AZ ISCHAEMIAS STROKE KOCKÁZATÁT ÉS KIMENETELÉT BEFOLYÁSOLÓ VÉRALVADÁSGENETIKAI ÉS HAEMORHEOLÓGIAI TÉNYEZŐK
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
DR. PONGRÁCZ ENDRE Program és témavezető: Prof. dr. Nagy Zoltán
Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományok Doktori Iskola Klinikai idegtudományok
Hivatalos bírálók: Dr. Sándor Péter egyetemi tanár Dr. Fekete István egyetemi tanár
Szigorlati bizottság elnöke: Prof. dr. Karádi István egyetemi tanár Szigorlat bizottság tagjai: Prof. dr. Csiba László egyetemi tanár Prof. dr. Kerényi Tibor egyetemi tanár
Budapest, 2008
TARTALOMJEGYZÉK Téma
Oldal
Rövidítések jegyzéke
6
1. Bevezetés 1.
A kockázat fogalma, a stroke rizikófaktorai
8 8
1. 2.
Genetikai kockázat (genetikai epidemiológia)
9
1. 3.
A protrombin gén G20210A polimorfizmusa
11
1. 4.
Az ACE gén insertios/deletios (I/D) polimorfizmusa
11
1. 5.
A trombocita GP IIb/IIIa receptor (Leu33Pro) polimorfizmusa
12
1. 6.
Az V véralvadási faktor (Leiden) mutációjának vizsgálata
12
1. 7.
Az ABCA1 polimorfizmus R219K és V771M vizsgálata
13
1. 8.
Haemorheológiai tényezők és a stroke kapcsolata
14
1. 9. Trombocita aggregáció gátlás szerepe az ischaemias stroke
18
másodlagos megelőzésében
2. Célkitűzések 2. 1.
19 19
Genetikai vizsgálatok
2. 1. 1. A protrombin gén G20210A polimorfizmusának vizsgálata
20
2 1. 2. Az ACE gén insertios/deletios (I/D) genetikai polimorfizmusa
20
2. 1. 3. A trombocita GP IIb/IIIa receptor (Leu33 Pro)
21
polimorfizmusa 2. 1. 4. Az V véralvadási faktor (Leiden) mutációjának vizsgálata
21
2. 1. 5. Az ABCA1 polimorfizmus R219K és V771M vizsgálata
22
2. 1. 6. Összesített betegvizsgálatok, genetikai polimorfizmusok
22
halmozódásai 2. 2.
Haemorheológiai vizsgálatok krónikus stádiumban lévő ischaemias stroke betegekben 2. 2. 1. BAEP vizsgálatok hiperviszkozitással járó agytörzsi
22 22
keringési zavarban szenvedő betegekben 2. 2. 2. A fibrinogén gén -455A variáns, a Leiden mutáció és a vérviszkozitás kapcsolata
2
23
2. 3.
Trombocita aggregáció vizsgálata cerebrovascularis
23
betegségekben
3. Módszerek 3. 1.
A vizsgálatokba bevont betegek és kontroll személyek
25 25
3. 1. 1. A protrombin gén G20210A vizsgálata során
26
3. 1. 2. Az ACE gén I/D vizsgálata során
26
3. 1. 3. A trombocita GP IIb/IIIa polimorfizmus vizsgálata során
27
3. 1. 4. A Leiden mutáció vizsgálata során
28
3. 1. 5. Az ABCA1 genetikai polimorfizmus vizsgálata során
28
3. 1. 6. BAEP és haemorheológiai vizsgálatok
29
3. 1. 7. A FIB -455G/A és Leiden mutációval rendelkező betegekben
29
történt viszkozitás vizsgálatok során 3. 1. 8. A trombocita aggregációs vizsgálatokba bevont személyek
30
3. 2. Genetikai vizsgálatok 3. 2. 1. A protrombin gén G20210A polimorfizmusának kimutatása
30 30
3. 2. 2. Az ACE gén I/D genetikai polimorfizmusának kimutatása
31
3. 2. 3. A trombocita GP IIb/IIIa receptor Leu33Pro genetikai
31
polimorfizmusának kimutatása 3. 2. 4. A Leiden mutáció kimutatásának módszere
32
3. 2. 5. Az ABCA1 R219K, V771M és I883M allélok DNS-einek
32
izolációja és kimutatása „LighCycler” hibridizációs technikával 3. 2. 6. A fibrinogén gén -455 G/A genetikai polimorfizmusának
32
vizsgálata 3. 2. 7. Az MTHFR C677T gén polimorfizmusának kimutatása
33
3. 3.
33
Haemorheológiai és hemostaseológiai módszerek
3. 3. 1. A teljesvér és plazma viszkozitás mérésének módszere
33
3. 3. 2. A trombocita aggregáció mérésének módszere
33
3. 3. 3. A GP IIb/IIIa trombocita sejtfelszíni receptor ex vivo
34
vizsgálata Egyéb vizsgálati módszerek:
35
3. 3. 4. Agytörzsi akusztikus kiváltott válasz (BAEP)
35
3
3. 3. 5. Rizikó felmérés a betegcsoportban
36
4. Eredmények
38
4. 1.
A protrombin gén G20210A genetikai polimorfizmusa
38
4. 2.
ACE gén I/D polimorfizmusa
39
4. 3.
A GP IIb/IIIa Leu33Pro polimorfizmus vizsgálatának
41
eredményei 4. 4.
A Leiden mutációs vizsgálatok eredményei
44
4. 5.
Az ABCA1 genetikai polimorfizmus vizsgálatok eredményei
45
4. 6.
Összesített genetikai vizsgálatok eredményei
48
4. 7.
A BAEP vizsgálatok eredményei
50
4. 8.
A FIB gén -455 G/A, valamint a Leiden mutáció összefüggése
51
4. 9.
A trombocita aggregációs vizsgálatok eredményei
53
5. Megbeszélés
56
5. 1.
A Factor II genetikai polimorfizmus
57
5. 2.
Az ACE gén I/D polimorfizmusa
58
5. 3.
A GP IIb/IIIa (Leu33Pro) polimorfizmus klinikai és in vitro
60
vizsgálatok 5. 4.
A faktor V (Leiden) mutációs vizsgálatok
61
5. 5.
Az ABCA1 genetikai polimorfizmus vizsgálatok
63
5. 6.
Az összesített genetikai vizsgálatok
64
5. 7.
BAEP és viszkozitási vizsgálatok
65
5. 8.
Fibrinogén -455 G/A polimorfizmus, Leiden mutáció
65
5. 9.
és haemorheológiai vizsgálatok A trombocita aggregációs vizsgálatok
66
6. Következtetések
68
7. Összefoglaló
70
7. 1.
Magyar nyelvű
70
7. 2.
Angol nyelvű
71
8. Irodalomjegyzék
72
8. 1.
A disszertáció irodalomjegyzéke
72
8. 2.
A disszertációhoz felhasznált saját közlemények és peer
86
4
review absztaktok 8. 3.
A disszertációhoz kapcsolódó közlemények és peer review
88
absztaktok 8. 4.
A tudományos munka részét képező de a disszertációtól
89
független közlemények 8. 5.
Peer review, angol nyelvű folyóiratokban megjelent,
91
idézhető abstraktok
9. Köszönetnyilvánítás
5
93
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACE
angiotenzinkonvertáló enzim
ASA
acetilszalicilsav
AT
antithrombin
BAEP
brainstem auditory evoked potentials
CI
konfidencia intervallum
COX
ciklooxigenáz
CDS
carotis duplex scan
CS
completed stroke
CT
computer tomograph
GP IIb/IIIa
(trombocita) glikoprotein IIb/IIIa receptor
HDL
high density lipoprotein
HHC
hiperhomociszteinémia
Htc
haematocrit
IHD
ischemic heart disease
ICV
intracerebrális vérzés
IS
ischaemias stroke
LDL
low density lipoprotein
MI
myocardialis infarctus
MRI
mágneses rezonancia imaging
MVT
mélyvénás trombózis
OR
odds ratio
PBS
phosphate buffer solution
PFC
plazma fibrinogén koncentráció
PRP
platelet rich plasma
PV
plazma viszkozitás
PVR
polycythaemia vera rubra
RR
relative risk
PRIND
progressiv reversibile ischaemic neurological deficit
SAV
subarachnoidealis vérzés 6
TCD
transcranialis Doppler
Tct
trombocita
TIA
tranziens ischaemias attack
TVV
teljesvér viszkozitás
TXA2
thromboxan A2
Vvs
vörösvérsejt
7
1. BEVEZETÉS 1. 1. A kockázat fogalma, a stroke rizikófaktorai A stroke az agyszövet olyan ischaemias vagy vérzéses eredetű károsodása, mely vascularis betegségek heterogén csoportjainak fennállása esetén keletkezik és klinikai tüneteiben 1) vagy a kezdetétől számított 24 órán túl is fennáll, 2) vagy halálhoz vezet (WHO MONICA Project 1988). Azoknak a külső és belső, a vérkeringésben és az érrendszerben megjelenő kóros folyamatokat elősegítő tényezőknek a sokaságát, melyek részben önmagukban, részben egymással társulva képesek a stroke kockázatát emelni és melyek olykor a betegség kiváltó okaiként is szerepelhetnek, rizikó vagy kockázati
tényezőknek
nevezzük.
Epidemiológiai
szempontból
fontos,
nem
befolyásolható kockázati tényezők: 1) Kor, ismeretes, hogy a stroke előfordulása gyermekkorban és 45 év alatt (3%) ritka, középkorúaknál már gyakoribb és időskorban a legmagasabb. Ugyanakkor fiatal korban gyakoribb a vérzéses kórforma. A fiatalkori stroke esetén gyakoriak a malformatiok és az aneurysmák. Jellemző, hogy az ischaemias stroke okainak keserése során 30-50%-ban nem tudunk pontos magyarázatot adni. A stroke patomechanizmusa is változó a kor függvényében. Idősebb korban az atherosclerosis előrehaladásával és a pitvarfibrilláció okozta cardiogen embolias mechanizmus megszaporodtával egyértelműbben tisztázhatók az ischaemias kórokok, ugyanakkor a kezeletlen vagy rosszul beállított magas vérnyomás és az amyloid angiopathia következtében pedig 10-15% között van a vérzéses stroke-ok aránya. 2) a nemi különbségek minden korosztályban a férfiak számára kedvezőtlenek mind az ischaemias, mind a vérzéses stroke-ot illetően. 3) a stroke előfordulása más és más a különböző etnikai csoportokban. Ez a jelenség genetikai meghatározottságra utal. Csökkenő a trendencia a következők szerint: feketék> ázsiaiak és a hispánok> fehérek. Különbség mutatkozik a geográfiai megjelenésüket illetően is: magasabb a stroke incidenciája közép és kelet Európában, kevesebb nyugat Európában. Magas Ázsiában és kevesebb Európában és Észak
8
Amerikában (Meschia J.F.,2003). A genetikai hatások természetesen nem önmagukban jelentenek kockázatot, hanem a társuló környezeti tényezőkkel együtt (klasszikus rizikófaktorok, szociális különbségek stb.) 4) Emeli a stroke kockázatát a családban előforduló stroke vagy szívbetegség is mely szintén genetikai kockázatot támaszt alá. Természetesen a különböző etnikai, földrajzi és családi halmozódásban szerepet játszanak az eltérő hagyományos rizikófaktorok is, mint pl. az adott populációban a magas vérnyomás előfordulása, az étkezési szokások, a szociális lét különböző formái és az egészségügyi ellátó rendszerek eltérő fejlettségi foka is. Jól ismertek a stroke módosítható rizikófaktorai is, melyek különböznek a szívinfarktusra jellemzőktől, ezek az alábbiak: hypertonia, diabétesz mellitus, emelkedett vér koleszterin szint, dohányzás, de ezeken kívül egész sora ismert a még nem jól definiált kockázati tényezőknek, mint pl. a migrén, az orális anticoncipiens tabletták szedése, az elhízás, a mozgás-szegény életmód, a vér hiperviszkozitása és polyglobulia, gyógyszer-abusus, alvási apnoe stb. A probléma az, hogy a fenti jól és kevésbé jól definiált, hagyományos rizikófaktorok a stroke előfordulásáért ill. kiváltásáért mindösszesen csak kb. 60 %-ban felelősek. Ezek alapján felvetődött az utóbbi évtizedben az az igény, hogy a fenti 40%-ban, részben genetikai kockázati tényezőket is kellene keresni. A genetikai kutatások jelentőségére utal az a tényező is, hogy a hagyományos rizikófaktorok egy része maga is genetikailag meghatározott, mint pl. a magas vérnyomás, a cukorbetegség, és a lipoprotein anyagcsere rendellenességei. 1. 2. Genetikai kockázat (genetikai epidemiológia) A stroke multifaktoriális betegség, ritka az egy génhez kötött formája. Részben az ikervizsgálatok, részben a stroke családi előfordulási gyakoriságának vizsgálatai mutattak rá arra, hogy a genetikus hajlam a stroke kockázati tényezője. A stroke kutatásokban meglepően kevés ikervizsgálat található. 1975-ből származik a Swedish Twin Registry melyben a cerebrovascularis betegségek mortalitását vizsgálva nem találtak különbséget a mono és dizigóta testvérek között (n=10,900) (De Faire U. 1994). Ebben a vizsgálatban nem tettek különbséget a vérzéses és ischaemias eredetű kórformák között. A The National Academy of Sciences-National Research Council (NAS-NRC) Twins Registry-ben 15,924, fehér testvérpárt regisztráltak az USA 9
hadseregében, akiket 10 év múlva megkérdeztek stroke előfordulásról (Braun M.M. 1994). 3,1% -os stroke incidenciát tapasztaltak. A monozigóta konkordancia 17,7% a dizigóta 4,3% volt (p<0,05). A vizsgálatokat folytatva fiatalabb és idősebb korosztályban későbbi interjúkkal (1994, 1997 és 1998-ban) igazolták, hogy a stroke előfordulása gyakoribb testvérek között a fiatalabb korosztályban, mint az idősebbekben. Újabb, hosszú távú vizsgálatok igazolták, hogy genetikai tényezőknek is szerepük van a stroke syndroma létrejöttében, ebben a vizsgálatban már a vérzéses és ischaemias kórformákat kettéválasztották (Bak S. 2002). Szorosabb összefüggés mutatkozott a vérzéses eredetű stroke és a genetikai komponensek között, mint az infarktusok és a genetikai tényezők között. Az újabb vizsgálatok már figyelembe vették a környezeti tényezőket is és ezek közül a populáció 30-40%-át érintő dohányzást is. A CDS vizsgálatok eredményeit két csoportra osztották a dohányzási szokások szerint és a testvér vizsgálatok azt igazolták, hogy a dohányzókban gyakoribb volt a carotis stenosis. A genetikai vizsgálatok másik részében abból indultak ki, hogy ha valamelyik genetikai tényező hajlamosít stroke-ra, akkor a családban előforduló stroke lehet a stroke kockázati tényezője. Más szóval a stroke gyakoribb, ha családi genetikai halmozódás mutatkozik. Az utóbbi években a figyelem a kromoszóma vizsgálatokról a genetikai polimorfizmusok felé irányult, melyekben a genetikai eltérés többnyire egyetlen nucleotidot érint (single nucleotide polymorphisms, SNP). Ezt lehetővé tette a PCR vizsgálatok technikai fejlődése és tömeges vizsgálatra való alkalmassága. Az ischaemias eredetű stroke hátterében döntően atherothromboticus folyamatok igazolhatók, a thrombosis kiváltásáért felelős kedvezőtlen allélok emelhetik a thrombosis kockázatát. A különböző polimorfizmusok allélfrekvenciája 0,01-0,47 közötti, minél ritkább az előfordulás populációs szinten, annál nagyobb a jelentősége az egyén szempontjából. Ugyanakkor a magasabb allélfrekvenciával rendelkező, prothrombogén genetikai polimorfizmusok is lehetnek még frekvensebbek bizonyos populációkban, melyek populációs rizikót jelentenek. A kedvezőtlen polimorfizmusok kombinálódhatnak
is
egymással,
emelve
az
egyéni
stroke
kockázatot.
A
polimorfizmusok egymással való kapcsolata még nem tisztázott kellően, valószínű, hogy additív hatásokról is szó lehet, máskor esetleg gátolják a termékeik egymást. Az elmúlt évek intenzív kutatásai hozzájárultak a genetikai polimorfizmusok klinikai jelentőségének megismeréséhez. Megállapítható, hogy 1) a ritka pontmutációk fiatalokban tartós prothromboticus állapotot idézhetnek elő (pl. Leiden mutáció, protrombin gén G20210A), 10
2) a hagyományos vascularis rizikó státusz besorolását módosíthatják, 3) adott esetben terapiás döntésünket módosíthatják (pl. intracerebralis stenosis és Leiden mutáció együttesen tartós anticoagulálást indikálhat), 4) módosíthatják a kezelésre adott választ is, pl. az ACE I/D és az adducin-1 gén (ADD1 Gly460Try) ritkább allél hordozói jobban reagálnak hydrochlorothyazid kezelésre, mint a vad alléllal rendelkezők (Sciarrone MT. 2003). A hemosztázis-endothel interface fontosabb genetikai polimorfizmusai közül az alábbiakat kívántuk tanulmányozni a technikai lehetőségek és adottságok figyelembe vételével minden betegben: 1. 3. A protrombin gén G20210A polimorfizmusa Egy leideni munkacsoport vizsgálatai alapján 1996 óta ismeretes a prothrombint kódoló gén G20210A mutációja, ami emelkedett prothrombin koncentrációt eredményez a vérben (Poort SR.1996). Ezt a prothrombotikus állapotot igazolták mélyvénás trombózison átesett betegekben, valamint sinus thrombosisban is 4,7 OR-val (95% CI, 2,83-75,3), mely, ha ösztrogén szedésével társul 24-es OR-ra emelkedik (95% CI, 2,26127,3) és ha az újabban fefedezett Protein C promoter CG haplotípusával, akkor az OR 19,8 (95% CI, 2,1-186,5) (Le Cam-Duchez V. 2005). Az artériás thrombosisban, így az ischaemias stroke-ban azonban egyértelműen nem bizonyított ennek a mutációnak önálló rizikófaktor volta. Újabb megfigyelés (Lalouschek W. 2005) alátámasztja a 20210A variáns önálló rizikófaktor szerepét arterias agyi thrombosisban férfiakban OR: 6,1 (95% CI 1,3 -28,3 P=0,021). 1. 4. Az ACE gén insertios/deletios (I/D) polimorfizmusa Az utóbbi években többen foglakoztak az ACE gén (17q) 26 intron polimorfizmusának vizsgálatával cardiovascularis betegségekben (Tiret L. 1998, Cambian F. 1992). A plazmában keringő angiotenzin koncentrációja genetikus kontroll alatt áll. Az angiotenzin solubilis szintje egy adott egyénben meglehetősen állandó, azonban az inter-individuális változékonyság kb. 50%-os, ami az ACE gén polimorfizmusának köszönhető. Különösen a D allél és a D/D genotípus jár együtt magasabb keringő ACE koncentrációval és a MI fokozott rizikójával, különösen azok között, akik kevés hagyományos rizikófaktorral rendelkeznek (Soubrier F. 1993). Kimutatták, hogy a 11
polimorfizmus jelenléte nem a hypertonia súlyosságával, hanem a myocardialis infarctus bekövetkezésével és mortalitásával függ össze. Mások nem tudtak hasonló pozitív összefüggést kimutatni a D allél és a MI között (Lindpaintner K. 1995). A polimorfizmus stroke-val való kapcsolatára kevés adat állt rendelkezésre.
Több
tanulmány szerint a D allél szignifikánsan gyakoribb férfiakban (Sharma P. 1994). 1. 5. A trombocita GP IIb/IIIa receptor (Leu33Pro) polimorfizmusa A trombociták aktiváltságától függő tromboembólia az atherothromboticus stroke alapvető és leggyakoribb (kb.80%) mechanizmusa. Több vérlemezke receptor működését kódoló génről derült ki, hogy polimorfizmust mutatnak (Santoso S. 1993), azonban egyikről sem bizonyosodott be, hogy a stroke egyértelmű és önálló rizikófaktora lenne (Riedker PM. 1997). A trombociták az utóbbi időben legtöbbet vizsgált receptora a glikoprotein (GP) IIb/IIIa, melyet az jellemez, hogy egy thrombocita felszínén kb. 40000 receptor mutatható ki és az intergrinek családjába tartozik, aktiválódás esetén szinte „esernyőszerűen” nyílik ki a felszínt megsokszorozva. A receptor genetikai polimorfizmust mutat, a IIIa részén PLA2 allél esetében az 1565ös pozicióban citozin-timin báziscsere→ leucin-prolin aminósavcserét eredményez. A receptor IIIa részének konformáció változása még nem tisztázott kellően, de a fokozott thrombózis készségben játszott szerepére több közlés utalt, klinikai eseményekkel igazolva (Carter A.M. 1996). Weiss (Weiss EJ.1997) megfigyelte, hogy instabil anginában és myocardialis infarctusban az PLA2 allél szignifikánsan magasabb arányban fordul elő kontrollokhoz képest. A vad allél és a heterozigóta állapot funkcionális vizsgálatára vascularis betegek véréből nyert in vitro vizsgálatokról kevés az adat. 1. 6. Az V véralvadási faktor (Leiden) mutációjának vizsgálata Az intenzív molekuláris genetikai vizsgálatok eddig 10-12 genetikai polimorfizmusról mutatták ki, hogy emelhetik a vaszkuláris károsodás bekövetkeztének kockázatát, mint ahogy több vizsgálat igazolta ennek halmozott előfordulását az érintett családokban (Graffagnino C. 1994, Morgenstern LB. 1997, Pullicino P. 1997). Bizonyított továbbá a gutaütés eltérő incidenciája a különböző etnikai csoportokban is (Scaglione L, 1998,
12
Weiss EJ. 1996). A véralvadási folyamatok egyik meghatározója a protein C rendszer melynek szerepe, hogy a véralvadási folyamat csak lokálisan jöjjön létre, ott ahol az endothel sérült és ne terjedjen tovább az érpályában. A trombin egy olyan folyamatot indít be, amely önmaga képződésének folyamatát leállítja és ez a gátló hatás arányos a keletkezett trombin mennyiségével. A protein C a trombin hatásá ra aktiválódik, aktivált protein C képződik (APC). A protein C a májban képződik, szerkezetét a 4. kromoszómán található gén kódolja. Aktivitásának csökkenése trombózis hajlammal jár. Elsősorban mélyvénás trombózisra hajlamosít, de leírták isémiás stroke kapcsán is. Képzési zavarának hátterében kb. 160 mutációt írtak le, melyek mindegyike mérsékelt trombózisfokozódással jár. Az V véralvadási faktor génjében (A506G) pár éve polimorfizmust mutattak ki, az ún. Leiden mutációt (Happich D. 1993), mely az APC rezisztenciáért az esetek kb. 85 %-ában tehető felelőssé. Szerepe már bizonyított vénás trombózisban, az arteriásban szerepe vitatott. 1. 7. Az ABCA1 polimorfizmus R219K és V771M vizsgálata
Az ATP kötő-kötő kazetta A1(ABCA1) gén mutációi a korábbi vizsgálatok alapján felelőssé tehetők két örökletes HDL anyagcsere rendellenességhez kötődő betegség kialakulásáért: a 1) Tangier kór és a 2) familiáris hypo-alfa lipoproteinémia (BrooksWilson A. 1999, Bodzioch M. 1999). Kísérletes vizsgálatok szerint az ABCA1 transzporter fokozott expressziója a plazma HDL koleszterin koncentrációjának emelkedésével jár együtt (Vaisman BL. 2001,Singaraja RR. 2001). Az ABCA1 fehérje elősegíti a HDL koleszterin és a foszfolipidek átépítését a sejt membránba, valamint a koleszterin efflux növelését a lipid szegény apoA-részecskékbe, miáltal emeli a koleszterin transzport szintjét vissza a májba (Wang N. 2001, Oram JF. 2000, Brewer HB. Jr. 2003). Megállapítható, hogy az ABCA1 gén magas polimorfizmus gyakorisággal rendelkezik, sok a szekvencia variáció, melyek aminosav változásokhoz vezetnek és befolyásolják a fenti régiókat (Probst MC. 2004, más forrás: www.abca1mutants.all.at).
Több
vizsgálat
próbálta
meghatározni
különböző
ABCA1
polimorfizmusok szerepét coronaria, valamint a lipoprotein anyagcsere betegségekben, de ezek eredményei ellentmondásosak voltak. Néhányan bizonyították a coronaria szűkületben szenvedő betegek esetében ezeknek a polimorfizmusoknak a védő hatását
13
(Clee SM. 2001, Wang J. 2000), valamint igazolták anti-atherogén hatását is (Yamakawa-Kobayashi K. 2004). 1. 8. Haemorheológiai tényezők és a stroke kapcsolata A rheológia (áramlástan) egyik speciális területe a haemorheológia, tárgya a vér áramlási tulajdonságainak megismerése normális és kóros viszonyok között. A klinikai haemorheológia a kóros áramlási viszonyok és az érrendszeri megbetegedések közötti kapcsolatot vizsgálja annak érdekében, hogy megelőzhesse a betegségek előfordulását és javíthassa azok kimenetelét. Élettani viszonyok között a vérátáramlás meghatározó tényezői a perfúziós nyomás (hemodinamikai tényező) és az érátmérő. Kóros körülmények között, amikor a hemodinamikai tartalék kimerül és az érátmérő sem változtatható, a hemorheológiai tényezők döntő faktorrá lépnek elő és jelentősen képesek a perfúziót rontani. A nyomásgrádiens emelkedése és a vasodilatatio a hyperviszkozitást széles határok között képes korrigálni.
