Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
AZAFTALOCYANINY – OD SYNTÉZ PŘES FOTOCHEMICKÉ A FOTOFYZIKÁLNÍ VLASTNOSTI K APLIKACÍM PETR ZIMČÍK* Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové
[email protected] Došlo 19.10.11, přijato 19.1.12.
Klíčová slova: azaftalocyanin, singletový kyslík, fluorescence, fotodynamická terapie, senzor, zhášeče fluorescence
Obr. 1. Základní struktury ftalocyaninu a azaftalocyanin. M = kationt kovu
jejich vlastností začal až počátkem let devadesátých (data z databáze SciFinder®). AzaPc, podobně jako Pc, jsou planární makrocyklické útvary s rozsáhlým systémem konjugovaných vazeb, což jim dodává modré, zelené, případně fialové zbarvení v závislosti na pozici absorpčních pásů. AzaPc se vyznačují dvěma charakteristickými pásy – v oblasti kolem 360 nm (tzv. B-pás) a v oblasti nad 600 nm (tzv. Q-pás). Absorpční spektrofotometrie zaměřená zejména na tvar a polohu Qpásu je velice silným nástrojem při zkoumání těchto látek. Q-pás je totiž velmi citlivý nejen na složení makrocyklického systému, ale i na chování látek v roztoku a v pevné fázi, jako jsou např. supramolekulární seskupování, protonizace částí makrocyklu, interakce s jinými molekulami. Typickými příklady (viz obr. 2 a Doplněk k práci) mohou být např. symetrie/asymetrie molekuly2, tvorba agregátů3 a organizovaných dimerů4 nebo deprotonizace centrálních NH skupin5. AzaPc mohou, podobně jako jim analogické látky ze skupiny Pc, porfyrinů nebo chlorinů, chelatovat do svého centra různé kationty kovů, což jim poté dává specifické vlastnosti. V závislosti na typu kationtu kovu se mění např. polohy pásů v absorpčních spektrech (obr. 2), schopnost produkovat singletový kyslík6, emitovat fotony ve formě fluorescence7 nebo získávat zajímavé oxidoredukční schopnosti8. Tato práce se zaměří zejména na přehled syntetických postupů k přípravě AzaPc, dále na jejich fotochemické a fotofyzikální vlastnosti a možnosti jejich ovlivnění a v závěru pak na aplikace, ve kterých byly naší pracovní skupinou tyto látky zkoumány.
Obsah 1. Úvod 2. Syntézy 2.1. Syntézy prekurzorů 2.2. Cyklotetramerizační reakce 2.3. Postcyklotetramerizační modifikace 3. Fotofyzikální a fotochemické vlastnosti 4. Aplikace 4.1. Fotodynamická terapie 4.2. Zhášeče fluorescence 4.3. Senzory 5. Závěr
1. Úvod Azaftalocyaniny (AzaPc) je souhrnný název pro azaanalogy syntetických barviv ftalocyaninů (Pc) (obr. 1). Podle počtu a umístění isosterní záměny dusíkem za methin v makrocyklickém kruhu, lze odvodit více typů látek s jádry pyridinovými, pyrazinovými, pyridazinovými atd. V této práci budou pod pojmem azaftalocyaniny rozuměny zejména tetrapyrazinoporfyraziny, které jsou výrazně nejprozkoumanější. První zmínka o těchto AzaPc se datuje do roku 1937 – pouze čtyři roky poté, co se objevily první Pc – kdy byla uveřejněna syntéza periferně nesubstituovaného derivátu bez centrálního kationtu1. Překvapivě, další zmínky o těchto zajímavých látkách se objevují až v 60. letech a výraznější rozmach v oblasti syntéz AzaPc a zkoumání
* Autor článku byl oceněn Českou společností chemickou Cenou Alfreda Badera II za bioanorganickou a bioorganickou chemii za r. 2010. 275
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
heteroatom, využívá se nukleofilní substituce 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitrilu (I) přebytkem nukleofilního činidla za vzniku látek se stejnými substituenty v polohách 5 a 6 (II)3,9. V případě reakce s jedním ekvivalentem nukleofilu, často ještě za chlazení, se získají monosubstituované látky. Ty mohou dále podléhat reakci s jiným nukleofilem a lze tak do molekuly prekurzoru zavést dva různé periferní substituenty (III)10. V případě, že jsou alkyly nebo aryly vázány přímo na skelet C-C vazbou (IV), vzniká pyrazinové jádro kondenzací diaminomaleonitrilu s příslušným diketonem nebo -ketokyselinou v kyselém prostředí (např. kyselina octová nebo případně přídavek HCl do reakce). Vhodně substituovaný diketon je potřeba získat předem, např. benzoinovou kondenzací s následnou oxidací11 nebo reakcí oxalylchloridu s Grignardovými sloučeninami12.
