; p=0,03), FTO (RO 1,16; p=7,2×10−4), KCNJ11 (RO 1,11; p=0,01), WFS1 (RO 1,13; p=0,004), CDKAL1 (RO 1,21; p=0,05), IGF2BP2 (RO 1,12; p=0,01), dan SLC30A8 (RO 1,11; p=0,02). Varian yang memprediksi transisi dari prediabetes (impaired fasting glucose atau impaired glucose tolerance) menjadi DMT2 adalah
TCF7L2 (RO 1,30; p=2,7×10−5),
PPARG (RO 1,29; p=0,004), KCNJ11 (RO 1,15; p=0,02), dan FTO (RO 1,13; p=0,03) (Lyssenko dkk., 2008).
2.2.2
Temuan regio pada kromosom 10q sebagai awal penelitian asosiasi gen TCF7L2 dengan DMT2
Pada awal tahun 1999, Duggirala dkk. melaporkan bahwa regio pada kromosom 10q berhubungan dengan DMT2 pada orang Meksiko-Amerika.
Reynisdottir
dkk., 2003 mendapatkan hubungan yang sama pada populasi di Islandia. Pada tahun 2006 Grant dkk. melaporkan temuan adanya potensi hubungan antara polimorfisme TCF7L2 dengan risiko DMT2. Mereka melakukan genotiping terhadap 228 penanda mikrosatelit pada kromosom 10q. Mikrosatelit DG10S478 yang berlokasi pada intron 3 dari gen TCF7L2, berasosiasi dengan DMT2. Hasil serupa juga didapatkan pada kohort di Denmark dan USA (Grant dkk., 2006). Dua SNPs, rs12255372 dan rs7903146, memiliki asosiasi disequilibrium yang kuat (strong linkage disequilibrium) dengan DG10S478 dan juga menunjukkan asosiasi yang kuat dengan DMT2.
11
2.2.3
Studi gen TCF7L2 pada ras kaukasia di Eropa dan Amerika
Evaluasi asosiasi gen TCF7L2 dengan DMT2 membutuhkan replikasi dan penilaian pada sampel dengan jumlah yang banyak. Studi kasus kontrol di UK menggunakan 4 SNP (rs4506565, rs7903146, rs12243326, rs12255372) pada 2.158 DMT2 dan 2.574 kontrol dilengkapi dengan analisis asosiasi berdasarkan keluarga pada 388 orang tua-anak trios (parent-offspring trios). Pada studi ini semua SNP menunjukkan asosiasi kuat dengan diabetes, yang paling kuat adalah rs7903146 (risiko relatif allele-wise 1,36 [95% CI 1,24–1,48], p=1,3 x10-11). Analisis berbasis keluarga menunjukkan bukti adanya asosiasi pada semua lokus (misal rs4506565, transmisi 62%, p=7 x 10-5) tanpa ada efek pada orangtua. Frekuensi genotipe TCF7L2 yang berasosiasi diabetes lebih besar pada kasus dengan riwayat diabetes dan onset diabetes yang dini (rs4606565, p=0,02); risiko di populasi yang diperkirakan dari kasus yang tidak terseleksi adalah ~16%. Secara keseluruhan bukti asosiasi varian ini adalah p=4,4 x 10-14 bila dikombinasi dari kasus kontrol dan analisis berbasis keluarga untuk rs4506565. Angka ini melewati kriteria signifikan berdasarkan genome-wide dan mempertegas bahwa TCF7L2 merupakan gen yang penting yang menentukan kerentanan terhadap terjadinya DMT2 (Groves dkk., 2006). SNPs yang diteliti oleh Grant secara ekstensif diteliti oleh peneliti lain pada group etnik yang berbeda. Pada studi kasus kontrol (886 kasus dan 896 kontrol) di USA, varian gen TCF7L2 khususnya rs12255372 (T/G) berasosiasi dengan DMT2 pada ras Kaukasia. Frekuensi allele T lebih tinggi pada kasus dibanding kontrol; tiap kopi allele T berasosiasi 1,32 lipat (p=0,0002) dan 1,53
12
lipat (p<0,0001) lebih tinggi pada DMT2 wanita dan laki. Rasio odds (95% CI) karier homozygote allele T adalah 1,86 (1,30–2,67) pada wanita dan 2,15 (1,48– 3,13) pada laki. Risiko diabetes pada populasi berasosiasi dengan allele T adalah 14,8 and 22,3% untuk wanita dan laki-laki. Pada meta analisis terhadap 3.347 kasus dan 3.947 kontrol, tiap kopi allele T berasosiasi dengan peningkatan risiko 1,48 (p<10-16). Temuan pada penelitian ini mengkonfirmasi bahwa gen TCF7L2 merepresentasikan lokus penting untuk memprediksi terjadinya DMT2 (Zhang dkk., 2006). Penelitian GWAS mengidentifikasi 5 lokus yang mengandung varian yang berisiko untuk berkembang menjadi DMT2 berdasarkan beda signifikan yang paling tinggi dari frekuensi genotipe antara kasus DMT2 dengan kontrol sehat, termasuk di dalamnya mengkonfirmasi asosiasi TCF7L2 dengan DMT2 (Sladek dkk, 2007). Di antara semua SNP maka rs12255372 dan rs7903146 yang paling kuat berasosiasi dengan DMT2 (Helgason dkk., 2007). Laporan lain menunjukkan bahwa rs7903146 memiliki efek yang paling kuat pada orang kulit putih (Goodarzi dan Rotter, 2007). Pada Framingham Offspring Study sebanyak 1.087 anggota keluarga diperiksa asosiasi genetik menggunakan metode Affymetrix 100K SNP array. Tiga penanda kadar gula pada diabetes yang diperiksa adalah kadar glukosa darah puasa, hemoglobin A1c, 28-yr time-averaged fasting plasma glucose (tFPG)), dan tiga penanda insulin yang diperiksa adalah insulin puasa, HOMA-IR, dan indeks sensitivitas insulin 0–120 menit. Dari penelitian ini didapatkan 415 SNP yang berasosiasi (p<0,001) sedikitnya dengan satu dari enam pemeriksaan kuantitatif
13
tersebut dan 128 SNP berasosiasi dengan insiden diabetes. Penelitian ini mengkonfirmasi asosiasi gen TCF7L2 dengan diabetes (Meigs dkk., 2007). Pada dua kohort independen populasi Skandinavia, genotipe CT/TT dari rs7903146 memprediksi dengan kuat terjadinya DMT2 di kemudian hari (Lyssenko dkk. 2008).
2.2.4
Studi gen TCF7L2 pada populasi Arab
Data dari studi pada populasi Arab mengkonfirmasi asosiasi antara alel rs7903146T dengan DMT2 (Amoli dkk., 2010).
2.2.5
Studi gen TCF7L2 pada populasi Asia Penelitian kasus kontrol pada populasi India (DMT2=955, kontrol=399)
yang memeriksa 3 SNP TCF7L2 (rs7903146, rs12255372 dan rs4506565) mendapatkan asosiasi kuat DMT2 dengan semua SNP, yaitu rs12255372 (RO1,50 interval kepercayaan atau IK 95% 1,24–1,82; p=4,0×10−5), rs4506565 (RO1,48; IK 95% 1,24–1,77; p=2,0×10) dan rs7903146 (RO 1,46; IK 95% 1,22–1,75; p=3,0×10−5). Dari ketiga varian ini risiko relatif pada homozygote lebih kuat dibanding heterozygote, yang paling kuat adalah rs12255372 (RO 2,28; IK 95% 1,40–3,72 vs. RO 1,43; IK 95% 1,11–1,83). Tidak didapatkan asosiasi dengan umur pada saat terdiagnosis, BMI atau WHR, namun rs12255372 berasosiasi dengan kadar glukosa puasa lebih tinggi (p=0,001), kadar glukosa 2 jam setelah makan (p=0,0002) dan nilai HOMA-IR yang lebih tinggi (p=0,012) pada subyek nondiabetes (Chandak dkk., 2007).