Ezzel magyarázható, hogy a polyglobulia hosszú időn keresztül
klinikai következmények nélkül maradhat. Ha azonban hemodinamikai zavar vagy atherosclerosis miatt vérkeringési zavar alakul ki, a vérviszkozitás jelentősége az agyi keringésben előtérbe kerül. Megkülönböztetünk: - makro és mikro (sejt) rheológiai paramétereket. Az előzőek a nagyerek áramlási tulajdonságait, az utóbbiak a prekapillárisok,
kapillárisok,
posztkapilláris
reprezentálják, tehát a mikrokeringést.
venulák
szintjén
bekövetkezőket
A főbb makrorheológiai paraméterek: 1) a
teljesvér viszkozitása, mely függvény formában értelmezhető, a vér lamináris rétegeinek egymáshoz való relatív sebességétől függ és annak szuszpenzió jellegével függ össze (nem-Newtoni folyadék). Ex vivo mérhető kapilláris (Hevimet 40, Hemorex Kft., Budapest) és rotációs viszkoziméterekkel (Wells-Brookfield USA, Contraves UK, Carry-Med UK stb.) különböző sebességgradiensen és nyírófeszültség esetén. 2) Hematokrit: 0,45 érték felett a hematokrit lineáris emelkedésével a TVV exponenciálisan emelkedik. A hematokrit 0,40 ről 0,50-re való emelkedése az össz agyi vérkeringést 50%-al csökkenti. 3) Plazma viszkozitás: A vérplazma ún. Newtoni folyadék, mely viszkozitása annak sebességétől független. Jelentősen emeli a plazma FIB koncentrációja, a paraproteinek jelenléte, az α-2 makroglobulin koncentrációjának emelkedése, valamint az exsiccosis. Mikrorheológiai paraméterek:
14
1) a vvs-ek deformálható képessége, mely kóros körülmények között csökken, megváltozik a sejtek membránjának és stromájának viszkozitása, a sejt felület/térfogat aránya, a vvs-ek membrán rotációs és axial-migrációs képessége. A vvs. deformabilitás csökkenése számos kórfolyamat következménye, melyek lehetnek egyben az ischaemias stroke hagyományos rizikófaktorai is, pl. életkor, dohányzás. 2) Vvs. aggregáció: „rouleaux” képződés fokozott, lokális hiperviszkozitás emelkedéssel, lassult keringéssel, mely reverzibilis folyamat, a nyírófeszültség nagyságától és a plazma fibrinogén koncentrációjától függő jelenség. Diabétesz esetén a vvs-ek pathológiás, tüskésebb formátumú sejteket és ezek pathológiás szerkezetű, „pénztekercsszerű” képződményeket képeznek, melyek lokálisan emelik a viszkozitást és főleg a postcapilláris venulák területén keringési stoppal járhatnak. Ilyen módon jelentős vérmennyiség válik képtelenné a meglévő, vagy megnyíló shunt-keringésben való részvételre. A fentiekhez akut fázis reakcióként kapcsolódik a fehérvérsejtek aktivációja, az endothelhez való kitapadása, ugyanakkor a trombociták adhezivitásának és aggregációs képességének fokozódása miatt áramló, kitapadó és leszakadó mikroaggregátumok képződnek. 3) A már makro-rheológiai paraméterként említett plazma viszkozitás szerepe jelentős a capilláris keringésben is, a vvs.flexibilitás csökkenésen kívül a másik meghatározója. A teljesvér viszkozitását a makro és sejtrheológiai tényezők együttesen határozzák meg. A plazma viszkozitás emelkedése független rizikófaktor agyi ischaemiakban (Lowe G.O.D. 1998, Szirmai I. 1993). A vér egyik fontos funkciója az oxigén szállítása, a transzport részben az oxigénszállító kapacitástól (hgb. koncentráció és htk.), részben az áramlási sebességtől függ. A magasabb hematokrit nagyobb oxigénszállító kapacitással jár, de a nagy viszkozitás miatt az áramlási sebesség csökken és az oxigén csere is csak korlátozott lehet. Az alacsony hematokrit, bár kisebb oxigén transzport kapacitással társul, a kis viszkozitás miatt nagy áramlási sebességet tesz lehetővé és emiatt az oxigén csere is javul. Az optimális hematokritot ezeknek a tényezőknek a figyelembevételével lehet meghatározni. Ha csak a fiziko-kémiai tényezőket vennénk figyelembe, akkor az optimális hematokrit érték 0,30 lenne. Minthogy az áramlási sebesség és az oxigenizáció között egyenes, a viszkozitás és az oxigénszállítás között azonban exponenciális az öszefüggés az optimális hematokrit 0,36-0,38 között van. Ez az elméleti és kísérletesen igazolt megfontolás a különböző típusú hemodilutios kezelések szempontjából fontos.
15
A stroke rheológiája 1. A vérviszkozitás emelkedése az ischaemias cerebrovascularis betegségek kockázati tényezője. Epidemiológiai vizsgálatok igazolták, hogy a hematokrit emelkedése növeli a stroke kockázatát. Burge azt találta, hogy a polycythaemia rubra verában szenvedő betegek mortalitása hatszoros az átlag populációhoz képest (Burge P.S. 1995). A Framingham Study-ból kiderült, hogy amennyiben a férfiak hemoglobin koncentrációja 15 g%, a nőké 14 g% felett volt, az agyi infarktus kockázata a kétszeresére nőtt (Kannel W.B. 1972). Figyelemre méltó, hogy ebben az esetben nem kóros laboratóriumi értékekről volt szó, hanem már a normális tartomány felső határzónájába eső értékek is rizikófaktoroknak minősültek. Ugyanebben a tanulmányból derült ki, hogy a relatíve magas hemoglobin érték a mortalitás háromszoros kockázat növekedésével társul. Thogi experimentális vizsgálataiban 46%-nál nagyobb hematokrit érték esetén a cerebralis infarktus nagyságának szignifikáns emelkedését figyelte meg az ez alatti htk. értékekkel rendelkező kontrollokkal szemben (Tohgi H. 1977). 2. Cerebrovascularis betegségekben gyakoriak a kóros rheológiai viszonyok Számos klinikai vizsgálat igazolja, hogy a betegek több mint felében egy vagy több rheológiai paraméter kóros. A TVV, PV és a vvs. aggregábilitása stroke betegekben magasabb, a vvs. deformabilitás pedig alacsonyabb értékű a kontrollokhoz viszonyítva. 3. A haemorheológiai eltérés arányos a cerebrovascularis betegség súlyosságával, kimenetelét kedvezőtlenül befolvásolja. Főleg idősebb, arterioscleroticus egyénekben a viszkozitás emelkedése - heveny cerebrovascularis insufficientia nélkül is - sajátságos tünetegyüttest eredményez: a beteg fáradtságról, bágyadtságról, fejfájásról, nehézkes gondolkozásról, figyelemzavarról panaszkodik. Fejében és mellkasában nyomást érez, az a benyomása, mintha állandóan nagy terhet cipelne a hátán. Fahey ezt a panasz együttest hyperviscositas syndromának nevezte el (Fahey J.L. 1965). Psychometriai mérésekkel is igazolták, hogy a vérviszkozitás emelkedése a mentális funkciók romlásával jár. Shundt és Pollock állatkísérletben igazolta, hogy a hematokrit mértéke és az infarktus térfogata között egyenes arányosság áll fenn (Shundt J.R. 1967, Pollock S. 1982). Hasonló eredményt közölt Harrison is aki acut stroke-betegekben a hematokrit érték és a cerebralis infarktus CT -vel meghatározott nagysága között pozitív összefüggést mutatott ki (Harrison N.J.G 1981). Lowe, valamint hazai vizsgálattal Csornai is azt találta, hogy akut stroke-ban a magas hematokrit kedvezőtlen prognosztikai tényező, a letalitást növeli (Lowe G.D.O. 1983, Csornai M. 1987). Sakai az agyi keringésre vonatkozó 16
megfigyeléseket SPECT vizsgálatokkal is alátámasztotta (Sakai F. 1989). 4. Az ischaemias stroke betegek rheológiai viszonyainak javítása. Thomas
igazolta,
hogy
a
polycythaemiaban
a
csökkent
agyi
vérátáramlás
hemodilutioval javítható (Thomas D.J. 1977). A hiperviszkozitás syndromában szenvedő betegek rossz mentális funkcióit a hemodilutio szignifikánsan javította. A polycythaemias,
heveny
stroke
betegek
isovolaemias
vagy
hypervolaemias
hemodilutios kezelésével kapcsolatban több kedvező tapasztalatot közöltek, a betegek javulását a rheológiai viszonyok rendezésével hozták kapcsolatba. Ugyanakkor akut ischaemias stroke esetén a rutinszerűen alkalmazott hypervolemias és izovolémiás hemodilutios kezelés eredményességére nincs evidence based szintű bizonyíték. Bizonyos alcsoportokban az akutan elvégzett izovolemias hemodilutio kedvező hatású a mortalitásra és a mélyvénás thrombosis kialakulásának megelőzésére (PVR, 0,50 feletti htk.-al járó secunder polyglobulia exsiccosis nélkül). A
vér
viszkozitásának
emelkedése
az
adott
szerv
globális
és
lokális
keringéscsökkenését eredményezi. A keringő vér ex vivo, low shear, medium és high shear körülmények között, műszeresen mérhető viszkozitás emelkedése feltételezi, hogy a keringési rendszer különböző nyírási rátával jellemezhető területein in vivo sem áramlik másképp, jóllehet bizonyos kompenzáló mechanizmusok változtathatják a lokális értékeket (pl. Fahreus-Lindquist effectus). Magasabb htk. tartományokban (0,48-0,55) azonban ez a kompenzáló mechanizmus is kimerül, a kóros irányba történő hemorheológiai változások kóros hemodinamikai változásokkal járnak együtt.
A
hemodinamikai viszonyok arterioscleroticus folyamatok társulása esetén jelentős befolyással bírnak az agytörzsi keringésre (Nagy Z. 1993). Az agytörzsi lokalizációjú stroke-ok 80%-ban isémias eredetüek (Bamford J. 1991). Az eddigi agyi vérkeringéssel és vérviszkozitással foglalkozó munkák döntően a supratentorialis érrendszeri tüneteket mutató kórformákat elemezték, ennek a rendszernek azonban az angio-architectonikája jelentősen különbözik az agytörzsi-posterior érrendszerétől. Az utóbbiban a fentieken kívül a cerebralis autoregulatioban, valamint a kollateralis hálózatban mutatkoznak lényeges különbségek, az erek között sok a végarteriás jellegű és a carotis vertebrobasilaris anastomosis-rendszer működése is különböző fejlettségű. A fentiek miatt célunk volt annak vizsgálata, hogy a tartósan fennálló vér-hiperviszkozitás mutat e összefüggést a hátsó skálai szubklinikusan regisztrálható eltérésekkel, ezért
az
agytörzsi lokalizációjú, ischaemias eredetü stroke betegek kivizsgálása alkalmával
17
rendszeresen végeztünk agytörzsi akusztikus kiváltott válasz (BAEP), valamint egyidőben, párhuzamosan klinikai haemorheológiai vizsgálatokat is. 1. 9. Trombocita aggregáció gátlás szerepe az ischaemias eredetű stroke másodlagos megelőzésében Az ischaemias stroke másodlagos profilaxisában egyértelműen bizonyított szerepe van a trombocita aggregáció gátló gyógyszeres kezelés hatásosságának, melyet nagy multicentrikus vizsgálatok eredményei igazolnak és a fentiek alapján rendszeres alkalmazásukat nemzetközi ajánlások is megfogalmazzák (Antiplatelet Trialists’ Collaboration 1994, Antithrombotic Trialists’ Collaboration 2002, Sacco R.L. 2006). A kezeléssel 20-25%-os relatív rizikócsökkenést lehet elérni. A fenti témában összefoglaló referátum formájában az elmúlt évben amerikai szakértői folyóiratban számoltunk be (Pongracz E., 2005). A kezelés javallatai amerikai és európai ajánlásokban fogalmazódtak meg, hazánkban az európai ajánlás (EUSI) alapján a Magyar Stroke Társaság javaslatai a mérvadók (A Magyar Stroke Társaság és a Neurológiai Szakmai Kollégium szakmai irányelvei 2004). A mindennapi klinikai gyakorlatban ugyanakkor a gyógyszeres trombocita aggregáció gátlás hatékonyságának rutinszerű, laboratóriumi mérésére még nincs ajánlás. Kórházunkban 2000 óta végezzük az aggregometriás vizsgálatokat stroke betegekben és csatlakoztunk ahhoz az öt magyarországi vizsgálóhelyhez ahol szintén a CARAT TX (Budapest) 4 csatornás, computerizált, sorozatmérésre alkalmas aggregométert használtak és mérési adataikat rendelkezésre bocsájtották, ezáltal a vizsgálóhelyek adatai összehasonlíthatók voltak. A fenti központokon kívül még öt centrumban vizsgálják rutinszerűen a trombocita aggregációt, ezek adatai azonban nem álltak rendelkezésre. Az aggregációs induktorok egy gyártótól származnak, koncentrációjuk fix dózisú. A vizsgálat a különböző induktorok okozta
trombocita szuszpenzió, Born által kidolgozott fényáteresztő
képesség változásának mérésén alapul, mely jelenleg világszerte a „gold standard” (Born G.V.R. 1962). Az eddigi klinikai vizsgálatok a trombocita gátló gyógyszerek 1) hatékonyságának megítélésére kizárólag klinikai végpontokat alkalmaztak, 2) főleg dózis-keresést végeztek, 3) nem történtek laboratóriumi vizsgálatok, melyek a rezisztencia kérdésében tisztították volna a beteganyagot.
18
2.
CÉLKITŰZÉSEK
2. 1. Genetikai vizsgálatok Vizsgálatainkat, melyek a genetikai polimorfizmusok kedvezőtlen és esetleges kedvező alléljainak kimutatására vonatkoztak, 10 évvel ezelőtt kezdtük, hazánkban elsők között. 1) A rendelkezésre álló külföldi irodalmi adatok elemzése alapján célunk volt annak megállapítása, hogy az általunk vizsgált, kaukázusi egyénekben (középmagyarországi kohorsz, Budapest-Kecskemét)
az adott polimorfizmus frekvenciája
különbözik e a más populációkban regisztrált előfordulási gyakoriságoktól. A hazai egészséges
kontroll
személyek
allélfrekvenciáit
vetettük
össze
a
külföldi
egészségesekkel. 2) Vizsgáltuk az ischaemias stroke alcsoportok polimorfizmus gyakoriságát, összehasonlítva a hasonló külföldi alcsoportokkal. A polimorfizmusok relatív kockázatát eset-kontroll vizsgálatok eredményeivel becsültük meg. 3) Egyes ritkább polimorfizmusok esetén külön vizsgáltuk az allélfrekvenciát 50 év alatti, fiatal stroke betegekben és 50 év feletti betegcsoportban is. A vizsgált genetikai polimorfizmusokat úgy választottuk ki, hogy reprezentálják a véralvadás egyes lépéseit (PLA2 a trombocita GP IIb/IIIa receptoron az elsődleges hemosztázis részéről, a Leiden mutáció, a protrombin gén G20210A, valamint a FIB -455 G/A polimorfizmus
a
másodlagos
hemosztázis részéről),
valamint
a
trombotikus
folyamatokban aktívan résztvevő endothel részéről az ACE I/D, valamint az MTHFR különböző variánsainak előfordulását. Utóbbi években figyelmünk a lipid anyagcsere egyik érvédő faktorának (HDL koleszterin) genetikai polimorfizmusára is ráirányult (ABCA1). 4) Vizsgálataink további részében - immár csak a betegcsoportokat vizsgálva - arra voltunk kíváncsiak, hogy mutatkoztak e statisztikailag is mérhető különbségek a vad alléllal rendelkező betegcsoport és a hetero vagy homozigóta variánssal rendelkező betegcsoportok között egyrészt a betegek családi anamnesiseben előforduló stroke, másrészt a betegek egyéni vascularis jelentőségű rizikófaktorainak vagy betegségének gyakoriságát illetően. Vizsgálatainkat kiterjesztettük a fiatal és idősebb (>50 év) betegcsoportokra is. A betegek adatainak regisztrálása során figyelmet fordítottunk a képalkotó
vizsgálatok
(CT/MRI),
valamint
19
a
laboratóriumi
(hemosztázis
és
haemorheológiai) mérések eredményeire is, melyek összefüggéseit kerestük az allélok illetve genotípusok gyakoriságának előfordulásával a különböző csoportokban. Ismeretes, hogy bizonyos genetikai polimorfizmusok alacsony frekvenciával fordulnak elő [protrombin gén 20210A (2-4%), Leiden mutáció (4-7%)], ezért ezekben az esetekben az allélfrekvenciát vizsgáltuk, más esetekben, amikor a hetero és homozigóta csoportok elég nagy számúak voltak (GP IIb/IIIa PLA2, MTHFR, FIB -455 gén) a vad alléllal szemben vizsgáltuk külön külön a genotípusok gyakoriságát is. 5) Az évek során a betegszám emelésével (400-500 közötti) lehetőség mutatkozott a betegcsoportban és a kontrollokban egyidejűleg több polimorfizmus kapcsolatának vizsgálatára is (genetikai cluster). 2. 1. 1. A protrombin gén G20210A polimorfizmusának vizsgálata A hazai fiatalkori magas vascularis morbiditás miatt célunk volt megvizsgálni, hogy elsősorban a fiatal, 50 év alatti stroke betegeknél milyen százalékban van jelen a 20210A variáns. Ezért vizsgáltuk meg az adott korcsoportban, három neurológiai-stroke osztály 50 év alatti ischaemias stroke betegeinél az említett mutációt és az adatokat kontroll személyek vizsgálati adataival hasonlítottuk össze. Elemeztük továbbá a protrombin gén polimorfizmus gyakoriságát magas és alacsony hagyományos vascularis rizikóval rendelkező csoportokban is. 2. 1. 2. Az ACE gén insertios/deletios (I/D) polimorfizmusa A vizsgálataink célja volt kimutatni, hogy: 1) van e különbség a hazai, egészséges kontroll csoportban található I/I, I/D és D/D genotípus
megoszlása
és
gyakorisága,
valamint
a
különböző
országokban,
egészségesekben kimutatható genotípus megoszlás és gyakoriság között, 2) van e különbség a magyarországi kontroll csoportnál és az ischaemias stroke betegeknél talált genotípus szerinti gyakoriság között, 3) van- e összefüggés a betegek családi anamnesisében a hagyományos rizikófaktorok, a vascularis betegségek valamelyike és a betegek pathológiás allélformái között,
20
4) mutatkozik e kapcsolat a betegek hagyományos, egyéni vascularis rizikófaktorai és a különböző genotípusai között, valamint 5) van-e összefüggés a D allél és a betegcsoport vizsgálati leleteiben kimutatható kóros elváltozások, vagy értékek között (CDS, CT, haemorheológiai laboratóriumi értékek).
2. 1. 3. A trombocita GP IIb/IIIa receptor (Leu33Pro) polimorfizmusa A trombocita GP IIb/IIIa (Leu33Pro) esetleges klinikai szerepét megítélendő, klinikai vizsgálatokat kezdtünk annak érdekében, hogy meghatározzuk: 1)
Magyarországon egészséges kontroll csoportban milyen a GP IIIa (Leu33Pro)
prevalenciája és ez jelent e gyakoriságbeli változást a külföldi irodalomban szereplő előfordulásbeli adatokkal, 2)
Milyen gyakorisággal fordul elő stroke betegekben a polimorfizmus közép
magyarországi beteganyagban, 3)
Az ischaemias stroke betegekben milyen a megoszlás az 50 év alatti és feletti
korcsoportban, 4)
Mutat e összefüggést a heterozigóta PLA1/PLA2 és
homozigóta PLA2/A2
genotípus a stroke betegek -
családi anamnesisében előforduló vascularis eseményekkel és
-
a betegek egyéni, hagyományos rizikófaktoraival.
5)
A GP IIb/IIIa receptor és azon belül a fenti bázis-aminosavcserét mutató GP IIIa
rész funkcionális reakcióját kívántuk megvizsgálni ischaemias stroke betegekből nyert vérmintákban ex vivo rendszerben különböző induktorok alkalmazásával mind teljes vérben, mind PRP-ben aggregációs és flow cytometriás módszerekkel. 2. 1. 4. Az V véralvadási faktor (Leiden) mutációjának vizsgálata Vizsgálatokat kezdtünk annak érdekében, hogy meghatározzuk: 1) egészséges, kontroll csoportban milyen a Leiden mutáció prevalenciája, 2) milyen gyakorisággal fordul elő isémiás stroke betegekben a polimorfizmus, 3) milyen a megoszlás az 50 év alatti és feletti betegek korcsoportjában, 4) mutat-e összefüggést a mutáció hordozása a stroke betegek családi anamnesisében előforduló vascularis eseményekkel, a betegek egyéni
21
vascularis anamnézisével. A Leiden mutáció és a haemorheológiai paraméterek összefüggésének vizsgálatára is kísérletet tettünk.
2. 1. 5. Az ABCA1 polimorfizmus R219K és V771M vizsgálata
Vizsgálatunk célja az volt, hogy kimutassunk lehetséges összefüggéseket az ABCA1 három vizsgált kódoló szekvencia variánsai és a koronária betegségek, a lipid paraméterek, valamint - elsőként az irodalomban - ischaemias stroke betegség között. 2. 1. 6. Összesített betegvizsgálatok, genetikai polimorfizmusok halmozódásai Az utóbbi években a pályázatok során elnyert anyagi támogatás a genetikai vizsgálatok esetszámának folyamatos növelését tette lehetővé. 1)
További
matematikai-statisztikai
módszerek
alkalmazásával
célunk
volt
megvizsgálni, hogy a fenti genetikai polimorfizmusok - ebben a nagyobb kohorszban (n=433) - önmagukban jelentenek e rizikónövekedést a kontroll személyekkel szemben, 2) melyek azok a kettős polimorfizmus előfordulások, amelyek kedvezőtlenül befolyásolhatják a stroke kockázatát a kontrollokkal szemben, 3) vizsgáltuk a fentieket külön fiatalabb (<50 éves) betegcsoportban, valamint a hetero és homozigóta variánsokat a családi vascularis betegségek, az egyéni rizikófaktorok és esetleges laboratóriumi értékekkel összefüggésben. 2. 2. Haemorheológiai vizsgálatok krónikus stádiumban lévő ischaemias stroke betegekben különös tekintettel a hátsóskálai mikrokeringésre 2. 2. 1. BAEP vizsgálatok hiperviszkozitással járó agytörzsi keringési zavarban szenvedő betegekben Prospektív vizsgálataink célja volt annak kimutatása, hogy: 1) Az ischaemiás eredetű, agytörzsi keringészavarban szenvedő betegek BAEP mintáit befolyásolja-e a vér hyperviszkozitása, 2) Az ischaemias agytörzsi károsodásoknál észlelhető BAEP minták mutatnak e csoportokba rendezhető jellegzetességeket, ha a kórfolyamat hátterében egyidejűleg a vér hyperviszkozitása is kimutatható,
22
3) Hyperviszkozitással jellemezhető, neurológiailag panasz és tünetmentes betegcsoportban vannak e jellegzetes BAEP minták. 2. 2. 2. A fibrinogén gén -455 G/A variáns, a Leiden mutáció és a vérviszkozitás kapcsolata Ismeretes, hogy a plazma fibrinogén koncentráció 3,5 g/l fölé történő emelkedésének kettős következménye van: 1) önmagában fokozott trombózis készséget jelent 2) emeli a plazma viszkozitását és ezzel együtt a teljesvér viszkozitását is. A fenti állapot gyakori akut fázis reakcióként, de ha ennek lezajlása után is fennáll, a vascularis folyamatok önálló és független rizikófaktoraként definiálható (Szirmai I. 1993). A FIB plazma koncentrációját befolyásolják genetikai és külső tényezők is. A külsők közül legfontosabb a dohányzás (IL-6 fokozott elválasztása a tüdőben), ezért a vizsgálatok során a plazma FIB koncentráció külön vizsgálandó dohányzó és nem dohányzó betegcsoportokban. A FIB gén -455A allél esetén különböző szerzők (Nishiuma S. 1997, Tybjaerg-Hansen A, 1998) magasabb plazma FIB koncentrációt találtak, ugyanakkor mások ezt nem látják bizonyítottnak (Carter AM. 1996, Folsom AR. 2001). A Leiden mutáció részvétele a protrombotikus folyamatokban tisztázott. Mind a FIB, mind a Leiden mutáció aktív résztvevője a véralvadási folyamatoknak. Nem találtunk viszont közlést a két genetikai polimorfizmus és a makro-rheologiai paraméterek kapcsolatáról. Célunk volt annak vizsgálata, hogy: 1) megállapítsuk a két polimorfizmus gyakoriságát egészségesekben és ischaemias stroke betegek csoportjában, 2) a makro-rheológiai paramétereket (plazma FIB koncentráció, teljesvér és plazma viszkozitás) a β-FIB (-455G/A) gén polimorfizmus, valamint a Leiden mutáció különböző genotípusai szerint ischaemias stroke betegekben, 50 év alatti fiatal betegcsoportban és nem dohányzó alcsoportokban.
2. 3. Trombocita aggregáció vizsgálata cerebrovascularis betegekben A trombocita aggregáció gátlás az ischaemias stroke secunder profilaxisában evidencia. A különböző gyógyszerek különböző utakon képesek a trombocita adheziójának és aggregációs képességének csökkentésére. Mindennapi klinikai gyakorlat, hogy a
23
betegek
egy
részében
az
alkalmazott
gyógyszeres
kezelésre
non-reszponzió
(rezisztencia) jelentkezik, mely fogalmat két összefüggésben használjuk: 1) klinikai: amennyiben az adott gyógyszer szedése mellett újabb klinikai esemény (stroke) követezik be, vagy 2) laboratóriumi: az ex vivo vérminták laboratóriumi módszerekkel történő mérése alkalmával nem sikerül hatásos farmakodinámiás hatást (aggregáció gátlást) regisztrálni. Vizsgálataink a laboratóriumi módszer standardizálására, a különböző trombocita gátló gyógyszerek
laboratóriumi
rezisztencia,
vagy
non-reszponzió
előfordulás
gyakoriságának megfigyelésére, valamint a mortalitási vizsgálatokra koncentráltak laboratóriumilag rezisztens betegek esetében. Feladatnak tűztük ki a különböző gyógyszerek
laboratóriumilag
igazolható
algoritmusok kidolgozását is.