Obr. 2. Absorpční spektra zinečnatého AzaPc VII (plná čára) a bezkovového AzaPc IX (přerušovaná čára) v tetrahydrofuranu; struktury VII a IX viz obr. 4
2.2. Cyklotetramerizační reakce Vznik AzaPc makrocyklu je podmíněn reakcí čtyř molekul pyrazin-2,3-dikarbonitrilu v reakci nazývané cyklotetramerizace. Obecně existují dva základní mechanismy tvorby makrocyklického jádra (Schéma 2A). Při prvním se využívá tzv. templátového efektu kationtu kovu, který poté zůstává centrálně chelatován. Předpokládá se, že prekurzory se seskupí okolo kationtu kovu, dostanou se tak k sobě na krátkou vzdálenost a následně zahřátím na vyšší teplotu (proto se reakce provádějí ve výše vroucích rozpouštědlech, jako je chinolin, DMF, N,N-dimethylacetamid, N,N-dimethylaminoethanol) dojde k vytvoření AzaPc jádra13. Přesný mechanismus dosud není znám. Druhá metoda využívá ataku alkoholátů alifatických alkoholů (většinou butanol, pentanol) na elektrondeficitní uhlík nitrilové skupiny. V první kroku dochází k tvorbě alkylkarboximidátu9, který dále pokračuje v napadání dalších kyanoskupin až dojde k cyklotetramerizaci. AzaPc kruh je tedy v tomto případě stavěn postupně. Nejčastěji se používají alkoholáty hořečnaté, lithné nebo vzniklé za pomocí silné báze např. 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu. U hořečnatých alkoholátů je další výhodou možnost využití také templátového efektu hořečnatého kationtu, což usnadňuje průběh reakce. Metoda využívající templátového efektu poskytuje většinou nižší výtěžky než metoda druhá, i přesto je ale její využití někdy nezbytné14,15. Elektrondeficitní uhlíkové atomy v polohách 5 a 6 pyrazinového jádra prekurzorů jsou totiž snadno napadány alkoholáty používanými jako iniciátory cyklotetramerizace v případě druhé metody. Dochází tak k nechtěné výměně periferních substituentů za alkoxyskupiny z příslušného alkoholátu. Této reakci podléhají alkylsulfanyl a zejména pak alkyloxy a aryloxy deriváty16. U prvně zmiňovaných lze tuto vedlejší reakci eliminovat za použití slabších butanolátů hořečnatých místo lithných, u dalších dvou typů zmiňované substituce je již naprosto nezbytné využití templátového efektu, kde k těmto reakcím nemůže docházet17,18. V případě, že do cyklotetramerizační reakce vstupuje pouze jeden prekurzor, vznikají látky symetrické.
2. Syntézy 2.1. Syntézy prekurzorů Syntézy AzaPc vycházejí z cyklotetramerizace vhodně substituovaných pyrazin-2,3-dikarbonitrilů, kde právě nitrilové skupiny se účastní tvorby centrálních pyrrolových jader a vazeb mezi jednotlivými čtvrtinami výsledného makrocyklu. Syntéza těchto prekurzorů je zásadní pro celkové vlastnosti finálních látek, protože periferní substituenty na AzaPc makrocyklu jsou většinou zavedeny již do struktury pyrazin-2,3-dikarbonitrilů. Obecně lze vycházet ze dvou typů reakcí (Schéma 1). Pokud jsou požadovány periferní substituenty vázané přes
Schéma 1. Možnosti syntézy substituovaných pyrazin-2,3-dikarbonitrilů
276
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
A
B
Schéma 2. A) Dvě metody cyklotetramerizace za vzniku AzaPc jádra – s využitím alkoholátů jako iniciátorů nebo templátového efektu kationtu kovu (DBU = 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en). B) Schematické znázornění statistické kondenzace látek A a B za vzniku šesti kongenerů AzaPc
V některých případech jsou ovšem pro výzkum vlivu struktury na fotofyzikální a fotochemické parametry, případně pro optimalizaci určité vlastnosti v jednotlivých aplikacích, požadovány nesymetrické AzaPc s různým rozložením periferních substituentů. V tom případě do cyklotetramerizační reakce vstupují najednou dva prekurzory A a B (tzv. statistická kondenzace, Schéma 2B), které pak dávají vznik šesti různým kongenerům19. Ty musejí být dále rozděleny chromatografickými metodami. Tato metoda, přestože není příliš jednoduchá, poskytuje často látky s výhodnějšími vlastnostmi (viz kapitola 4. Aplikace), než jsou deriváty symetrické. Metoda statistické kondenzace se osvědčila zejména v případech, kdy je zapotřebí izolovat kongener typu AAAB. I přestože tento přístup není selektivní a pro strukturně podobné Pc byly vyvinuty selektivní metody20, je to doposud prakticky jediná možnost získání nesymetrických AzaPc. Unikátní modifikací statistické kondenzace vycházející pouze z jednoho prekurzoru je metoda zahrnující vznik druhého prekurzoru in situ. Využívá se původně nechtěné vedlejší reakce, kdy u aryloxy AzaPc dochází k transetherifikaci použitým alkoholátem. Takto byly připraveny nesymetrické alkyloxy/aryloxy AzaPc, které představovaly do té doby neřešitelný problém. Při optimalizaci podmínek lze takto dosáhnout zajímavých výtěžků AzaPc obsahujících jednu původní aryloxy skupinu a sedm periferních substituentů z odpovídajícího alkoholátu21.
