BAB I. PENGANTAR
A. LATAR BELAKANG Proses menua merupakan proses penurunan fungsi dan kapasitas cadangan seluruh organ dalam tubuh manusia, termasuk kulit, yang berlangsung secara intrinsik dan berangsur sepanjang waktu (Yaar & Gilchrest, 2007). Pada kulit, proses menua intrinsik tersebut dipercepat oleh berbagai faktor ekstrinsik, dan yang paling dominan adalah pajanan sinar matahari. Proses ini disebut sebagai skin photoaging atau premature aging skin (Yaar & Gilchrest, 2007), yang dialihbahasakan sebagai kulit menua dini (KMD). Jika pada kulit menua intrinsik dijumpai garis-garis kerut yang halus maka pada KMD garis kerut tersebut tampak sebagai keriput yang dalam (Burgess, 2006) Kulit keriput sebagai tampilan kulit menua, tidak disukai oleh kebanyakan para wanita dan sebagian para pria; karena tampilan tersebut dapat menyebabkan kecemasan dalam hubungan sosial akibat adanya berbagai perasaan seperti: tersingkir dan rendah diri, seolah menderita penyakit kronis, kurang memperdulikan kesehatan diri, dan merasa mendapat diskriminasi di tempat kerja (Gupta & Gilchrest. 2005). Aspek psikososial tersebut menyebabkan banyak orang mengunjungi klinik-klinik kecantikan dan mengkonsumsi berbagai obat yang dipercaya bersifat anti menua. Secara klinis, perbaikan keriput kulit menua, dapat dilakukan dengan berbagai cara. Salah satunya adalah injeksi material pengisi atau filler. Pada injeksi ini, material yang digunakan sangat bervariasi, mulai dari material autolog seperti: kolagen, sel-sel
1
2
lemak, fibroblas; material allograft; material semi sintetik, material sintetik, sampai injeksi botox (Burgess, 2005; Burgess, 2006). Cara yang dianggap paling aman dan paling efektif adalah injeksi filler fibroblas autolog yang dibiakkan sebelumnya (West & Alster, 1998; Watson et al.,1999). Fibroblas dari gingiva atau kulit yang tidak terpajan sinar matahari, diisolasi, dibiakkan, dan digunakan sebagai filler. Para ahli menduga bahwa sel yang tumbuh cepat dan mendominasi biakan fibroblas adalah sel punca mesensimal (Zuk et al., 2001; Lorenz et al.,2008). Hal tersebut didasarkan pada penelitian yang membuktikan bahwa fibroblas yang diisolasi dari preputium anakanak ternyata dapat mengalami diferensiasi menjadi lini sel-sel adipogenik, osteogenik, atau kondrogenik, serupa dengan sel punca mesensimal (Zuk et al., 2001). Kelemahan dalam pemakaian filler fibroblas adalah membutuhkan waktu lebih dari 2 bulan untuk biakan fibroblas dan membutuhkan biaya yang tinggi sekitar 7.500 dolar Amerika (http://www.smartskincare.com). Biaya yang besar untuk membuat filler fibroblas autolog tersebut ternyata merupakan sebagian kecil dari belanja yang dihabiskan untuk mengkoreksi keriput kulit menua. Selain filler, keriput di wajah juga dapat dikurangi dengan injeksi toksin botulinum (botox) karena toksin ini dapat mengurangi tonus otot mimik yang bertanggung jawab terhadap timbulnya keriput pada kulit yang mengalami penuaan, termasuk akibat KMD (Burgess, 2006). Di Amerika Serikat, keuntungan pabrik produsen botox diperkirakan meningkat dari 25 juta dolar AS pada tahun 1993 menjadi 430 juta dolar pada tahun 2002 (Misra, 2002). Ongkos sebesar itu masih akan meningkat jika belanja non-botox juga diperhitungkan. Obat lain yang banyak digunakan untuk mencegah dan memperbaiki penuaan kulit adalah obat antihamil.