24
rezisztenciája
esetén
újabb
kezelési
3. MÓDSZEREK 3. 1. A vizsgálatokba bevont betegek és kontroll személyek Általános szempontok a genetikai vizsgálatok során vizsgált kontroll csoport és betegcsoport kiválasztása során: A genetikai vizsgálatok alkalmával a kontroll csoportot részben az Országos Hematológiai Intézetben véradásra megjelent egészséges egyének képezték, akiknél a vérvételek
kapcsán
DNS
vizsgálatra
történt
vérminta
elkülönítés,
a
DNS
preparátumokat -70 °C-on tároltuk, a véradók a vizsgálatok elvégzésébe írásban beleegyeztek. A vizsgálatokat az OHII etikai bizottsága engedélyezte. A genetikai vizsgálatok másik részét egészséges egyéneknél a budapesti H-Med Diagnosztika Kft. végezte. A két laboratóriumban azonos metodikával történt a polimorfizmusok analízise és az eredmények egyezőségét próbaszerűen 100 beteg vérmintáiban úgy állapítottuk meg, hogy párhuzamos vizsgálatokat végeztünk. Mind a 100 esetben a két vizsgálóhely azonos vizsgálati leletet adott. Az egészséges egyének átlagos életkora fiatalabb volt, mint a teljes betegpopulációé és hasonló az 50 év alatti beteg kohorsz életkorához. Felvetődött, hogy az idősebb betegekben a kedvezőtlen genetikai polimorfizmusok már kisebb számban fordulhatnak elő a szelektálódás miatt. Ugyanakkor ez nem igazolódott, a nagy metaanalízisek, valamint az általunk elvégzett öt éves időtartamban történt követéses vizsgálatok (nincs közölve) is kimutatták, hogy a polimorfizmusok nem rendelkeznek
a
mortalitásra
olyan
nagy
jelentőséggel,
melyek
önmagukban
befolyásolnák a polimorfizmusok számának drasztikus megváltozását az idősebbek csoportjában. Azt a betegcsoportot, akik a betegségük kezdetén 50 éves kor alattiak voltak „A” csoportnak a többieket „B” csoportnak jelöltük. Annak érdekében, hogy a betegek számát a fiatal (<50 év) és idősebb betegcsoportban közel azonos mennyiségre hozzuk, a betegek vizsgálatba történő bevonását az idősebb betegcsoportban hamarabb állítottuk le. Kezdetben még beválasztottuk a SAV, az ICV kórformákat és a sinus thrombosist is kisebb számban (1. táblázat ACE gén és PLA2 vizsgálatok), de a vizsgálati lehetőségeink bővülésével a betegcsoport homogenizálására törekedve már a vérzéses kórformákat és a sinus thrombosist kizártuk, csak ischaemias eredetű stroke képezte a vizsgálataink alapját a TOAST ajánlásai alapján. A stroke betegségben a hagyományos alcsoportok meghatározására különböző felosztások ismeretesek, melyek
25
szerint a kórokok a betegek kora alapján is különbözők lehetnek. Fiatal betegekben gyakoribb a cardiogen embóliás mechanizmus, a kor előrehaladtával pedig az atherothrombosis szerepe kerül előtérbe. Vizsgálatunk során arra voltunk kíváncsiak, hogy a kis és közepes artériás rendszer trombotikus folyamataiban milyen arányban fordulnak elő ezek a polimorfizmusok a vad és a kóros alléllal rendelkező betegcsoportokban, ezért a betegek beválasztása elsősorban a nagy és kis artériás rendszer okozta ischaemias stroke folyamatokra koncentrálódott, mely megfelel a TOAST felosztásnak (Trial of ORG 10172 in Acute Stroke (TOAST) JAMA 1998). Csak így lehetett elérni, hogy az A és B csoportban a stroke pathomechanizmusát illetően ne legyen szignifikáns különbség a betegek között. Ha a klasszikus fiatal-idős betegcsoportot a hagyományos stroke pathomechanizmus szerint gyűjtöttük volna, nagyon hosszú időbe tellett volna annak elérése, hogy az alcsoportok között ne legyen szignifikáns különbség. A GP IIb/IIIa vizsgálatok ETT támogatásban is részesültek (ETT 27/1996.). Tekintettel arra, hogy a vizsgálatok nemcsak a véralvadási-genetika területét ölelték fel, hanem a klinikai haemorheológiát is, a különböző vizsgálatokba beválasztott kontrollok és betegek alapadatait a könnyebb áttekinthetőség érdekében összevontan, külön táblázatban tüntettük fel (1. táblázat). 1. táblázat
3. 1. 1. A protrombin gén G20210A vizsgálata során A prothrombin gén az átlag populációban alacsony prevalenciával fordul elő. Eddig döntően fiatalok vizsgálatáról voltak adatok. Vizsgálatainkba közép-magyarországi központok (Budapest-Kecskemét) által gyűjtött fiatal betegek (átlagos életkor 40±10 év) kerültek, akik nem álltak rokoni kapcsolatban egymással. A protrombin gén vizsgálatokat technikai lehetőség hiányában (H-MED Diagnosztika Kft. megszűnése) csak 101 betegben tudtuk elvégezni. 3. 1. 2. Az ACE gén I/D vizsgálata során A vizsgált személyeket két csoportra osztottuk.
A kontroll csoportot az Országos
Hematológiai és Immunológiai Intézetben véradásra jelentkezett személyek közül azok 26
alkották, akiknél fizikális vizsgálattal kóros belgyógyászati eltérést nem találtunk, vérnyomás értékeik 140/80 Hgmm alatt voltak, véradásra alkalmasak voltak, gyógyszeres kezelésben nem részesültek, panaszmentesek voltak, egymással rokoni kapcsolatban nem álltak és a vizsgálatba írásban beleegyeztek. A kontroll csoportot egyéb szempontok (családi betegségek, rizikófaktorok stb.) alapján nem dolgoztuk fel, a betegcsoporttal ilyen összehasonlítást nem tettünk, így a két csoport vizsgálatakor csak korra és nemre korrigált logaritmikus regresszió-analízist végeztünk, a genetikai pontmutáció előfordulásának meghatározása céljából. A betegcsoportot kórházi kezelésben részesült stroke betegek képezték, akik kivizsgálása a már ismert központokban történt. A beválasztott betegek aktív kezelés után a 4-ik héttől kerültek genetikai vizsgálatra. A betegek családi anamnesisében előforduló vascularis betegségek és egyéni rizikófaktorok megismerése céljából a már említett kérdőívet alkalmaztuk. Kezdeti vizsgálataink során a vérzéses kórformákat még nem választottuk le az ischaemiásaktól, így ezek is feldolgozásra kerültek. Későbbiekben már kizártuk ezeket a kórformákat. 3. 1. 3. A trombocita GP IIb/IIIa polimorfizmus vizsgálata során A kontroll csoportot szintén az Országos Hematológiai és Vértranszfúziós Intézetben véradásra jelentkezett személyek közül azok alkották, akiknél fizikális vizsgálattal kóros eltérés nem volt, vérnyomás és rutin laboratóriumi vizsgálati értékeiket tekintve véradásra alkalmasak voltak, gyógyszeres kezelésben nem részesültek, panaszmentesek voltak, egymással rokoni kapcsolatban nem álltak és a vizsgálatba írásban beleegyeztek. A betegcsoportot kórházi kezelésben részesült stroke betegek képezték, akik kivizsgálása a különböző stroke központokban egységesen, az elfogadott kivizsgálási protokoll szerint történt (Magyar Stroke Társaság javaslatai). A beválasztott betegek aktív kezelés után a 4-ik héttől kerültek genetikai vizsgálatra, az akut fázis reakciók (leukocita, fibrinogén, trombomodulin stb.) lezajlása után. A betegek családi anamnesisének megismerése céljából ez előzőekben leírt kérdőívet használtuk. A betegek egyéni kórelőzményében és vizsgálata alkalmával kimutatható vascularis jelentőségű rizikófaktorokat szintén vizsgáltuk a már fentiekben részletezett kérdőívek segítségével.
27
Az ex vivo GP IIb/IIIa vizsgálatok alkalmával prospektív módon 105 ischaemias stroke beteg került kivizsgálásra akiknek a véréből ( PRP és teljes vér) történtek a vizsgálatok. 51 beteg rendelkezett PL
A1/A1
azaz vad genotípussal, 54 beteg pedig PL
A1/A2
genotípussal. A két csoport között nem volt szignifikáns különbség a hagyományos rizikófaktorokat illetően.
3. 1. 4. A Leiden mutáció vizsgálata során
A vizsgált személyeket két csoportra osztottuk. 1) a kontroll csoportot véradásra jelentkezett személyek közül választottuk ki. 2) a betegcsoportot kórházi kezelésben részesült stroke betegek képezték. A beválasztott betegek a 4-ik héttől kerültek genetikai vizsgálatra. A vizsgált csoportba isémias stroke betegek kerültek (in situ trombózis, arterio-arterialis trombózis, cardiogen embolias mechanizmus). Kizártuk az intracerebrális és subarachnoidealis vérzésben szenvedőket. Nem vizsgáltunk sinus trombózisban szenvedő betegeket sem. A betegek családi és egyéni rizikóelemzését a szokásos kérdőívekkel és a kórrajzok egységes szempontok alapján történő feldolgozásával végeztük. Irodalmi adatokat gyűjtöttünk különböző populációkban az egészségesek körében történő előfordulási gyakoriságot illetően. 3. 1. 5. Az ABCA1 genetikai polimorfizmus vizsgálata során Kontroll csoport: n=193, ismételt véradó személy (2-5 x véradók), akik orvosi vizsgálaton vettek részt a véradás előtt abból a célból, hogy kiszűrjük azokat az egyéneket, akiknek az egyéni kórelőzményében komolyabb betegség szerepel, mint pl. malignus betegségek, gyulladásos megbetegedések, szívkoszorú ér megbetegedés, vagy TIA/stroke. Stroke beteg csoport: n=244, egymással rokoni kapcsolatban nem álló beteg került be a prospektív vizsgálatba, akik ischaemias stroke-ban szenvedtek, a vizsgálat időtartama 1998 január 1 és 1999 november 30 között volt. Az ischaemias stroke bizonyítása CT vizsgálattal történt. Az agyi ischaemias folyamat súlyossága a következő megoszlást mutatta TIA (n=78), PRIND (n=123) valamint CS (n=43). A rizikófaktorok
28
gyakoriságai a következők voltak: hypertonia: 49,6% (121/244), diabetes: 12,3% (30/244), dohányzás: 53,5% (122/228) és fokozott alkohol felvétel: 19,7% (45/228). Koronária beteg csoport: A másik beteg csoportot 150 koronária szűkületben szenvedő beteg képezte, akik 1998. szeptember 1. és 1999. október 30. között kerültek beválasztásra. A koronária betegek közül 99 szenvedett angina pectorisban 51 pedig acut myocardiális infarktusban. A koronária angiográfia minden betegnél megtörtént. 3. 1. 6. BAEP és hemorheológiai vizsgálatok A vizsgált egyéneket négy csoportba osztottuk, úgymint: 1. Csoport (kontroll: N = 45). Ebbe a csoportba tartoztak a szürővizsgálatokkal vizsgált egészségesek, akiknek hallásuk ép volt, panaszmentesek voltak, neurológiai szakvizsgálattal tünetek nem voltak regisztrálhatók és hemorheológiai vizsgálataik eredményei a normális laboratóriumi tartományon belül voltak. 2. Csoport (agytörzsi ischaemias stroke betegek: N = 23). Ezeknél CT/MRI vizsgálat történt, mely az agytörzsben infarktus tüneteit (CT-n hipodenzitás, MRI-n T1en hiperintenzitás) mutatta, ugyanakkor a rheológiai vizsgálatok eredményei negatívak voltak. 3. Csoport (agytörzsi ischaemias stroke betegek: N = 24). Ezeknél a betegeknél a képalkotó eljárásokkal a klinikai tünetek mellett a morfológiai tünetek is bizonyíthatóak voltak különböző lokalizációban, ugyanakkor hyperviszkozitás is társult, mind a teljesvér, mind a plazma részéről. 4. Csoport (hyperviszkozitásos betegcsoport: N = 26), akik neurológiai szempontból
panasz
és
tünetmentesek
voltak,
belgyógyászati
hematológiai
szakambulanciánkról kiemelt betegek, akik közül 5 esetben polycythaemia vera és 21 esetben secundaer polyglobulia fordult elő és rheológiai vizsgálatokkal mind a teljesvérben, mind a plazmában hiperviszkozitás volt bizonyítható (high risk csoport). 3. 1. 7. A FIB -455G/A és Leiden mutációval rendelkező betegekben történt viszkozitás vizsgálatok során A genetikai vizsgálatok 173 kontroll, egészséges és egymással rokoni kapcsolatban nem álló személy vérmintáiban történtek. Meghatározásra került mind a FIB -455 G/A polimorfizmus, mind a Leiden mutáció frekvenciája. Az ischaemias stroke beteg 29
csoportot 248 egyén alkotta. Náluk is megtörtént a genetikai vizsgálat, valamint a vér és plazmaviszkozitás vizsgálatokat is minden betegnél elvégeztük. A kontroll csoportban nem végeztünk haemorheológiai vizsgálatokat, hanem a betegcsoport viszkozitási viszonyait a Magyar Haemorheológiai Társaság módszertani útmutatójában található normálértékekhez viszonyítottuk mely szerint a teljesvér viszkozitás értéke 90 s-1 sebességgradiens mellett mérve kisebb, mint 5,0 mPas, a plazma viszkozitás normál értéke kisebb, mint 1,35 mPas (Módszertani útmutató. Érbetegségek 200 3. 1. 8. A trombocita aggregációs vizsgálatokba bevont személyek 1) A mérési metodika standardizálására négy hazai központban, összesen 150, egészséges
egyén
vérmintáit
vizsgáltuk
trombocita
aggregációs
képesség
szempontjából. A vizsgált személyek fizikailag egészségesek voltak, nem szenvedtek betegségben, a csoport kórházi önkéntesekből állt. Kizártuk a dohányzókat, valamint bármilyen gyógyszert szedőket. A fix induktor dózisok (ADP 5 uM, ADP 10 uM, kollagén 2 µg/ml, adrenalin 10 µM) mellett mért aggregációs értékeket tekintettük a CARAT TX agregométer referencia tartományának. 2) A következőkben 555 ischaemias stroke betegben vizsgáltuk meg az alacsony adagú (100-350 mg/nap) ASA kezelés in vitro hatékonyságát, melyet kiegészítettünk a ticlopidint és clopidpogrelt szedő betegek vizsgálatával, így a betegek száma összesen 718-re emelkedett. A különböző antiaggregációs kezelések hatékonyságát és a laboratóriumi rezisztencia előfordulását vizsgáltuk a betegek csoportjaiban. 3) A továbbiakban összesen 921 ischaemias stroke és cardiovascularis beteg sorsát követtük
28
hónapon
keresztül.
Össz-mortalitásukat
Kaplan-Meier
görbék
alkalmazásával regisztráltuk. 3. 2. Genetikai vizsgálatok 3. 2. 1. A protrombin gén G20210A polimorfizmusának kimutatása A DNS izolálás 300μl alvadásgátolt, teljes vérből Wizard™ Genomic DNA Purification Kit segítségével (Promega) történt a gyártó utasítása szerint. A genetikai defektus kimutatására PCR és restrikciós emésztést alkalmaztunk (Poort SR. 1996). A DNS amplifikáció során használt primer egy bázisban eltért az egészséges szekvenciától, így ha jelen volt a 20210 G-A bázis-szubsztitúció a vizsgálandó DNS-ben, akkor a PCR
30
terméke egy 345 bázispár (bp) hosszúságú fragment. Az amplifikáció generálta restrikciós hely (AGRS) módszerének elve: az egyik primer egy bázispárnyi eltérése a 3’ véghez közel, a mutáns allél jelenléte esetén egy új Hind III hasítási helyet hoz létre a keletkezett PCR termékben. A fehérje jellemzője: az aminosav sorrend nem változik, ugyanakkor a pontmutáció jelenléte magasabb plazma prothrombin koncentrációval jár. Az allélfrekvenciát a következő módon számítottuk ki, p= m/2n, ahol p=az allélfrekvencia, 2n=a vizsgált egyének kromoszómaszáma és az m=a mutáns allélok száma. Standard error = √(p(1-p)/2n), 95%-os konfidencia intervallum ± (=2SE) mellett. 3. 2. 2. Az ACE gén I/D genetikai polimorfizmusának kimutatása A betegektől 5 ml, citráttal alvadásgátolt, cubitális vért vettünk melyből a genetikai vizsgálatokat két lépcsős vizsgálattal végeztük el PCR módszerrel, az eredményeket agar ELFO révén UV fényben tettük láthatóvá (Rigat B. 1991). Az ACE gén polimorfizmusai közül vizsgáltuk az I/I, I/D és a D/D genotípust. Az I/I a vad allél. Az egyik allélon 287 bp Alu szekvencia található a 16-os intronban, ez az (I) insertios allél. A D (deletio) jelöli a 287 bp szakasz hiányát.
3. 2. 3. A trombocita GP IIb/IIIa receptor Leu33Pro genetikai polimorfizmusának kimutatása A betegektől szintén 5 ml, citráttal alvadásgátolt, cubitális vér vettünk, melyből a genetikai vizsgálatokat két lépcsős vizsgálattal végeztük el (Weiss EJ, 1996 42). DNS extractio: ezt kisózásos módszerrel végeztük. A vérben a vörösvérsejtek hypozmotikus lízisét követően a fehérvérsejteket proteináz K-val emésztettük. A DNS-t ethanollal csaptuk ki. A pontmutáció kimutatása: PLAT1 5’-TTCTGATTGCTGGACTTC, PLAT2 5’TCTCTCCCCATGGCAAAG segítségével, PCR-el felsokszoroztuk a GP-III-t kódoló gén II exonját. A termék emésztése Mspl Ncil restrikciós enzimekkel történt. Ezt követően agaróz gél ELFO-t végeztünk majd a keletkezett DNS fragmentumokat etidium bromidos festés és UV révén tettük láthatóvá. A PLA2 allélból származó PCR termék egy-egy új hasítási
31
helyet tartalmaz. A genotípusok a keletkezett DNS fragmentumok nagysága alapján különíthetők el. 3. 2. 4. A Leiden mutáció kimutatásának módszere Az V. alvadási faktor genetikai polimorfizmusának vizsgálata a betegektől vett 5 ml, citráttal alvadásgátolt cubitális vérből történt Happich D. módszere szerint (Happich D. 1999). Első lépésben perifériás vér leukocitáiból DNS extractio történt, a vérben a vörösvérsejtek hypozmotikus lízisét követően a fehérvérsejteket proteináz K-val emésztettük. A DNS-t ethanollal csaptuk ki és 5μl került PCR vizsgálatra. A faktor V gén 10 exonja volt a target terület. Restrikciós endonuclease emésztés történt Bertina módszere szerint (Bertina RM. 1994). A PCR vizsgálati anyagot a Perkin Elmer (Foster City, CA) cég ajánlása szerint készítették elő, szintetizálták és tisztították TaqMan rendszerben.
Az eredményeket gél elektroforetikus megjelenítés során lehetett
leolvasni.
3. 2. 5. Az ABCA1 R219K, V771M és I883M allélok DNS-einek izolációja és kimutatása „LighCycler” hibridizációs technikával A DNS izolációt antikoagulált, perifériás vérből, standard „kisózásos” technikával végeztük. A következő ABCA1 szekvencia variánsok vizsgálata történt meg: R219K (exon 7, c.969A>G, Arg219→Lys szubsztitúciója); V771M (exon 16, c.2624G>A, Val771→Met szubsztitúciója); valamint I883M (exon 18, c.2962A>G, Ile883→Met szubsztitúciója). A három genotípus vizsgálatát a PCR-t követően hibridizációs próbák alkalmazásával, olvadáspont analízissel végeztük LightCycler készüléken (Roche Diagnostics). 3. 2. 6. A fibrinogén gén -455 G/A genetikai polimorfizmusának vizsgálata DNS kinyerése és preparálása történt teljes vérből a genotípus meghatározása céljából. A DNS kinyerésére a Miller és mtsai által közölt módszert használtuk (Miller SA. 1988). A ß-fibrinogén -455 G/A polimorfizmusának genetikai meghatározása során, a ß-fibrinogén gén
5'-szomszédos régiója és az első exonjának enzimatikus
32
amplifikációja történt PCR reakció és oligonukleotidok használata révén, mint ahogy azt Thomas és mtsai közölték (Thomas AE. 1994). A G-455 és az A-455 allélokat H1 és H2-nek neveztük a nemzetközi gyakorlat szerint.
3. 2. 7. Az MTHFR C677T gén polimorfizmusának kimutatása Sacchi és munkatársainak módszerét használtuk a polimorfizmus kimutatására (Sacchi E. 1997). 3. 3. Haemorheológiai és haemostaseologiai vizsgálati módszerek 3. 3. 1. Teljesvér és plazma viszkozitás mérésének módszere Teljesvér viszkozitás mérése: 10, 40 és 90 sec-1 sebességgradiensen, termostabilizált (37 Cº) HEVIMET - 40 (Hemorex Kft. Budapest) kapilláris viszkoziméterrel történtek a vizsgálatok.
Ugyanezzel a készülékkel mértük a plazma viszkozitását is 90 sec-1
sebességgradiensen (37 ºC). A teljesvér viszkozitását kórosnak vettük, ha 10 sec-1 nél magasabb volt, mint 8,5 mPas, 40 sec-1 nél magasabb, mint 5,5 mPas, és 90 sec-1 nél magasabb, mint 4,5 mPas. A plazma viszkozitást 1,35 mPas-nál magasabb értéknél tekintettük kórosnak. A hemorheológiai mérések metodikájára vonatkozóan utalunk Mátrai és mtsai (Mátrai A. 1987) a vizsgálatok normál tartományának meghatározását illetően korábbi vizsgálatainkra (Pongrácz E. 1989). A plazma fibrinogén koncentráció mérése. A betegektől reggel éhgyomorra 4,5 ml vért vettünk 3,8%-os nátrium citrát tartalmú Vacutainer csőbe. A fibrinogén koncentráció meghatározására a módosított Clauss féle módszert alkalmaztuk (Fibrinogen assay kit, Reanal, Budapest, Hungary).
3. 3. 2. A trombocia aggregáció mérésének módszere A trombocita aggregáció mértékét a CARAT TX 4, négycsatornás, számítógéppel vezérelt aggregométer segítségével határoztuk meg. A vizsgálathoz 10 ml 3,3 % Nacitrátos, 1:9 hígitású vénás vért használtunk. A vizsgálatot a vérvételt követően maximum két órán belül elvégeztük. Centrifugálásos minta előkészítést végeztünk. A trombocita dús plazmát (platelet rich plasma, PRP) 150 g-n 10 percig tartó centrifugálással, a trombocita szegény plazmát (platelet poor plasma, PPP) pedig 2000
33
g-n, 10 percig tartó centrifugálással nyertük. A PRP trombocita száma 250-350 G/l közöttire lett beállítva, a PPP vérlemezke száma pedig 10 G/l alatti kellett legyen. Az értékeket ABBOTT Cell Dyn 3200 típusú hematológiai automatával ellenőriztük. Reagensként a THERACONT TA-3 (CARAT Diagnosztika Kft.) induktor kitjét alkalmaztuk, amely 5 μM és 10 μM ADP, 2 μg/ml kollagén és 10 μM adrenalin koncentrációjú aggregáló oldatokat tartalmazott. A vizsgált rendszer összetétele: 0,45 ml PRP + 0,05 ml aggregáló oldat. A PPP a vizsgálat előtti kalibráláshoz szükséges. A mérések 37 Co-on történtek. A mérések elve a Born által leírt metodika volt (Born G.V.R. 1962). Száz százaléknak a PPP optikai sűrűségét, 0 %-nak a PRP optikai sűrűségét vettük. A kirajzolódó aggregációs görbe a trombocita dús plazma fényáteresztő képességének változását mutatja az alkalmazott fix induktor hatására bekövetkező trombocita aggregáció gátlás függvényében. Minél nagyobb az aggregáció mértéke, annál nagyobb az áteresztett fény mennyisége. A méréseket 8 percen át végeztük. Az eredményt relatív százalékban fejeztük ki. számítógépes
program
a
gyógyszer
hatására
lecsökkent
A készülékbe épített aggregációs
értéket
összehasonlítja a kezeletlen trombocitákon mért referencia értékekkel. Az egészséges egyénekből - akik semmiféle olyan gyógyszer nem szedtek, amelyek esetleg a thrombociták agregációját gátolták volna (n= 150) - vett vérminták nem gátolt aggregációjú trombocitáinak referencia értéke kollagén aggregáló ágens használata esetén 64-92 %, adrenalin indukálta TA esetén pedig 60-88 % volt. Az adott gyógyszer által elért hatásos (optimális) trombocita aggregáció gátlást állapítottunk meg, ha a mért TA érték 30 % alatti volt. Mérsékelt volt a gátlás, ha a mért érték 31 és 50 % közé esett. Hatástalannak értékeltük a gátlást, ha a trombocita aggregáció mértéke több mint 50 % volt. Ezek a relatív százalékok voltak érvényesek az ADP induktor alkalmazására is, amelyek a ticlopidin és clopidogrel hatásosságának mérését voltak hivatottak tükrözni.
3. 3. 3. A GP IIb/IIIa trombocita sejtfelszíni receptor ex vivo vizsgálata alkalmával a trombocita funkciók megítélésére több módszert is alkalmaztunk annak érdekében, hogy a heterozigóta tulajdonsággal rendelkező receptor működését minél alaposabban tisztázhassuk. Trombocita aggregáció mérése: Ingerman-Wojenski módszerét (Ingerman-Wojenski. 1999) használtuk a teljes vérben történő aggregációs vizsgálatokhoz, mely során
34
luciferin luciferáz jelenlétében ADP (5 µM), kollagén (5 µg/ml) és risztocetin (1,25 mg/ml) aggregáló ágenst használtunk. Jelen esetben az aggregométer a Chrono-Par (Chrono-Log) volt. Vizsgálatunk másik részében a trombocita aggregációt PRP-ben a klasszikus Born-féle módszerrel mértük (Chrono-Log Corp., USA). Az ATP release vizsgálataink során lumineszkáló reagenst adtunk a trombocitákhoz, mely ATP jelenlétében világít, így detektálható. Az aggregáció és szekréció együttesen a biológiailag aktív prosztaglandin intermedierek szintézisére utal. Flow cytometriás vizsgálatok: teljes vérben Michelson és mtsai szerint végeztük a méréseket (Michelson et al. 1996). A vért 1:9 arányban foszfát pufferrel (PBS) hígitottuk, 5000 trombocitán 0,62 mg/ml-es végső risztocetin koncentrációval, ezzel történt a preaktiváció, valamint a különböző glikoprotein receptor részeknek megfelelő antitestekkel. A CD 42b megfelel a GP Ib-nek, a CD41a megfelel a GP IIb/IIIa komplexnek, a CD 61 lényegében a GP IIIa rész, amelyen a genetikai polimorfizmus (Leu33Pro) található, valamint a CD 62P vizsgálatal történt, mely tulajdonképpen a P szelektin. Megvizsgáltuk a fentieket kötött fibrinogénnel is, miután ismert, hogy a GP IIb/IIIa komplex elsősorban a trombocita FIB kötő helye.
Flow cytometriás
vizsgálataink PRP-ben Mc Gregor és mtsai szerint történtek (Mc Gregor et al. 1983). A trombocitákat a fenti receptor részekkel szembeni antitestekkel jelöltük, melyekből 5000 darabot gyűjtöttünk mintánként. A vizsgálatok eredményei során az átlagos fluoreszcencia intenzitást valamint azoknak a sejteknek a számát adtuk meg %-ban, melyek a speciális antitestet expresszálják.