14
Pada populasi Asia, frekuensi SNPs rs12255372 dan rs7903146 agak rendah. Tapi asosiasi DMT2 dengan SNPs ini diidentifikasi pada dua kohort yang besar di Jepang (Hayashi dkk., 2007; Horikoshi dkk, 2007). SNP TCF7L2 yang berasosiasi dengan DMT2 teridentifikasi pada populasi Cina. SNP rs290487 diidentifikasi oleh Chang dkk. pada populasi Cina Han di Taiwan (Chang dkk., 2007). SNP rs11196218 teridentifikasi pada populasi Cina Hongkong (Ng dkk., 2007; Van Vliet-Ostatchouk dkk., 2007). Pada studi kasus kontrol pada populasi Cina Hongkong yang meneliti 22 SNP dari gen TCF7L2 yang berasosiasi dengan DMT2, diidentifikasi rs11196205 yang sebelumnya sudah diidentifikasi di Jepang, sedangkan rs7903146 tidak berasosiasi dengan diabetes. Penelitian ini mengidentifikasi SNP yang lain yaitu rs11196218 allele G, yang berlokasi di blok disequilibrium yang berdekatan, yang mengubah risiko independen untuk DMT2 (RO 1,43; IK 95% 1,14-1,79) dan berkontribusi sebagai risiko (contributed high-population attributable risk) 42%. Penelitian ini mereplikasi asosiasi dengan rs11196218 dan haplotipe untuk DMT2 di keluarga sampel (p<0,05) (Ng dkk., 2007). Pada penelitian di Bali, TCF7L2 rs7903146 juga berasosiasi dengan obesitas dan profil lipid. Tidak seperti penelitian sebelumnya, tidak didapatkan asosiasi rs7903146, rs12255372, dan rs10885406 dengan diabetes, namun didapatkan bahwa kadar glukosa darah pada genotipe CT secara signifikan lebih tinggi dibandingkan genotipe CC dan TT pada rs7903146 (Saraswati dkk., 2011).
15
2.2.6
Studi gen TCF7L2 pada populasi Afrika
Penelitian kasus kontrol (675 kasus DMT2 dan 377 kontrol) yang dilakukan di rumah sakit di Kumasi Ghana untuk mencari asosiasi antara beberapa varian genetik (TCF7L2 rs7903146, KCNJ11 rs5219, PPARγ rs1801282 and CAPN10 rs3842570, rs3792267, dan rs5030952) dengan DMT2, menunjukkan bahwa frekuensi alel T dari TCF7L2 rs7903146 (T) adalah 0,33. Angka ini sebanding dengan frekuensi pada Kaukasian, namun asosiasi alel ini dengan DMT2 lebih lemah (dengan model multivariat, alel ini meningkatkan risiko DMT2 39%, IK 95% 1,07-1,81; p=0,014). Sedangkan alel risiko KCNJ11 (G) dan alel protektif PPARγ (G) tidak didapatkan (Danquah dkk., 2013).
2.2.7
Studi gen TCF7L2 pada diabetes gestasional
Penelitian kasus kontrol pada 826 ibu diabetes gestasional dan 1.185 kontrol sehat di Swedia (the Diabetes Prediction in Skåne Study), mempelajari SNP TCF7L2 rs7903146, rs12255372 dan rs7901695. Genotipe heterozygote CT, GT dan TC dari rs7903146 (T merupakan alel risiko untuk DMT2), rs12255372 (T: alel risiko) dan rs7901695 (C: alel risiko) dan homozygote TT, TT dan CC dari rs7903146, rs12255372 dan rs7901695, berasosiasi kuat dengan diabetes gestasional (p<0,0001). Asosiasi SNP gen TCF7L2 dengan diabetes gestasional independen terhadap ada atau tidaknya HLA-DQB1*0602 dan autoantibodi terhadap sel beta dan faktor-faktor lain termasuk usia ibu, jumlah kehamilan, riwayat diabetes dalam keluarga, dan genotipe HLA-DQ yang lain (Papadopoulou dkk., 2011).
16
Penelitian lain yang melibatkan 1460 subyek terdiri dari 347 DMT2, 261 diabetes gestational, 147 anak dari penderita diabetes, dan 329 wanita dengan polycystic ovary syndrome (PCOS), dan 376 kontrol, juga mempelajari tentang tiga SNP yang sama dari TCF7L2 yaitu: rs7901695; rs7903146; dan rs12255372 pada populasi Czech. Haplotipe CTT menunjukkan asosiasi yang kuat dengan DTM2 yaitu RO 1,57; p=0,0003, frekuensi haplotipe CTT/CTT ini lebih rendah pada pada kelompok yang lain, yaitu: diabetes 10,6%, anak penderita diabetes 9,5%, diabetes gestasional
6,1%, kelompok kontrol 5,3% dan PCOS 4,9%
(Vcelak dkk., 2012).
2.2.8
Meta analisis tentang asosiasi SNP gen TCF7L2 dengan DMT2
Meta analisis penelitian-penelitian yang dikumpulkan melalui PubMed, the Cochrane Library, dan Embase dari tahun 2006 sampai 2012 tentang asosiasi rs12255372 gen TCF7L2 dengan DMT2 pada populasi di dunia menunjukkan bahwa rs12255372 berasosiasi secara signifikan dengan DMT2 pada populasi global. Meta analisis ini meliputi 33 artikel dan 42 penelitian (total 34.076 kasus dan 36.192 kontrol). Penelitian ini meliputi 6 penelitian di Eropa, 14 pada populasi Kaukasia, 17 di Asia, 2 di Afrika, dan 3 di Amerika (Wang dkk., 2013a). TCF7L2 berasosiasi dengan DMT2 pada berbagai populasi, namun hasilnya kontradiktif pada populasi China dan Pima Indian. Metaanalisis terhadap 36 penelitian meliputi rs7903146, rs7901695, rs12255372, dan rs11196205, meliputi 35.843 kasus DMT2 dan 39.123 kontrol, keempat varian TCF7L2 berasosiasi dengan DMT2 (Tong dkk., 2009).
17
Meta analisis tentang asosiasi SNP gen TCF7L2 dengan DMT2 pada populasi China melalui PubMed, The Cochrane Library, dan Embase dari Januari 2007 sampai Februari 2012 mendapatkan sebanyak 21 artikel yaitu 7 artikel meneliti tentang rs11196218 (3.942 kasus dan 3.502 kontrol), 8 artikel tentang rs290487 (3.377 kasus dan 2.975 kontrol), dan 14 artikel tentang rs7903146 (7.902 kasus dan 7.436 kontrol). SNP rs11196218 dan rs290487 gen TCF7L2 tidak berasosiasi dengan risiko DMT2, sedangkan rs7903146 berasosiasi dengan DMT2 pada populasi China baik di bagian Utara maupun Selatan (Wang dkk., 2013b). Untuk memahami dasar genetik DMT2 beberapa konsorsium di bidang diabetes yaitu DIAbetes Genetics Replication And Meta-analysis (DIAGRAM) Consortium, Asian Genetic Epidemiology Network Type 2 Diabetes (AGEN-T2D) Consortium, South Asian Type 2 Diabetes (SAT2D) Consortium, Mexican American Type 2 Diabetes (MAT2D) Consortium and Type 2 Diabetes Genetic Exploration by Next-generation sequencing in multi-Ethnic Samples (T2DGENES) Consortium,
merangkum
data
meta-analisis
dari
genome-wide
association studies (GWAS), meliputi 26.488 kasus dan 83.964 kontrol baik dari Eropa, Asia Timur, Asia Selatan, Meksiko dan Meksiko-Amerika. Dari semua grup, nampaknya terdapat konsistensi dari alel risiko yang didapat dari penelitian sebelumnya, termasuk TCF7L2, meski kalau dilihat dari tiap SNP asosiasinya lemah. Dengan melihat signal paling kuat dari asosiasi yang didapat dari meta analisis trans-etnik, diidentifikasi tujuh lokus baru yang berasosisasi dengan DMT2. Hasil ini menunjukkan keuntungan GWAS trans etnik untuk dapat
18
memahami peranan arsitektur genetik dalam mempelajari patogenesis penyakit pada manusia (Diagram Consortium, 2014).
