Automatisch petriplaten beënten met de WASP Erik Briers Keywords: bacteriology — petri-dish — inoculation automation — WASP
Microbiologie, bacteriologie is het laatste departement dat aan automatisering toe is. Na eerdere minder succesvolle pogingen komt er nu beweging; er is een automaat voor het uit platen van monsters, de ‘WASP’ waar het hieronder over gaat, en er is de identificatie op basis van massaspectrometrie (MALDI-TOF) waar we het in een volgend nummer over zullen hebben. Daarmee blijkt voorlopig de vol-moleculaire weg naar automatisering nog even te moeten
F0143N_2010
wachten.
Inleiding
Automatisering in de microbiologie
Tot voor enkele jaren zou Louis Pasteur bij een bezoek aan
Microbiologie is inzake automatisering tot vandaag een
een modern laboratorium voor medische microbiologie
beetje een ondergeschoven kindje geweest. Er was slechts
zich snel thuis hebben gevoeld. Hij zou nog steeds de
een aanbod voor bepaalde deeltaken. Zo kennen we al vele
vertrouwde ‘bunsenbrander’, platina entogen, petriplaten,
jaren automatische en vooral semiautomatische systemen
microscoop enzoverder aantreffen. Hij zou allicht onterecht
voor de identificatie van geïsoleerde bacteriën en voor
denken dat de wereld van de microbiologie toch niet zo sterk
de bepaling van de minimale inhibitorische concentratie
geëvolueerd is. Want, bij nader inzicht zou hij vaststellen dat
(MIC). In deze twee toepassingen vertrekt men steeds van
er zich al heel wat technische evoluties hebben voorgedaan.
een op petriplaat afgezonderde kolonie. Voor het uitplaten
Hij zou zich bijvoorbeeld verwonderen over de aard van de
van nieuw ontvangen monsters was er lang slechts een
petriplaten die uit plastic vervaardigd zijn en dat de massa’s
oplossing voor urinemonsters.
buisjes uit zijn tijd vervangen zijn door plastic edities in
Zelfs voor het microscopisch onderzoek, dat in het domein
miniatuur.
van de hematologie reeds zeer sterk geautomatiseerd is, is
Maar hij zou gelijk hebben dat de essentie van de micro
automatiseren niet vanzelfsprekend. Daar is natuurlijk een
biologie, kweken, isoleren en identificeren, allemaal op basis
reden voor; in hematologie is het aantal ‘te verwachten’
van groei en groei onder speciale groeiomstandigheden niet
objecten redelijk beperkt en even redelijk gekend en
veranderd is, ook vandaag nog niet.
constant. We weten wat we mogen verwachten. Komt er iets
Wel zou hij verbaasd zijn over het gebruik van antibiotica
onverwacht aan, dan wordt de klinisch-bioloog verwittigd.
en over het bestaan van DNA en RNA, daar waren zij nog
In de microscopie van een urinesediment bijvoorbeeld is de
niet aan toe.
variatie veel groter en zijn de objecten ook niet steeds van
[1] • Vol 18 • Nr 4 • 2010
Figuur 1: De WASP, bovenaanzicht. Onderaan links bevindt zich de ‘Jane’ robotarm die instaat voor het beënten van de petriplaten die vanuit het daarnaast gelegen magazijn worden aangevoerd.Rechts boven zien we de labelprinter die voor elke gebruikte petriplaat een label zal afdrukken. Naast de printer bevindt zich ‘Tarzan’ de robotarm die monsters en petriplaten manipuleert.Rechts onder worden de monsters aangevoerd. dezelfde afmeting. Toch is er ook in dit domein vooruitgang
Een belangrijk bijkomend probleem is het kwaliteitsbeleid.
waarop we in een ander nummer nog zullen ingaan.
In een modern medisch laboratorium wordt gewerkt volgens procedures waarbij de traceability geen loos begrip
Alles start met een monster
is. Op eender welk moment in de tijd, ook lang nadat de
Zoals steeds begint alles met een monster. Dat kan zeer
patiënt al genezen verklaard is, moet men voor elke stap alle
uiteenlopend zijn. Het eenvoudigste is dan bijvoorbeeld
gegevens kunnen reconstrueren. Dat gaat van de incubator
een urinemonster. Netjes vloeibaar afgeleverd in een vooraf
temperatuur over de operator, supervisor tot de lot
steriel potje, klaar voor verwerking. Of een bloedmonster
nummers van de gebruikte media. Dit laatste lijkt evident,
opgevangen in een flesje met het geschikte kweekmedium
maar alleen al het identificeren van de gebruikte platen voor
klaar voor incubatie. Maar er zijn ook stoelgangmonsters
de individuele patiënt is geen sinecure, daar komt heel wat
afgeleverd in zeer uiteenlopende gedaanten en consistenties,
schrijfwerk bij. Een gevolg is dat er soms platen gevonden
gewrichtsvocht, sputum, pus enz. Allemaal vragen deze
worden zonder dat men weet over welke patiënt het gaat.