Egyéb vizsgálati módszerek: 3. 3. 4. Akusztikus agytörzsi kiváltott válasz (BAEP) Elektrofiziológiai vizsgálat (BAEP): Az ingerlés 80 db-es koppanó hangingerrel történt. Pozitív eredmény esetén 90 db-es ingerlést is végeztünk. Vertex - processus mastoideus elvezetést alkalmaztunk. A felvétel Sierra Cadwell készülékkel történt. 2000 egyedi választ átlagoltunk, kétszeri ismétléssel. Az egyes komponensek latenciáját és az I - III, III – V, valamint az I - V hullámok közötti latenciát mértük. Statisztikailag átlag, szórásérték meghatározás és 2SD határértékkel képzett konfidencia ellipszis számítás történt. Az értékeket a normál csoport adataival hasonlítottuk össze. A BAEP 35
vizsgálatok objektív, reprodukálható és érzékeny módszernek bizonyultak. A vizsgálat élettani alapját és folyamatait Nuwer részletezte (Nuwer MR. 1964). 3. 3. 5. Rizikó felmérés a betegcsoportban A genetikai vizsgálatok mellett kérdőív alkalmazásával rögzítettük a hagyományos rizikófaktorok és vascularis betegségek családi előfordulását (stroke, hypertonia, diabetes mellitus, myocardiális infarctus, alsóvégtagi obliteratív verőérbetegség, migrén) a felmenő ágon. A betegek egyéni kórelőzményében és a vizsgálat alkalmával kimutatható és vascularis jelentőségű rizikófaktorokat a kérdőívek és a kórrajzok egységes feldolgozása alapján tekintettük át. Felmértük az ischaemiás eredetű stroke betegség hagyományos rizikófaktorai közül a jelentősebbeket, úgymint, -
hipertóniabetegség (ha a beteget stroke előtt legalább egy évvel már antihypertenzív gyógyszer szedésére beállították),
-
diabetes mellitus (IDDM vagy NIDDM, ha a stroke előtt legalább egy évvel diagnosztizálták),
-
dohányzás (stroke előtt legalább 2 évvel 10/die vagy több cigaretta),
-
az előzetesen előforduló TIA vagy stroke betegséget (zárójelentéssel igazolva),
-
a myocardialis infarctust,
-
a migrén típusú fejfájást az International Headache Society kritériumai alapján,
-
az alkoholfogyasztást (40 g koncentrált alkohol/die feletti fogyasztást a stroke előtt legalább 2 évvel kezdve tekintettük alkoholos rizikónak),
-
a hyperuricaemiat 350 umol/l serum húgysav koncentráció felett, valamint a
-
hyperlipidaemiat (se. cholesterin 5,2 mmol/l felett, se. triglicerid 2,2 mmol/l felett,
izolált és kombinált formájukat). A szérum össz-koleszterin, a HDL-koleszterin (HDLC) és a triglicerid (TG) szint meghatározása standard kolorimetriás technikával történt. Az LDL-koleszterin koncentrációjának meghatározása a Friedewald képlet szerint azokban az estekben történt meg, amelyekben az össz-koleszterin, a TG és HDL-C szintek egyidejűleg meg lettek határozva. A betegek szérum mintáit centrifugálással nyertük ki és –70°C on tároltuk azokat a lipid paraméterek meghatározásáig. A szérum TG és LDL értékek nem lettek meghatározva vagy kalkulálva a véradó csoportban, mert éhgyomri értékek nem voltak elérhetők. A különböző genetikai polimorfizmusok
36
vizsgálata esetén azonos családi anamnesis és egyéni rizikófelmérési kérdőíveket alkalmaztunk a különböző centrumokban.
37
4. EREDMÉNYEK (A címek után a vonatkozó közlemények lettek feltüntetve arab számmal, elérhetők a disszertáció „Saját publikációk jegyzéke” [8] részben) 4. 1. A protrombin gén G20210A genetikai polimorfizmusa (I.) A kontroll csoportban az allélfrekvencia 0,9 ±1,1 % volt (7 heterozigótát találtunk, homozigóta pathológiás forma nem volt). A stroke csoportban az allélfrekvencia 4,0 ±2,7% volt (8 heterozigótát találtunk, homozigóta pathológiás forma nem volt). A statisztikai vizsgálatokat elvégezve megállapítható, hogy a fiatalkori stroke betegekben a vizsgált allélfrekvencia szignifikánsan magasabb (OR= 4,88 95% CI 1,26-18,82 p= 0,02). Nem találtunk összefüggést a betegek vad alléllal és A alléllal rendelkező csoportjainak családi anamnesisében előforduló vascularis betegségek, valamint a betegek egyéni rizikófakorainak jellegében. A továbbiakban a betegeket a hagyományos rizikófaktoraik előfordulási gyakorisága alapján két csoportra osztva az alacsony kockázatú csoportba azok a betegek kerültek, akiknek bármely hagyományos rizikófaktoruk közül 0 vagy 1 volt, míg a másik csoportot a 2 vagy több rizikófaktorral rendelkezők alkották (2. táblázat). 2. táblázat Látható, hogy az alacsony hagyományos rizikófaktorokkal rendelkező betegek körében a prothrombin gén heterozigóta formája közel kétszer olyan gyakori (5,7%), mint a magas hagyományos rizikóval rendelkező betegek körében (3,0%). A különbség statisztikailag nem szignifikáns, az eredmény jelzés értékű. További vizsgálatokkal a faktor II. mutáció gyakorisága a hagyományos rizikófaktor halmozódás szempontjából sajátságos eloszlást mutatott (1. ábra). 1. ábra Míg a vad alléllal rendelkező betegek esetében a gyakoriság a klasszikus rizikószám függvényében harangszerű eloszlást mutatott - leggyakoribbnak bizonyult 2 rizikó faktor jelenléte -, addig a heterozigóta esetek gyakrabban fordultak elő az alacsony
38
vascularis kockázatú (0 vagy 1 rizikójú) betegek között. Továbbiakban megvizsgáltuk, hogy a 20210A variáns egyéb, a hemosztázisban szerepet játszó, feltehetően a trombózis készség irányába ható polimorfizmusokkal együttesen hogyan befolyásolja a betegek prothromboticus rizikó állapotát (3. táblázat). 3. táblázat
Látható, hogy a trombocita GP IIb/IIIa (Leu33Pro) polimorfizmusa (PLA2) és a faktor II heterozigóta formájának együttes előfordulása eredményezte a legmagasabb relatív rizikófokozódást a kontroll csoporthoz képest (OR: 7,0), ugyanakkor megállapítható, hogy ez tendenciaszerű, nem érte el a szignifikancia határát (p=0,06). A többi vizsgált polimorfizmus az OR értékeket jelentősen megemeli 4,6 és 6,2 közötti értékre. A fenti vizsgálat azt igazolja, hogy az egyenként gyenge genetikai rizikófokozódás egy betegben összeadódhat és szinergisztikus hatások révén már jelentősebb rizikó fokozódást eredményezhetnek. Nincs konszenzus a szakirodalomban, hogy mekkora matematikailag
kifejezhető
veszélyeztetettséget.
rizikófokozódás
jelent
már
klinikailag
is
Ez az összadódó rizikó fokozódás képezi alapját a fiatalkori,
etiológiailag nem tisztázott stroke betegek véralvadási genetikai vizsgálatai elvégzése szükségességének.
4. 2. ACE gén I/D polimorfizmusa (II.) 1) A saját kontroll csoport vérmintáinak PCR vizsgálata, valamint más országokból származó közlemények adatainak összevetése alapján megállapítható, hogy a középmagyarországi polimorfizmus előfordulási gyakorisága lényegesen nem tér el az európai adatoktól (I/I 20%, I/D 52%, D/D 28%). 2) Statisztikai vizsgálatnak vetettük alá a stroke betegek és a kontroll csoport (n=173) közötti relatív allélfrekvencia előfordulását (A) az összes beteg esetén (n=253) és külön az 50 év alatti (B) (n=114) fiatal stroke betegeknél is amely alcsoportot a fiatal kontroll alcsoporttal hasonlítottunk össze (n=104). (A) Kontroll és teljes beteganyag: I/D genotípus versus I/I vad allél OR: 0,88, a D/D genotípus versus I/I vad allél OR: 0,96. A kapott érték egyik esetben sem szignifikáns. (B) Fiatal, <50 éves kontroll egyének versus beteg csoport: I/D genotípus versus I/I OR: 1,00, D/D genotípus versus 39
I/I OR: 0,96. A fenti adatok arra utalnak, hogy sem az összes beteg adatait feldolgozva, sem az 50 év alatti stroke betegcsoportban nem találtuk az I/ D és D/D genotípusok szignifikáns gyakoriságbeli fokozódását a korban megfelelő kontroll csoporttal szemben. Későbbi nagyobb elemszámú vizsgálataink adatai szerint (n=433) a D allél már szignifikánsan gyakoribb volt a betegcsoportban, mint a kontrollokban. 3) A demográfiai jellemzők közül a betegcsoportban a férfi-nő arányt megvizsgálva a következő eredményt kaptuk: A férfiak %-a: a D/D csoportban (n=77) 74, az I/D csoportban (n=128) 66,4 és az I/I csoportban (n=49) 69,4. Más szerzőkkel ellentétben Sharma P. 1994), akik a D/D variánst férfiakban gyakoribbnak találták mi nem tudtunk a nemek között különbséget kimutatni. 4) További vizsgálataink során a betegek családi anamnesisében előforduló vascularis betegség és a betegeknél kimutatható ACE gén variáns között kerestünk összefüggést (4. táblázat). 4. táblázat Több a D/D genotípus azoknál a betegeknél, akik családjában stroke, perifériás obliteratív érbetegség vagy hypertonia fordult elő, de az eredmények nem szignifikánsak. A szívinfarktus gyakoriságában viszont lényeges eltérést találtunk a csoportok között (p<0,05). Ez a megfigyelés megegyezik más vizsgálókéval (Lindpaintner K. 1995) ami azt mutatja, hogy a DD genotípus öröklésének szerepe lehet az endothel diszfunkcióban illetve az atheroscleroticus folyamat kialakulásában. 5) A betegek kivizsgálása során figyelemmel kísértük az egyéni, vascularis betegségekre már bizonyított, hagyományos rizikófaktorokat is, az ACE genotípusaival összefüggésben. (5. táblázat).
5. táblázat Látható, hogy egyik hagyományos egyéni rizikófaktor sem emelkedett ki a különböző ACE gén variánsok közül szignifikánsan. Azonban a fiatal stroke csoportban szignifikánsan több hyperlipidaemiat találtunk mind a D/D, mind az I/D genotípussal rendelkező betegek körében (p<0,02). Figyelemre méltó a hyperlipidaemia és a D/D allél együttes előfordulása.
40
6) Megvizsgáltuk azt a lehetőséget is, hogy az ún. „low risk” és a „high risk” csoportokban milyen arányban képviseltetik magukat a különböző genotípusok. Nincs összefüggés a D allél és az alacsony-vagy magas rizikójú betegek között. Ugyancsak nem találtunk összefüggést az atherosclerosis mértéke és a D allél között carotis duplex scan vizsgálatokkal a stenosis súlyosságát illetően. 7) Eszközös vizsgálatokkal (CT, CDS, Holter, ECHO CG) volt lehetséges a stroke pathomechanizmus szerinti alcsoportok elkülönítése. Mint fent említettük betegeink döntő többsége ischaemias stroke-ban szenvedett, de vizsgálataink kezdetén még egyéb pathomechanizmust is kimutattunk. A későbbiekben, ahogy egyre több vizsgálatot tudtunk végezni, a betegcsoport homogenizálása érdekében már a SAV, ICV és sinus thrombosisos kórformákat kizártuk. (6. táblázat) 6. táblázat A D/D csoportban a cardiális embólia szignifikánsan ritkább, mint az I/I csoportban (p=0,04). Elvégeztük a statisztikai vizsgálatokat az 50 év alatti fiatal betegeknél is, akiknél ez az összefüggés még szorosabb volt (p=0,01). Ez arra utal, hogy jól elkülöníthető a stroke betegség ezen alcsoportja, melynek kiváltásában inkább a véralvadási
rendszer
prothromboticus
irányába
való
eltolódása,
valamint
hemorheológiai jelenségek (hiperviszkozitás, fokozott vörösvérsejt aggregáció) játszanak fontos szerepet, nem elsősorban az endothel károsodása a kiváltó tényező, melyet vizsgálati eredményeink is alátámasztanak. A vér áramlási paraméterei közül a plazma fibrinogén koncentrációját is vizsgáltuk. Az összes beteg adatainak vizsgálata alkalmával nem kaptunk szignifikáns összefüggést a különböző genotípusokkal (p=0,21), azonban az 50 év alatti stroke betegek plazma FIB koncentrációjának elemzése alkalmával a következő eredményt kaptuk: FIB (g/l) / genotípus = 3,5 / D/D (n=48), 3,1/ I/D (n=37), 2,8 / I/I (n=39) (Kruskal–Wallis próba p=0,01 a D/D és I/I genotípus között).
4. 3. A GP IIb/IIIa polimorfizmus vizsgálatának eredményei (III. klinikai és IV. experimentális vizsgálatok)
41
A) Klinikai vizsgálatok 1) A rendelkezésünkre álló irodalmi adatok áttekintése alapján az egészségesekben a polimorfizmus eltérő prevalenciával jelentkezik a különböző országokban. ÉszakEurópában magas a PLA1 vad típus aránya (93,5%) ugyanakkor ezekben az országokban a cerebro és cardiovascularis morbiditás is alacsony, ezzel szemben nálunk a fenti és a közép-európai országokhoz képest is magas a heterozigóta és homozigóta variáns aránya (PLA1/PLA2=21,2% a PLA2/PLA2= 2,2% a PLA2 allél= 23,4%). 2) További vizsgálatainkban a betegekben előforduló hetero és homozigóta gyakoriságot elemeztük és megállapítottuk, hogy a fiatalokban (<50 év) a PLA2 allél gyakorisága 27,6%, mely idősebbekben 33,6%-ra emelkedik. Nincs prospektív hazai vizsgálat arra nézve, hogy ezekből az évek folyamán milyen arányban lesz stroke-ban szenvedő beteg. A fiatal stroke csoportban nem tudtunk magasabb allélfrekvenciát kimutatni az idős csoporttal szemben (27,6% vesus 33,6%), mint ahogy Weiss cardiológiai beteganyagban ezt igazolta (Weiss A, 1995). 3) Az egészséges és beteg csoportokban előforduló PLA2 allél gyakoriságot statusztikailag kiszámolva az összes beteg versus kontroll OR:1,42, a fiatal betegcsoport versus kontroll OR: 1,24, ezek nem szignifikáns eredmények, az idősebb betegek versus kontrollok esetén az OR: 1,65 p= 0,09. 4) A családi anamnesisben előforduló vascularis betegségek nem mutattak pozitív összefüggést a kedvezőtlen PLA2 alléllal és az egyéni vascularis kockázati tényezőket vizsgálva sem mutatkozott szignifikáns eltérés a két csoport között. Nem sikerült különbséget találnunk az ún. low risk és high risk csoportban előforduló allélgyakoriság különbség között sem. A fenti vizsgálatok a teljes beteganyagra vonatkoztak. 5) Megvizsgáltuk néhány hemorheológiai jelentőségű laboratóriumi jellemző (FIB koncentráció, hematokrit, TVV és PV) valamint a GP IIb/IIIa polimorfizmus kapcsolatát, de nem talátunk szignifikáns összefüggést a mért értékek között. Az összefüggés hiánya arra utal, hogy a GP IIb/IIIa polimorfizmus okozta rizikófokozódás önállóan hat az elsődleges hemostasis zavara útján és nincs kapcsolata vér-áramlási faktorokkal. 6) A PLA2 allél és a CDS leleteket vizsgálva az 50 év alatti betegeknél, a 85% alatti carotis stenosis és a PLA2 között maginálisan szignifikáns összefüggés
42
mutatkozott (p=0,06). Azoknál a betegeknél, akiknél a CDS vizsgálattal nem találtunk kóros érfalszerkezeti elváltozást, több A1/A1 genotípust tudtunk kimutatni (50% normális, szemben 36% heterozigóta). Mind az összes, mind a fiatalabb beteg csoportban magasabb arányban találhatók P1A2 és P2A2 genotípussal rendelkező betegek, ami azzal magyarázható, hogy az endothel sérülés, kollagén-felszabadulás, a von Willebrand factor és a stenosis területén jelentősen emelkedő shear stress megnövekedett thrombocytaadhezivitást és aggregációfokozódást eredményez, mely a hetero és homozigóta pathológiás vérlemezkékben már eleve is fokozott. A fenti, csak thrombocitákra levezetett mechanizmus valószínűleg nem érvényes a 85% feletti szűkületekre. Úgy tűnik, hogy a polimorfizmus fiatal stroke betegekben szerepet játszhat a stroke pathogenezisében, de csak carotis szűkület esetén. 7) A stroke-alcsoportok szerint sem találtunk lényeges különbséget a kétféle genotípussal rendelkező thrombociták megoszlásában. Elvégeztük 50 év alatti betegeinknél a PLA genetikai vizsgálata mellett a prothrombin gén G20210A vizsgálatot is. A prothrombin gén variáns fiatal stroke betegeinkben szignifikánsan magasabb prevalenciát mutat (OR: 4,9 95% CI, p=0.02) (Morgenstern LB. 1997). Ebben a vizsgálatban mindkét polimorfizmust 7,0-szeres OR-val találtuk (95% CI: 0,89-43,3) a kontrollokhoz képest, mely szinergisztikus hatásra utal. B) Experimentális vizsgálatok Trombocita aggregációs vizsgálatok teljes vérben: luciferin luciferáz jelenlétében ADP, kollagén és risztocetin induktorok alkalmazásával. Mindegyik induktor esetén a heterozigóta receptorok mérsékelten fokozott aggregabilitást mutattak, de csak risztocetinnel volt az eredmény szignifikáns (p<0,05). A továbbiakban ezzel az induktorral folytatuk a vizsgálatokat teljes vérben.
Ebben a vizsgálatban az ATP
release-t is vizsgáltuk, de nem találtunk különbséget a vad típusú receptorokkal szemben. Aggregációs vizsgálatok PRP-ben: a fenti induktorokkal nem találtunk különbséget a kétféle típusú receptor között. Flow cytometriás vizsgálatok: teljes vérben a CD62P+ jelzett trombociták nyugvó állapotban (PBS ben) sem a vad típus esetén sem a heterozigóta típus esetén nem mutattak változást, risztocetinnel indukálva azonban a PLA2 sejtek szignifikánsan nagyobb számban expresszálódtak (p<0,01) (2. ábra /A). 43
2. ábra Az ábra B részében a P szelektinnel és fibrinogénnel együttesen jelzett sejtek teljes vérben törénő vizsgálatát mutatja. Nyugvó állapotban, PBS-ben inkubálva nem volt különbség a két csoport között. Risztocetinnel indukálva a vad típusú csoport nem mutatott fokozott expresszálódást ellentétben a heterozigóta csoporttal (p<0,05). Flow cytometrás vizsgálatok PRP-ben: 3. ábra A kettős jelzésű CD41/CD42b trombociták nem mutattak változást PBS inkubáció esetén, ADP induktorral vizsgálva mindkét típusu trombociták expressio csökkenéssel válaszoltak. A GP I/B receptor működését reprezentáló CD42b pozitív sejtek fluorescein intenzitását mértük, de nem reagáltak
ADP indukcióra a vad típussal
szemben (3. ábra A része). A CD61/CD41 pozitív sejtek egyformán expresszálódtak PBS-ben és ADP induktorral. Ugyanazok a sejtek fluoreszcein intenzitása már különböző volt, amennyiben ADP-vel történt az indukció, a heterozigóta sejtek szignifikánsan magasabb fluoreszcenciával válaszoltak (p=0,006) (3. ábra B része). A GP IIIa (CD61 pozitív) receptor rész nyugalomban nem mutat intenzitásbeli különbséget, de ADP induktorral már a vad típusú sejtek is intenzitásbeli fokozódással válaszoltak, azonban a PLA2 sejtek szignifikánsan emelkedettebb mértékben (p=0,0001). A CD62 pozitív, vad típusú sejtek (P szelektin) fluoreszcencia intenzitásában szignifikáns különbség mutatkozott a PBS és ADP inkubáció között (P=0,002) de ez kifejezettebb volt heterozigóta sejtek esetében (p=0,0001) 4. 4. A Leiden mutációs vizsgálatok eredményei (V.) 1) Elsőként azt vizsgáltuk, hogy milyen arányban fordul elő a Leiden mutáció a kontroll csoportban és ezt összehasonlítottuk a beteg csoportban található adatokkal. A homozigóta eseteket kis számuk miatt a heterozigóta esetekkel összevontuk. Megállapítottuk, hogy mind a kontroll csoportban, mind a betegek között a Leiden mutáció homozigóta formája ritka (0,79% az összes beteg vizsgálata esetén). A
44
heterozigóta és homozigóta mutánsok előfordulása magasabb az 50 év alatti stroke betegekben, mint az idősebbekben (11,19% versus 8,33%). A fiatal betegcsoportot összehasonlítva a kontroll csoporttal az OR: 1,67 (95% CI: 0,75-3,70 p=0,53) mely mérsékelt rizikófokozódásra utal, de nem szignifikáns. Az idősebb betegcsoportot összehasonlítva a kontroll csoporttal az OR: 1,21 (95% CI:0,50-2,87 p=0.82), mely eltérésre nem utal. Az összes betegre vetített OR: 1,45, gyenge rizikóemelkedéssel. 2) A következő táblázatban (7. táblázat) a polimorfizmusok előfordulását vizsgáltuk, immár csak a betegcsoportban, a heterozigótákat és homozigótákat szintén összevonva. A betegek családi anamnézisében a Leiden mutációval rendelkezők körében szignifikánsan több stroke fordult elő (p=0,01) a többi vaszkuláris rizikófaktorokkal nem mutatkozott kapcsolat. A betegek egyéni kórelőzményében, illetve a vizsgálat alkalmával mutatkozó vaszkuláris betegség szempontjából releváns rizikófaktorok közül a hyperlipidémia mutatott szignifikáns összefüggést a pontmutációval rendelkezőkkel (p=0,03). 7. táblázat 4. 5. Az ABCA1 genetikai polimorfizmus vizsgálatok eredményei (VI.) A R219K, V771M és I883M ABCA1allél variánsok meghatározásának eredményei A genotípusok és statisztikai analízis eredményeit a 8. táblázat mutatja. 8. táblázat A kontroll csoportban az R219K, V771M és I883M variánsok allélfrekvenciája a következő volt: 30±4,7%, 4,9±2,2% és 12,4±4,5%). Csökkent allélfrekvenciát találtunk mindkét betegcsoportban az R219K és V771M variánsokra vonatkozóan (stroke: 28,9± 4,1% és 3,3±1,6%; koronária beteg: 25,7±5,0% és 1,3±1,3%). A koronária beteg csoportban a V771M AF csökkenés szignifikáns volt, a vizsgálatok egyváltozós analízissel történtek (p=0,009). A továbbiakban a beteg csoportokat a betegségük jelentkezésének ideje alapján csoportosítva még kifejezettebb csökkenés volt megfigyelhető. (4. ábra). 4. ábra 45
Az 50 év alatti stroke betegekben (n=114) mindkét variáns szignifikánsan alacsonyabb frekvenciával volt képviselve a kontroll csoporthoz képest [R219K: 22,4±5,5% p=0,013, OR=0,55 (0,34-0,88), valamint a V771M:1,8±1,7% p=0,045; OR=0,33 (0,111,00)]. Hasonló tendencia volt megfigyelhető a koronária betegek csoportjában 60 év alatt (n=62) az R219K-ra és a V771M ra nézve, de csak a V771M allélfrekvencia csökkenés volt szignifikáns [22,6±3,6% p>0,05; és 0±1,6%, p=0,005; OR=0,07 (0,0041,2)]. A harmadik allél variáns az I883M frekvenciája nem mutatott szignifikáns különbséget a beteg csoportban (CHD: 12,3±3,8% és stroke: 15,2±3,2%) valamint a különböző korú alcsoportokban. Multivariációs vizsgálat (logisztikus regresszió) is igazolta, hogy az R219K és V771M variánsok védő faktorok a stroke-val szemben, függetlenül a kortól és nemi különbségektől [R219K: p=0,032, OR: 0,68 (0,48-0,97); V771M: p=0,017, OR: 0,34 (0,14-0,82)]. A szívbeteg csoportban csak a V771M látszik szignifikáns és független védő faktornak [p=0,027, OR: 0,08 (0,01-0,75)]. A további vizsgálatunkban a TIA csoportot kihagytuk az agyi ischaemias betegek közül. Hasonlóan a teljes agyi ischaemias csoporthoz az R219K és V771M allélfrekvencia csökkenés volt megfigyelhető a kontroll csoporttal szemben [R219K: 27,4±4,9%, p=0,015, OR: 0,59 (0,39-0,91); V771M: 3,3±2,0%, p=0,042, OR: 0,36 (0,13-0,97)]. Hasonlóan szignifikáns R219K és V771M AF csökkenés volt tapasztalható az ischaemias stroke betegekben, összehasonlítva a kontroll csoporttal [n=124; R219K: 24,6±5,5%, p=0,049, OR: 0,64 (0,41-0,99) és V771M: 1,2±1,4%, p=0,021, OR: 0,19 (0,05-0,78)]. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, hogy az allélfrekvencia csökkenést nem az ischaemias szív betegeséggel történő gyakori társulás eredményezi-e, logisztikus regresszió analízist végeztünk azon stroke betegek csoportjában, akiknél nem fordult elő egyidejűleg ISZB (n=207, 84,8%). A vizsgálat azt mutatta, hogy az R219K és a V771M variánsok védő faktort jelentenek a stroke-kal szemben függetlenül a kortól és nemtől [R219K: p=0,040, OR:0.69 (0,48-0,98); V771M: p=0,034, OR: 0,39 (0,16-0,93)]. Ezek az eredmények azt igazolják, hogy az R219K és V771M előfordulása a stroke betegekben nem magyarázható az ISZB gyakori előfordulásával. A CDS leletek szerint a stroke betegeket három csoportba osztottuk [negatív CDS (n=112), stenosis a CDS vizsgálattal (n=107) 85%-ig és 85%-os stenosis felett vagy occlusio (n=25)]. Az allélfrekvenciák (ABCA1 SNPs) gyakoriságát illetően nem találtunk különbséget a 46
csoportok között. A betegeket saját rizikó faktoraik (hipertónia, diabétesz, dohányzás és fokozott alkoholfogyasztás) számát illetően két csoportba osztottuk úm. „low risk” csoportba 0-1 rizikófaktorral (n=146) vagy „high risk” csoportba több, mint egy rizikófaktorral (n=98). Alacsonyabb R219K és V771M allél frekvenciákat találtunk a „low risk” csoportban (R219K: 27,4±5,2% vs. 30,6±6,6%, V771M: 2.1±1.7% vs. 4,6±3,0%), de az eredmények nem voltak szignifikánsak. A Hardy-Weinberg eloszlás vizsgálata és az allél összefüggések a genetikai variánsok között. Az egyes polimorfizmusok Hardy-Weinberg eloszlás vizsgálata a különböző csoportokban Arlequin szoftverrel történt. A három csoportban (kontroll, ISZB, stroke) a vizsgált három ABCA1 polimorfizmus Hardy Weinberg equilibriumban volt (p>0,05), eltekintve a R219K polimorfizmustól a stroke csoportban (p=0,00465). Mivel a Hardy Weinberg equilibriumtól történő eltérést jelen esetben nem magyarázhatjuk a vizsgált polimorfizmus nem régi kialakulásával, valamint a populáción belüli nem egyenletes keveredéssel,
így
feltehetőleg
a
betegcsoport
fenotípusos
szelekciója
miatt