2.3
Peranan GLP 1 pada Sekresi Insulin
GLP1 dan GIP adalah hormon inkretin yang disekresikan sebagai respon terhadap makanan dan meningkatkan sekresi insulin (Nauck dkk., 1993; Kjems dkk., 2003; Visboll dkk., 2003). Penurunan respon inkretin dapat berkontribusi terhadap gangguan respon insulin pada pasien DMT2.
2.3.1
Struktur molekul GLP1
GLP1 merupakan protein yang dihasilkan dari gen proglukagon atau glucagon gene (gcg). Gen proglukagon terdiri dari 6 ekson dan 5 intron (Mojsov dkk., 1986). Gen proglukagon mengkode prekursor glukagon, GLP1, dan GLP2, pada ekson yang berbeda. Gen proglukagon menghasilkan salah satu dari ketiga peptide sesuai dengan proses post translansi yang bersifat jaringan spesifik, misalnya di sel alfa pankreas akan dihasilkan glukagon (tidak dihasilkan GLP1 dan GLP2). Di sel intestin akan dihasilkan GLP1 dan GLP2 (tidak dihasilkan glukagon) (Kieffer dan Habener, 1999). Sekuen tranksrip mRNA identik di pankreas, intestin dan otak, namun produk post translasi menghasilkan protein yang berbeda di tiap-tiap organ. Di pankreas yang dihasilkan adalah 1) glicentin-related pancreatic peptide, 2) glukagon dan 3) peptide panjang yang mengandung sekuen GLP1 dan GLP2. Di sel L intestin dihasilkan glicentin, oxyntomodulin, GLP1 dan GLP2. Proses lanjutan di sel L menghasilkan bentuk terputus dan berikatan dengan amide yaitu
19
GLP1(1-36), GLP1(7-36), dan GLP1(7-37). Di otak, proses yang terjadi mirip seperti di intestin (Blázquez dkk., 2002). Pada fase awal, yang dikenal adalah GLP1(1-37), namun yang bersifat aktif in vivo dan dikenal oleh reseptor di pankreas adalah dua bentuk dengan Nterminal yaitu GLP1(7-37) dan GLP1(7-36) (Drucker dkk, 1987; Holst dkk., 1987; Mojsov dkk 1987). GLP1(1-37) terdiri dari 37 asam amino, GLP1(7-37) terdiri dari 31 asam amino, dan GLP1(7-36) terdiri dari 30 asam amino.
2.3.2
Sekresi dan Metabolisme GLP1 GLP1 disekresikan dari sel L di intestine bagian bawah, sedangkan di
intestine bagian atas hormon inkretin lain yaitu GIP disekresikan dari sel K. Sekresi GLP1 bersifat bifasik diawali sekresi fase awal (dalam 10-15 menit) dan diikuti dengan sekresi fase kedua yang lebih panjang (30-60 menit). Stimulus dari puncak kadar GLP1 paska makan dimediasi secara tidak langsung melalui jalur neuroendokrin, meski hal ini masih dalam tahap penelitian. Secara in vivo GLP1 disekresikan dalam beberapa bentuk yaitu: GLP1(1-37) dan GLP1(1-36) dalam bentuk inaktif, serta GLP1(7-37) dan GLP1(7-36) yang aktif secara biologis. Pada manusia, yang predominan adalah GLP1(7-36) (Asmar M, 2011). Waktu paruh GLP1 utuh (intact) di sirkulasi pendek, kurang dari 2 menit, karena GLP1 bentuk aktif cepat didegradasi menjadi bentuk tidak aktif dengan cara memotong dua asam amino NH2 terminal. Metabolit yang terbentuk adalah GLP1(9-37) atau GLP1(9-36) yang bersifat inaktif terhadap sekresi insulin (Deacon dkk., 1995; Hansen dkk., 1999). Beberapa studi menunjukkan bahwa
20
bentuk metabolit ini memiliki aktivitas terhadap sistem kardiovaskular. Sebagian besar GLP1 yang keluar dari saluran cerna telah berada dalam bentuk metabolit dan hanya 25% dari GLP1 yang disekresikan masuk ke dalam vena porta dalam bentuk utuh (Hansen dkk., 1999). Metabolit GLP1 dieksresikan melalui ginjal. Waktu paruh plasma GLP1 utuh atau GLP1(7-36) pada orang normal adalah 2,3±0,4 menit, sedangkan waktu paruh metabolit GLP1(9-36) adalah 3,3±0,4 menit. Waktu paruh GLP1 utuh dan metabolit GLP1 lebih panjang pada gangguan fungsi ginjal, yaitu masing-masing 3,4±0,6 menit dan 5,3±0,8 menit. Konsentrasi GLP1 utuh hanya meningkat sedikit setelah pemberian glukosa. Tidak ada perbedaan antara kelompok normal ataupun dengan gangguan fungsi ginjal. Sebaliknya, konsentrasi metabolit GLP1(9-36) secara signifikan meningkat sebagai respon terhadap beban glukosa oral. Kadar GLP1(9-36) pada gangguan fungsi ginjal kronik secara signifikan lebih tinggi dari subyek normal (Meier dkk., 2004). GLP-1 dengan cepat mengalami degradasi proteolitik oleh enzim DPP4, sehingga pada penelitian seharusnya diperiksa kadar GLP1 utuh dan total (yaitu GLP1 utuh ditambah dengan metabolit GLP1 hasil katalisis enzim DPP4). Pemeriksaan GLP1 utuh membutuhkan antibodi spesifik dan tidak tersedia secara luas. Di samping itu, bagian carboxyl-terminal arginine dari GLP1 peka terhadap amidasi, sehingga GLP1 ada dalam bentuk amidated GLP1(7-36) dan nonamidated GLP1(7-37), keduanya memiliki efek insulinotropik dan efek metabolik. Sebagian besar GLP1 yang disekresikan dari saluran cerna ada dalam bentuk
21
amidated, meski demikian hal ini perlu dipertimbangkan karena sebagian antibodi hanya mengenali bentuk amidated dari GLP1 (Seino dkk., 2010).
2.3.3
Efek fisiologis dari GLP1 GLP1 dan GIP memiliki sekuen asam amino yang mirip, khususnya di
bagian N-terminal. GLP1 dan GIP juga memiliki fungsi yang serupa dalam hal merangsang sekresi insulin dari sel beta pankreas, namun kedua peptide ini bekerja melalui reseptor yang berbeda, yaitu reseptor GLP1 atau GLP1 receptor (GLP1R) untuk GLP1 dan reseptor GIP atau GIP receptor (GIPR) untuk GIP. GLP1R disandi oleh 463 asam amino berbentuk heptahelikal dan merupakan G protein-coupled receptor (GPCR). GPCR terdiri dari empat kelas utama berdasarkan kemiripan sekuen yaitu kelas A, B, C (sebelumnya disebut kelas 1, 2 dan 3) dan frizzled family (Doyle dan Egan, 2007). Penelitian pada baboon yang sehat menunjukkan bahwa eliminasi kerja GLP1 mengakibatkan gangguan toleransi glukosa setelah ingesti nutrisi. Eliminasi kerja GLP1 dilakukan dengan pemberian exendin-(9-39) atau Ex-9 yaitu suatu antagonis reseptor GLP1 atau dengan anti–GLP1 mAb (D‘Alessio dkk., 1996). Efek fisiologis GLP1 pada pengaturan glukosa darah ini melalui beberapa mekanisme di pankreas, saluran cerna khususnya lambung, otak, serta jaringan perifer yaitu hati, otot, dan lemak. Di endokrin pankreas, GLP1 meningkatkan sekresi insulin dan menurunkan sekresi glukagon. GLP1 juga meningkatkan proliferasi sel beta dan menurunkan apoptosis sel beta pankreas (Drucker, 2006).