monsters om verwerking en dan wordt automatiseren al
Hetzelfde geldt natuurlijk voor bi-platen.
snel een heikele klus.
Een oplossing van Copan Bij de start van een microbiologisch onderzoek van eender
Copan, een Italiaans bedrijf dat vooral actief is in het pro
welk monster zijn er steeds dezelfde twee elementen; een
duceren van monster swabs, heeft een voorstel voor een
microscopisch onderzoek na gramkleuring en uitplaten
oplossing voor het uitplaten van monsters. Die oplossing
op petriplaten met volgens het monster geselecteerde
noemen zij de ‘WASP’, ‘Walk-Away Specimen Processor’. In België
kweekmedia. Indien de monsters allemaal in verschillende
wordt de ‘WASP’ verdeeld door MLS die ons uitnodigden om
potjes zitten en een andere consistentie hebben, is
een apparaat in werking te zien in het AZ Sint-Jan te Brugge.
automatiseren niet mogelijk zonder tussenstappen.
Dr. Bart Gordts was onze gastheer en gaf de nodige uitleg.
[2] • Vol 18 • Nr 4 • 2010
Figuur 2: De WASP een vooraanzicht. Het vooraanzicht, met de laadzone voor nieuwe petriplaten in de carrousel, links zien we de robotarm en rechts de aanvoer van monsters. De sturing verloopt via een computeraanraakscherm. Het apparaat meet 183cm breed bij 81cm diep en heeft een hoogte van 183cm.
Het laboratorium van het AZ Sint-Jan Het medisch laboratorium van het AZ Sint-Jan te Brugge is een groot laboratorium waar 8 arts klinisch biologen werken samen met 7 universitaire medewerkers en 113 vol tijdsequivalenten medisch laboratoriumtechnologen. Samen ‘verwerken’ zij niet minder dan 330.000 monsters per jaar waarvan meer dan 95% van gehospitaliseerde patiënten. Het laboratorium budget overschrijdt 18 miljoen euro per jaar. Het laboratorium microbiologie werkt zeven dagen op zeven van 7 tot 20uur met minstens 6 technologen per shift. Vandaag zijn de laboratoria uit hun voegen aan het barsten in die mate dat het vlotte werken wel eens bemoeilijkt wordt. De bouw van een nieuw laboratorium is dan ook voor binnenkort gepland. Binnen de activiteiten microbiologie wordt er strikt volgens afgesproken procedures gewerkt.Voor elk type van ontvangen monster ligt vast hoe er gewerkt zal worden, welke media zullen worden ingezet en wat er met de resultaten op deze primaire platen zal gebeuren. In bacteriologie wil dat zeggen welke vervolgonderzoeken zullen volgen, een identificatie, het bepalen van een antibiogram enzoverder.
Figuur 3: Een detailbeeld van de ‘Tarzan’ robotarm tijdens de manipulatie van een monsterbuisje.
[3] • Vol 18 • Nr 4 • 2010
Al deze stappen zijn vastgelegd en ook de rapportage van tussenresultaten verloopt aan de hand van computerpro grammatuur. Op elk ogenblik kan een klinisch bioloog of technoloog nagaan waar een bepaalde aanvraag zich bevindt en welke stappen nog in uitvoering zijn. In het recente verleden hebben deze procedures al tot belangrijke stappen geleid; zo werd er voor alle monsters geopteerd voor de ESwab van Copan die op basis van eigen en gepubliceerde studies betere resultaten oplevert inzake het terugvinden van kiemen. Daarnaast worden ook barcode labels gebruikt in elke stap, op elke petriplaat en op elk buisje dat met een bepaald monster te maken heeft. Dit laatste zorgt voor een goede transparantie van het proces. Een barcode lezer en een computerterminal geeft voor een ‘gevonden’ petriplaat ondubbelzinnig de identiteit van het monster (patiënt) weer en het doel van die bepaalde plaat. Een klassieke moeilijkheid bleef dat alle monsters manueel
Figuur 4: Een detailopname van de beënting van een petriplaat.