periferii neposkytují AzaPc. Z tohoto důvodu dochází k cyklotetramerizaci prekurzorů obsahujících terciární aminoskupiny a kvarternizace periferních skupin je prováděna až na hotovém makrocyklu6. Dalším důvodem může být labilita periferních substituentů, které by byly nestálé za podmínek cyklotetramerizace. Toho se využívá v případě látek obsahujících složité spojovací články určené k vazbě na biomolekuly, např. na DNA sondy10,22. Posledním důvodem může být požadovaná vysoká diverzita následně vázaných substituentů. Příkladem může být např. možnost modifikace jednoho AzaPc různými nosiči, zvyšujícími např. selektivitu k různým nádorovým tkáním23. Jednodušší je v tomto případě mít k dispozici AzaPc s optimálními vlastnostmi a ten následně upravovat sérií různých nosičů, než vytvářet celý makrocyklus znovu pro každou novou látku.
3. Fotofyzikální a fotochemické vlastnosti Díky systému konjugovaných vazeb jsou AzaPc schopny absorbovat světlo určitých vlnových délek, což jim, jak již bylo řečeno výše, dodává barevnosti. Absorbovaná světelná energie může být ovšem dále využita k různým aplikacím (viz níže), proto je potřeba na začátku vývoje nových látek pro tyto aplikace zjistit vztahy mezi strukturou a příslušnými fotofyzikálními a fotochemickými vlastnostmi. Látka, jež přijala energii, se může z excitovaného singletového stavu S1 vrátit do stavu základního (S0) několika relaxačnímu cestami (obr. 3). Z těch nejčastějších procesů lze zmínit nezářivé relaxace s následným uvolněním energie ve formě tepla, emisi fotonu formou fluorescence a mezisystémový přechod do tripletového stavu (T1). V tripletovém stavu látka může opět energii emitovat formou fotonu (fosforescence), předávat energii kyslíku v tripletovém stavu fotoprocesem typu II nebo ji ztrácet při odtržení elektronu nebo protonu a jeho předání okolním molekulám (fotoproces typu I). Z hlediska níže diskutova-
2.3. Postcyklotetramerizační modifikace Modifikace struktury AzaPc lze provádět i na již syntetizovaném makrocyklu. K tomuto kroku se většinou přistupuje ze závažných důvodů, protože syntetické práce, zejména separace a čištění, nejsou u AzaPc příliš jednoduché kvůli jejich schopnosti agregovat a silně se vázat na silikagel. První důvod postcyklotetramerizačních reakcí může být nereaktivnost výchozích pyrazin-2,3-dikarbonitrilů. Zde se jedná zejména o kationické deriváty, kde prekurzory obsahující kvarterní amoniové skupiny na 277
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
systémového přechodu na úkor emise fluorescence29. Studie, zabývající se vlivem více centrálních kationtů (hořečnaté, hlinité, zinečnaté, galité a indité komplexy AzaPc), ukázala lineární růst ΦΔ se zvyšujícím se atomovým číslem a současně lineární pokles hodnot ΦF (dosud nepublikováno). Z hlediska složení makrocyklického systému lze snadno porovnávat Pc a AzaPc. V případech, kde se látky nelišily v dalších částech struktury (tzn. měly stejný centrální kation a stejnou periferní substituci, např. VII a VIII), se ukázalo, že Pc mají o něco vyšší tendenci k produkci singletového kyslíku a relativně málo fluoreskují a AzaPc naopak7. Dalším faktorem ovlivňujícím poměr mezi fluorescencí a produkcí singletového kyslíku jsou periferní substituenty, přesněji řečeno první atom spojující makrocyklus s periferním řetězcem16. Při srovnání alkyl, aryloxy a alkylsufanyl substituentů vycházejí u alkylsulfanyl AzaPc hodnoty ΦΔ nejvyšší, naopak u alkyl substitovaných derivátů jsou nejnižší (ΦΔ = 0,56 pro X, ΦΔ = 0,61 pro XI a ΦΔ = 0,65 pro VII)30. I zde se zřejmě projevuje efekt těžkého atomu, rozdíly ovšem nejsou tak markantní jako u změny centrálního kationtu. Specifické postavení mezi periferními substituenty mají alkylamino- a dialkylamino- deriváty (např. XII). U těchto látek se volný elektronový pár na dusíkovém atomu zapojuje do konjugace a po excitaci dochází k velice rychlému přerozdělení hustoty náboje v molekule a poté k rychlému návratu do základního stavu (dochází k ICT)19. Tento proces se tak stává preferovaným způso-