22
Peran GLP1 dalam mengendalikan glukosa darah post prandial selain ditentukan oleh efek GLP1 pada sekresi insulin, juga ditentukan oleh efek GLP1 dalam memperlambat pengosongan lambung (Wettergren dkk., 1993; Nauck dkk., 1997), dan mencetuskan rasa kenyang (Flint dkk., 1998). GLP1 meningkatkan disposal glukosa di perifer (D‘Alessio dkk., 1994; D‘Alessio dkk., 1995; Egan dkk., 2002).
2.3.4
Peranan GLP1 pada sekresi insulin Sekresi insulin dikendalikan oleh beberapa faktor yang kompleks, yaitu
glukosa, asam amino, katekolamin, serta hormon intestin (inkretin). Kadar glukosa setelah pemberian glukosa intravena lebih tinggi dibanding setelah pemberian intrajejunal, namun respon kenaikan kadar insulin lebih tinggi setelah pemberian intrajejunal (Gambar 2.1). Berdasarkan fakta ini McIntyre dkk., 1964 menduga adanya bahan humoral yang dilepaskan jejunum selama absorpsi glukosa yang bekerja bersama glukosa untuk meningkatkan sekresi insulin dari pankreas.
23
Gambar 2.1 Konsep Inkretin, Dilihat dari Respon Glukosa dan Insulin setelah Pemberian Infus Glukosa melalui Intravena dan Intrajejunal (Gambar ini diambil oleh Kieffer dan Habener, 1999 dari McIntyre dkk., 1964, Lancet; 2:20-21).
Efek insulinotropik dari GLP1 diteliti pada isolat pankreas tikus dengan menggunakan GLP1 sintetis. Pada penelitian ini didapatkan bahwa pada kadar glukosa 6,6 mM, GLP1(7-37) merupakan stimulator poten untuk sekresi insulin. Efek insulinotropik pada konsentrasi yang rendah menunjukkan bahwa GLP1(737) berperan pada regulasi insulin secara fisiologis. GLP1(1-37) tidak memiliki efek sekresi insulin meski diberikan pada konsentrasi tinggi (Mojsov dkk., 1987). GLP1 meningkatkan sekresi insulin yang diinduksi glukosa melalui peningkatan ekspresi gen insulin dan kadar cAMP, yang dibuktikan dengan penelitian in vitro menggunakan rat islet cell line (Drucker dkk., 1987). GLP1 (maupun GIP) menstimulasi pembentukan cAMP dan aktivasi protein kinase A (PKA). Penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa penghambatan PKA ternyata tidak menggagalkan efek inkretin pada sekresi insulin (Drucker, 2006).
24
Stimulasi sekresi insulin oleh inkretin yang bergantung pada PKA berpengaruh pada guanine nucleotide exchange factors (GNEFs), khususnya cyclic AMP-GEFII (Epac2) (Ozaki dkk., 2000). Reduksi ekspresi GEFII menguatkan efek GLP1 pada sekresi insulin (Kashima dkk., 2001). Peningkatan cAMP mengaktivasi protein kinase A (PKA) dan penukaran protein yang diaktivasi oleh cAMP2 (Epac2)/cAMP-guanine nucleotide exchange factor (GEF)II. Aktivasi PKA mencetuskan penutupan KATP channels dan memfasilitasi depolarisasi membrane. PKA juga mengakibatkan hambatan pada delayed rectifying K+ (Kv) channel, suatu regulator negatif sekresi insulin di sel beta pankreas yang menghasilkan perpanjangan aksi potensial. Depolarisasi membuka voltage-gated Ca2+channels (VDCC), sehingga konsentrasi Ca2+ intraseluler meningkat yang memobilisasi penyimpanan Ca2+ intraseluler melalui mekanisme yang bergantung pada PKA dan Epac2. Peningkatan konsentrasi Ca2+mencetuskan fusi dari granula insulin dengan membran plasma dan sekresi insulin dari sel beta. Peningkatan Ca2+ juga meningkatkan transkripsi gen proinsulin, sehingga insulin di dalam beta sel meningkat. Aktivasi EPAC2 meningkatkan densitas granula insulin di dekat membrane plasma (Seino dkk., 2010) Peranan subunit reseptor sulfonylurea (SUR) pada modulasi penutupan GLP1R-dependent KATP channel telah diketahui. Meski GLP1 dan GIP menstimulasi pembentukan cyclic AMP (cAMP) di SUR1-/- islets, efek insulinotropik kedua inkretin ini berkurang secara nyata pada tikus SUR1-/-. Hal ini terjadi kemungkinan karena defek coupling dari cAMP dengan jalur regulasi
25
eksositosis insulin (Nakazaki dkk., 2002; Shiota dkk., 2002). Temuan ini konsisten dengan peranan SUR1 dalam pengaturan eksositosis yang diinduksi oleh Ca2+ yang bergantung cAMP (cyclicAMP-dependent regulation of Ca2+induced exocytosis). Sebaliknya pada tikus dengan Kir6.2-/-, GLP1 (tapi tidak terjadi pada GIP) tetap mempertahankan kerja insulinotropik (Miki dkk., 2005). Hal ini menunjukkan bukti adanya jalur signaling yang berbeda-beda dan kompleksnya aksi subunit KATP channel di sel beta pankreas. Tidak seperti kerja sekretogogus lain yang primer melalui KATP channel, GLP1 juga mempertahankan penyimpanan insulin melalui stimulasi ekspresi gen proinsulin (Drucker dkk., 1987). Efek ini terjadi melalui peningkatan transkripsi gen proinsulin dan stabilitas mRNA melalui mekanisme PKA independen yang dependen cAMP (cyclic AMP-dependent PKA-independent mechanisms). Transkripsi faktor Pdx-1 merupakan target untuk GLP1 pada ekspresi gen insulin. GLP1 meningkatkan ekspresi Pdx-1 melalui penguatan (enhancement) ekspresi gen Pdx-1 dan augmentasi ikatan Pdx-1 dengan promoter gen insulin (Wang dkk., 1999). Reduksi atau eliminasi ekspresi Pdx-1 berasosiasi dengan reduksi dari ekspresi reseptor GLP1 dan hilangnya aksi GLP1 pada sel beta. Hal ini terbukti pada studi menggunakan cell lines atau sel beta in vitro dan penelitian in vivo pada tikus dengan inaktivasi gen Pdx-1 sel beta spesifik (Li dkk., 2005a; Wang dkk., 2005).