keletkezhetett (Weiss EJ. 1992). Az egyes polimorfizmus párok között megvizsgáltuk a kapcsoltságot a kontroll és betegcsoportokban egyaránt. A V771M allél csaknem kizárólag azoknál az egyéneknél volt megtalálható, akik az R219K allélt hordozták (36/37 V771M hordozó volt pozitív R219K-ra). Szoros kapcsoltság volt megfigyelhető a V771M és R219K között (p<0,0005). Ezen kívül hasonló, non-random allél asszociáció volt igazolható az R219K és I883M variánsok között (p<0,05). Minden genotípus eredményt kombinálva az I883M hordozók 69,6%-a volt pozitív az R219Kra, míg az I883M vad alléllal rendelkezők csak 39,6%-a volt pozitív az R219K-ra. A kettős pozitív (R219K és I883M) hordozók és az egyes pozitív hordozók (csak I883M) előfordulása hasonló volt a kontroll, stroke és cardiovascularis betegcsoportban. Ezek az eredmények azt támasztják alá, hogy az R219K és az I883M polimorfizmusok is „linkage disequilibrium”-ban vannak a vizsgált személyekben, tehát ezek a variánsok gyakori előfordulásai ugyanabban az egyénben nem valószínű, hogy a betegség megjelenésével kapcsolatban vannak. A V771M és I883M között nem találtunk szignifikáns kapcsoltságot. Szérum lipid meghatározások A fontos genotípus-fenotípus összefüggések feltárása érdekében plasma lipid meghatározások történtek a kontroll csoportban (n=193) és a beteg csoportban (stroke: n=113; ISZB n=95). Nem volt összefüggés a plasma lipid értékek és a genotípus 47
megoszlások között. Ugyanakkor a stroke csoportban a V771M hordozókban magasabb HDL koncentráció volt mérhető, mint a nem hordozókban [n=104; 1,00 (0,90-1,30) versus 1,60 (1,05-1,80) mmol/l; p=0,053]. 4. 6. Összesített genetikai vizsgálatok eredményei (VII., VIII.) A vizsgálatok előrehaladtával a beteganyag mennyiségének a növekedése szükségessé tette újabb statisztikai vizsgálatok elvégzését és eredmények megállapítását (betegszám: 433). Ehhez először a betegek [fiatalabb csoport, <50 éves (A csoport), idősebb csoport>50 éves (B csoport)] alapvető demográfiai adatait mutatjuk be a 9. táblázatban. 9. táblázat Szignifikáns különbség mutatkozott a két csoportban a korban. A B csoport betegeinek családi anamnesisében több hipertonia és diabétesz volt. Ugyanezen csoport betegeinek egyéni vaszkuláris betegségei és rizikótényezői között több volt a hipertónia, melyet a diabétesz és az alkoholizmus követett gyakoriságban. A fiatal betegcsoportban a migrén gyakoribb volt. A laboratóriumi paramétereket vizsgálva a hiperlipidémia fordult elő gyakrabban az idősebbekben, a többi paraméterben nem volt szignifikáns különbség. Több PRIND-et találtunk a B csoportban. Az ischaemias alcsoportok szerint a genetikai polimorfizmusok előfordulásában különbségeket nem találtunk. Az egészségesekben és betegekben előforduló allél gyakoriságokat összehasonlítottuk a más országokban közölt egészségesek és stroke betegek adataival (10. táblázat). 10. táblázat A genetikai polimorfizmusok a stroke pathogenesisében kifejezettebbek a fiatal betegekben, ezért ebben az alcsoportban kiszámítottuk a különböző allélek és genotípusok rizikót fokozó hatását kontrollokkal szemben, melyet az esélyhányados értékekkel fejeztünk ki (11. táblázat) 11. táblázat
48
Látható, hogy a GP IIb/IIIa PLA2 allélja önmagában nem jelent rizikó-fokozódást. A protrombin gén A allél előfordulása azonban szignifikáns rizikó-fokozódást eredményez. A Leiden mutáció 2,00 OR-val szerepel, de önmagában nem jelent szigifikáns rizikó-fokozódást. Az ACE gén D allélje szignifikáns rizikó-emelkedést eredményez, de a DD genotípus már nem. A FIB gén homozigóta formája (H2/H2) fiatalokban magasabb OR-t eredményez, mely nem szignifikáns. Hasonló a helyzet a MTHFR gén polimorfizmusánál is. A továbbiakban arra voltunk kíváncsiak, hogy mind a kontroll csoportban, mint a betegekben milyen arányban fordul elő két genetikai polimorfizmus közül bármelyik hetero vagy homozigóta formája a vad alléllel rendelkező betegekkel szemben. Odds ratio: először a normális, vad típus előfordulási arányát vizsgáltuk a kontroll és betegcsoportban és ezt viszonyítottuk a két polimorfizmus közül egy hetero vagy homozigóta variáns előfordulási arányához a kontroll és betegcsoportban. A két odds arányát (OR 1) tüntettük fel. Vizsgálatunk további részében a vad allél előfordulási arányát elemeztük a kontroll és betegcsoportban, majd ezt viszonyítottuk két hetero vagy homozigóta variáns előfordulási arányához a kontroll és betegcsoportban. A két odds arányát (OR 2) is feltüntettük (12. táblázat). 12. táblázat Megfigyelhető, hogy a protrombin gén 20210A allélja kiemelten kapcsolódik a többi polimorfizmusokhoz, a PLA2 variánshoz (p=0,045), a Leiden mutációhoz (p=0,001), az ACE I/D-hez (p=0,025), a FIB génhez (p=0,049) valamint az MTHFR (p=0,001) A alléljához. Másik két kombináció is rizikót módosító faktor, az ACE kapcsoltan a FIBhez (p=0,044) és a FIB az MTHFR-hez (p=0,001). További, immár nem a 12. táblázathoz tartozó megfigyelések: A polimorfizmusok közül az MTHFR +/+ genotípus (n=308) összefüggést mutatott a családban előforduló strokekal (p=0,009), mely nem igazolható a betegek vad alléllal rendelkező csoportjában. Hasonló eredményt kaptunk a fiatalok csoportjában is (n=148) (p=0,03). A betegek egyéni rizikófaktorai közül a +/+ genotípussal szignifikánsan csak a diabetes mellitus mutatott összefüggést (p=0,01). Nem volt kimutatható összefüggés a genetikai polimorfizmusok és a hematokrit, fvs. szám valamint a trombocita szám között. A
49
Leiden mutáció, a FIB gén variáns, a plazma FIB koncentráció valamint a plazma viszkozitásának összefüggéséről külön részben számoltunk be. 4. 7. A BAEP vizsgálatok eredményei (IX, X.) 1. csoport (kontroll): A fentiekben jelzett egészséges csoportban kóros BAEP regisztrátumot nem találtunk, itt a hemorheológiai vizsgálatok is negatív eredményt adtak. 2. csoport: Krónikus stádiumban lévő, agytörzsi ischamias betegek, MRI-vel jól körülírt morfológiai károsodással különböző lokalizációban. Ezeknél a betegeknél kóros hemorheológiai paramétert nem tudtunk igazolni. A BAEP mintákat összevetettük a képalkotó eljárásokkal észlelt leletekkel és megállapítottuk, hogy: - 12 betegben az ischaemias gócok oldalisága megegyezett a BAEP regisztrátumban észlelt kóros elváltozások oldaliságával (5. ábra, 1-2) - 5 betegben a talált gócos agytörzsi elváltozások a regisztrált BAEP kóros mintákkal inkongruensek
voltak (pl. mesencephalon infarktusát láttuk MRI felvételen,
ugyanakkor a III. hullám kóros mintáját regisztráltuk). - 6 betegben MRI vizsgálattal egyszeres vagy többszörös infarktus jeleit észleltük, ugyanakkor a BAEP vizsgálat negatív eredményt adott (5. ábra 3-4). Ez az észlelés viszonylag gyakori a mindennapi elekrtofiziológiai gyakorlatban, hiszen lehetnek olyan gócos elváltozások, melyek nem esnek a hallópálya útjába. 5. ábra A fenti csoportról összefoglalva elmondhatjuk, hogy a BAEP elváltozások aszimmetrikusan jelentek meg, jól körülírt formában. A csoportra nem volt jellemző, hogy a BAEP vizsgálatok egyidejüleg mindkét oldalon kóros elváltozást mutattak volna, valamint nem találtunk egyetlen BAEP regisztrátumot sem melyben minden hullám egyformán deformált vagy amplitudó anomáliákkal lett volna jellemezhető. 3. csoport: Az agytörzsi infarktusos betegek ebben a csoportjában a vér hiperviszkozitását is észleltük. Megállapítottuk, hogy a csoport mindegyik tagjánál szimmetrikus kóros eltérések mutatkoztak a BAEP mintákon. Ezeket a III. és IV - V. 50
komplexum mutatta leginkább. Ugyanakkor minden esetben szignifikáns latencia megnyúlást is észleltünk. 4 betegben a III. hullám hiánya mutatkozott mindkét oldalon. Ezt mutatjuk be a 6/A ábrán. 6. ábra Erre a csoportra jellemző volt, hogy a hyperviszkozitáshoz a BAEP regisztrátumok kétoldali kórossága társult. 4. csoport: Ezekben a nem neurológiai szakrendelés által regisztrált belbetegekben rheológiai vizsgálattal hyperviszkozitást tudtunk dokumentálni. A csoport korban és hagyományos vaszkuláris rizikófaktorokban (hypertonia, diabetes mellitus, dohányzás) nem különbözött az agytörzsi stroke betegektől. Alapbetegségük (sec. polygobulia ill. policythaemia vera) legalább egy éve már ismert volt a vizsgálatba történt bevonásukkor és az alapbetegségük természetének megfelelően kezelésük után bizonyos idővel hyperviszkozitásuk visszatért, a BAEP vizsgálatok az ilyen ún. dekompenzált fázisban történtek. Ebben a csoportban negativ BAEP regisztrátum nem fordult elő. Az eletrofiziológiai elváltozások különböző súlyosságuak voltak. Az alábbiakban ezekre mutatunk be ábrákat. 7. ábra Az 5. ábrán viszonylag enyhe fokú elváltozásokat láthatunk, azonban a 6. és 7. ábrán már kifejezett szubklinikai károsodás jelei mutatkoztak.
4. 8. A FIB gén -455 G/A, valamint a Leiden mutáció összefüggése haemorheológiai paraméterekkel ischaemias stroke betegekben (XI. XII.) Vizsgálataink során az ischaemias stroke betegeket a FIB gén polimorfizmusainak megfelelően különböző csoportokba osztottuk, 165 beteg volt H1/H1, 76 H1/H2, 37 H2/H2 genotípusú. A hagyományos vascularis rizikófaktorokban és a hematokritban nem mutatkozott szignifikáns különbség a csoportok között. A hetero és homozigóta variánsok arányát megvizsgáltuk kontroll és betegcsoportban. Eredmények: H1/H2 versus H1/H1: OR 0,95 (95% CI: 0.47-1.27), H2/H2 versus H1/H1: OR 1,57 (95%CI:
51
0,53-4,61). 50 év alatti, fiatal alcsoportban (n=132) az eredmények a következők voltak: H1/H2 versus H1/H1: OR 0,96 (95%CI:0,49-1,29) és H2/H2 versus H1/H1: OR:1,66 (95%CI: 0,52-5,25). Mindkét esetben magasabb volt az előfordulási arány betegekben, ha a homozigóta pathológiás variánsokat hasonlítottuk a vad allélhoz, de az eredmények nem voltak szignifikánsak. A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy 1) a dohányzási szokások szerint hogyan alakult a plazma FIB koncentrációja és megállapítottuk, hogy a dohányzók csoportjában H2/H2 variáns magasabb FIB koncentrációval jár a vad típussal rendelkezőkkel szemben. 2) a nem dohányzók vad típussal jellemezhető csoportjában a plazma FIB koncentráció alacsonyabb volt, mint a dohányzó, vad típusú betegekben. Ez a kedvező hatás eltünt a nem dohányzók abban a csoportjában, mely H2/H2 genotípussal rendelkezett, összehasonlítva a saját vad alléllal rendelkező csoportjukkal (p<0,05). 3) Vizsgáltuk a plazma FIB koncentrációinak terciliseit a FIB genotípusainak függvényében. A 4 g/l FIB koncentráció feletti betegcsoportban szignifikánsan több H2/H2 genotípussal rendelkező beteget találtunk, összehasonlítva a H1/H1 csoporttal (p<0,05). 4) A haemorheológiai paraméterek közül a teljesvér viszkozitását mértük (0,40-re standardizált hematokrit mellett) és megállapítottuk, hogy a dohányzóknál a vad típusuak és a H2/H2 között csak mérsékelt különbséget regisztráltunk (p=0,11), nem dohányzókban már szignifikáns viszkozitás emelkedés volt megfigyelhető a vad alléllel rendelkezők versus H2/H2 csoportban (p<0,05). Vizsgálatunk másik része a Leiden mutáció és a haemorheológia kapcsolatára vonatkozott. A Leiden mutáció frekvenciája a kontroll csoportunkban 7,2%, a fiatal betegcsoportban 11,9% és az 50 év feletti betegcsoportban 8,33% volt. Nem volt szignifikáns különbség az V alvadási faktor mutációjával, valamint a vad típussal rendelkezők között a hagyományos rizikófaktorok szerint. A plazma viszkozitásának értékeit tercilisekbe osztva magvizsgáltuk a megoszlást a Leiden mutáció alléljei szerint mind teljes betegcsoportban mind a stroke betegek alcsoportjaiban (fiatal és nemdohányzó). Ezeket az értékeket tüntettük fel a 13. táblázatban. 13. táblázat Szignifikáns összefüggést találtunk a Leiden mutáció + allélje, valamint a legmagasabb plazma viszkozitású csoport között a teljes beteganyagban, a fiatalabb 50 év alatti alcsoportban és a nem dohányzó betegcsoportban is. 52
4. 9.
A trombocita aggregációs vizsgálatok eredményei (XIII., XIV.,XV.,XVI.
XVII.) Vizsgálataink első részében a CARAT TX aggregométerrel a készülék standardizációját végeztük el, öt hazai centrumban, hasonló körülmények között, azonos, fix dózisú aggregációs induktorokkal. A 8. ábrán a vizsgálati eredményeket tüntettük fel. 8. ábra Az ábra A,B és C része az egészséges, gyógyszert nem szedő 150 egyén trombocitáinak aggregációs szintjeit mutatja különböző induktorok alkalmazása esetén. A= 78±7%, az átlagos –2SD 64%. B= 75±8%, -2SD 59%. C= 76±7%, -2SD 62%. Látható, hogy a különböző központokból kapott eredmények jó egyezést mutattak, lehetővé vált a normál „range” megállapíthatósága. Az ábra D, E és F részében négy központban összesen 823 aszpirint szedő beteg vérmintáinak gátlási görbéit mutatjuk be (a betegek napi 100 – 325 mg közötti, „low dose” aszpirint szedtek). D: három központban a görbe maximuma 35% egy központban 48% volt. E: Hasonló eredményeket kaptunk adrenalin induktorral is. F: ADP aggregáló anyaggal az átlagos gátlás normális tartomány alsó értékénél volt, úgy tűnik, hogy az aszpirin szedése minimálisan, de hatással van az ADP indukálta aggregáció csökkentésében is. További vizsgálatainkban 718, ischaemias eredetű és különböző aggregációgátló gyógyszereket szedő stroke beteg vérmintáiban (PRP) vizsgáltuk meg a trombocita aggregáció szintjét. 555 beteg szedett aszpirint, 96 ticlopidint és 67 clopidogrelt (9. ábra). 9. ábra Három szintet különböztettünk meg a gyógyszer hatásosságára vonatkozóan: hatásos volt 30%-os gátlási szint alatt, mérsékelten hatásos 30% és az induktor átlagos normál értéke -2SD között és hatástalannak minősítettük, ha az aggregációs görbe maximuma a normál tartományba esett. Hatásos gátlási értékeket találtunk: aszpirint szedő betegeink 36%-ában, ticlopidin esetén 73%-ban és clopidogrel szedése esetén 25%-ban. Hatástalan gátlást találtunk aszpirin esetén 17%-ban, ticlopidin esetén 4%-ban valamint
53
clopidogrel esetén 18%-ban. A többi beteg a mérsékelten hatásosan reagálók csoportjához tartozott. A továbbiakban egy 28 hónapig tartó, követéses, multicentrikus vizsgálatot végeztünk annak megítélésére, hogy a különböző típusú antiaggregációs gyógyszereket szedő betegek csoportjában hogyan alakul az összmortalitás. A vizsgálat felépítését az alábbi ábrán mutatjuk be (10. ábra). 10. ábra A vizsgálatba összesen 921 ischaemias stroke és ISZB beteget vontunk be. A betegek az adott központokban rendszeresen TAG vizsgálatokon vettek részt annak érdekében, hogy a gyógyszer (napi 100-325 mg aszpirin monotherapia) hatásosságát laboratóriumi módszerrel kontrolláljuk. A hatásosság megítélése ebben a vizsgálatban a következő volt: hatásos gátlást véleményeztünk, ha kollagén és adrenalin induktorral az aggregációs görbe maximuma 64% alatt volt és hatástalannak, ha e fölött. 717 betegnek volt hatásos a TAG gátlási szintje. Ezek a betegek a továbbiakban maradtak aszpirin monotherapián (1-sel jelezve). 204 beteg esetében (2-sel jelezve) találtuk az aggregációs képességet hatástalannak (rezisztens betegek csoportja). Ezekben az esetekben javasoltuk a betegeket gondozó háziorvosoknak, hogy a gyógyszerelést módosítsák thienopyridin kezelésre. A 204 betegből 48 betegnél (3-sal jelezve) a módosítás nem történt meg, ezek a tanács ellenére aszpirin kezelésen maradtak. A 28 hónapos követés végén információkat kaptunk a betegek mortalitásáról. A 204 rezisztens betegből 55 került (4-sel jelezve) thienopyridin-re való átállításra (30 ticlopidin, 25 clopidogrel). A többi beteg részben ASA+dipyridamol, vagy kombinált kezelésre lett átállítva. A mortalitási adatokat az ANTSZ adatbázisából és a háziorvosok megkérdezése útján kaptuk. Először az 1. és 2. jelzésű csoportok mortalitási adatait hasonlítottuk össze (KaplanMeyer görbék) és tüntettük fel a következő ábrán. 11. ábra Az aszpirin reszponder és rezisztens csoport között nem találtunk a mortalitásban szignifikáns különbséget. Ez azzal magyarázható, hogy a 2. csoport heterogén megoszlású volt a további kezelésüket illetően. 54
A továbbiakban az 1. csoport és a 3. csoport adatait vizsgáltuk (12. ábra). 12. ábra Szignifikánsan magasabb volt a mortalitás abban a betegcsoportban, amely betegei annak ellenére tovább szedték az aszpirint, hogy TAG vizsgálattal rezisztensek voltak (p<0,01). Vizsgáltuk a 3. csoport és a 4. csoport mortalitási adatait is (13. ábra). 13. ábra Szignifikánsan magasabb volt a mortalitás a laboratóriumilag aszpirin rezistens csoportban, akik továbbra is szedték az aszpirint, összehasonlítva a gyógyszerváltáson átesett betegekkel (p<0,05).
55
5. MEGBESZÉLÉS
A hagyományos rizikófaktorok (hypertonia, diabetes mellitus, zsíranyagcsere rendellenességei, dohányzás, a metabolikus syndroma stb.) az ischaemias stroke létrejöttére csak kb. 65-70%-ban adnak magyarázatot, a fentmaradó részben az okok nem tisztázhatók kellően (Probst MC. 2004). A sokoldalú fenotípusú, komplex pathomechanizmusú ischaemias stroke hátterében genetikai tényezők is meghúzódnak, ezek tiszta formában jelennek meg a például a Mendel féle öröklésmenetet mutató kórformák esetén [nagyérbetegségek: homocisztein, dyslipidemiak, hematológiai betegségek, kisérbetegségek: CADASIL (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leucoencephalopathy), vagy Fabry betegség esetén]. További hasonlóak a mitokondriális betegségek, MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes) vagy kötőszöveti betegségek, melyekhez stroke társulhat
(Marfan
syndroma,
Ehlers-Danlos,
osteogenesis
pseudoxantoma elasticum, neurofibromatosis) stb. A
imperfecta
Wrolik,
stroke 5%-ban monogenikus,
95%-ban poligenikus betegség, melynek relatív rizikója anyai stroke esetén 1,4, apai esetén 2,4, azonban a konkordancia heterozigóta állapotban 3,6%, homozigóta esetén már 17,7%. Poligenikus meghatározottság esetén jellemző, hogy a kiváltó kórfolyamatra
több
genetikus
befolyás
fenotípusként
különböző
kórélettani
folyamatokat eredményezhet, ugyanakkor a több száz igazolt variáns egyenként mérsékelt rizikófokozódást okoz. További jellegzetesség, hogy a gének csak bizonyos körülmények között fejtik ki hatásukat (variabilis penetrancia), más
esetben csak
egyszerre több gén képes hatást kiváltani (gén-dózis hatás), valamint lehetséges, hogy a gén külső hatással találkozik (epistaticus interakció, pl.dohányzás, anticoncipiens szedése). Gyakran a végső hatás szinergisztikus mechanizmusok útján jön létre. Megállapítható, hogy a genetikai hatások a fiatal korban megjelenő stroke esetén kifejezettebbek és ezeket testvér és családvizsgálatok eredményei bizonyítják. A polimorfizmusok egy része: 1) befolyásolhatja a stroke rizikóját (itt vannak nemcsak kedvezőtlen, hanem ún. védő genetikai variánsok is, gyakran ezek együttes előfordulása neutralizálhatja a rizikó kedvezőtlen irányba történő eltolódását, ennek a jelenségnek a felmérése epidemiológiai vizsgálatokkal még nem történt meg),
56
2) befolyásolhatja az infarktus nagyságát is (a vascularis reakció, a kollaterális keringés, az isémiás folyamatra történő neuronális válasz megváltozásával), valamint 3) az eNOS-NO szint befolyásolása útján az endothel károsodását idézheti elő és kedvezőtlen hatású az autoregulációra is. A „stroke gén” megtalálása több szempontból nehéz feladat: a) a stroke betegség jellemzően késői megjelenése miatt, b) a „locus heterogenitás” miatt, amin azt értjük, hogy több betegség-allél képes létrehozni ugyanazt a fenotípust, c) a stroke megjelenésében heterogén (syndroma) és különböző pathogenézisű betegség, d) valamint a stroke 30%-a criptogen. Csak néhány ún. „stroke gén”-t fedeztek fel az utóbbi két évben Izlandon történt vizsgálatokkal, a foszfodieszteraze 4D gént (PDE4D) és az 5-lipoxigenaze aktiváló protein gént (ALOX5AP) (Gretarsdottir S. 2003, Helgadottir A. 2004). A genetikai polimorfizmusok hatásai két szinten vizsgálhatók: 1) az egyén szintjén az epistatikus interakció révén, valamint 2) populációs szinten, itt a sporadikus esetek magas prevalenciával fokozzák a populáció vascularis rizikóját, mely népcsoportonként és földrajzi elhelyezkedéstől függően nagy különbségeket mutathat. 5. 1. A Faktor II genetikai polimorfizmus A mutáció prevalenciája egészségesekben, Európában átlagosan 1,0 % észak-déli növekedést mutat (Rosendaal FR. 1998). Egészségesek körében végzett, első hazai, kelet-magyarországi vizsgálatokban a prothrombin 20210A variáns előfordulását 1.4%nak találták, míg trombofiliás betegekben a fenti variáns előfordulása 3,9%-os (OR: 2,7) (Balogh I. 1999). Saját vizsgálati adataink jó egyezést mutattak Balogh és mtsai eredményeivel. Ezek szerint viszonylag egyenletes mutáns eloszlás tételezhető fel az ország különböző területein (1,4 keleten és 0,9 a saját vizsgálatunkban). A fiatal stroke betegeknél az eddigi vizsgálatok adatai jelentős különbségeket tártak fel. De Stefano (De Stefano. 1998) elemzésében a heterozigóta prevalencia 9,7 %-nak bizonyult, míg a homozigóta gyakoriság 2,7% volt. Mások gyermekkorban kialakuló ischaemias stroke-ban vizsgálták egyéb polimorfizmussal együtt (Leiden mutáció és MTHFR C677T) a faktor II variáns szerepét (McColl. 1999). Nem találtak szignifikáns különbséget a két csoport között. Egy ausztriai vizsgálatban 33 csecsemő vérmintáiban 57
Leiden mutációt és faktor II variánst vizsgálták (Zenz W. 1998). Az előbbi mutáció szignifikánsan magasabb volt a csecsemőkori vascularis eredetű agykárosodásban, mint a kontroll csoportban (18% versus 4,6 %, p=0,01). Mások 45 év alatti nőkben vizsgálták a Leiden mutáció és a faktor II variáns előfordulását és összefüggését a stroke rizikójával (Longstreth WT. Jr. 1998). Sem a Leiden mutáció előfordulásában (OR: 1,2), sem a faktor-II mutáns esetében (OR: 1,48) nem lehetett szignifikáns különbséget kimutatni. Ennek alapján nem javasolják a protrombin gén fenti mutációjának rutinszerű szűrését. Egy prospektív amerikai vizsgálatban 833, kezdetben egészséges férfinél, akiknél 10 éves követés során időközben MI, stroke vagy MVT alakult ki megvizsgálták a faktor II-A allél gyakoriságát (Ridker PM. 1999). A kontrollokban nem alakult ki agyi thrombosis (n=1774). Nem volt szignifikáns relativ rizikóemelkedés sem a MI, sem a stroke (RR: 1,1 p=0,8) csoportban, csupán az MVT esetekben találtak marginálisan szignifikáns rizikó emelkedést (RR:1,7 p=0,08). Reuner és mtsai (Reuner KH. 1998) vizsgálatukban ischaemias stroke és/vagy TIA beteg adatait hasonlították össze kontrollokkal. Itt az OR 2,3 volt. Van Goor és mtsai (Van Goor M.P.J. 1999) 45 holland ischaemias stroke beteget vizsgáltak, akik 45 évesnél fiatalabbak voltak és az OR-t a kontrollokkal szemben 4,31-nek találták. Szén és mtsai (Szén L. 1997) egy thrombofiliás család két tagjánál mutatták ki a faktor-II heterozigóta állapotát. A családban halmozottan fordult elő MVT és pulmonális embólia. Egy újabb keletű vizsgálatban Lalouschek és mtsai (Lalouschek K. 2005) férfi stroke betegekben szignifikánsan magasabb G20210A frekvenciát talált a kontrollokhoz képest (6% versus 1%) melyet nem észleltek nőbetegekben. Vizsgálataink alapján a hazai egészéges csoportban a 20210A variáns prevalenciája 0,9 % ami megegyezik az európai átlaggal. Azoknál, akiknek 0 vagy 1 hagyományos vascularis rizikó faktoruk van, a genetikai vizsgálatot érdemes elvégezni. Több vascularis genetikai rizikófaktor közül a Faktor II és PLA polimorfizmus együttes előfordulása a rizikót tovább emelheti. 5. 2. Az ACE gén I/D polimorfizmus Az ACE gén insertios/deletios intron polimorfizmusa PCR módszerrel jól kimutatható, a polimorfizmus különböző genotípusai és a cardiovascularis rendszer betegségei között szoros összefüggés mutatható ki, különösen ami a D/D variánst illeti, azonban a genetikai pontmutáció okozta funkcióváltozás még nem ismert. Valószínűleg egy
58
markerről van szó, amely endothel lokalizációjú, jelenléte részben magasabb angiotenzin koncentrációval, részben endothel diszfunkcióval jár együtt (Kopper L. 1997). Egyes külföldi vizsgálatok adatai szerint a D/D genotípus magasabb arányban fordul elő azoknál 1) akik myocardialis infarctuson estek át 2) ischaemias stroke esetén 3) ischaemias és idiopathias cardiomyopathiaban 4) hypertrophias cardiomyopathias betegek közül azoknál, akik hirtelen haltak meg és a 5) PTCA utáni restenosissal járó esetekben (Lindpaintner K. 1995). A stroke és D allél összefüggése nem ennyire egyértelmű. Irodalmi adatokból kitűnik, hogy a szerzők többsége a kontroll csoporttal szemben nem talált szignifikáns D allélfrekvencia fokozódást. Tehát az I/D és a D/D variáns önmagában nem okoz kockázat emelkedést a stroke betegeknél, ezeknek egyik alcsoportjában sem. Ezek a vizsgálatok 60-200 közötti betegszám mellett lettek elvégezve. Saját vizsgálatainkban a kontroll csooporthoz képest, 50 év alatti betegekben a vad típushoz képest a D allélt szignifikánsan többnek találtuk (OR: 3,28 95% CI: 2,04-5,26 p=0,001).