Obr. 3. Modifikovaný Jablonského diagram. 1. Absorpce energie (světla), 2. Nezářivá relaxace ve formě tepla, 3. Fluorescence, 4. Intramolekulární přenos náboje (CSS = charge separated state), 5. Mezisystémový přechod, 6. Fosforescence, 7. Fotoproces typu I (ROS = reactive oxygen species), 8. Přenos energie fotoproces typu II
ných aplikací jsou nejdůležitějšími procesy fluorescence (pro fluorescenční senzory) a mezisystémový přechod, který po předání energie kyslíku vede k produkci jeho vysoce reaktivního stavu24,25, tzv. singletového kyslíku (1O2). Ten je základem pro medicinální aplikaci ve fotodynamické terapii. Pravděpodobnost jednotlivých přechodů udávají tzv. kvantové výtěžky, které jsou definovány jako množství jednotek určitého procesu (např. počet emitovaných fotonů, počet molekul singletového kyslíku aj.) děleno počtem absorbovaných fotonů. Nepříliš častým procesem, který je ovšem velice důležitý pro některé unikátní aplikace AzaPc, je nezářivý intramolekulární přenos náboje (intramolecular charge transfer, ICT). ICT je kompetitivním dějem k běžným procesům zmíněným výše, a pokud se vyskytuje, tak díky své rychlosti výrazně převládá. Pravděpodobnost jednotlivých relaxačních přechodů může být výrazně ovlivněna strukturou AzaPc, a to jak použitým centrální kationtem a složením makrocyklického jádra, tak i periferií makrocyklického systému. Z centrálních kationtů se využívají pro ovlivnění fotofyzikálních a fotochemických vlastností zejména diamagnetické kovy a polokovy (Zn, Mg, Al, Si). Naopak kationty paramagnetických kovů, např. ionty železnaté, měďnaté, kobaltnaté, se snadno účastní oxidoredukčních procesů a takové komplexy jsou zkoumány jako katalyzátory např. při rozkladech peroxidu vodíku26 nebo při oxidacích nečistot v odpadních vodách27. Systematicky asi nejrozsáhlejší studie se zabývají porovnáním vlastností zinečnatých a hořečnatých komplexů. U zinečnatých AzaPc výrazně převyšují hodnoty kvantových výtěžků singletového kyslíku (ΦΔ) kvantové výtěžky fluorescence (ΦF), u hořečnatých je tomu přesně naopak (např. ΦΔ = 0,53, ΦF = 0,26 pro zinečnatý AzaPc V a ΦΔ = 0,25, ΦF = 0,50 pro hořečnatý AzaPc VI, obr. 4)28. Tento jev souvisí s tzv. efektem těžkého atomu, kdy substituce (v tomto případě chelatace) atomy s vyšším atomovým číslem vede k preferenci mezi-
R
R X
R
X N
X
R
N
N
M N
R
X R
V-XIII
XII M=Zn, X=N, R=
VII M=Zn, X=N, R=
S
VIII M=Zn, X=CH, R=
S
IX M=2H, X=N, R=
S
X
N X
R
VI M=Mg, X=N, R=
N
N X
N
X
N N
V M=Zn, X=N, R= R
N
X M=Zn, X=N, R= N
S
N
S
XIII M=Zn, X=CH, R=
XIV M=Zn, X=N, R=
S
XI M=Zn, X=N, R= O
N+
I-
Obr. 4. Struktury některých zkoumaných AzaPc
278
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
substituentů na periferii (např. VII-XI)3 nebo substituentů s náboji (XIV)14. Druhým výrazným problémem je často špatná rozpustnost ve vodě. To se dá řešit například využitím nosičových systémů, kdy je lipofilní AzaPc inkorporován do lipidové dvojvrtsvy liposomů34. Jinou možností je příprava ve vodě rozpustných a neagregujících derivátů zavedením kvartérních amoniových skupin na periferii6. Takovéto látky jsou snadno aplikovatelné k in vitro tes-
bem relaxace excitovaných stavů a je zodpovědný za prakticky nulové hodnoty ΦΔ i ΦF u takto substituovaných AzaPc4. Proces je tak rychlý, že již jedno donorové centrum v molekule (jeden N,N-diethylaminosubstituent) je schopno ICT vyvolat a účinně excitované stavy zhášet. V případě, že center je v molekule méně než 5, lze vlastnosti takovýchto látek ovlivňovat blokací volného elektronového páru, např. protonizací v kyselém prostředí11 nebo chelatací s různými kationty přítomnými v roztoku. Toho se dá úspěšně využít při návrhu nových senzorů reagujících změnou intenzity fluorescence na vlastnosti prostředí. V případě, že těchto center je již více, látka se stává prakticky necitlivou ke změnám okolního prostředí, neprodukuje žádný singletový kyslík a nemá vlastní fluorescenci. Toto je výhodou při návrhu nových zhášečů fluorescence v DNA sondách31.