26
2.3.5
Penelitian GLP1 pada pasien DMT2 dan orang normal
Respon peningkatan insulin, C peptide, inkretin (GLP1 dan GIP) serta glukagon pada tes toleransi glukosa oral (TTGO) dibandingkan antara subyek dengan DMT2 dan orang normal yang match dari segi umur dan berat badan, masingmasing kelompok sebanyak 9 orang. Subyek dengan DMT2 menunjukkan peningkatan yang lambat dari kadar insulin dan C peptida, namun secara keseluruhan responnya tidak berbeda dengan orang normal (Gambar 2.2, B dan C). Respon peningkatan GLP1 lebih tinggi pada DMT2 (61±5 vs. 43±5 pmol/liter, p=0,034), sedangkan respon peningkatan GLP1(7-36) secara keseluruhan lebih rendah dengan p=0,047 (Gambar 2.2, E). Meski demikian, puncak konsentrasi yang dicapai antara DMT2 dan orang normal setara. Kadar glukagon basal pada kedua kelompok sama, dan kadarnya menurun setelah pemberian glukosa pada kedua kelompok (Gambar 2.2, F) (Nauck dkk., 1993). Pada pemberian hormon inkretin eksogen, baik GLP1 (7-36) maupun GIP meningkatkan sekresi insulin (insulin, C-peptide) pada kedua kelompok (p<0,05) sesuai dengan dosis. DMT2 mencapai peningkatan C-peptide 71% dari respon orang normal (tidak berbeda bermakna) dengan injeksi GLP1(7-36). Efek maksimum pada DMT2 lebih rendah secara signifikan dibanding orang normal (54%; p<0,05) dengan injeksi GIP. Kadar glukagon pada orang normal lebih rendah selama hyperglycemic clamps, namun hal ini tidak terjadi pada DMT2. Respon penurunan glukagon terjadi pada kedua kelompok (p<0,05) setelah pemberian GLP1(7-36). Respon penurunan glukagon ini tidak terjadi dengan pemberian GIP (Nauck dkk., 1993).
27
Gambar 2.2 Respon Glukosa Plasma, Insulin, C-peptida, Immunoreactive GIP, Immunoreactive GLPl dan Glucagon Pankreas terhadap Glukosa Oral pada DMT2 dan Orang Normal (Nauck dkk., 1993) Keterangan: Respon glukosa plasma (A), insulin (B), C-peptida (C), immunoreactive GIP (D), immunoreactive GLPl (antiserum 2135; E) dan glukagon pankreas (antiserum 4305; F) terhadap glukosa oral pada DMT2 (bulat hitam) dan orang normal (bulat putih). Nilai ditampilkan dalam rata-rata ± SEM. Kadar glukosa kapiler 120 menit setelah glukosa oral ditunjukkan dengan simbul kotak. IR-GIP=immunoreactive GIP. IR-GLP1=immunoreactive GLPl
28
GLP1 meningkatkan sekresi insulin pada pasien dengan diabetes dan kontrol subyek tanpa diabetes dalam pola tergantung dosis dan respon sel beta terhadap glukosa dapat meningkat ke level normal dengan infus GLP1 dosis rendah. Penelitian tentang hubungan antara GLP1 dengan laju sekresi insulin prehapatik (prehepatic insulin secretion rate [ISR]) basal dan dengan stimulasi glukosa yang dilakukan pada 7 pasien DMT2 dan kontrol menunjukkan bahwa pada DMT2 respon sel beta terhadap glukosa dan GLP1 terganggu (Kjems dkk., 2003). Penelitian kadar hormon inkretin pada orang sehat yang kurus, orang sehat yang gemuk, DMT2 gemuk, dan DMT1 (masing-masing sebanyak 8 orang) dengan dua tes makan (260 kkal and 520 kkal) menunjukkan terjadi peningkatan signifikan kadar GLP1 dan GIP setelah makan baik pada orang diabetes maupun orang sehat. Respon inkretin lebih tinggi setelah makan yang kalorinya lebih besar dibanding kalori yang lebih rendah, dengan disertai respon C-peptida yang lebih tinggi. Baik DMT1 maupun DMT2 memiliki respon GIP yang normal bila dibanding orang sehat. Pada DMT1 respon peningkatan GLP1 normal. Sementara itu, respon GLP1 lebih rendah pada DMT2 dibanding dengan subyek orang sehat yang gemuk (Visboll dkk., 2003). Kadar GLP1 total, GLP1 utuh, dan kadar GIP pada saat tes toleransi glukosa oral (TTGO) atau oral glucose tolerance test (OGTT) dan tes toleransi makanan atau meal tolerance test (MTT) diteliti pada 18 subyek orang Jepang dengan DMT2 dan 17 orang Jepang sebagai kontrol sehat yang match dari sisi usia, diukur kadar GLP1nya. Kadar GLP1 total puasa sama antara kedua
29
kelompok (sekitar 15pM). Kadar GLP1 total 30 menit setelah pemberian glukosa pada kelompok DMT2 adalah 35,3 ± 8,7 pM sedangkan pada kelompok kontrol 40,3 ± 10,4 pM (Yabe dkk., 2010). Penelitian pada orang Jepang menunjukkan sekresi GIP dan GLP1 dan efek insulinotropik pada sel beta berbeda pada pasien DMT2 dibanding orang normal (Seino dkk., 2010).
2.4
Insulin
Insulin adalah hormon polipeptida yang diproduksi di sel beta pankreas. Gen insulin manusia berlokasi di lengan pendek kromosom 11. Molekul prekursornya adalah preproinsulin, yaitu peptida dengan berat molekul 11.500 yang ditranslasi dari mRNA preproinsulin di retikulum endoplasma. Enzim mikrosomal memecah preproinsulin menjadi proinsulin dengan berat molekul ~ 9000, dan pemecahan ini terjadi segera setelah sintesis. Proinsulin selanjutnya disimpan dalam granula sekretori di apparatus golgi. Granula sekretori yang matur akan mengeluarkan proinsulin dalam bentuk insulin dan connecting peptide (C peptide) atau C peptida. C peptida yang terdiri dari 31 asam amino dengan berat molekul 3000, tidak memiliki aktivitas biologis. Jumlah C peptida yang dilepas dari sel beta pankreas berjumlah ekuimolar dengan insulin. Waktu paruh C peptida tiga sampai empat kali lebih panjang dari insulin (Masharani dkk., 2004). Insulin adalah protein yang terdiri dari 51 asam amino yang berbentuk dua rantai peptida yaitu rantai A dengan 21 asam amino dan rantai B dengan 30 asam amino. Kedua rantai ini dihubungkan oleh dua jembatan disulfida. Di samping itu, dalam molekul insulin juga terdapat jembatan disulfida intrachain di rantai A
30
(Gambar 2.13). Berat molekul insulin adalah 5808. Insulin endogen memiliki waktu paruh 3 – 5 menit di dalam darah. Katabolisme insulin terjadi di hati, ginjal dan pankreas dengan bantuan enzim insulinase (Masharani dkk., 2004). Sekresi insulin dari pankreas pada orang normal berkisar 30 unit per hari. Konsentrasi kadar insulin di darah pada keadaan puasa adalah 10 µU/mL (0,4 ng/mL atau 61 pmol/L). Kadar insulin pada orang normal setelah pembebanan makanan standar tidak melebihi 100 µU/mL (610 pmol/L). Peningkatan konsentrasi insulin di perifer terjadi 8 – 10 menit setelah makan dan puncak konsentrasi di darah tepi terjadi dalam 30 - 45 menit (Masharani dkk., 2004).
2.4.1
Pengukuran konsentrasi insulin perifer Pengukuran
konsentrasi
insulin
perifer
dengan
pemeriksaan
radioimmunoassay masih banyak digunakan untuk kuantifikasi fungsi sel beta in vivo. Namun kelemahannya adalah 50-60% insulin yang dihasilkan oleh pankreas diekstraksi oleh hati tanpa pernah mencapai sirkulasi sistemik. Di samping itu pemeriksaan radioimmunoassay ini juga tidak dapat membedakan antara insulin eksogen dan insulin endogen (Buse dkk., 2011).