Ugyanakkor vannak szerzők, akik a betegek családtagjainál
szignifikánsan több stroke-ot fedeztek fel a D/D genotípussal rendelkezőknél (Margaglione M. 1995). Mi a családi anamnesisben (3. táblázat) a D allél és a myocardialis infarctus között találtunk pozitív összefüggést. Ugyanakkor a D/D genotípusnál várható volt a szorosabb kapcsolat a hypertoniával, de ezt nem tudtuk igazolni, amit ugyanakkor japán betegekben bizonyítottak (Kario K. 1996).
Nem
találtunk kapcsolatot a makro-angiopathia (carotis stenosis) és a D allél között, amit viszont többen igazoltak kaukázusi betegeknél (Sertic J. 1996, Pfohl M. 1998). Új összefüggésként tudtuk megállapítani, hogy a fiatal, 50 év alatti betegeknél a D/D genotípus
a
hyperlipidaemiával
és
a
plazma
fibrinogén
koncentrációjának
emelkedésével mutat szoros összefüggést, ami jelentős rizikóemelkedéssel járhat. Vizsgálataink alkalmával még egy összefüggést találtunk, mely az ACE gén polimorfizmus természetére és a stroke pathomechanizmusára jellemző, úgy tűnik, hogy a cardialis emboliás mechanizmusban nem játszik szerepet a D allél. Az ACE gén fenti polimorfizmusának pathogenetikai szerepe stroke betegeknél még nem teljesen tisztázott, de Sharma és mtsai (Sharma P.?) metaanalízise szerint recesszív modellben mérsékelt, ugyanakkor független rizikófaktor az ischaemiás stroke kiváltásában. Összefoglalva, első hazai stroke vizsgálatként igazolva látjuk, hogy a D allél, különösen a D/D genotípus 50 év alatti betegeknél, egyéb rizikótényezőkkel (zsíranyagcserezavar 59
és
hyperfibrinogenaemia)
társulva
szerepet
játszhat
a
szélütés
rizikójának
fokozódásában.
5. 3. A GP IIb/IIIa (Leu33Pro) polimorfizmus (klinikai és in vivo vizsgálatok) Klinikai vizsgálatainkat tekintve megállapítottuk, hogy egészségeseknél a PLA2 allél prevalenciája magasabb, mint a közép-európai adatok szerinti és megegyezik az USAbeli kaukázusiak és kanadai franciák körében észlelt adatokkal. Stroke-betegeinknél rizikófokozódást észleltünk a teljes beteganyagban, 1,42 OR-val, az 50 év feletti betegek körében pedig marginálisan szignifikáns 1,65 OR-val. Ez azt támasztja alá, hogy a PLA2 polimorfizmus a biológiai kor előrehaladtával, valószínűleg egyéb faktorokkal együtt, már jelentősebb rizikótényező. A fiatal stroke betegeknél a heterozigóta formát gyakoribbnak találtuk 20-85% carotisszűkület esetén, ugyanakkor ebben a betegcsoportban egy másik, mostanában vizsgált polimorfizmus (faktor-II, G20210A) együttes előfordulását 7,0 OR-val találtuk (Pongrácz E. 2001). Nagyobb elemszámú, későbbi vizsgálatainkban a kettős polimorfizmus együttes előfordulását meg tudtuk erősíteni (12. táblázat). A fentiek alapján a P1A2 vagy P2A2 genotípusú stroke-betegeknél mérsékelt, örökletes rizikófokozódással lehet számolni.
A PLA2
pontmutáció klinikailag releváns patogenetikai szerepéről a rendelkezésre álló irodalmi adatok ellentmondásosak (Hassan A. 2004). Obliteratív érbetegségek közül főleg ischaemias stroke-ban és myocardialis infarctusban vizsgálták. A fenti eredények azt támasztják alá, hogy a PLA2 polimorfizmusnak, mint önálló, genetikai rizikófaktornak a szerepe további tisztázásra vár. A különböző földrajzi elhelyezkedésű
népcsoportok
egészséges
véradóinak
csoportjaiban
lényeges
különbségek mutatkoznak a polimorfizmus prevalenciáját illetően, a magasabb strokemortalitású országokban és így hazánkban is a heterozigóta patológiás állapot is gyakoribb. Egyidejűleg egyéb genetikai polimorfizmussal is rendelkezőkben a PLA2 variáns kedvezőtlenül módosíthatja a protrombotikus állapotot. Mérsékelt, kockázatot növelő tényező lehet, melynek az a jelentősége, hogy a magas PLA2 allél gyakoriság populációs szinten genetikai terheltséget jelenthet, miután a trombocita GP IIb/IIIa complex IIIa részén kimutatható mutáció a trombocita mérsékelt, ugyanakkor állandó aggregáció fokozódásához vezet ugyanakkor az egy trombocitán előforduló receptor szám a többi sejtfelszíni receptorok közül a legmagasabb (kb.40.000 / trombocita).
60
Ex vivo trombocita aggregációs és flow citometriás vizsgálataink célja az volt, hogy egy komplex vizsgálati rendszerben kimutassuk, hogy van e különbség a vad típusú és heterozigóta receptorok reakciójában különböző induktorokra. A trombociták aggregációs képességét leggyakrabban ADP-vel, adrenalinnal és kollagénnel indukálva vizsgálják. Esetünkben azonban a risztocetin alkalmazásával mutatkozott szignifikáns különbség a vad és heterozigóta típusú trombociták aggregációs képességében teljes vérben, ami a vWf –al való kapcsolódásra utal. Továbbiakban az ATP release mértékét vizsgáltuk, mely megegyezett a kétféle trombocita esetén.
Továbbiakban flow
citometriás vizsgálataink (teljes vérben és PRP-ben) új megvilágításba helyezték a kérdést, mert sikerült igazolnunk, hogy egyrészt a heterozigóta típusú trombociták szignifikánsan magasabb értékben expresszálják a PLA2 receptorokat, mint a vad alléllal redelkezőket, másrészt ezeknek a receptoroknak jelentősen megnő a FIB kötő affinitásuk. Ugyanakkor az ADP szerepére mutat rá a flow citmetriás vizsgálati sorozat, mely induktor alkalmazása során az egy trombocitán expresszálódó receptorok mennyisége szignifikánsan többnek mutatkozott a PLA2 típusú trombocitákon a vad alléllal rendelkezőkhöz képest. 5. 4. A faktor V (Leiden) mutációs vizsgálatok A vénás rendszerben jelentkező thrombosisok létrejöttéért az AT-III hiány 2-4%-ban, a protein S és protein C hiány egyaránt 5-8%-ban, a fibrinogén abnormalitás 10-15%-ban és az APC rezisztencia 35-40%-ban felelős. A Leiden (FV Q506) mutáció fennállása esetén az öröklött trombofiliák között számolnunk kell pathogenetikai szerepével. Elméletileg felelőssé tehető az artérias trombózisok kialakulásáért is, de az idevágó irodalmi adatok ellentmondásosak. Leginkább a kaukázusi populációban fordul elő és dél-észak gradienst mutat (Pullicino P. 1997). A magyar népességben a fenti polimorfizmus egyike a leggyakoribbaknak (Balogh I, 1988. 88), ugyanakkor magas az előfordulás a görög, ciprusi, török és dél-svédországi adatok szerint is (Rees D. C. 1999). A Magyarország keleti részén élő egészséges roma lakosság körében végzett vizsgálatok szerint a mutáció a világon itt a leggyakoribb (heterozigóta 10,2%, homozigóta 2%). Az allélfrekvencia magyar körben: 4,9% (3,4-6,4), roma körben: 7,1% (4,2-10,1) (Balogh I. 1999). Négereknél a Leiden mutáció ritkaság számba megy (Rosendaal FR. 1998). Artériás trombosisban a vizsgálatok egy részében nem találtak számottevő rizikófokozódásra utaló prevalencia növekedést (Chapman J. 1999, 61
Madonna P. 2004). Ugyanakkor a neonatalis és fiatalkorú betegek esetén szignifikáns rizikófokozódást talált több szerző (McColl MD. 1999 Zenz W. 1999, Kenet G. 2000). Hazai vizsgálók szerint az isémiás stroke nagyérbetegséggel jellemzett alcsoportjában szignifikáns rizikófokozódás volt észlelhető (Szolnoki Z. 2001). Önmagában a Leiden mutáció heterozigóta formája nem fokozza szignifikánsan az isémiás stroke rizikóját. Ezt észlelte Lalouschek is, azonban interakciót talált a Leiden mutáció, a dohányzás és a női nem között , ezekben a betegekben szignifikánsan több mutációt találtak mint a kontrollokban (OR 8,8 95% CI: 2,0-38,0; p=0,004) (Lalouschek J. 2005). Saját vizsgálatunk adatai is alátámasztják azt a megállapítást, hogy a faktor V Leiden mutáció nem fokozza a stroke rizikóját, ugyanakkor kimutattuk, hogy az 50 év alatti betegekben magasabb rizikót jelent (OR: 1,67), mint az idősebb betegek esetén (OR:1,21). A fentiek alapján 50 év alatt fellépő, ischaemias stroke esetén a trombofilia vizsgálatok között javasolható a Leiden mutáció vizsgálata is. Indokolt egyszerre több genetikai polimorfizmust is vizsgálni, mert több polimorfizmus jelenléte egymás hatását erősítik, a trombóziskészség fokozódik (gén-dózis hatás) (Pongrácz E. 2002, Szolnoki Z. 2000). Egyidejűleg szedett hormonális fogamzásgátló gyógyszerek is befolyásolhatják a trombóziskészséget Leiden mutáció megléte esetén. Minél több a meglévő genetikai terheltség és a külső provokáló tényező (trauma, gyógyszerek, hagyományos rizikófaktorok jelenléte) annál nagyobb szerepe lehet a Leiden mutációnak artériás trombózis esetén is (Gaustadnes M. 1997). Vizsgálatainkban új megállapítás, hogy a Leiden mutációval rendelkező betegek felmenő ági rokonai között szignifikánsan több stroke volt kimutatható, ugyanakkor előfordulása egyéb vaszkuláris betegségekkel nem mutatott összefüggést. Vizsgált anyagunkban a Leiden mutációs betegcsoportban szignifikánsan több hiperlipidémias beteg volt (p=0,03) és ez vonatkozott mind a hiperkolesztrinémiás, mind a hipertrigliceridémiás csoportra is. A fentiek alapján a Leiden mutáció vizsgálata diagnosztikus célból javasolható a trombofiliás panelben. Amennyiben ischaemias stroke esetén a terápiás megfontolások között az antikoagulálás szükségessége is felmerül (pl. többszörös, de egyenként nem szignifikáns intracerebrális stenosisok), akkor a Leiden mutáció jelenléte segítséget jelenthet abban, hogy egyértelművé teheti az antikoagulálás akár élethosszan tartó alkalmazását is.
62
5. 5. Az ABCA1 genetikai polimorfizmus vizsgálatok Az ABCA1 gén egyes nucleotid polimorfizmusai viszonylag gyakoriak. Több variáció érinti az aminosav sorrendet, a 11 polimorfizmus allélfrekvenciája kb. 1 % (Probst MC. 2004). Az ABCA1 gén kódoló régiójának leggyakoribb misszensz polimorfizmusa az R219K, a K allél frekvenciája 25-46% kaukázusi populációban. Egészségesekben és ischaemias eredetű cardiovascularis betegeségekben többen vizsgálták az általunk is vizsgált polimorfizmusokat, de ischaemias stroke-ban a mi vizsgálatunk az első. Mi is hasonló eredményeket értünk el, mint Clee és mtsai vizsgálataikban (Clee SM. 2001). Azonban a V771M variánsra nézve szignifikáns allél frekvencia csökkenést tudtunk kimutatni a kontroll csoporttal szemben nemcsak a coronariabetegek, hanem a stroke betegek csoportjában is. További eredményeink szerint a stroke betegek csoportjában az átlagos életkor a stroke diagnozisának időpontjában az R219K homozigóta és heterozigóta betegekben szignifikánsan magasabb volt, mint az R219K vad alléllal rendelkező betegekben (58,2±13,0, 55,4±13,8 versus 51,2±14,9). A coronariasclerosisos betegeinkben az átlagos életkor nem különbözött szignifikánsan az R219K genotípusokra nézve a különböző csoportokban. Mégis, az alcsoport vizsgálatok szerint mindkét betegcsoportban, akiknek a betegségük megjelenésekor az életkoruk fiatalabb volt, mindkét variáns (R219K és V771M) szignifikánsan csökkent allélfrekvenciát mutatott (2. ábra). Már Clee és mtsai. is kimutatták, hogy az ABCA1 I883M is védő faktorként szerepet játszik coronaria betegekben. Ebben a megfigyelésükben az R219K és V771M variánsok között „linkage disequilibrium” kapcsolat mutatkozott.
A mi vizsgálatunkban a V771M variáns, vagy a kapcsolt
heterozigóta állapot az V771M és R219K-ra szignifikáns allélfrekvencia csökkenést mutatott a betegcsoportokban annak ellenére, hogy a kontroll csoport átlag életkora fiatalabb volt, mint a coronaria és stroke betegek átlagos életkora. Nem tudtunk kimutatni összefüggést az ABCA1 I883M genotípusok és a coronariabetegség vagy a stroke megjelenése között. Ennek a variánsnak a szerepéről az irodalomban ellentmondásosak az adatok. Clee és mtsai adatai szerint ennek a variánsnak a hordozói között a coronaria betegség súlyosabb megjelenésű. Wang és mtsai (Wang J. 2000) az I883M homozigóta genotípusa esetén magasabb HDL koncentrációt talált a betegek plazmájában, mint heterozigóta vagy vad allállal rendelkezőkben. A hazai populációban ennek a polimorfizmusnak a szerepe rejtve marad, mert a hetero és homozigóta prevalencia igen alacsony. Összefoglalásképpen megállapítható, hogy az ABCA1 63
R219K és V771M polimorfizmusok védő szerepet játszhatnak a coronária és stroke betegség szempontjából. A védő hatás kifejezettebb a fiatalabb egyénekben, valamint azoknál az egyéneknél, akik az ABCA1 génen mind az R219K, mind V771M polimorfizmust együttesen hordozzák. 5. 6. Összesített genetikai vizsgálatok Vizsgálataink egyik jellemzője volt, hogy a „haemostasis-endothel interface” rendszer viszonylag sok (hat) genetikai polimorfizmusát tudtuk vizsgálni egyszerre, melyek vizsgálataink idején a nemzetközi munkacsoportoknál is a figyelem központjában voltak. Jellemző volt a vizsgált polimorfizmusokra, hogy mindegyik (kivéve az ABCA1) mérsékelten, egyenként emeli az IS kockázatát (Carter AM. 1996, Catto AJ. 1997). Az emelkedés mértékében van különbség a kaukázusi populációk között, mint említettük a GP IIb/IIIa lényegesen gyakoribb a hazai egészségesek között, összehasonlítva más adatokkal. A thrombocita receptor IIIa részén lévő anminosav csere konformáció változást eredményez, in vitro flow cytometriás vizsgálatokban ADP agonista esetén fokozott választ lehetett mérni a log mean értékekben a vad alléllal rendelkezőkhöz képest. Ennek a jelenségnek a szerepe két szempontból lényeges: 1) Ha a betegben a haemostasis rendszer más thrombogén polimorfizmusai is jelen vannak egyidejűleg, akkor a prothrombotikus állapot rizikója megnő (gén-gén interakció). Ezt mutattuk ki a PLA2 és Faktor II kapcsolódása esetén. 2)
Másik megállapítás, hogy a fenti polimorfizmussal rendelkező receptorok
aggregáció gátló gyógyszerekkel szembeni affinitásuk csökken. Ilyen esetben a gyógyszerek szedése mellett az esetek kb 30%-ában nem kellő mértékű a gátlás mértéke (Pongrácz E. 2005). Az általunk kiválasztott genetikai polimorfizmusokról már korábbi munkákban igazolódott, hogy a vad alléllal rendelkező genotípushoz képest a kódoló gén szerint a heterozigóta állapot a fenotípusban mérsékeltebb, a homozigóta variáns erőteljesebb fenotípus változást eredményez (Poort SR. 1996, Santoso S. 1997, Santoso S. 1998, Pullicino P. 1997, Tybjaerg-Hansen A. 1997, Bertina RM. 2001). Ez alapján feltehető, hogy amennyiben a betegcsoportban protrombogén genetikai polimorfizmusok heterozigóta vagy homozigóta csoportjai gyakoribbak akkor emelhetik az öröklött trombózis készséget.
64
A vizsgálataink szerint nemcsak a trombocita-plazmatikus alvadási faktorokban, hanem az alvadási faktorok génjei (Faktor II, FIB) és az endothel diszfunkciójához köthető további két polimorfizmus (ACE I/D és MTHFR) együttes előfordulásában is szignifikáns
rizikófokozódás
mérhető
a
kontrollokkal
szemben.
Ezekből
a
vizsgálatokból kitűnik a prothrombin gén polimorfizmusának jelentősége is.
5. 7. BAEP és viszkozitási vizsgálatok Elsőként vizsgáltunk két, viszonylag távol álló vizsgálati módszerrel hátsóskálai mikrokeringés károsodásával összefüggő szubklinikus jelenségeket. Amennyiben a gócos agytörzsi károsodások a kiváltott válasz pályája mentén helyezkednek el, általában egyoldali hullámmorfológiai károsodásokat okoznak.
Eredményeink két
irányból is megközelíthetők. 1. A klinikai elektrofiziológiai laboratóriumban kiváltott válaszokat végző vizsgálók, amennyiben egyidejűleg kétoldali kóros BAEP elváltozásokat észlelnek, javasoljanak hemorheológiai vizsgálatokat is a kórfolyamat további tisztázása érdekében. 2. A stroke szakambulanciák vertebrobasilaris keringészavar kivizsgálási protokolljába illesszék bele a fenti vizsgálatokat együttesen. Vizsgálataink eredménye alapján felvetődik a kérdés, hogy a talált bilaterális kóros minták a hyperviszkozitás normalizálásával megszüntethetők e, vagy kórosságuk mértéke csökkenthető-e ( pl. sorozat hemodilutioval, rheológiailag aktív gyógyszerek szedésével). Előzetesen 12 beteg, átlagosan 3 hemodilutios kezelése után mért kontroll BAEP vizsgálatok azt mutatták, hogy a viszonylag "frissen" fennálló hyperviszkozitás (nem több, mint 4 hónapja) rendezése után a BAEP minták kórossága jelentősen mérséklődött. Ennél régebbi polyglobuliás betegekben a viszkozitási viszonyok normalizálása a BAEP mintákban változást nem okozott. 5. 8.
Fibrinogén -455 G/A polimorfizmus, Leiden mutáció és haemorheologiai
vizsgálatok Hazai egészségesekben a FIB gén H2 alléljának a frekvenciája 42,5% mely hasonló az USA-beli eredményekhez (35,2%) (Kessler C. 1997). A betegekben előforduló H2 allél lényegében nem gyakoribb az egészséges kontrollokhoz viszonyítva, ugyanakkor
65
egyetértésben különböző szerzőkkel a plazma FIB koncentrációjának döntő meghatározója (Nishiuma S. 1998, Tybjaerg-Hansen A. 1998). Vannak ezzel ellentétes megállapítások is (Carter AM. 1996, Folsom AR. 2001). Mi a H2/H2 genotípus esetén stroke betegekben szignifikánsan magasabb plazma FIB koncentrációt regisztráltunk. Nem dohányzó betegekben, amennyiben H2/H2 genotípussal rendelkeztek a dohányzókhoz viszonyítva a kedvező, alacsonyabb plazma FIB koncentráció emelkedik, így a hatás kiegyenlítődik. A H2/H2 genotípus magasabb teljesvér viszkozitással járt együtt nem dohányzókban, de nem mutatott összefüggést a plazma viszkozitásával. A Leiden mutáció - mint már korábban említettük – mérsékelten gyakoribb a begtegekben, mint a kontrollokban. Nem találtunk pozitív összefüggést a magas vérnyomással, a diabetes mellitussal és a dohányzással. Új megfigyelésünk, hogy 1) a Leiden mutáció pozitív összefüggést mutat az emelkedett plazma viszkozitással, 2) ez a jelenség megfigyelhető fiatal stroke betegcsoportban is és 3) a nem dohányzó betegek csoportjában is. Kevés közleményt találtunk a hemosztázis rendszer genetikai polimorfizmusai és haemorheologiai paraméterek kapcsolatáról. Weng szoros kapcsolatot talált a FIB -455 A allél és a vvs. aggregációja között MI btegekben (Weng X. 1999). Vizsgálataink lehetséges kórélettani háttere: a -455G/A polimorfizmus esetén kóros szerkezetű FIB képződhet, mely a koagulációs kaszkád prothrombotikus
irányú
eltolódásához
vezethet
(fokozódó
FIB-FIB
és
FIB-
vvs.kapcsolat) emelkedett teljesvér viszkozitással. Ugyanakkor a Leiden mutáció és az emelkedett plazma viszkozitás közötti kapcsolat nem tisztázott kellően. Mostanában Andrew és mtsai alacsonyabb fibrinolitikus aktivitást igazoltak Leiden mutáció jelenlétében patkányokban (Andrew C. 2004). A folyamat kórossága a trombin aktiváló fibrinolitikus inhibitor enzimrendszerrel (TAFI) függ össze. Vizsgálataink azt igazolják, hogy a hemosztázis rendszer bizonyos genetikai polimorfizmusai nemcsak a véralvadás folyamatai révén, hanem a haemorheológiai viszonyok kóros megváltoztatása révén is, együtt hozhatnak létre prothrombotikus állapotot. 5. 9. A trombocita aggregációs vizsgálatok A trombociták aggregációs képességének csökkentése meghatározó jelentőségű az IS másodlagos megelőzésében, mely gyógyszerek alkalmazása 20-25%-al képes csökkenteni a következő ischaemias eseményt (Antiplatelet Trialists’ Collaboration 1994). Az aszpirint monotherapiában szedő betegek esetében a rizikó csökkenés 17%. 66
Ugyanakkor az is igazolható, hogy az aszpirint szedő stroke betegek 10-20 %-ában annak ellenére bekövetkezik egy újabb esemény, hogy szedik a gyógyszert. Ez a jelenség a klinikai rezisztencia. A laboratóriumi rezisztencia kérdése és főleg ennek a jelenségnek a klinikai eseményekkel történő összefüggése jelenleg intenzív kutatások tárgya. Vizsgálatainkban a CARAT TX aggregométerrel különböző központokban jól egyező eredményeket kaptunk mind egészségesek laboratóriumi adatainak, mind az aszpirint szedő betegek vizsgálata során. A jelenleg alkalmazott vizsgálat az eredeti Born módszerrel szemben kiküszöböli a thrombocita szám befolyását (itt standard, 300 ezerre van beállítva), az induktorok különböző koncentrációját (itt fix dózisú induktorok kerültek alkalmazásra), valamint a teljesvér aggregometriával szemben nincs befolyása az eredményekre a hematokrit értékének sem. Vizsgálataink második részében nagyszámú beteganyagon vizsgáltuk a laboratóriumi rezisztencia kérdését különböző induktorok alkalmazásával. Aszpirin monotherapia alkalmazása esetén (100-325 mg/nap dózisban) 17%-ban találtunk laboratóriumi rezisztenciát az egyik vizsgálatunkban (n=555) és másik mortalitási vizsgálatunkban ez az eredmény 22% volt (204 beteg a 921 ből). Ezek jó közelítést mutattak Helgason eredményeivel összehasonlítva (Helgason C.M. 1993). Új megállapítás, hogy stroke betegeink kezelése során clopidogrel rezisztenciával hasonló nagyságrendben kell számolnunk, mint aszpirin rezisztencia esetén (18%). A laboratóriumi rezisztencia jelentőségét ítéltük meg következő vizsgálatunkban, mely során megállapítottuk, hogy azok közül az aszpirint szedő betegek közül, akik a laboratóriumi rezisztencia ismeretében nem lettek thienopyridin készítményre átállítva, szignifikánsan magasabb volt az összmortalitás az átállítottakhoz képest. A fenti eredmények alátámasztják azt a megfigyelést,
hogy
a
rutinszerüen
alkalmazott
és
nemzetközi
ajánlásokban
megfogalmazottak szerinti gyógyszeres kezelés esetén az aggregometriás vizsgálatokkal jelentős individuális különbségek mérhetők. A rezisztens esetekben vagy a gyógyszer adagjának emelése (aszpirin esetén 100 mg-ról 300 mg-ig), vagy a gyógyszer másikra történő váltása szükséges, mint ahogy utóbbi vizsgálatunkból látható, hogy az ASA rezisztens betegeknél a thienopyridinre való átállítás életmentő jelentőségű volt.