A
4. Aplikace 4.1. Fotodynamická terapie Fotodynamická terapie (PDT) je relativně moderní metodou léčby zejména nádorových onemocnění, ale nalézá využití také v jiných oblastech, jako jsou oftalmologie, kožní onemocnění a fotodetekce32. Základem PDT je produkce reaktivních forem kyslíku jako jsou kyslíkové radikály a singletový kyslík fotosensitizátory (PS) po jejich ozáření. Tyto reaktivní formy ničí okolní biomolekuly, což vede k porušení biologických funkcí v zasažených buňkách a jejich smrti (obr. 5A). Obecně je za nejdůležitější toxický produkt považován singletový kyslík. Metoda je vysoce selektivní, protože singletový kyslík má krátkou dobu života a z ní vyplývající malý difuzní poloměr (< 0,1 m)33. Důsledkem krátké vzdálenosti, do které se singletový kyslík může dostat, je ničena pouze tkáň, která je ozářena aktivujícím světlem. Mezi důležité parametry každého PS patří také ΦΔ, jakožto ukazatel míry produkce singletového kyslíku. Vzhledem k tomu, že světlo je nezbytnou součástí celé terapie, je prostupnost světla skrz tkáně často limitujícím faktorem při výběru PS. Ideální rozsah vlnových délek pro excitaci je přibližně 630 až 800 nm, kde světlo proniká nejhlouběji a přitom je zachována dostatečná energie vznikajících tripletových stavů pro účinnou produkci singletového kyslíku. Náš výzkum se orientoval na vývoj nových PS ze skupiny AzaPc. Jejich výhodou je vysoká produkce singletového kyslíku a absorpce světla v rozsahu vhodném pro excitaci (660700 nm), přičemž absorpční pásy lze dále bathochromně posunout až k 750 nm, např. přikondenzováním dalších benzenových jader za vzniku tetrachinoxalinoporfyrazinů (např. XIII)14,30. Nevýhodou AzaPc je jejich vysoká tendence k agregaci a tvorbě dimerů díky rozsáhlému planárnímu makrocyklickému systému. Agregované formy poté již neprodukují singletový kyslík, protože excitované stavy jsou zhášeny jinými procesy. Návrh nových AzaPc vhodných nejen pro PDT proto musí zahrnovat cílenou inhibici tohoto chování zavedením objemných
B
C
Obr. 5. A) Princip fotodynamické terapie (PS = fotosensitizátor), B) Princip detekce DNA sekvencí pomocí dvojice fluorofor (F), zhášeč (Q), C) Využití AzaPc jako senzorů (příklad pro pH-senzitivní deriváty)
279
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
tům. Například AzaPc XIV vykázal vysokou fotodynamickou aktivitu na Hep2 buňkách (IC50 ~ 100 nM po ozáření), přičemž bez aktivace světlem látka nevykazovala toxicitu ani po 24 hodinách až do maximální studované koncentrace 200 M (cit.6).
V porovnání statického zhášení s komerčně dostupnými zhášeči ze skupiny diazasloučenin (BHQ1, BHQ2, BBQ650) měly AzaPc deriváty nejvyšší účinnost zhášení, většinou v rozsahu 9799,5 %. U zhášení RET byly studovány pouze dva krajní fluorofory (FAM a Cy5) a opět v porovnání s výše jmenovanými zhášeči vykazovaly AzaPc nejvyšší zhášecí účinnost díky výraznému překryvu absorpčního a emisního spektra. Díky své univerzálnosti a vhodným fotofyzikálním vlastnostem jsou AzaPc zhášeče využitelné pro širokou škálu v současnosti používaných fluoroforů a oba využívané mechanismy zhášení v hybridizačních studiích. Toto je výhoda, kterou jiné strukturní typy v současné době komerčně využívaných nebo zkoumaných zhášečů nemohou nabídnout.