2.4.2
Homeostasis Model Assessment (HOMA) Kadar insulin dan glukosa di dalam darah sangat dinamis dan dipengaruhi
oleh fungsi sel beta dalam mensekresi insulin, juga resistensi insulin di perifer terutama jaringan lemak dan hari. Homeostasis Model Assessment (HOMA)
31
adalah model matematik yang digunakan untuk menilai fungsi sekresi sel beta pankreas dan juga resistensi insulin perifer. HOMA-%B
memperkirakan
fungsi
sel
beta
dan
HOMA-%S
memperkirakan sensitivitas insulin (HOMA%S) dalam keadaan steady state. Konsep ini diawali oleh Robert Turner and Rury Holman 1976 yang menyatakan bahwa kadar insulin plasma puasa dan kadar glukosa ditentukan sebagian oleh hepatic-beta cell feedback loop. Konsep ini kemudian dikembangkan menjadi model matematika pada tahun 1979. Tahun 1985, Matthews dkk. mengemukakan model struktural yang lebih komprehensif dan disebut Homeostasis Assessment Model (HOMA). Tahun 1998, Levy dkk. mempublikasikan HOMA model 2 (HOMA 2) yang didalamnya memperhitungkan variasi resistensi hepatik dan perifer. Model ini direkalibrasi sehingga dapat menghasilkan nilai HOMA%B, HOMA%S dan HOMA-IR. HOMA-IR
adalah inverse atau resiprokal dari
HOMA-%S, yang didapatkan dengan rumus: 100/%S. Kalkulator HOMA dirilis tahun 2004. Pada penelitian ini kalkulator HOMA yang digunakan adalah kalkulator secara on line melalui https://www.dtu.ox.ac.uk/homacalculator/.
2.5
Mekanisme Asosiasi TCF7L2 dengan DMT2
2.5.1 Gen TCF7L2 TCF7L2 adalah suatu T-cell specific, HMG-box. HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee) IDnya adalah HGNC:11641. Gen ini pada awalnya disebut dengan T-cell transcription factor 4, yang disimbulkan dengan TCF4 atau TCF-4. Lokasi sitogenetik dari TCF7L2 ini adalah pada kromosom 10, yaitu
32
10q25.2-q25.3. Koordinat genomiknya (GRCh37) adalah: 10:114,710,008 114,927,436, dengan locus tag RP11-357H24.1. Tipenya merupakan gen yang menyandi protein. Gen ini memiliki 22 transkrip, dengan 114.710.009114.927.437 forward strand (Anonim, 2011). Struktur genomik gen TCF7L2 manusia dan posisinya pada kromosom 10q25.3 diidentifikasi dengan metode fluorescence in situ hybridization (FISH) (Duval dkk., 2000). Prototipe keluarga TCF (TCF7 atau TCF-1) awalnya diisolasi sebagai faktor transkripsi limfoid (van de Wetering. 1991). Anggota dari keluarga TCF ini sekarang diketahui berperan sebagai regulasi transkripsional di berbagai proses perkembangan dan pada organisme dewasa berfungsi dalam beberapa sel dan organ. Setelah identifikasi TCF1/TCF7 (van de Wetering. 1991), Castrop dkk. mengisolasi cDNA untuk TCF7L1 dan TCF7L2 yang mereka sebut dengan TCF3 dan TCF4. Karena high mobility group (HMG) boxes dari sekuen dari TCF7L1, TCF7L2, dan TCF7 menunjukkan kemiripan, Castrop dkk. mengelompokkan sebagai subfamili dari faktor transkripsi TCF7 like HMG box-containing (Castrop dkk., 1992). Produk gen TCL7L2 adalah high mobility group (HMG) box-containing transcription factor yang berperan pada homestasis glukosa darah. Pada gambar 2.3 diilustrasikan domain fungsional TCF7L2 manusia yang berinteraksi dengan β-cat, DNA, Groucho, dan CtBP-1.
33
Gambar 2.3 Struktur Protein TCF7L2 Manusia (Jin dan Liu, 2008) Keterangan: HMG= high mobility group; CtBP1= C-terminal binding protein 1; GSK= glycogen synthase kinase
2.5.2
Jalur Wnt-signaling Jalur Wnt merupakan jalur multifungsi yang mengatur proliferasi dan
diferensiasi sel, menjaga kelangsungan sel punca, angiogenesis, inflamasi, fibrosis, dan karsinogenesis (Wodarz dan Nusse, 1998). Wnt-signaling pertama dikenal melalui studi pada kanker kolon dan perkembangan embrionik Drosophila, Xenopus, dan organisme lain (Pfeifer dan Polakis, 2000). Wntsignaling menunjukkan berbagai fungsi fisiologis dan patofisiologis yang penting pada berbagai sel dan orang yang berbeda termasuk organogenesis dan perkembangan progresi tumor (Van Es dkk., 2003).
34
Gambar 2.4 Ringkasan Jalur Wnt-Signaling Kanonikal (Jin dan Liu, 2008) Keterangan: Panel A: pada saat absennya stimulasi Wnt, β-cat mengalami fosforilasi oleh GSK-3, CK-1α, dan pERK, dan secara subsekuen dihancurkan oleh proses degradasi protein yang dimediasi proteosom. Protein TCF akan berikatan dengan promoter gen target Wnt dan menekan ekspresinya dengan merekrut Groucho, CtBP-1, dan HDACs. Panel B: setelah stimulasi Wnt, kompleks fosforilasi terlepas. β-cat bebas akan berakumulasi dan membentuk faktor transkripsi bipartit β-cat/TCF, yang dapat merekrut ko-aktivator nuklear, seperti protein pengikat CREB atau CREB binding protein (CBP), yang menguatkan ekspresi gen target Wnt. Catatan: β-TrCP, β-transducing repeat-containing protein. Dvl, Dishevelled. pERK, phosphorylated ERK.
35
Kunci efektor dari kanon Wnt-signaling adalah pasangan (bipartit) faktor transkripsi β-cat/TCF, yang dibentuk oleh β catenin (β-cat) dan anggota dari keluarga TCF (TCF1/ TCF7, LEF-1, TCF3/ TCF7L1, dan TCF4/ TCF7L2). Pada keadaan tidak ada signaling Wnt, protein TCF HMG box dalam nukleus berfungsi sebagai represor transkripsional dari gen target Wnt. TCF membentuk kompleks dengan ko represor transkripsional, termasuk Groucho dan C-terminal binding protein 1 (CtBP1) (Jin dan Liu, 2008). Baik Groucho maupun CtBP1 dapat merekrut ko represor nuklear seperti histone deacetylase (HDACs) ke promoter dari gen target Wnt (gambar 2.4 panel A). Namun β-cat mengubah TCF menjadi aktivator transkripsional untuk panel gen yang ditekan oleh TCF pada saat tidak adanya β-cat (gambar 2.4 panel B). Zhou dkk., 2012 melakukan penelitian ekspresi ligan Wnt dan reseptor frizzled pada jalur kanon WNT pada ginjal pada mRNA dengan menggunakan PCR, membandingkan antara mencit Akita, tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin, mencit db/db dan kontrolnya, yaitu sel epitel tubular bagian proksimal ginjal manusia. Pada penelitian ini ditemukan bahwa jalur Wnt diaktivasi pada ginjal baik pada model diabetes tipe 1 maupun tipe 2 (Zhou dkk., 2012). Sampai saat ini belum diketahui mekanisme pasti bagaimana polimorfisme dalam regio intron dari TCF7L2 memberi risiko terjadinya DMT2, tapi regulator transkripsional ini telah terbukti berperan dalam stimulasi sel beta pankreas dan produksi hormon inkretin GLP1 di sel L endokrin intestin (Yi dkk., 2005) sehingga diduga polimorfisme ini meningkatan risiko DMT2 melalui pengaruhnya
36
pada produksi GLP1. Penelitian Yi dkk. (2005) menunjukkan bahwa TCL7L2 berperan melalui pengaturan proglukagon, melalui represi gen proglukagon di sel enteroendokrin melalui jalur Wnt-signaling (Wnt signaling pathway). Pada sel L endokrin intestin, ekspresi gen proglukagon menyebabkan produksi hormon inkretin GLP1.