67
6. KÖVETKEZTETÉSEK Vizsgálataink az alábbi következtetések levonását engedik meg: Közép-magyarországi egészséges egyének között a vizsgált véralvadásigenetikai polimorfizmusok gyakoriságukban megegyeznek az egyéb európai egészséges csoportok gyakoriságaival, kivéve a trombocita GP IIb/IIIa PLA2 variánsát, mely 40%al gyakoribb, ezt megerősítik egyéb hazai vizsgálóhelyek adatai is. Bár a polimorfizmus relatív kockázatemelő hatása betegekben mérsékelten, de kimutatható, ugyanakkor előfordulása populációs szinten magas (minden 3-ik egyén heterozigóta), javasolható a vascularis genetikai vizsgálatok paneljében való szerepeltetése. A fenti megállapítás fontosságát támasztja alá további új megfigyelésünk, mely szerint in vitro vizsgálatokkal kimutattuk, hogy a PLA2 variánssal rendelkező trombocita hiperaktiváció egyidejűleg több mechanizmussal valósul meg, ilyen módon felelős lehet a gyógyszeres kezelés (ASA és thyenopyridin származékok) nem kellő hatékonyságáért (non-reszponzió). Amennyiben a genetikai vizsgálat PLA2 allélt igazol, a beteg szekunder stroke profilaxisa során fokozottabb figyelmet kell fordítani az antiaggregációs gyógyszerek pontos és megfelelő adagban való szedésére, melyet laboratóriumi módszerekkel is kontrollálnunk kell. Vizsgálatainkban, fiatal ischaemias stroke betegekben sikerült tisztázni, hogy a vizsgált polimorfizmusok közül szignifikánsan gyakoribb a protrombin gén és ACE D allél. Kimutatásuk genetikai panelben fontos, egyes hematológiai laboratóriumokban a protrombin gén már szerepel, ugyanakkor az ACE gén még rutinszerűen nem, mert szinergista módon növelik a hagyományos vascularis rizikófaktorok trombózis elősegítő képességét. Új eredményünk, hogy a fiatal betegcsoportban a kettős polimorfizmusok előfordulása szignifikánsan gyakoribb az egészséges csoporthoz képest, melyek géndózis növelő hatást mutatnak, ezek közül különösen a protrombin gén kapcsolódásai
68
fontosak. Tehát a protrombin gén fenti variánsa nemcsak önmagában jelent trombózis rizikót, hanem fontos gyakori kapcsolódása egyéb variánsokhoz is. További új eredményként értékelhető, hogy a protrombotikus állapot megjelenésében fontos véralvadási genetikai polimorfizmusok nemcsak a véralvadás biokémiai folyamataiban vesznek részt, azokat kóros irányba tolva, hanem megállapítottuk, hogy ezek közül a FIB gén variáns és a Leiden mutáció a haemorheológiai paraméterek közül mind a teljesvér, mind a plazma viszkozitását emelve, haemorheológiai zavarokat okozva tovább emelik a trombózis készséget. Első
megfigyelésü
hiperviszkozitása
még
vizsgálatainkban
egészséges
kimutattuk,
egyénekben
is
hogy
szubklinikus
a
vér
tartós
idegrendszeri
károsodáshoz vezethet, mely elváltozások elektrofiziológiai módszerekkel jól dokumentálhatók, fő jellemzőjük a szimmetrikus hullámmorfológiai megjelenés. Haemorheológiai orientációjú kezelési módszerekkel a hiperviszkozitás normális tartományba való csökkentése egészségesekben megelőzheti a károsodások kialakulását (primer prevenció), poliglobuliával társuló stroke betegekben hozzájárulhat az újabb esemény megelőzéséhez (secunder prevenció). A trombocita aggregációs vizsgálatok eredményei rámutattak arra, hogy a gyógyszeres kezelések ellenére bekövetkező új klinikai események hátterében az esetek egy részében (10-30%) laboratóriumilag is mérhető elégtelen gátló hatás mutatható ki. A metodika alkalmas a gátlási viszonyok tisztázására. Fenti megállapításokat igazolják nagy esetszámú vizsgálataink is, melyek során kimutattuk, hogy laboratóriumi nonreszponzió esetén a gyógyszer váltása a beteg számára életmentő jelentőségű.
69
7. 1. ÖSSZEFOGLALÁS Célkitűzés: Egyszerre vizsgáltuk a haemostasis rendszer több genetikai polimorfizmusát, melyek szerepe ellentmondásos a stroke rizikófaktoraival összefüggésben. Vizsgálódásunk további részében kerestük a vér viszkozitás emelkedésének hatását szubklinikai jelekre, valamint az antiaggregációs therapia során a trombociták laboratóriumilag is mérhető rezisztenciájának gyakoriságát és hatását a mortalitásra. Ex vivo rendszerben mértük a GP IIb/IIIa receptorok polimorfizmusának hatását a receptorok funkciójára. Beteganyag és módszer: PCR-el vizsgáltuk a faktor II G20210A, az ACE gén I/D, a trombocita GPIIb/IIIa receptor (33LeuPro), a Leiden mutáció, az MTHFR, a fibrinogén gén -455 polimorfizmusainak előfordulási gyakoriságát krónikus stádiumban lévő fiatal (<50 év) és idősebb (>50 év) stroke betegekben és kontrollokban. BAEP vizsgálatokkal és a teljesvér viszkozitásának mérésével kerestük az összefüggéseket kontroll és hiperviszkozitásos belgyógyászati és stroke betegekben. A trombocita aggregációt CARAT TX készülékkel ADP, kollagén és adenalin induktorokkal mértük nagy beteganyagban. Eredmények: Elsőként állapítottuk meg hazai anyagon, hogy a vizsgált polimorfizmusok egy része a kontrollokhoz képest gyakoribb előfordulásával tűnik ki (PLA2, Leiden mutáció), mások esetében a családi anamnézisben szignifikánsan több a vascularis esemény a betegek heterozigóta állapota esetén (ACE I/D, Leiden mutáció). Új megállapítás, hogy egyes polimorfizmusok esetén a beteg vascularis betegségei közül szignifikánsan gyakoribb a kapcsolódás a szívinfaktussal és a zsíranyagcsere zavarával (ACE I/D). Eeredeti megfigyelésünk, hogy a PLA2 receptor aktivációja fokozott a vad allélhez képest és több úton vezet erre az eredményre. Elsőként közöltük, hogy az ABCA1 gén vizsgált polimorfizmusai viszont védő hatásúak ischaemias stroke betegekben. Kettős polimorfizmusok együttes előfordulásai esetén leggyakrabban a protrombin G20210A mutat kapcsoltságot a többivel. Szintén elsőként mutattuk ki haemorheológiai vizsgálatokkal, hogy hiperviszkozitásos állapotban a BAEP regisztrátumokban a kóros minták bilaterális jelleggel jelennek meg. A FIB gén -455 G/A homozigóta genotípus esetben magasabb a plazma FIB koncentráció kontrollokkal szemben. Új megfigyelés, hogy a Leiden mutáció magasabb plazma viszkozitással jár együtt a vad alléllal rendelkezőkkel szemben. Elsőként végeztünk megfgyeléseket arra vonatkozólag, hogy a laboratóriumilag igazolható ASA rezisztencia ellenére tovább folytatott antiaggregációs kezelés magasabb mortalitással jár a thienopyridinre váltott betegcsoporttal szemben. H. Andrikovics, E. Pongrácz, Á. Kalina, A.Szilvási, Ch. Aslanidis, G. Schmitz, A. Tordai. Decreased freqencies of ABCA1 polymorphism R219K and V771M in Hungarian patients with cerebrovascular and cardiovascular diseases. Cerebrovasc Dis 2006; 2: 254-259. (IF: 2,16) Bernáth, S.I. Bernát, E. Pongrácz, P. Köves, Z. Szakács, A. Horváth: Effects of blood hyperviscosity on functional integrity in the brain stem: a brain stem evoked auditory potential study. Clin Hemorheology and Microcirculation 2004; 31:123-128. (IF: 0.63) E. Pongrácz, H. Andrikovics, M. Csornai, IS. Bernát, Z. Nagy: Contribution of the -455G/A polymorphism at β-fibrinogen gene and Leiden mutation to haemorheological parameters in ischaemic stroke patients. Clin Hemorheology and Microcirculation 2006; 35:75-82. (IF: 1.03) E. Pongracz, H Andrikovics, J. Fent , J Fűrész, Z. Nagy. The effects of platelet receptor GP IIb/IIIa polymorphism (Leu Pro33) on the receptor expression and platelet aggregation in patients with ischaemic stroke. Turk J Hematol 2007; 24: 155-163. Pongrácz E, Andrikovics H, Bernát SI, Nagy Z. Connection between genetically determined blood coagulation factors and haemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 2008; (közlésre elfogadva) (IF:1,03) E. Pongrácz. Measurement of platelet aggregation during antiplatelet therapy in ischemic stroke. Clin. Hemorheol and Microcirculation 2004; 30 (3-4): 237-42 (IF: 0,63) E. Pongrácz , Z. Káposzta: Antiplatelet therapy in ischemic stroke. Expert Review of Neurotherapeutics 2005; Vol. 5 (4): 541-549.
70
7. 2. SUMMARY Purpose: At the same time was studied some genetic polymorphisms of the hemostatic system, which role is controvers in connection with risk factors of stroke. It has been studied also the effect of blood hyperviscosity on electrophysiological, subclinical signs of brainstem in ischaemic stroke patiens. Furthermore, the laboratory resistance of platelets for antiaggregation drugs was measured in connection with mortality in stroke patients and PLA2 platelets were sutied in vitro system as well. Patients and methods: The factor II G20210A, ACE gene I/D, platelet receptor GP IIb/IIIa (LeuPro33), Leiden mutation, MTHFR G677A and fibrinogen gene -455G/A genetic polymorphisms were studied by PCR method in ischemic stroke patients (group <50 years an older, n=433) compared to healthy controls. Connections has been searched between brainstem auditory evoked potentials (BAEP) and blood hyperviscosity in different groups of ischaemic stroke patients. The laboratory resistance of platelet aggregation was measured by CARAT TX optical aggregometer in a large group n=2455) of ischaemic vascular patients. Collagen, ADP and epinephrine were used as inductors. Results: PLA2 and Leiden mutation prevalence has been found to be more frequent in stroke group as compared to controls. Singificantly more ischaemic stroke and vascular events has been found in family anamnese of patients with heterozigous variant of ACE gene and Leiden mutation as compared to patients having wild types. Hyperactivity and aggregability of PlA1/A2 platelets may occur as result of several mechanisms. Polymorphisms of ABCA1 gene seems to be protect factors with elevated HDL cholesterol as compared to controls. The prevalence of dual genetic polymorphisms are more frequent in stroke patients as compared to controls. The factor II variant coupled with most frequent occurrence with other polymorphisms in stroke patients. On the other hand it has been detected that the pathological BAEP patterns are bilateral in case of blood hyperviscosity. The FIB -455 G/A variant goes hand in and with elevated FIB concentration in plasma and it was detected a tight connection between Leiden mutation and hyperviscosity of plasma compared to patients with wild types. Platelet aggregation studies presented, that in case of ASA resistance, the continuation of ASA treatment leads to significant higher mortality as compared to mortality in group who’s therapy was changed to thyenopyridines. H. Andrikovics, E. Pongrácz, Á. Kalina, A.Szilvási, Ch. Aslanidis, G. Schmitz, A. Tordai. Decreased freqencies of ABCA1 polymorphism R219K and V771M in Hungarian patients with cerebrovascular and cardiovascular diseases. Cerebrovasc Dis 2006; 2: 254-259. (IF: 2,16) Bernáth, S.I. Bernát, E. Pongrácz, P. Köves, Z. Szakács, A. Horváth: Effects of blood hyperviscosity on functional integrity in the brain stem: a brain stem evoked auditory potential study. Clin Hemorheology and Microcirculation 2004; 31:123-128. (IF: 0.63) E. Pongrácz, H. Andrikovics, M. Csornai, IS. Bernát, Z. Nagy: Contribution of the -455G/A polymorphism at β-fibrinogen gene and Leiden mutation to haemorheological parameters in ischaemic stroke patients. Clin Hemorheology and Microcirculation 2006; 35:75-82. (IF: 1.03) E. Pongracz, H Andrikovics, J. Fent , J Fűrész, Z. Nagy. The effects of platelet receptor GP IIb/IIIa polymorphism (Leu Pro33) on the receptor expression and platelet aggregation in patients with ischaemic stroke. Turk J Hematol 2007; 24: 155-163. Pongrácz E, Andrikovics H, Bernát SI, Nagy Z. Connection between genetically determined blood coagulation factors and haemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 2008; (közlésre elfogadva) (IF:1,03) E. Pongrácz. Measurement of platelet aggregation during antiplatelet therapy in ischemic stroke. Clin. Hemorheol and Microcirculation 2004; 30 (3-4): 237-42 (IF: 0,63) E. Pongrácz , Z. Káposzta: Antiplatelet therapy in ischemic stroke. Expert Review of Neurotherapeutics 2005; Vol. 5 (4): 541-549.
71
8. IRODALOMJEGYZÉK 8. 1. A disszertáció irodalomjegyzéke Albers GW, Amarenco P, Easton JD, Sacco RL, Teal P. Antithrombotic and thrombolytic therapy for ischemic stroke. Chest. 119, 300S-320S (2001). A Magyar Stroke Társaság és a Neurológiai Szakmai Kollégium szakmai irányelvei a cerebrovascularis betegségek megelőzéséről, diagnosztikájáról és ellátásáról. Tényekre támaszkodó ajánlások. Agyérbetegségek. 2004; 10. 4: 2-30 Andrew C, Parker BS, Lakshmi V, Mundada MS, Alvin H., Schmaier MD, William P, Fay MD. Factor V Leiden inhibits fibrinolysis in vivo. Circulation. 2004; 110:3594-3598. Antiplatelet Trialists’ Collaboration. BMJ. 1994; 308: 81–106. Antithrombotic Trialists’ Collaboration. BMJ. 2002; 324: 71–86. Bak S, Gaist D, Sindrup SH, Skytthe A, Christensen K. Genetic liability in stroke: a long term follow-up study of Danish twins. Stroke. 2002; 33: 769-774. Balogh I, Póka R, Pfiegler Gy, Dékány M, Boda Z, Muszbek L . High prevalence of factor V Leiden mutation and 20210 a prothrombin variant in
Hungary. Thromb
Haemost 1999: 81: 660-661. Bamford J, Sandercock P, Dennis M, Burn J, Warlow C. Classification and natural history of clinically identifiable subtypes of cerebral infarction. Lancet 1991; 337: 1521-6. Bardoczy J, Gyorffy B, Kocsis I, Vasarhelyi B.: Re-calculated Hardy-Weinberg values in papers published Atherosclerosis between 1995 and 2003. Atherosclerosis. 2004; 173: 141-143.
72
Bertina RM, Koeleman BPC, Koster T, Rosendal FR, Dirven RJ, de Ronde H, van der Velden PA, Reitsma PH. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated proteinc C. Nature. 1994; 369: 64-67. Biousse J, Ou CY, Bray PF, Goldschmidt-Clermont PJ és mtsai. Platelet glycoprotein receptor IIIa polymorphism L1A2 and ischemic stroke risk: the Stroke Prevention in Young Women Study. Stroke. 1998; 29: 581-585. Bodzioch M, Orso E, Klucken J, Langmann T, Bottcher A, Dietrich W, et al: The gene encoding ATP binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease. Nat Genet. 1999; 22: 347-351. Born,G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and reversal. Nature. 1962; 194: 927. Botto, L. D., Yang, Q.: 5,10 methylene-tetrahydrofolate reductase (MTHFR) and birth defects. Am. J. Epid. 1999; 150: 675-682 Braun M. M, Haupt R, Caporaso N.E. The National Academy of Sciences: National Research Council Veteran Twin Registry. Acta GeneticaeMedicae et Gemellologiae (Roma) 1994; 43: 89-94. Brooks-Wilson A, Marcil M, Clee SM, Zhang LH, Roomp K, van Dam M, Yu L, Brewer C, Collins JA, et al. Mutations in ABC1 in Tangier disease and familiar high-density lipoprotein deficiency. Nat .Genet. 1999; 22: 336-345. Burge P.S. és mtsai. Morbidity and mortality in pseudopolycythaemia. Lancet.1975; I:1266-1269. Cambian F, Poirier O, Lecerf L, et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature. 1992; 359: 641-44.
73
Carter A.M., Ossei-Gerning N., Grant P.J.: Platelet glycoprotein IIIa PLA polymorphism and myocardial infarction. N. Eng J. Med. 1996; 335: 14.1073 (Letter) Carter AM, Mansfield MW, Stickland MH, Grant PJ. Β-fibrinogen gene -4555 G/A polymorphism and fibrinogen levels: risk factors for coronary artery disease in subjetcs with NIDD. Diabetes Care. 1996; 19: 1265-68. Carter, AM Ossei-Gerning, N Grant, PJ: Platelet glycoprotein IIIa PLA polymorphism and myocardial infarction. N. Eng. J. Med. 1996; 335: 14. 1073. Carter AM, Mansfield MW, Stickland MH, Grant PJ. Β-fibrinogen gene -4555 G/A polymorphism and fibrinogen levels: risk factors for coronary artery disease in subjetcs with NIDD. Diabetes Care. 1996; 19: 1265-68. Catto A, Carter A, Ireland H, Bayston TA, Philippou H, Barrett J, Lane DA, Grant PS Factor V Leiden gene mutation and thrombin generation in relation to the development of acute stroke. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15 (6): 783-785. Catto AJ, Carter AM, Stickland M, Bamford JM, Davies JA, Grant PJ. Plasminogen activator inhibitor1 (PAI-1) 4G/5G promoter polymorphism and levels in subjects with cerebrovascular disease. Thromb Haemost 1997; 77: 730-734. Chapman J, Wang N, Treves TA, Korczyn AD, Bornstein NM. ACE, MTHFR, factor V Leiden, and APOE polymorphisms in patients with vascular and Alzheimer’s dementia. Stroke 1999 7: 1401-4. A.von Clauss. Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens. Acta Haemathol. 1957; 17: 237-246. Clee SM, Zwinderman AH, Engert JC, Zwarts KY, Molhuizen HO, Roomp K, Jukema JW, van Wijland M, van Dam M, Hudson TJ, Brooks-Wilson A, Genest J Jr, Kastelein JJ,
74
Hayden MR. Common genetic variation in ABCA1 is associated with lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease. Circulation. 2001; 103: 11981205. Csornai M., Vámosi B. Cerebrovascularis betegek kezelése isovolaemias haemodilutioval. Orvosi Hetilap. 1987;128:307-318. Clee SM, Zwinderman AH, Engert JC, Zwarts KY, Molhuizen HO, Roomp K, Jukema JW, van Wijland M, van Dam M, Hudson TJ, Brooks-Wilson A, Genest J Jr, Kastelein JJ, Hayden MR. Common genetic variation in ABCA1 is associated with lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease. Circulation. 2001; 103: 1198-1205. Csornai M., Vámosi B. Cerebrovascularis betegek kezelése isovolaemias haemodilutioval. Orvosi Hetilap. 1987;128:307-318. De Faire U, Friberg L, Lundman T. Concordance for mortality with special reference to ischaemic heart disease and cerebrovascular disease: a study on the Swedish Twin Registry. Preventive Medicine 1975; 4: 509-517. De Stefano V,Chiusolo P, Paciaroni K, Casorelli I, Rossi E, Molinari M, Servidei S, Tonali PA, Leone G: Prothrombin G20210A mutant genotype is a risk factor for cerebrovascular ischemic disease in young patients. Blood. 1998; 10: 3562-3565. Fahey J.L.et al. Serum hyperviscosity syndrome. JAMA. 1965; 192: 464-468. Folsom AR, Aleksic N, Ahn C, Boerwinkle E, Wu KK. Beta- fibrinogen gene – 455G/A polymorphism and coronary heart disease incidence: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Ann Epidemiol. 2001; 11: 166-70. Gaustadnes M, Rudiger N, Moller J, Rasmussen K, Bjerregaard Larsen T, Ingerslev J. Thrombophilic predisposition in stroke and venous thromboembolism in Danish patients. Blood Coagul Fibrinolysis 1999; (5): 251-259.
75
Graffagnino C, Gasecki AP, Doig GS. The importance of family history in cerebrovascular disease. Stroke. 1994; 25: 599-603. Gretarsdottir S, Thorleifson G, Reynisdottir ST, Manolescu A, Johnsdottir S és mtsai. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke. Nat. Genet. 2003; 35: 131-138. Happich D, Schwaab R, Hanfland P, Hoernschemeyer D. Allelic discrimination of factor V Leiden using a 5, nuclease assay. Thromb Haemost. 1999; 82: 1294-1296. Harrison N.J.G. et al. Effect of haematocrit on carotid stenosis and cerebral infarction. Lancet. 1981; II.:114-118. Hassan A., Markus H.S. Polygenic ischaemic stroke including new genetic and statistical approaches. In: Stroke Genetics, Ed. H. Markus, Oxford Univ.Press, London, (2004), 170-176. Helgadottir A, Manolescu A, Thorlefson G, Grettarsdottir S, Johnsdottir S és mtsai. The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardialis infarction and stroke. Nat. Genet. 2004; 36: 233-239. Helgason, C.M., Tortorice, K.L., Winkler, S.R. et al.: Aspirin response and failure in cerebral infarction. Stroke. 1993; 24: 345-350 Ingerman-Wojenszki C M, Silver M J. A quick method for screening platelet dysfunctions using the whole blood Lumi-Aggregometer. Thromb Haemost 1984; 51: 154-56. Kario K, Kanai N, Saito K, Nago N, Matsuo T, Shimada K. Ischemic stroke and the gene for angiotensin-converting enzyme in Japanese hypertensives. Circulation 1996; 9: 1630-3. Kannel W.B. et al: Haemoglobin and the risk of cerebral infarction. The Framingham Study. Stroke. 1972; 3: 409-413. 76
Kenet G, Sadetzki S, Murad H, Martinowitz U, Rosenberg N, Gitel S, Rechavi G, Inbal. A Factor V Leiden and antiphospholipid antibodies are significant risk factors for ischemic stroke in children. Stroke 2000; 31 (6): 1283-1288. Kessler C, Spitzer C, Stauske D, Mende S, Stadlmuller J, Walther R, Rettig R.The apolipoprotein E and beta-fibrinogen G/A-455 gene polymorphisms are associated with ischemic stroke involving large-vessel disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997; 17: 2880-84. Kopper L, Marcsek Z., Kovalszky I. Molekuláris medicina. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1997; p.146-48. Lalouschek W, Schillinger M, Hsieh K, Endler G, Tentschert S, Lang W, Cheng S, Mannhalter C. Matched case-control study on factor V Leiden and the prothrombin G20210A mutation in patients with ischemic stroke/transient ischemic attack up to the age of 60 years. Stroke. 2005; 36 (7): 1405-9. Lalouschek W, Aull S, Serles W, Schnider P, Mannhalter C, Pabinger-Fasching, Deecke I, Zeiler K, C677T MTHFR mutation and factor V Leiden mutation in patients with TIA /minor stroke, a case control study. Thromb Res 1999; 93 (2) 6169. Lalouschek W, Schillinger M, Hsieh K, Endler G, Tentschert S, Lang W, Cheng S, Mannhalert C. Matched case-control study on factor V leiden and the prothrombin G20210A mutation in patients with ischemic stroke/transient uschemic attack up to the age of 60 years. Stroke. 2005; 36: 1405-9. Le Cam-Duchez V, Bagan-Triquenot A, Menard JF, Mihout B, Borg JY.Association of the p rotein C promoter CG haplotype and the factor II G20210A mutation is a risk factor for cerebral venous thrombosis. Blood Coagul Fibrinolysis. 2005; 16 (7): 495-500.
77
Lindpaintner K, Pfeffer MA, Kreutz R, et al. A prospective evaluation of an angiotensin-converting-enzyme gene polymorphism and the risk of ischemic hearth disease. N. Eng. J. Med. 1995; 322: 706-711. Lindpaintner K, Pfeffer MA, Kreutz R, et al. A prospective evaluation of an angiotensin-converting-enzyme gene polymorphism and the risk of ischemic hearth disease. N. Eng. J. Med. 1995; 322: 706-711. Longstreth WT Jr, Rossendal FR, Siscovick DS, Vos HL, Schwarz SM, Psaty BM, Raghunathan TE, Koepsell TD, Reitsma PH Risk of stroke in young women and two prothrombotic mutations: factor V Leiden and prothrombin gene variant (G20210A). Stroke, 1998; 29: 577-580. Lowe G.D.O. et al. Relation of atrial fibrillation and high haematocrit to mortality in acute stroke. Lancet.1983; II: 784-788. Lowe G.O.D., Barbenel J.C., Plasma and blood viscosity. In: Clinical Blood Rheology Vol. I, G.D.O. Lowe (Ed) pp: 11-44, CRC Press, Boca Raton, 1998. Madonna P, de Stefano V, Coppola A, Cirillo F, Cerbone AM, Orefice G, Di Minno G. Hyperhomocysteinemia and other inherited prothrombotic conditions in young adults with a history of ischemic stroke. Stroke 2002; 33(1):51-56. Margaglione M, Celentano E, Grandone E, Vecchione G, Cappucci G, Giuliani N et al. Deletion polymorphism in the angiotensin-converting enzyme gene in patients with a history of ischemic stroke. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996;16: 304-9. Mátrai A, Whittington R.B, Ernst E.: A simple method of estimating whole blood viscosity at standardized hematocrit. Clin. Hemorheol. 1987; 7: 261-265. McGregor JL, Brochier J, Wild F, Follea G, Trzeciak MC, James E, Dechavanne M, McGregor L, Clemetson K. Monoclonal antibodies against platelet membrane glycoproteins. Eur J Biochem 1983; 131: 427-36.
78
McColl, Chlamers EA, Thomas A, Sproul A, Healey C, Rafferty I, McWilliam R,Eunson P: Factor V Leiden, prothrombin 20210G-A and the MTHFR C677T mutations in childhood stroke. Thromb Haemost 1999; 81: 690-694. Meschia J.F., Brown Jr R.D. Genetic epidemiology of stroke. In. Stroke genetics ed. H. Markus. p. 53-65. Oxford Univ. Press, Oxford, 2003. Michelson AD. Flow cytrometry: a clinical test of platelet function Blood 1996; 87: 4925-33. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 1215–20. Módszertani útmutató a hemoreológiai mérések végzéséhez. Érbetegségek 2005; (suppl) 1: 28-29. Morgenstern LB, Spears WD, Goff DC. African Americans and woman have the highest stroke mortality in Texas. Stroke. 1997; 28: 15-18. Nagy Z.: Az agyi vérkeringés kórélettana.
In.
Kórélettan. (Ed.) Szollár L.:
Semmelweis Kiadó, Budapest, 1993. pp. 425 - 428. Nishiuma S, Kario K, Yakushijin K, Maeda M, Murai R, Matsuo T, Ikeda U, Shimada K, Matsuo M. Genetic variation in the promoter region of the betafibrinogen gene is associated with ischemic stroke in a Japanese population. Blood Coagul Fibrinolysis. 1998; 9: 373-79. Nuwer MR, Aminoff M, Goodlin D, Matsouka S., Maugiere F. Starr A, Vibert JF : IFCN recommended standards for brain - stem auditory evoked potentials. Report of an IFCN commitee. Electroencephalography and Clin. Neurophysiology, 1994; 91: 12 - 17.