4.2. Zhášeče fluorescence Unikátní aplikací pro alkylamino- a dialkylaminosubstituované AzaPc je zhášení fluorescence v DNA hybridizačních sondách (obr. 5B)31. Zhášeče fluorescence jsou velice široce využívány v biochemii, genetice a molekulární biologii pro identifikaci a kvantifikaci jasně definovaných sekvencí DNA (např. u virových onemocnění, genových mutací)35. Při metodě se využívá dvojice barviv – fluorofor a zhášeč. Zhášeč by neměl produkovat reaktivní částice, ani by neměl mít vlastní fluorescenci. Pokud jsou obě barviva v dostatečné vzdálenosti od sebe, lze pozorovat fluorescenci fluoroforu. Pokud se přiblíží k sobě, dochází buď k rezonančnímu přenosu energie (resonance energy transfer, RET) nebo k vytvoření heterodimeru mezi oběma barvivy (statické zhášení)36. U obou mechanismů pak dochází k poklesu intenzity fluorescence, který se využívá k detekčním účelům. U RET je nezbytný výrazný překryv emisních spekter fluoroforů s absorpčními spektry zhášeče, u statického zhášení toto potřeba není, ale obě látky se musí k sobě přiblížit. Přestože AzaPc a jim podobné látky ze skupiny Pc nebo porfyrinů často mají výraznou fluorescenci a produkci singletového kyslíku, které by bránily jejich použití jako zhášeče fluorescence, jsou tyto procesy u alkylaminoa dialkylamino-AzaPc díky ICT limitovány, např. dokonce není pozorovatelná prakticky žádná fluorescence10. Navíc díky absorpci v širokém rozsahu 300700 nm (nutné pro RET) jsou tyto látky ideálními kandidáty pro zhášeče fluorescence po napojení AzaPc na oligonukleotidovou sondu. Tento předpoklad byl potvrzen v hybridizačních studiích s šesti rutinně používanými fluorofory pokrývajícími prakticky celé emisní spektrum využívané v DNA analýze od 520 nm (fluorescein) po 703 nm (Cy5.5)10,22.
4.3. Senzory Proces ICT, který byl potvrzen u AzaPc, lze také různými způsoby ovlivňovat a využít tak tyto látky jako fluorescenčních senzorů emitujících v červené oblasti spektra. Jak již bylo naznačeno výše, červené světlo je obzvláště vhodné pro in vivo aplikace, protože proniká nejhlouběji skrze tkáně. Pro proces ICT je zásadním způsobem důležitá přítomnost volného elektronového páru na donorovém dusíku periferního substituentu. Po jeho zablokování nebo odstranění pak ICT neprobíhá a projeví se původní fotofyzikální a fotochemické vlastnosti s hodnotami ΦΔ a ΦF srovnatelnými s analogickými AzaPc bez donorového centra. Jednou z možností, jak donorové centrum blokovat, je protonizace v kyselém prostředí (obr. 5C). Toto bylo jednoznačně prokázáno v první takto zaměřené studii u AzaPc obsahujících periferně vázané čtyři donory11. Po úplném zablokování donorů použitím kyseliny sírové došlo k nárůstu jak fluorescence, tak produkce singletového kyslíku až o dva řády, což naznačilo velice dobrý poměr signál/šum u nově vyvíjených senzorů. Problémem u zkoumaných látek byla přítomnost čtyř donorových center. Proces ICT, jak bylo dříve naznačeno, je rychlý a stačí jeden donor k vysoce účinnému zhášení excitovaných stavů19. Pro zablokování všech čtyř center bylo proto zapotřebí vyšších koncentrací kyseliny. Za účelem zvýšení citlivosti na změnu pH byly AzaPc v následující studii navrženy pouze s jedním donorovým centrem, navíc se snadno modulovatelnou bazicitou v rozsahu pKa 2,24,2 (obr. 6, XV)37. Tyto látky pak splnily očekávání v provedených testech, kdy blokováním