2.5.3
Mekanisme bagaimana silencing TCF7L2 mengurangi sekresi insulin yang distimulasi glukosa
Setelah penelitian dari Lyssenko, 2007, dapat disimpulkan sementara bahwa alel risiko dari TCF7L2 memberi predisposisi untuk terjadinya DMT2 melalui akibat yang ditimbulkannya pada sel beta pankreas. Adanya alel risiko mengakibatkan overekspresi TCF7L2 di sel beta pankreas dan mengakibatkan penurunan sekresi insulin sebagai respon berbagai stimuli. Ada beberapa pertanyaan yang belum terjawab yaitu selain terjadi peningkatan RNA TCF7L2, apakah konsentrasi protein Tcf7l2 di sel beta meningkat? Bagaimana peningkatan ekspresi TCF7L2 mengurangi sekresi insulin? (Hettersley, 2007). Untuk memeriksa apakah TCF7L2 berperan pada sel beta pankreas, Shu dkk. (2008) memberi paparan TCF7L2 small interfering RNA pada isolasi islet pankreas manusia. Deplesi TCF7L2 mengakibatkan apoptosis sel beta meningkat 5,1 kali, penurunan proliferasi sel beta 2,2 kali, dan penurunan sekresi insulin yang distimulasi glukosa sebanyak 2,6 kali, dan efek yang serupa didapatkan pada islet tikus dengan deplesi TCF7L2. Sebaliknya overekpresi TCF7L2 melindungi islet dari apoptosis sel beta pankreas yang dimediasi glukosa atau sitokin.
37
Gambar 2.5 Mekanisme Silencing TCF7L2 Mengurangi Sekresi Insulin yang Distimulasi Glukosa (Gloyn dkk., 2009) Keterangan: Panel A: Stimulus sekresi coupling sel beta dengan glukosa melalui produksi ATP dan peningkatan rasio ATP-ADP di mitokondria, mengakibatkan penutupan ATP-sensitive KATP channels dan mendatangkan potensial aksi yang berasosiasi dengan terbukanya voltage-gated Ca2+channels. Peningkatan [Ca2+]i menstimulasi eksositosis granula sekretori yang mengandung insulin. Panel B: Granula insulin berada pada pool fungsional yang berbeda dengan kompetensi untuk lepas yang berbeda. Sebagian besar granula insulin tidak mencapai kompetensi untuk lepas (granula berwarna merah). Sebagian kecil granula segera bisa melepaskan insulin (granula berwarna hijau). Banyak RRP berada dekat dengan voltage-gated Ca2+ channels (i). Bila TCF7L2 tidak ada, Ca2+ channels terlepas dari granula sekretori dan [Ca2+]i meningkat di bagian sel beta yang salah (ii). Panel C: Peningkatan local [Ca2+]i (zona abu-abu) menutup Ca2+ channels selama stimulasi potensial aksi yang singkat (i) dan peningkatan global terjadi pada stimulasi yang berkepanjangan (misal pada kadar K+ tinggi) (ii). Mitoch = mitokondria. AP = action potentials (potensial aksi). SG = secretory granules (granula sekretori). RRP = the readily releasable pool.
38
Sebuah studi yang baru telah mengidentifikasi sejumlah besar region kromatin terbuka yang mengandung elemen regulatori aktif pada pulau pankreas manusia. SNP pada TCF7L2 yang berasosiasi dengan DMT2 ditemukan berlokasi di region kromatin terbuka (open chromatin) dan menunjukkan aktivitas penguat yang bersifat alel spesifik, mengarahkan kepada mekanisme potensial untuk asosiasi dengan penyakit ini (Groop, 2010).
Gambar 2.6 Model Kromatin dan Mekanisme Asosiasi TCF7L2 dengan Diabetes (Groop, 2010) Keterangan: Panel a: Alel risiko (alel T) yang berasosiasi dengan T2DM pada varian gen TCF7L2 (SNP rs7903146) berasosiasi dengan kromatin terbuka (open chromatin) yang dapat memfasilitasi ikatan DNA-protein dan berasosiasi dengan peningkatan relatif kadar transkripsi dibanding dengan alel yang tidak berisiko (non risk allele). Panel b: Alel tidak berisiko (alel C) berasosiasi dengan kromatin yang tertutup (closed chromatin), yang dapat mengurangi akses untuk ikatan protein.
39
2.5.4
Overekspresi Tcf7l2 di luar sel beta pankreas
Perhatian untuk mengetahui bagaimana efek TCF7L2 terhadap terjadinya DMT2 difokuskan pada sel beta pankreas, dan sebagian hasil penelitian saling menunjukkan kontradiksi. Selain pada sel beta pankreas, faktor transkripsi ini diekspresikan secara luas di berbagai organ dan jaringan yang terlibat dalam metabolisme glukosa. Peran fisiologis Tcf7l2 di berbagai jaringan ini juga belum dapat dijelaskan dengan secara lengkap (Nobrega 2013). Shao dkk. (2013) menjelaskan bagaimana ekspresi TCF7L2 di otak berperan pada pengaturan metabolisme
glukosa.
Hal
ini
membuka
kemungkinan
untuk
meneliti
kemungkinan faktor transkripsi ini juga diekspresikan di darah tepi. Mengingat alel risiko untuk DMT2 ini berasosiasi dengan open chromatin, menarik untuk dilihat apakah terdapat perbedaan varian isoform mRNA pada subyek dengan dan tanpa alel risiko diabetes varian SNP gen TCF7L2. Kontribusi overekspresi Tcf7l2 di sel beta dan jaringan lain terhadap fenotipe metabolik diteliti dengan tikus yaitu humanized mouse model. Ekspresi Tcf7l2 di pankreas pada model tikus ini dikembalikan ke tingkat endogen sementara di jaringan lain terjadi overekspresi, yang mengakibatkan gangguan sekresi insulin, mengurangi jumlah sel beta dan area islet. Hal ini menguatkan data yang didapat pada manusia yang menunjukkan bahwa fenotipe yang sama terjadi sebagai akibat dari manipulasi yang berakibatkan pada hilangnya fungsi Tcf7l2. Yang menarik adalah overekspresi persisten dari Tcf7l2 di jaringan non pankreas mengakibatkan perburukan toleransi glukosa yang signifikan. Jadi, hal ini menunjukkan bahwa overekspresi Tcf7l2 di sel beta tidak berperan pada
40
toleransi glukosa pada model tikus dengan overekspresi Tcf7l2. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa Tcf7l2 berperan pada metabolisme di luar peranannya pada sel beta pankreas (Bailey dkk., 2015).
2.6
Alternative Splicing pada mRNA gen TCF7L2
Sebagian besar gen manusia dipecah menjadi beberapa segmen (ekson) yang harus disambung lagi setelah transkripsi menjadi mRNA prekursor (precursor mRNA [pre-mRNA]) Sampai sekitar 76% gen manusia mengekspresikan mRNA yang beragam melalui alternative splicing dari pre-mRNA di mana ekson disambung kembali dengan pola yang berbeda. Akibatnya, gen individu mengekspresikan beragam mRNA yang identik kecuali di regio variabilitas tertentu (discrete regions of variability ). Beberapa gen memiliki regio alternative splicing multipel dan mengekspresikan ratusan atau bahkan ribuan mRNA yang berbeda. Sebanyak 80% alternative splicing terjadi di coding region dan menghasilkan isoform protein dengan fungsi yang berbeda bergantung pada pengaturan sel spesifik (berdasarkan tipe sel, tahap perkembangan, jenis kelamin, atau respon terhadap signal eksternal) (Faustino and Cooper 2003). Varian genetik SNP TCF7L2 ini kemungkinan berkaitan dengan terjadinya alternative splicing. Setiap faktor transkripsi dari keluarga TCF/LEF memiliki posisi awal transkripsi atau transcription starts sites (TSS) yang berbeda untuk menghasilkan protein fungsional yang berbeda. Hal ini menjelaskan tidak adanya asosiasi antara ekspresi TCF7L2 yang diperiksa dengan berdasarkan ex7-8 dengan rs7903146 dan rs12255372 (Prokunina-Olsson, 2009a).