3
Dewasa ini obat tersebut tidak saja digunakan oleh para wanita tetapi juga mulai dikonsumsi oleh para pria dan fakta ini yang ditakutkan oleh banyak pengamat, karena di negara-negara berkembang yang miskin, pengadaan pil kontrasepsi masih disubsidi oleh pemerintah (Lucke et al., 2009). Pemanfaatan pil antihamil sebagai obat antipenuaan akan menguras banyak keuangan negara, dengan demikian, harus segera ditemukan cara lain untuk memperbaiki keriput kulit menua. Penelitian pada kulit manusia menunjukkan bahwa kandungan kolagen pada kulit yang terpajan sinar matahari, ternyata 20% lebih rendah dibandingkan kulit yang tidak terpajan sinar matahari (Schwartz et al., 2008). Rendahnya timbunan kolagen tersebut, terjadi karena berbagai proses yang dialami oleh fibroblas dermis yang menyerap energi sinar matahari. Pada tingkat selular, pajanan salah satu spektrum sinar matahari, yaitu sinar ultraviolet A (SUVA), terbukti dapat menghambat proliferasi fibroblas, menghambat sintesis kolagen oleh fibroblas (Yamauchi et al., 1991; Chung et al., 2001), dan merusak kolagen akibat meningkatnya aktivitas enzim matrix metalloproteinase (MMP) sehingga menjadi patahan-patahan serabut kolagen (Menter et al., 2003; Brenann et al., 2003; Choi et al., 2007). Patahan-patahan serabut kolagen tersebut akan berakibat pada penurunan daya mekanik fibroblas yang terbukti dapat menghambat sintesis kolagen lebih lanjut (Varani et al., 2006). Proses kimiawi intraselular yang mendasari respon fibroblas di atas, terjadi akibat kerusakan DNA sel-sel di kulit manusia oleh pajanan SUVA; baik secara langsung melalui reaksi fotoadisi maupun tidak langsung melalui reaksi oksidatif, yang keduanya akan berakibat pada pemulihan DNA, sehingga memperpanjang G1 arrest pada siklus sel (Pignolo et al., 1998; Auclair et al., 2010). SUVA juga akan
4
mengaktifkan gena penyandi AP-1 dan AP-1 sebagai protein inti akan mengaktifkan gena penyandi protein yang memblokir reseptor transforming growth factor-β (TGF-β) (Fisher et al., 2002; Quan et al., 2004), sehingga terjadi penimbunan TGF-β ekstraselular. Padahal, TGF-β merupakan GF penting untuk signaling proliferasi fibroblas, signaling migrasi fibroblas, dan signaling sintesis kolagen oleh fibroblas (Capelo, 2005). Selain itu, aktivasi AP-1 juga akan memacu ekspresi gena penyandi MMP yang berfungsi merusak kolagen (Choi et al., 2007). Berdasarkan uraian di atas, fibroblas KMD (FKMD) mempunyai sifat khas berupa: proliferasi yang tertekan, migrasi yang tertekan, sintesis kolagen yang tertekan, yang diakibatkan oleh gagalnya signaling TGF-β dan degradasi kolagen yang meningkat. Gagalnya signaling TGF-β tersebut berakibat pada penimbunan TGF-β ekstraselular. Selanjutnya, para peneliti mencoba mencari model untuk pengembangan riset KMD. Model tersebut dibutuhkan karena fibroblas yang diisolasi dari kulit manusia penderita KMD ternyata memiliki umur yang terbatas (Gilchrest, 1980), sehingga sulit untuk dibiakkan dan memiliki keterbatasan sebagai subyek eksperimen. Untuk mengatasi hal tersebut, para peneliti menggunakan fibroblas yang diisolasi dari kulit manusia berusia muda yang dipacu menjadi tua secara dini. Naru et al. (2005) menemukan bahwa akselerasi penuaan fibroblas yang diukur dengan menghitung berbagai aktivitas fibroblas seperti: proliferasi, migrasi, sintesis kolagen; dan ekspresi β-galactosidase yang menjadi penanda penuaan sel, ternyata dapat dilakukan secara buatan, yaitu dengan memberikan penyinaran tiga kali SUVA kumulatif sebesar 10.000 mJ/cm2. Selanjutnya, fibroblas tua buatan tersebut digunakan sebagai model riset-riset KMD.