ICT v kyselém prostředí docházelo ke změnám ΦΔ a ΦF opět až o dva řády, a to při výrazně nižších koncentracích kyseliny. Navíc tyto lipofilní látky byly inkorporovány do liposomů, jako jednoduchých modelů biomembrán, a modulace fluorescence byla prokázána také při změnách pH okolního pufru. Jinou možností, jak donorové centrum blokovat, je komplexace volného elektronového páru kationtem kovu. V současné době jsou proto studovány AzaPc obsahující periferní donorové centrum uzavřené do aza-crown etheru (XVI). Tato rozpoznávací část je zodpovědná za vazbu kationtů alkalických kovů a kovů alkalických zemin a díky
Obr. 6. Příklady AzaPc se senzorickými vlastnostmi
280
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
12. Babudri F., Fiandanese V., Marchese G., Punzi A.: Tetrahedron Lett. 36, 7305 (1995). 13. Makhseed S., Ibrahim F., Samuel J., Helliwell M., Warren J. E., Bezzu C. G., McKeown N. B.: Chem. Eur. J. 14, 4810 (2008). 14. Zimcik P., Miletin M., Musil Z., Kopecky K., Kubza L., Brault D.: J. Photochem. Photobiol., A 183, 59 (2006). 15. Mørkved E. H., Afseth N. K., Kjøsen H.: J. Porphyrins Phthalocyanines 10, 1301 (2006). 16. Zimcik P., Miletin M., Kostka M., Schwarz J., Musil Z., Kopecky K.: J. Photochem. Photobiol., A 163, 21 (2004). 17. Makhseed S., Ibrahim F., Bezzu C. G., McKeown N. B.: Tetrahedron Lett. 48, 7358 (2007). 18. Novakova V., Zimcik P., Miletin M., Vůjtěch P., Franzová Š.: Dyes Pigm. 87, 173 (2010). 19. Novakova V., Zimcik P., Miletin M., Vachova L., Kopecky K., Lang K., Chábera P., Polívka T.: Phys. Chem. Chem. Phys. 12, 2555 (2010). 20. De La Torre G., Claessens C. G., Torres T.: Eur. J. Org. Chem. 2000, 2821. 21. Novakova V., Miletin M., Kopecky K., Franzová Š., Zimcik P.: Eur. J. Org. Chem. 2011, 5879. 22. Kopecky K., Novakova V., Miletin M., Kučera R., Zimcik P.: Tetrahedron 67, 5956 (2011). 23. Novakova V., Zimcik P., Miletin M., Kopecky K., Ivincová J.: Tetrahedron Lett. 51, 1016 (2010). 24. Lang K., Mosinger J., Wagnerová D. M.: Chem. Listy 99, 211 (2006). 25. Lang K., Mosinger J, Wagnerová D. M.: Coord. Chem. Rev. 248, 321 (2004). 26. Korzhenevskii A. B., Efimova S. V., Zelenov A. A., Koifman O. I.: Russ. J. Gen. Chem. 76, 822 (2006). 27. Kudrik E. V., Theodoridis A., van Eldik R., Makarov S. V.: Dalton Trans. 2005, 1117. 28. Mørkved E. H., Afseth N. K., Zimcik P.: J. Porphyrins Phthalocyanines 11, 130 (2007). 29. Solovyov K. N., Borisevich E. A.: Phys.- Usp. 48, 231 (2005). 30. Novakova V., Zimcik P., Miletin M., Kopecky K., Musil Z.: Eur. J. Org. Chem. 2010, 732. 31. Miletín M., Zimčík P., Kopecký K., Musil Z., Nováková V., Haluza R., Bunček M.: CZ 300906 (2009). 32. Agostinis P., Berg K., Cengel K. A., Foster T. H., Girotti A. W., Gollnick S. O., Hahn S. M., Hamblin M. R., Juzeniene A., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Mroz P., Nowis D., Piette J., Wilson B. C., Golab J.: Ca-Cancer J. Clin. 61, 250 (2011). 33. Lang K., Mosinger J., Wagnerová D. M.: Chem. Listy 100, 169 (2006). 34. Zimcik P., Miletin M., Kopecky K., Musil Z., Berka P., Horakova V., Kucerova H., Zbytovska J., Brault D.: Photochem. Photobiol. 83, 1497 (2007). 35. Marras S. A., Kramer F. R., Tyagi S.: Nucleic Acids Res. 30, e122 (2002). 36. Tyagi S., Kramer F. R.: Nat. Biotechnol. 14, 303 (1996).
zablokování donorového centra dochází k výraznému zvýšení fluorescence AzaPc.