79
Oram JF, Vaughan AM. ABCA1-mediated transport of cellular cholesterol and phospholipids to HDL apolipoproteins. Curr Opin Lipidol. 2000; 11: 253-260. Pfohl M, Fetter M, Koch M, Barth CM, Rudiger W, Haring HU. Association between angiotensin I-converting enzyme genotypes, extracranial artery stenosis, and stroke. Atherosclerosis 1998;1:161-6. Pollock S. et al. The effect of haematocrit on cerebral perfusion and clinical status following carotid occlusion in the gerbil. Stroke. 1982; 13: 167-171. Pongrácz E., Bernát I.: Hemorheological examinations of healthy middle aged persons. Clin. Hemorheol. 1989; 3: 511-512. Pongrácz E., Tordai A., Andrikovics H., Szén L., Nagy Z. A prothrombin gén G20210A polimorfizmusának vizsgálata fiatalkori ischaemiás stroke-os betegeknél. Agyérbetegségek 2001; 2: 9-13. Pongrácz E., Tordai A., Csornai M. és Nagy Z. Stroke betegek thrombocyta glikoprotein IIb/IIIa (Leu Pro 33) polimorfizmusának vizsgálata. Orvosi Hetilap 2001; 142 (15): 781-785. Pongrácz E. Véralvadási genetika fiatalkori stroke-ban. Clin Neurosci/Ideggy Szle 2002; 55 (3-4): 111-117. Pongrácz E, Káposzta Z.: Antiplatelet therapy in ischemic stroke. Expert Review of Neurotherapeutics. 2005; Vol. 5 (4): 541-549. Poort SR, Rosendal FR, Reistma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3,-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and increase in venous thrombosis. Blood 1996; 88: 3698-703. Probst MC, Thumann H, Aslanidis C, Langmann T, Buechler C, Patsch W, Baralle FE, Dallinga-Thie GM, Geisel J, Keller C, Menys VC, Schmitz G. Screening for 80
functional sequence variations and mutations in ABCA1. Atherosclerosis. 2004; 175: 269-279. Pullicino P, Greenberg S, Trevisan M. Genetic stroke risk factors. Curr. Opin. Neurol. 1997; 10: 58-62. Rees, D. C, Chapman N. H. Webster M T, Guerreiro J. F, Rochette J, Clegg J. B. Born to clot: the European burden. Brit. J. Haemat 1999; 105: 564-566. Reuner KH, Ruf A, Grau A, Rickmann H, Stolz E, Juttler E, Druschky KF, Patscheke H: Prothrombin gene G20210A transition is a risk factor for cerebral venous thrombosis. Stroke, 1998; 29: 1765-1769. Riedker PM, Hennekens CH, Scmitz C, Stampfer M J, Lindpaintner K PLA1/A2 polymorphism of platelet glycoprotein IIIa and risks of myocardial infarction, stroke and venous thrombosis. Lancet 1997; 349: 385-88. Ridker PM, Hennekens CH, Miletich JP G20210A mutation in prothrombin gene and risk of myocardial infarction, stroke and venous thrombosis in a large cohort of US men. Circulation. 1999; 2: 999-1004. Rigat B, Hubert C, Corvol P, Soubrier F. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCP1) (dipeptidyl carboxypeptidase 1). Nucleic Acids Res. 1992; 20: 1433-37. Rosendaal FR, Doggen CJM, Zivelin A, Arruda VR, Aiach M, Siscovick DS, Hillartp A, Watzke HH, Bernardi F, Cumming AM, Preston FE, Reitsma PH. Geographic distribution of the 20210 G to A prothrombin variant. Thromb Haemost 1998: 79. 706-8. Sacchi E, Tagliabue L, Duca F, Mannucci PM:High frequency of the C677T mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene in northern Italy. Thromb Haemost. 1997; 78: 963-964.
81
Sacco R.L, Adams R, Albers G, Alberts MJ, Benavente O, Furie K, Goldstein LB, et al: Guidelines for prevention of stroke in patients with ischemic stroke or transient ischemic attack. AHA/ASA Guidelines. Stroke. 2006; 37: 592-594. Sakai F. et al. Cerebral blood flow and cerebral haematocrit in patients with cerebral ischaemia measured by single-photon emission computed tomography. Acta Neurol. Scand. Suppl. 1989; 127: 9-13. Santoso S, Kiefel V: Human platelet specific alloantigen. Update Vox Sang 1998; 74: 249. Scaglione L, Bergerone S, Gaschino G. Lack of relationship between the P1A1/P1A2 polymorphism of platelet glycoprotein IIIa and premature myocardial infarction. Eur J Clin Invest 1998; 28: 355-358. Sciarrone MT, Stella P, Barlassina C, Manunta P, Lanzani C, Bianchini G, Gusi D. ACE and alpha-adducin polymorphism as markers of individual response to diuretic therapy. Hypertension. 2003; 41: 398-403. Sertic J, Hebrang D, Janus D, Salzer B, Niksic M, Cvoriscec D et al. Association between deletion polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene and cerebral atherosclerosis. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996;4:301-4. Sharma P, Carter ND, Barley J, Brown MM. Molecular approch to assessing the genetic risk of cerebral infartion: deletion polymorphism in the gene encoding angiotensin 1-converting enzyme. J. Hum. Hypertens. 1994; 8: 645-8. Sharma et al. Meta-analysis of the ACE gene in ischaemic stroke.
J Neurol
Neurosurg Psychiatry. 1998; 64(2):227-30. Shundt J.R. et al. Experimental cerebral infarction: modification by treatment with haemodiluting. J.Neurosurg.1967; 26: 46-56.
82
Singaraja RR, Bocher V, James ER, Clee SM, Zhang LH, et al.: Human ABCA1 BAC transgenic mice show increased high density lipoproteincholesterol and apoAI-dependent efflux stimulated by an internal promoter containing liver X receptor response elements in intron 1. J. Biol. Chem. 2001; 276: 33969-33979. Soubrier F, Cambien F. Renin-angiotensin system genes as candidate genes in cardiovasular disease. Trends Cardiovasular Med. 1993; 3: 250-258. Szén L, Kremmer T, Horányi M, Sas G. A prothrombinképzés örökletes variánsa (F II 20210 A): a thrombosishajlam egyik lehetséges oka. LAM. 1997; 7: 500-503. Szirmai I, Kamondy A. A fibrinogén általános kockázati tényező az agyi vérkeringési betegségekben. Clin Neurosci/Ideggy. Szle. 1993; 46: 186-191. Szolnoki Z, Somogyvári F, Szabó M, Fodor L. A clustering of unfavourable common genetic mutations in stroke cases. Acta Neurol Scand 2000; 102: 124-128. Szolnoki Z, Somogyvári F, Kondács A, Szabó M, Fodor L. Evaluation of the roles of the Leiden V mutation and ACE I/D polymorphism in subtypes of ischaemic stroke. J. Neurol 2001; 48 (9): 756-761. Thomas D.J. et al. Effect of haematocrit on cerebral blood flow in man. Lancet. 1977; II: 941-945. Thomas AE, Green FR, Kelleher CH, Wilkes HC, Brennan PJ, Meade TW, Humphries SE. Variation in the promoter region of the beta fibrinogen gene is associated with plasma fibrinogen levels in smokers and non-smokers. Thromb Haemost. 1991; 65: 487–490. Tiret L, Blanc H, Ruidavets JB, Arveiler D, Luc G, Jeunemaitre X, Tichet J et al. Gene polymorphisms of the renin-angiotensin system in relation to hypertension and parental history of myocardial infarction and stroke: the PEGASE study. Projet d'Etude des Genes de l' Hypertension Arterielle Severe a moderee Essentielle. J Hypertens. 1998; 1: 37-44. 83
Tohgi H. et al. Importance of the haematocrit as a risk factor in cerebral infarction. Lancet. 1977; II: 941-945. Trial of ORG 10172 in Acute Stroke (TOAST) JAMA 1998; 279: 1265-72. Tosetto A, Missiaglia E., Frezzato M., Rodeghiero F: The VITA project: prothrombin G20210a mutation and venous thromboembolism in the general population. Thromb Hemost. 1999; 82: 1395-1398. Tybjaerg-Hansen A, Agerholm-Larsen B, Humphries SE, Abildgaard S, Schnohr P, Nordestgaard BG. A common mutation (G-455--> A) in the beta-fibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of ischemic heart disease. A study of 9.127 individuals based on the Copenhagen City Heart Study. J Clin Invest. 1997; 12: 3034-39. Vaisman, BL, Lambert G, Amar M, et al.: ABCA1 overexpression leads to hyperalphalipoproteinemia and increased biliary cholesterol excretion in transgenic mice. J. Clin. Invest. 2001; 108: 303-309. Van Goor M. P. J., Gomez E., Dippel D.W.J., Leebeck F.W.G. 20210A prothrombin gene variant and prothrombin activity in young patients with tia or ischemic stroke. Cerebrovasc Dis 1999; 9 (suppl. 1):21. Wagner KR, Giles WH, Johnson C12. Biousse V, Conrad J, Brouzes C, Horellou M.H., Ameri A, Bousser M.G. Frequency of the 20210 G-A mutation in the 3untranslated region of the prothrombin gene in 35 cases of cerebral venous thrombosis. Stroke. 1998; 29: 1398-1400. Wang J, Burnett JR, Near S, Young K, Zinman B, Hanley AJ, Connelly PW, Harris SB, Hegele RA. Common and rare ABCA1 variants affecting plasma HDL cholesterol. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000; 20:1983-1989.
84
Wang N, Silver DL, Thiele C, Tall AR. ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) functions as a cholesterol efflux regulatory protein. J Biol Chem. 2001; 276: 23742-23747. Weiss EJ, Bray PF, Tayback M: A polymorhism of a platelet glycoprotein receptor as an inhereted risk factor for coronary thrombosis N. Engl. J. Med. 1996; 334: 1090-1094. Weng X., Cloutier G.,Genest J.Jr.Contribution of the -455 polymorphism at the beta fibrinogen gene to erythrocyte aggregation in patients with coronary artery disease.Thromb.Haemost.1999;82:1406-1411. WHO MONICA Project Principal Investigators: The World Health Organisation MONICA Project (monitoring trends and determinants in cardiovascular disease): A major international collaboration. J. Clin. Epidemiol. 1988; 41:105-114. Yamakawa-Kobayashi K, Yanagi H, Yu Y, Endo K, Arinami T, Hamaguchi H. Associations between serum high-density lipoprotein cholesterol or apolipoprotein AI levels and common genetic variants of the ABCA1 gene in Japanese school-aged children. Metabolism. 2004; 53: 182-186. Zenz W, Bodo Z, Plotho J, Streif W,Male C, Bernert G, Rauter L, Ebetsberger G, Kaltenbrunner K, Kurnik P, Lischka A,Paky F,Ploier R, Hofler G, Mannhalter C, Muntean W: Factor V Leiden and prothrombin gene G 20210 A variant in children with ischemic stroke. Thromb Haemost 1998; 80: 763-766.
85
8. 2. A disszertációhoz felhasznált saját közlemények és peer review absztaktok
I. Pongrácz E., Tordai A., Andrikovics H., Szén L., Nagy Z.: A prothrombin gén G20210A polimorfizmusának vizsgálata fiatalkori ischaemiás stroke-os betegeknél. Agyérbetegségek 2001; 2: 9-13. II.
Pongrácz E., Tordai A., Csornai M., Nagy Z. Stroke betegek insertios-deletios
ACE- gén-polimorfizmusának vizsgálata. Clin Neurosci/Ideggyógyászati Szemle 2002; 55 (5-6): 156-163. III. Pongrácz E., Tordai A., Csornai M., Nagy Z. Stroke betegek thrombocyta glikoprotein IIb/IIIa (Leu Pro 33) polimorfizmusának vizsgálata Orvosi Hetilap 2001; 142 (15): 781-785. IV. E. Pongrácz, K. Schweitzer, J. Fűrész, J. Fent, A. Tordai, Z. Nagy. The effects of platelet receptor GP IIb/IIIa polymorphism (Leu Pro33) on the receptor expression and platelet aggregation in patients with ischaemic stroke. Turk J Hematol. 2007; 24: 155163. V. Pongrácz E., Tordai A., Csornai M., Nagy Z.: Van-e jelentősége a factor V gén A506G (Leiden) mutációjának isémiás stroke betegekben? Clin Neurosci/Ideggyógyászati Szemle 2003; 56 (5-6): 144-154. VI. H. Andrikovics, E. Pongrácz, Á. Kalina, A.Szilvási, Ch. Aslanidis, G. Schmitz, A. Tordai. Decreased freqencies of ABCA1 polymorphism R219K and V771M in Hungarian patients with cerebrovascular and cardiovascular diseases. Cerebrovasc Dis 2006; 2: 254-259. (IF: 2,16) VII.
Pongrácz E., Andrikovics H., Keresztúri M., Csornai M., Nagy Z. Az agyi
ischaemia rizikóját fokozó genetikai polimorfizmusok halmozódásának vizsgálata. Agyérbetegségek. 2006; 12(4): 14-21. VIII. Pongrácz E.: Véralvadási genetika fiatalkori stroke-ban. Clin Neurosci /Ideggyógyászati Szemle 2002; 55 (3-4): 111-117. IX. Bernáth, S.I. Bernát, E. Pongrácz, P. Köves, Z. Szakács, A. Horváth: Effects of blood hyperviscosity on functional integrity in the brain stem: a brain stem evoked auditory potential study. Clin Hemorheology and Microcirculation 2004; 31:123-128. (IF.:0.63) X.
Pongrácz E., Bernáth I: Az agytörzsi mikrokeringés vizsgálata BAEP és
hemorheologiai módszerekkel. Honvédorvos 1996; 48: 282-293. 86
XI. E. Pongrácz, H. Andrikovics, M. Csornai, IS. Bernát, Z. Nagy: Contribution of the -455G/A polymorphism at β-fibrinogen gene and Leiden mutation to haemorheological parameters in ischaemic stroke patients. Clin Hemorheology and Microcirculation 2006; 35:75-82. (IF.: 1.03) XII. E. Pongracz, H. Andrikovics, S.I.Bernat, Z. Nagy. Connection between genetically determined blood coagulation factors and haemorheology. Clin Hemorheology and Microcirculation 2008. (Közlésre elfogadva) (IF.: 1.03) XIII. E. Pongrácz Measurement of platelet aggregation during antiplatelet therapy in ischemic stroke. Clin. Hemorheology and Microcirculation 2004; 30 (3-4): 237-42. (IF.:0.63) XIV. E. Pongrácz, Z. Káposzta: Antiplatelet therapy in ischemic stroke. Expert Review of Neurotherapeutics 2005; Vol. 5 (4): 541-549. XV. RG Kiss, G. Kerecsen, L. Rudas, D. Apró, Gy. Stef, E. Pongracz, I. Bernat, I. Préda.: Aspirin and ticlopidine resistance in cardiovascular patients. Multicenter database of 2425 patients aimed to standardize the laboratory control of antiplatelet therapy. Eur Heart J. (Suppl). 2003; 24: 371.(IF.: 6,13) XVI. E. Pongrácz, SI. Bernát, L. Rudas, GY. Stef, RG. Kiss.
Resistance during
antiplatelet therapy based on a multicenter database of ischaemic stroke and cardiovascular patients. Cerebrovasc Dis. 2004; 17 (suppl.5): 73. (IF.:2,14) XVII. E. Pongrácz, G. Stef, G. Kerecsen, F. Poór, E. Seres, L. Németh, I. Préda, R.G. Kiss. Continuation of aspirin therapy despite aspirin resistance is associated with higher mortality. A two year follow up in 921 ischemic stroke and cardiovascular patients. Cerebrovasc. Dis. 2005; 19(suppl 2):159. (IF.:2,16)
87
8. 3. A disszertációhoz kapcsolódó közlemények és peer review absztaktok Pongrácz E.: A hemorheológia jelentősége a cerebrovasularis betegségekben. Honvédorvos 1988; 4: 253 – 266. Pongrácz E.: A hemorheológiai therapia kiindulási alapja és stratégiája. Honvédorvos 1995; 47: 54 – 65. Pongrácz E.: Rheológiai szempontok a stroke kezelésében. Háziorvos Továbbképző Szemle 1997; 2: 364-366. Bernát SI, Pongrácz E: Homocisztein szerepe az ischaemias cardio és cerebrovascularis betegségekben. Cardiologia Hungarica 2001; 4: 315-319. Pongrácz E.: A trombocita aggregáció gátlás jelentősége a stroke szekunder prevenciójában. Recept 2001; 12: 19-21. Pongrácz. E., Bauer E. Bernát S.I. Bálint K: ASA non-responsio vizsgálata, az Ipaton filmtablettával szerzett tapasztalatok. Novitates 2002; 1: 15-23. Bernát S.I, Pongrácz E., Gonda F.: Az aszpirin dózisának változtatása és a trombocitaaggregáció gátlás mértéke a kardio- és iszkémiás cerebrovaszkuláris betegségek szekunder provenciója során. Cardiologia Hungarica 2003; 33: 240-244. Pongrácz E., Csornai M.: A haemodilutio cerebrovascularis betegségekben. Érbetegségek 2005; (suppl.1): 35-37. Pongrácz E. A trombocitaaggregáció mérés értéke iszkémiás stroke szekunder profilaxisában. Metabolizmus 2005; 2: 108-113. Bernát S.I., Pongrácz E., Sidó Z.: Az iszkémiás szívbetegség és a trombocitaaggregációgátlás kapcsolata. Cardiologia Hungarica 2005; 35: 59-63. Bernát S.I, Pongrácz E., Sidó Z. Hematológiai, hemostazeológiai és hemoreológiai eltérések elhízásban, Metabolizmus 2005;(4): 246-250. S.I.Bernat, E. Pongracz, Z. Sidó. Effects of fluvastatin therapy on plasma fibrinogen concentration and plasma viscosity. Cardiol. Hung. 2006; 36: 248-250. Pongrácz E., Schweizer K., Fűrész J., Fent J., Tordai A., Nagy Z. The effects of platelet receptor GP IIb/IIIa polymorphism (Leu Pro33) on the receptor expression and platelet aggregation in patients with ischaemic stroke. Turk J Hematology 2007; 24: 155-163.
88
8. 4. A tudományos munka részét képező de a disszertációtól független közlemények
Pongrácz E.: Metrizamide
myelographiaval szerzett tapasztalataink a lumb.
discopathia kórismézésében. Honvédorvos 1985; (1-2): 89–102. Pongrácz E., Viczena tapasztalataink
P.: Transzfemoralis katéteres
ischaemias
cerebrovascularis
angiográfiával szerzett
betegségek
kórismézésében.
Ideggyógyászati Szemle 1986; 4: 404-409. Bernát S. I., Pongrácz E.: Hemorheologiai változások daganatos megbetegedésekben. Orvosi Hetilap 1994; 18: 961 – 964. Pongrácz E., Nagy E., Benke M., Bernát S. I.: Hypacusis, tinnitus és vertigo kezelése a hemorheológia figyelembevételével.Fül - Orr - Gégegyógyászat 1994; 1: 15 – 21. Marton Sz., Bernát S.I., Pongrácz
E., Szentmiklósi
P.: Egy pontenciális, új
hemorheológiai gyógyszer a Depogen humán kinetikai vizsgálata. Honvédorvos 1994; 46: 122 – 129. E. Pongrácz, Abdul M. E. Nagy, M. Benke, I. Bernát: Therapy of hypacusis, tinnitus and vertigo observing hemorheologic principles. The Med. Journ. of Cairo Univ. 1996; 4 (suppl): 9-15. Rákóczy Gy., Pongrácz E., Rényi T., : Splenectomizált gyerekek hemorheológiai utánvizsgálata. Gyermekgyógyászat 1995; 1: 35 – 39. I. Bernát, Abdul A, Abdul M., E. Pongrácz: Hemorheologic changes in malignant diseases. The Med. Journ. of Cairo Univ. 1996; 64 (suppl): 17-22. E. Nagy, E. Pongrácz,: Complex therapy of neck-related tinnitus, hypacusia and vertigo. The International Tinnitus Journal 1997; 3: 141-145. Pongrácz E: Cerebrális keringési zavarok és gyógyszeres kezelésük. Med Anonymus 2001; 12: 35-38. Pongrácz E. Szász G., Hőnig T., Bernát S.I. A Voluven 6% (130/0,4) infúzió haemorheológiai
hatásai
obliteratív
érbetegségben
szenvedő
betegekben.
Gyógyszereink 2004; 54.(4-5): 115-118. Bernát SI, Kormányos E., Pongrácz E.: Különböző infúziós oldatok hatása a vér és plazma viszkozitására. Fresenius Kabi Info 2005; VII/24: 3-7. Bernát S.I., Pongrácz E., Sidó Z.: Hematológiai, hemosztazeológiai és hemorheológiai eltérések elhízásban. Metabolizmus. 2005; 4: 246-250. 89
Pongrácz E. Háziorvosi teendők stroke-ban.
Háziorvos Továbbképző Szemle.
2006;11:107-111. Bernát S.I, Pongrácz E., Sidó Z. A fluvastatin hatása a fibrinogén koncentrációjára és a plazma viszkozitására. Cardiologia Hung. 2006; 36: 245-247.
90
8. 5. Peer review, angol nyelvű folyóiratokban megjelent, idézhető abstract-ok Pongrácz E., Bernát S.I.: Haemorheological examinations of healthy, middle aged persons. Clin. Haemorheol. 1989; 3: 511. (IF.:1,20) Bernát S. I., Pongrácz E.: Abnormal erythrocyte deformability in malignant tumors Ann Haemathol 1992, 65: 59-60. (IF.: 1,29) Bernát S.I., Pongrácz
E.: Haemorheological
examinations in malignant tumors.
Clin. Haemorheol. 1993; 13: 595. (IF.: 0,51) Pongrácz E., Tordai A., Nagy Z.: Genetic polymorphism of GP IIb/IIIa in young ischemic cerebrovascular patients. Cerebrovasc. Dis. 1998, 8 (suppl 4) 50. (IF.: 1,51) Pongrácz E. Schweizer K., Nagy Z.: GP IIb/IIIa polymorphism and platelet function in ischemic stroke patients. Cerebrovasc. Dis. 1999; 9. 22. (IF.:1,78) Andrikovics H., Pongrácz E., Kalmár L., Bors A., Szén L., Tordai A. Screening for genetic risk factors among patients with stroke. Genetics. 2000; 5: 145. (IF.: 4,48) Pongrácz E., Andrikovics H. Tordai A. Szén L. Csornai M., Nagy Z. Screening for genetic clotting factors (prothrombin gene G20210A and factor V Leiden) among patients with ischemic stroke. Cerebrovasc. Dis. 2000; (4): 126. (IF.:1,78) Pongrácz E. Tordai A., Csornai M., Nagy Z. MTHFT polymorphism and stroke. Cerebrovasc. Dis. 2001; (9): 127.(IF.:1,78)
SZERKESZTETT KÖNV ÉS KÖNYVFEJEZETEK BERNÁT S. IVÁN és PONGRÁCZ ENDRE (szerk.)
A Klinikai haemorheologia alapjai első magyar nyelvű tankönyv. Megjelent 1999. májusban Budapesten, Kornétás Kiadó, 1200 pld. 225 old.
Felkért könyvrészlet: 1. Vascularis neurológia (Springer Budapest, 2004 szerk. prof .Nagy Zoltán) Pongrácz E. Csornai M.: Rheológiai zavarok és stroke. Pongrácz E, Nagy Z.: A stroke syndroma genetikai háttere. Pongrácz E. Molnár M.: Genetikai vizsgálatok stroke-ban. 2. Vascularis medicina
91
(Válogatott fejezetek az angiológiából. Szerk. Meskó Éva, Therapia Kiadó, Budapest, 2004) Pongrácz E.: Az agy vérellátásának szerkezeti és kórélettani sajátosságai. A stroke genetikai háttere 78-87. HAZAI ÉS KÜLFÖLDI TUDOMÁNYOS KONGRESSZUSOKON MEGTARTOTT ELŐADÁSOK: 98 (Nincs részletezve).
92
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A jelenleg bemutatott PhD értekezésemet mindennapi munkám mellett végeztem, a Semmelweis Egyetem Vascularis Neurológiai Tanszékével (Agyérbetegségek Országos Központja) és az Országos Hematológiai Intézet Molekuláris Genetikai Osztályával közösen. Mindenütt önzetlen segítséget tapasztaltam, amiért ezúton is köszönetet mondok az intézetek munkatársainak. Külön köszönet illeti Prof. dr. Nagy Zoltán Főigazgató Főorvos urat, témavezetőmet, aki minden lehetőséget megadott, hogy irányítása alatt kutatómunkát végezhessek, a témát szabadon választhassam, mellyel kimutatta bizalmát felém, emberileg, szakmailag támaszom és lelkesítőm lett. Biztosan tudom, hogy ez a néhány sor kevés köszönetem kifejezésére. Köszönet illeti dr. Tordai Attilát az MTA doktorát és Andrikovics Hajnalkát PhD, akik a molekuláris genetikai vizsgálatok elvégzésén kívül komoly szakmai segítséget és útmutatást adtak a munkám során. Méltó köszönet jár dr. Csornai Márta oszályvezető főorvos asszonynak, aki mindig készen állt szakmai segítségnyújtással és a betegek kérdőíves és vérvizsgálati lehetőségeivel, megteremtve a vizsgálatok multicentrikus jellegét. Ezúttal szeretnék köszönetet mondani az Egészségügyi Minisztérium Egészségügyi Tudományos Tanácsának, a munka egy részének pályázati, anyagi támogatásáért. Külön köszönet illeti prof. dr. Bogár Lajos egyetemi tanár urat a Magyar Hemorheológiai Társaság elnökét és prof. dr. Tóth Kálmán egyetemi tanár urat, akik szakmai segítséget nyújtottak a hemorheológiai témák kidolgozása során. Köszönetet szeretnék mondani az intézetek közötti gyümölcsöző együttűködés páldájaként dr. Kiss Róbert egyetemi docens úrnak (MTA kardiológiai kutatócsoport, Állami Egészségügyi Központ, Budapest), aki önzetlen segétséget nyújtott a trombocita vizsgálatokkal kapcsolatban. Munkám nem jöhetett volna létre a BM Központi Kórház és Intézményei Neurológiai Osztály minden dolgozójának hathatós segítsége és az intézmény vezetésének támogatása nélkül. Sorrendiség állítása nehéz és sok tekintetben nem is lehetséges. Hálámat fejezem ki néhai szüleimnek tanulmányaim támogatásáért, feleségemnek dr. Bordács Erzsébetnek időigényes munkám türelmes elviseléséért és a nyugodt otthoni munkavégzés lehetőségének megteremtéséért és Márton fiamnak az előadások és közlemények képanyagának megszerkesztéséért.
93
94