5
Penurunan fungsi fibroblas yang menua tidak hanya dijumpai pada kulit yang menua, tetapi juga dijumpai pada dasar ulkus kronis yang menunjukan karakteristik fibroblas tua berupa: penurunan kemampuan fibroblas berproliferasi, migrasi, dan mensintesis kolagen (Mendez et al.,1998; Wang et al.,2007). Hal-hal tersebut di duga terjadi, baik karena suplai GF yang kurang akibat terjebak oleh fibrin yang bocor yang keluar dari pembuluh darah, dirusak oleh protease yang dihasilkan oleh biofilm pada permukaan ulkus (Falanga and Eaglestein, 1993), maupun akibat penurunan ekspresi gena penyandi GF seperti yang dijumpai pada ulkus-ulkus diabetik (Cianfarani et al., 2006). Untuk memacu penyembuhan ulkus kronis tersebut, para ahli memfokuskan penelitian mereka pada pemanfaatan platelet autolog (Buchwald et al., 2008), atau mencoba menfaatkan sel punca mesensimal (Hayashi et al., 2008). Pada peristiwa awal penyembuhan luka, platelet yang keluar pada saat perdarahan, tidak saja bermanfaat dalam proses penjedalan darah dan menghentikan perdarahan, tetapi platelet juga melepaskan berbagai sitokin yang dapat memacu fibroblas untuk berproliferasi dan menghasilkan serabut kolagen baru (Nevin et al., 2003; Ray et al., 2003). Platelet autolog yang diteteskan pada luka operasi sebelum luka operasi ditutup, terbukti dapat memacu migrasi dan proliferasi fibroblas (Kakudo et al., 2008), memacu penyembuhan luka (Buchwald et al., 2008), dan meningkatkan serta mempertahankan volume graft pada augmentasi buah dada yang kendor (Sadati et al., 2006). Injeksi platelet ternyata juga dapat memulihkan parut atrofik pasca varisela pada wajah pasien laki-laki yang sehari-harinya terpajan sinar matahari ( Resati et al., 2010).
6
Dewasa ini, platelet autolog dapat diperoleh dengan mudah melalui sentrifugasi bertingkat, yang dikenal dengan teknologi platelet rich plasma (PRP). Dari PRP dapat dihasilkan lisat platelet melalui penambahan ion kalsium dan inkubasi pada 4 ºC selama semalam (Anitua et al., 2004). Lisat tersebut ternyata kaya berbagai growth factor/GF (Frechete et al., 2005) dan kaya tissue inhibitor matriks metalloproteinase (TIMMP) yang dapat menghambat aktivitas MMP (Villeneuve et al., 2009). Lisat tersebut terbukti dapat memacu proliferasi fibroblas baik fibroblas dari kulit, sinovium, maupun tendon manusia (Anitua et al., 2009). Sentrifugasi bertingkat, pemakaian antikoagulan, dan pemakaian tabung khusus berharga mahal untuk memisahkan PRP dengan endapan eritrosit, dianggap tidak praktis oleh banyak pengamat. Kelompok peneliti lain mengembangkan cara yang lebih sederhana untuk memperoleh material kaya platelet dari darah tepi. Dengan cara yang hanya menggunakan sekali sentrifugasi, material kaya platelet dapat diperoleh dengan teknik platelet rich fibrin atau fibrin kaya platelet atau FKP (Dohan et al., 2006). Selanjutnya terbukti bahwa lisat yang diperoleh dari FKP ini ternyata juga kaya GF (Dohan et al., 2009), dan terbukti dapat memacu proliferasi sel-sel periodontal manusia (Tsai et al., 2009). Pemanfaatan lisat platelet dari teknologi FKP dalam pengobatan KMD akibat pajanan sinar UVA belum pernah dilaporkan. Dewasa ini, sel punca mesensimal dapat dibiakkan dalam laboratorium sehingga produksi masal dapat dilakukan. Bahkan bioreaktor untuk kebutuhan tersebut sudah dirancang dan dipublikasikan (Eibes et al., 2010). Penelitian membuktikan bahwa sel punca mesensimal dapat digunakan untuk regenerasi berbagai penyakit
7
degeneratif seperti penyakit jantung (Wu et al., 2007), penyembuhan tukak kronis pada tikus (Hayashi et al., 2008), iskemia tungkai bawah penderita diabetes (Debin et al., 2008) dan bahkan untuk memperbaiki bentuk buah dada yang kecil atau yang kendor (Yoshimura et al., 2008). Berbagai organ tubuh manusia ternyata kaya sel punca mesensimal. Sel-sel tersebut dapat diisolasi dari Wharton’s Jelly talipusat bayi baru lahir (Lu et al., 2006; Majore et al., 2009) atau dari jaringan adiposa orang dewasa (William et al., 2012; Eom et al., 2012). Salah satu keterbatasan pengobatan penyakit degeneratif dengan menggunakan sel punca heterolog adalah terjadinya reaksi penolakan dari resipien. Penelitian membuktikan bahwa sel punca, meskipun lemah, masih mengekspresikan MHC I pada permukaan sel (Rossignol et al., 2009) dan masih menimbulkan reaksi sitotoksik yang mendasari reaksi graft versus host (Pei et al., 2010). Keterbatasan tersebut menjadi kendala bagi produksi sel punca secara masal untuk berbagai terapi. Kelemahan di atas dapat di atasi dengan pendekatan baru. Dewasa ini para ahli mulai memalingkan perhatian mereka dari transplantasi sel punca menjadi penggunaan produk sel punca. Penelitian Potapova et al. (2007) membuktikan bahwa medium yang digunakan sel punca untuk tumbuh, disebut juga sebagai medium terkondisi sel punca, berguna bagi daya tahan hidup, proliferasi, invasi pada matrik ekstraselular, serta migrasi sel–sel endotel secara in-vitro. Hal tersebut terjadi karena sel punca mesensimal yang dibiakkan dalam bentuk tiga dimensi agar mengalami hipoksia, terbukti menghasilkan berbagai GF dengan kadar 5 sampai 10 kali lipat dibandingkan medium kontrol (Potapova et al., 2007; Gnecchi et al., 2008).