5. Závěr V chemii i aplikacích AzaPc byl za posledních deset let udělán výrazný pokrok. Kromě původně oceňované barevnosti těchto látek se začaly využívat i jejich zajímavé fotofyzikální, fotochemické, oxidoredukční i katalytické vlastnosti. Byla nalezena řada vztahů mezi strukturou a těmito vlastnostmi, což následně umožnilo rozvoj zcela nových aplikací, jako jsou např. zhášeče fluorescence nebo fluorescenční senzory. Dá se proto očekávat, že budoucnost je těmto látkám široce otevřená. Na tomto místě bych chtěl poděkovat všem kolegům, kteří se spolupodíleli na vzniku výše uvedených výsledků. Jmenovitě bych velice rád poděkoval současným i bývalým členům Azaphthalocyanine group Veronice Novákové, Kamilovi Kopeckému, Miroslavovi Miletínovi, Zbyňkovi Musilovi a Lence Váchové. Internetová verze této práce obsahuje navíc doplňující část. Pro vyhledání plné verze článku včetně příslušného suplementu je třeba otevřít aktuální webovou stránku Chemických Listů http://www.chemicke-listy.cz/docs/ full2012_04_275-282.pdf. LITERATURA 1. Linstead R. P., Noble E. G., Wright J. M.: J. Chem. Soc. 1937, 911. 2. Musil Z., Zimcik P., Miletin M., Kopecky K., Lenco J.: Eur. J. Org. Chem. 2007, 4535. 3. Kostka M., Zimcik P., Miletin M., Klemera P., Kopecky K., Musil Z.: J. Photochem. Photobiol., A 178, 16 (2006). 4. Novakova V., Zimcik P., Kopecky K., Miletin M., Kuneš J., Lang K.: Eur. J. Org. Chem. 2008, 3260. 5. Petrik P., Zimcik P., Kopecky K., Musil Z., Miletin M., Loukotova V.: J. Porphyrins Phthalocyanines 11, 487 (2007). 6. Zimcik P., Miletin M., Radilova H., Novakova V., Kopecky K., Svec J., Rudolf E.: Photochem. Photobiol. 86, 168 (2010). 7. Zimcik P., Miletin M., Novakova V., Kopecky K., Nejedla M., Stara V., Sedlackova K.: Aust. J. Chem. 62, 425 (2009). 8. Donzello M. P., Ou Z., Dini D., Meneghetti M., Ercolani C., Kadish K. M.: Inorg. Chem. 43, 8637 (2004). 9. Mørkved E. H., Ossletten H., Kjøsen H.: Acta Chem. Scand. 53, 1117 (1999). 10. Kopecky K., Novakova V., Miletin M., Kucera R., Zimcik P.: Bioconjugate Chem. 21, 1872 (2010). 11. Novakova V., Mørkved E. H., Miletin M., Zimcik P.: J. Porphyrins Phthalocyanines 14, 582 (2010). 281
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
Referát
pyrazine-2,3-dicarbonitriles. Several approaches to synthesis of azaphthalocyanines, both precursors and final products, are discussed. Interesting structure-properties relationships were found in several studies. These studies were mainly focused on photophysical and photochemical properties of azaphthalocyanines showing how to design the structure of these compounds in order to maximize singlet oxygen production, fluorescence or other deactivation pathways of excited states. Intramolecular charge transfer, an uncommon relaxation channel for azaphthalocyanines is explained. Several applications including photodynamic therapy, dark quenchers of fluorescence and sensors are discussed in relation to the structure-properties relationships.
37. Novakova V., Miletin M., Kopecky K., Zimcik P.: Chem. Eur. J. 17, 14273 (2011).
P. Zimčík (Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague): Azaphthalocyanines – from Synthesis through Photochemical and Photophysical Properties to Emerging Applications Azaphthalocyanines are macrocyclic compounds closely related to synthetic dyes phthalocyanines. They are synthesized by cyclotetramerization of corresponding
282
Referát doplněk
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
AZAFTALOCYANINY – OD SYNTÉZ PŘES FOTOCHEMICKÉ A FOTOFYZIKÁLNÍ VLASTNOSTI K APLIKACÍM PETR ZIMČÍK Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové
[email protected]
Absorbance, a.u.
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 550
600
650
700
750
800
vlnová délka, nm
Absorbance, a.u.
Obr. S1. Změny absorpčních spekter u tzv. J-dimerů v toluenu (modře) během jejich rozvolnění na monomer (červeně) při titraci pyridinem1
350
450
550
650
750
Vlnová délka, nm Obr. S2. Změny absorpčních spekter při deprotonizaci centrálních NH skupin bazí (titrace tetrabutylamonium hydroxidem v tetrahydrofuranu)2
1
Referát doplněk
Absorbance, a.u.
Chem. Listy 106, 275282 (2012)
500
600
700
800
Vlnová délka, nm
Obr. S3. Spektra AzaPc v tetrahydrofuranu v neutrální podobě (červená) a po protonizaci kyselinou sírovou na azomethinovém dusíku (modrá)2
absorbce / a.u.
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 300
400
500
600
700
800
vlnová délka / nm
Obr. S4. Absorpční spektra AzaPc symetricky (červená) a nesymetricky (modrá) periferně substituovaného3
LITERATURA PRO DOPLNĚK K PRÁCI 1. Novakova V., Zimcik P., Kopecky K., Miletin M., Kuneš J., Lang K.: Eur. J. Org. Chem. 2008, 3260. 2. Petrik P., Zimcik P., Kopecky K., Musil Z., Miletin M., Loukotova V.: J. Porphyrins Phthalocyanines 11, 487 (2007). 3. Zimcik P., Miletin M., Novakova V., Kopecky K., Nejedla M., Stara V., Sedlackova K.: Aust. J. Chem. 62, 425 (2009).
2