41
Ekspresi TCF7L2 yang mengalami alternative splicing kemungkinan memiliki peranan fungsional berbeda di omental dan jaring lemak subkutan, namun tidak berasosiasi dengan SNPs rs7903146 dan rs12255372, ataupun dengan status DMT2, kadar glukosa darah maupun hemoglobin terglikasi (HbA1c). Hal ini diketahui dari pemeriksaan ekspresi bentuk splice alternatif TCF7L2 yang dilakukan dengan quantitative reverse-transcriptase PCR (qRTPCR) pada bahan hasil biopsi jaringan lemak omental dan subkutan dari 159 individu yang obese (BMI 54,6±212,2 kg/m2). Ekpresi ‗‗ex12-13‘‘, ‗‗ex12-14‘‘ and ‗‗ex13-13a‘‘ yang mendeteksi ekson alternatif C-terminal dari TCF7L2 lebih tinggi di jaringan lemak subkutan dibanding dengan jaringan lemak omental (Prokunina-Olsson dkk., 2009b).
Gambar 2.7 Struktur dan Lokasi Ekspresi Gen TCF7L2 (Prokunina-Olsson dkk., 2009b) Keterangan: Skema ini menunjukkan ekson konstitutif (balok hitam), ekson alternative (balok putih); blok linkage disequilibrium (LD) yang berasosiasi dengan SNPs rs7903146 dan rs12255372; domain protein: ß-catenin-interacting domain, DNA-binding HMG domain dan C-terminal Binding Protein (CtBP)-
42
binding domain. Expression assays untuk mendeteksi bentuk splice alternatif dari TCF7L2 ditunjukkan dengan panah yang berhubungan. Pemeriksaan transkrip target TSS1 (transcription starts sites), TSS2 dan TSS3 didapatkan dari tempat awal transkripsi alternatif sementara bentuk splice alternatif yang lain dengan kombinasi ekson yang berbeda. * - Ekspresi dari ‗‗ex13-13b‘‘ juga diperiksa tapi tidak terdeteksi di jaringan lemak (Prokunina-Olsson dkk., 2009b).
Alternative splicing dapat menghasilkan produk protein yang beragam dengan komposisi domain bervariasi dari satu gen. Gen TCF7L2 mengkode TCF4 yaitu suatu protein DNA-binding yang merupakan anggota dari T-cell factor (TCF) family dan pasangan interaksi nuclear dari beta katenin yang membentuk fungsi esensial dalam Wnt-signaling growth factor. Isoform TCF4 multipel menunjukkan potensi distribusi yang bersifat spesifik untuk tipe sel tertentu dan berpengaruh kuat pada respon Wnt yang bersifat spesifik untuk tiap jaringan. Sejumlah varian splice Tcf7l2 tikus di jaringan neonatus yaitu sel stem embrionik dan progenitor neural diidentifikasi dengan metode amplifikasi PCR, cloning, dan sekuensing. Sebagian besar (namun tidak semuanya) menunjukkan distribusi jaringan yang luas (Weise dkk., 2010).
43
Gambar 2.8 Perbandingan Pola Ekspresi Varian TCF4 pada Jaringan Tikus dan Embryonic Stem (ES) Cell (Weise dkk., 2010) Keterangan: A. Skema stuktur protein TCF4 yang disederhanakan (atas) dan gen TCF7L2 tikus (bawah) Gen TCF7L2 terdiri dari 17 ekson, sebagian di antaranya dapat mengalami alternative splicing (ekson 4, 13–16; ditandai dengan warna merah). Ekson konstitutif berwarna hijau. Variasi tambahan sekuen mRNA TCF7L2 dihasilkan dari penggunaan alternative splice acceptor dan tempat donor (donor site), di ekson 7, 8, dan 9. Regio yang terkena alternative splicing ini diberi warna merah. Posisi start codon di ekson 1 diberi tanda. Stop codon yang mana yang potensial
44
akan digunakan mengikuti ekson 8 atau antara ekson 15, 16 and 17, bergantung pada kombinasi ekson yang ada di mRNa final. Retensi sekuen yang mengikuti ekson 8 (diberi tanda N) pada mRNA final membentuk varian TCF4N. Panjang ekson digambar dengan skala. Panah horizontal menunjukkan posisi dan orientasi primer yang digunakan pada reaksi RT-PCR. Daerah yang dengan garis terputusputus menunjukkan bagian C-terminal TCF4 yang paling bervariasi, dari ekson 13-17. β-cat=β-catenin binding domain; Grg=binding motif untuk produk grouchorelated gene (Grg); HMG: HMG box; NLS: nuclear localization signal. B. Analisis ekspresi varian splicing TCF4 pada jaringan tikus dan sel ES yang berbeda. Isolasi RNA dari sel ES dan sampel jaringan tikus berusia 3 hari, cDNA disintesis dan varian splicing TCF4 diamplikasi dengan PCR menggunakan kombinasi primer yang ekson-spesifik, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Amplifikasi dari sekuen GAPDH digunakan sebagai kontrol integritas RNA dan cDNA. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel dan divisualisasi dengan pewarnaan ethidium bromide. Kombinasi ekson yang dihasilkan dari berbagai fragmen DNA dideterminasi dengan melakukan subcloning dan sekuensing dari produk PCR. Kesimpulan ukuran dari hasil produk PCR dan kaitannya dengan varian splicing TCF4 E, S dan M ditunjukkan pada bagian kanan dari panel.Produk PCR dari jaringan otak diberi label bintang menunjukkan isoform S3 dan S6. C. Ringkasan dari identifikasi varian C-terminal TCF4 Ekson merah adalah splicing alternatif, ekson hijau adalah ekson konstitutif. Warna biru menunjukkan regio yang tidak ditranslasi (untranslated). Posisi stop kodon ditunjukkan pada gmabar. Varian splicing dikelompokkan berdasarkan ada atau tidak C-clamp, komplit, atau inkomplit. Isoform yang dulu disebut S5, direklasifikasi sebagai M3 (Weise dkk., 2010).
Kaminska dkk., 2012 meneliti tentang efek penurunan berat badan setelah pembedahan pada alternatve splicing gen TCF7L2 di jaringan lemak (adipose)
45
dan hati, serta asosiasi antara splicing TCF7L2 ini dengan kadar glukosa dan asam lemak bebas atau free fatty acid (FFA) serum, pada 3 studi independen (n=216). Ekspresi dari varian mRNA pendek (tidak mengandung ekson 12, 13, dan 13a) di jaringan lemak subkutan (n=46) dan hati (n=11) menurun setelah penurunan berat badan, dan lebih sering pada lemak subukutan subyek dengan DMT2 dibanding subyek dengan normal glucose tolerance (NGT) yang obese (n=54) dan sampel di populasi (n=49). Di samping itu, terdapat korelasi positif antara varian ini dengan kadar glukosa puasa pada individu nondiabetes (n=113). Asosiasi antara splicing TCF7L2 dan glukosa plasma independen terhadap genotipe TCF7L2. Varian ini berasosiasi dengan kadar serum FFA selama hiperinsulinemia, yang menunjukkan bahwa adanya gangguan kerja insulin di jaringan lemak, dan tidak berasosiasi dengan sekresi insulin atau ambilan glukosa di tubuh yang distimulasi insulin. Studi ini menunjukkan bahwa varian mRNA TCF7L2 yang pendek di lemak subkutan diregulasi oleh penurunan berat badan dan berasosiasi dengan hiperglikemia dan gangguan kerja insulin di jaringan lemak (Kaminska dkk., 2012).