8
Kajian secara in-vitro membuktikan bahwa medium terkondisi sel punca mesensimal dapat memacu penyembuhan luka melalui analisis scratch assay pada migrasi dan proliferasi biakan fibroblas L929 dan keratinosit HaCat. Pada penelitian tersebut, medium terkondisi sel punca mesensimal juga terbukti dapat memacu produksi TGF-β1, IGBP-7, kolagen tipe 1 dan fibronektin (Walter et al., 2010). Injeksi baik medium terkondisi sel punca mesensimal maupuan sel punca mesensimal pada luka kulit mencit secara ex-vivo terbukti dapat memacu migrasi, proliferasi fibroblas, dan meningkatkan angiogenesis (Templin et al., 2008). Kajian manfaat medium terkondisi sel punca mesensimal pada pemulihan aktivitas FKMD manusia akibat pajanan SUVA, ternyata belum pernah dilaporkan. 1.
Rumusan Masalah 1. Apakah lisat platelet dapat memperbaiki KMD akibat pajanan SUVA, yang diukur dari proliferasi, timbunan kolagen, migrasi FKMD dan perubahan kadar TGF-β ekstraselular biakan FKMD? 2. Apakah medium terkondisi sel punca mesensimal Wharton’s Jelly dapat memperbaiki KMD akibat pajanan SUVA yang diukur dari proliferasi, timbunan kolagen, migrasi FKMD dan perubahan kadar TGF-β ekstraselular biakan FKMD? 3. Apakah medium terkondisi sel punca mesensimal adiposa dapat memperbaiki KMD akibat pajanan SUVA yang diukur dari proliferasi, timbunan kolagen, migrasi FKMD dan perubahan kadar TGF-β ekstraselular biakan FKMD? 4. Dari ketiga sumber GF tersebut, manakah yang lebih menjanjikan untuk dikembangkan secara klinis sebagai obat anti KMD akibat pajanan SUVA
9
berdasar pada kemampuannya memacu FKMD untuk berproliferasi, menimbun kolagen dan bermigrasi? 2.
Keaslian Penelitian Penelitian pemanfaatan plasma kaya platelet untuk berbagai keperluan
klinik telah banyak dilakukan. Penelusuran pada PUBMED dengan kata kunci platelet rich plasma didapatkan 5304 publikasi. Selanjutnya dengan kata kunci platelet lysate didapatkan 478 publikasi, dan dengan kata kunci platelet lysate and skin aging didapatkan 0 publikasi. Dengan kata kunci platelet lysate and human skin fibroblast didapatkan 8 buah publikasi. Publikasi-publikasi tersebut sebagian besar mempunyai pokok bahasan pada pada pemanfaatan platelet dalam penyembuhan luka, misalnya: dikombinasikan dengan silver sulfadiazine (Sandri et al., 2012); merupakan komponen dari dresing biopolymers (Rossi et al., 2013); untuk memacu proliferasi fibroblas (Cipriani et al., 2009); untuk luka bakar (Kellouche et al., 2007) dan berbagai penelitian lain yang dipublikasi sebelumnya, tetapi tidak satupun membahas manfaat lisat platelet untuk pemulihan aktivitas fibroblas kulit manusia yang menua dini. Selanjutnya, dengan kata kunci platelet rich plasma and skin aging, didapat 11 buah publikasi. Publikasi-publikasi tersebut menggunakan plasma kaya platelet untuk: keriput kulit mencit akibat pajanan UVB (Cho et al., 2011); mempercepat penyembuhan bedah plastik pada wajah (Sclafani et al., 2012), mempercepat penyembuhan peremajaan kulit oleh sinar laser (Metelitsa, 2011; Na et al., 2011; Shin et al., 2012), peremajaan kulit wajah dan leher (Redaelli, 2010) dan merupakan campuran transplantasi lemak autolog (Cervelli et al., 2009). Tidak satupun publikasi tersebut menggunakan lisat platelet.