op plaat moesten geënt worden en verder verwerkt. Daarbij zijn heel wat handelingen nodig. Op elke plaat moet een barcode label aangebracht worden, elk monsterbuisje moet
Economische aspecten
geopend worden en de labels moeten vergeleken worden,
Koken kost geld en het uitplaten van monsters op petriplaten
de plaat, platen moeten manueel gelijkmatig geënt worden.
ook. In België is zelfs na de laatste herziening van de
Waar gaat het dan over, voor het AZ Sint-Jan worden er
nomenclatuur van de bacteriologie deze laatste nog steeds
wekelijks ruim meer dan 1.000 monsters aangeboden
onderbetaald. Ziekenhuizen hebben dan ook graag dat hier
voor een bacteriologisch onderzoek. Als we dan weten dat
kostenbesparend wordt gewerkt.
er voor veel microbiologische monsters 5 verschillende
De introductie van een automaat heeft zijn grootste effect
kweekmedia nodig zijn voor de eerste enting komen we
in de personeelskost, de operator plaatst monsters en media
op meer dan 3.000 platen per week. Het automatiseren van
en kan zich met andere taken bezighouden. Dan is er nog
deze entingen zou belangrijke effecten kunnen hebben. Bij
de kost van wegwerpentogen maar ook het kleiner aantal
een vergelijking tussen het inzetten van de WASP en het
hernemingen door een betere standaardisatie en traceability
gebruikelijke manuele schema kwamen de volgende sterke
en een verlaging van de tijd nodig om gestandaardiseerd
en zwakke punten naar voor:
geënte platen af te lezen. Dit alles komt neer op heel veel
voor de manuele verwerking, was de hoge kans op
euro’s per jaar. Daartegenover staat natuurlijk een investering
crosscontaminatie, de lage traceability en het effectief aan de
in een automaat die ook vele euro’s zal kosten.
werktafel gebonden zijn ongunstig. Voor de WASP stond daar dan tegenover een lage graad van crosscontaminatie, echte
De ‘Walk Away Specimen Processor’ – WASP
‘walk-away’ en een hoog niveau van traceability. Daarbij komt
De WASP is opgebouwd uit enkele essentiële onderdelen.
nog dat de entingen sterk gestandaardiseerd zijn en dat er
Er is een ent-robot die door de ontwikkelaars ‘Jane’ werd
diverse patronen mogelijk zijn (dit laatste kan uiteraard ook
genoemd en die de identificatie van de monsters doet. Verder
bij een manuele enting).
is er een tweede robot ‘Tarzan’ genoemd die petriplaten en
In de rand wordt ook opgemerkt dat de WASP zelf geen
monsters manipuleert. Daarnaast is er een laadplatform voor
geschoold technoloog vraagt en dat het aantal verwerkte
monsters, een carrousel waarop negen verschillende petriplaten
monsters per tijdseenheid hoger ligt.
geladen kunnen worden en een barcode label printer.
[4] • Vol 18 • Nr 4 • 2010
Rechts is de monsterzone, tot 72 ESwab buisjes, andere LBM
zelf aanpassen. De entogen worden door middel van hitte
(‘Liquid Based Microbiology’)-toepassingen, vacuüm urinebuisjes
gesteriliseerd en door steeds van entoog te wisselen kan
of 36 Cary-Blair feces potjes kunnen hier geladen worden
het ene afkoelen terwijl het andere gebruikt wordt. Op de
met behulp van speciale rekjes. Voor andere containers is er
WASP is een camera geïnstalleerd die de entogen controleert
een aanvoerdraaitafel. Monsters kunnen steeds bijgeplaatst
op hun gaafheid, maar die ook nagaat dat er wel degelijk
worden. Voor de monsters geldt als enige beperking dat ze
monster is opgenomen vóór de enting start.
in vloeibare fase moeten zijn. Elke container is voorzien van een barcode label. De barcode lezer leest het label en
Een monsterdoorgang verloopt dan als volgt: de barcode
weet via een verbinding met het LIS wat er met dit monster
wordt afgelezen en geïnterpreteerd. De container wordt eerst
moet gebeuren. De nodige platen worden uit de magazijnen
gecentrifugeerd of gevortext en dan geopend. De printer
getransporteerd. Elke petriplaat wordt voorzien van een
print het nodige aantal labels met de barcode van de patiënt.