10
Publikasi-publikasi tentang sel punca mesensimal banyak dijumpai, dengan kata kunci mesenchymal stem cell didapatkan 181.086 publikasi, dengan memasukan kata kunci conditioned medium mesenchymal stem cells didapatkan 713 publikasi. Dengan kata kunci conditioned medium mesenchymal stem cells and skin aging dijumpai 2 publikasi, yaitu: publikasi dengan pokok bahasan manfaat medium terkondisi sel punca adiposa pada kulit mencit dan fibroblas kulit mencit yang dipajan sinar UVB (Kim et al., 2009) dan publikasi medium terkondisi human exfoliated deciduous teeth untuk pemulihan fibroblas kulit mencit yang dipajan sinar UVB (Ueda dan Nishino, 2010). Perbedaan publikasi tersebut dengan penelitian ini terletak pada: subyek yang diteliti, sumber sel punca mesenkimal yang digunakan, dan spektrum sinar matahari yang digunakan. Seperti yang diketahui bahwa meskipun sinar UVB juga dapat memacu timbulnya fibroblas menua dini dalam laboratorium, dalam praktek sehari-hari hal tersebut sulit terjadi karena sinar UVB mempunyai penetrasi yang terbatas pada epidermis manusia. Spektrum sinar matahari yang dapat mencapai dermis kulit manusia adalah sinar UVA (Kochevar, 1995; Gueranger et al., 2011). 3.
Manfaat penelitian Jika lisat platelet terbukti dapat bermanfaat mencegah dan memulihkan
aktivitas FKMD akibat pajanan SUVA, maka para peneliti dan klinisi dapat memperoleh material autolog yang murah dan mudah yang dapat digunakan secara tunggal atau dikombinasikan dengan berbagai metoda peremajaan kulit yang sudah ada sehingga meningkatkan efektifitas gabungan metoda-metoda tersebut, dan sangat mungkin akan menurunkan pembiayaan yang dihabiskan oleh banyak wanita di dunia yang tidak menghendaki memiliki penampilan KMD. Perlu ditambahkan, dewasa ini
11
para peneliti telah berhasil memproduksi platelet dari sel punca hemopoetik (Chen et al., 2009; Reem, 2011) sehingga kelak lisat platelet universal dapat diproduksi secara masal dan penderita KMD tetap dapat tertolong meskipun memiliki kadar platelet yang rendah di dalam darah mereka. Jika medium terkondisi sel punca mesensimal terbukti dapat bermanfaat mencegah dan memulihkan aktivitas FKMD akibat pajanan SUVA, maka para peneliti sel punca dapat beralih dari terapi sel punca ke arah terapi produk sel punca, sehingga risiko adanya penolakan dari penderita dengan tampilan KMD dapat dihindari, dan keharusan menggunakan material autolog dapat dihapuskan. Tersedianya bioreaktor sel punca seperti yang dipublikasikan oleh Eibes et al., (2010) akan memungkinkan produksi masal medium terkondisi sel puca sehingga diharapkan dapat diperoleh medium terkondisi sel punca mesensimal dengan harga yang murah.
B. TUJUAN PENELITIAN 1.
Tujuan umum. Mencari material biologis yang dapat dikembangkan untuk mencegah dan
memperbaiki KMD akibat pajanan SUVA pada manusia. 2.
Tujuan khusus 1. Membandingkan proliferasi, migrasi, timbunan kolagen pada FKMD yang mendapat lisat platelet dan yang tidak serta penurunan kadar TGF-β ekstraselular pada supernatan biakan FKMD dalam lisat platelet. 2. Membandingkan proliferasi, migrasi, timbunan kolagen pada FKMD yang mendapat medium terkondisi sel punca mesensimal Wharton’s Jelly dan yang
12
tidak, dan penurunan kadar TGF-β ekstraselular pada supernatan biakan FKMD dalam medium terkondisi sel punca mesensimal Wharton’s Jelly 3. Membandingkan proliferasi, migrasi, timbunan kolagen pada FKMD yang mendapat medium terkondisi sel punca mesensimal adiposa dan yang tidak dan penurunan kadar TGF-β ekstraselular pada supernatan biakan FKMD dalam medium terkondisi sel punca mesensimal adiposa 4. Membandingkan proliferasi, migrasi, timbunan kolagen oleh FKMD yang mendapat lisat platelet, medium terkondisi sel punca mesensimal Wharton’s Jelly dan yang mendapat medium terkondisi sel punca mesensimal adiposa