barcode label nadat het beënt is. De petriplaten bevinden
De media worden vanuit de carrousel aangevoerd, een label
zich in een carrousel waarin negen verschillende media
wordt aangebracht en de plaat wordt geïnoculeerd met het
kunnen geplaatst worden met in elke stapel tot 42 platen.
juiste entoog. Een camera registreert steeds of het entoog
Op elk moment kunnen de stapels aangevuld worden. Na
gevuld is vooraleer de bodem geënt wordt. Daarna wordt
het enten worden de gelabelde en geënte platen afgevoerd
de plaat uitgeschoven en gestapeld voor overbrenging naar
en eventueel volgens incubatievoorschrift gesorteerd. De
een incubator. Containers die niet correct gelabeld zijn of
operator zorgt voor de overdracht naar de incubatoren.
die geen monster bevatten worden automatisch verwijderd.
Voor het enten beschikt de WASP over een keuze van drie
Volgens de werklast kan een laboratorium beslissen om
entogen, 1µL, 10µL en 30µL. De software bepaalt welk
meer dan één positie te voorzien voor hetzelfde medium.
entoog voor een gegeven monster-plaatcombinatie gebruikt
Indien bijvoorbeeld een grote reeks monsters binnenkomen
zal worden, het AZ St-Jan gebruikt bij voorkeur één soort
voor MRSA screening kan elke positie zelfs met hetzelfde
entoog, zij wisselen niet. De operator kan deze procedures
medium gevuld worden.
MRSA Screening keel (ter hoogte van de amandelen) en de neus te bemon steren, deze wissers worden in het aanrijkingsmedium uitgewrongen en daarna weggeworpen. De witte Swab wordt gebruikt om het perineum te bemonsteren waarna deze eveneens in het transportmedium wordt aangebracht en afgebroken. De buisjes, met de afgebroken witte wis ser, gaan correct gelabeld naar het laboratorium. Door het transportmedium in de buisjes te vervangen door een specifiek aanrijkingsmedium kunnen de buisjes bij ontvangst in het laboratorium zonder meer geïncu beerd worden zonder dat hier eerst een overenting zou moeten gebeuren. In het laboratorium worden de geïncubeerde buisjes de volgende dag in één keer uitgeplaat op een petriplaat met een chromogeen medium. Tijdens de eerste drie maan den van dit jaar werden 13.450 patiënten opgenomen waarvan 5.805 (93% van de patiënten die minstens één nacht in het ziekenhuis bleven) getest werden op MRSA. 104 patiënten leverden een positief resultaat op waarvan uiteindelijk slechts ‘2’ (0,01%) die infectie in het zieken huis hadden opgelopen. Het is duidelijk dat deze procedure haalbaarder is in dien het laboratorium over een automaat zoals de WASP beschikt.
In België is zoals in de ons omringende landen een beleid met betrekking op MRSA van toepassing. Daarbij worden in de meeste ziekenhuizen patiënten die aan bepaalde risicocriteria beantwoorden systematisch getest. Daarbij kan men testen met moleculaire technieken of met be hulp van klassieke kweekmethodes waarbij meestal een chromogene plaat gebruikt wordt. In het AZ Sint-Jan te Brugge stelde men reeds jaren vast dat het aantal MRSA casussen langzaam opliep. Daarbij stelde men eveneens vast dat het grootste aantal van de patiënten bij wie een MRSA aangetoond werd het ziekenhuis bin nenkwamen met een MRSA en dat slechts een minderheid in het ziekenhuis zelf besmet worden. Dit aantal is de laat ste maanden trouwens in dalende lijn. Recent werd beslist om niet langer enkel risicopatiënten te testen maar alle patiënten die in het ziekenhuis zullen overnachten. Maar dat is financieel geen haalbare kaart in dien men dat met moleculaire testen wil gaan doen. Daar om werd beslist om klassiek microbiologisch te werken. Sedert 1 januari 2010 worden alle patiënten bij opname bemonsterd met drie wissers. Daartoe zijn speciale MRSA screening setjes gemaakt die een transportmedium (aan rijkingsmedium) bevatten en drie wissers, Flocked Swabs van Copan. De twee roze Flocked Swabs worden gebruikt om de
[5] • Vol 18 • Nr 4 • 2010
De WASP die wij in actie hebben gezien beantwoordde aan
Besluit
de verwachtingen van het laboratorium. Zij hadden slechts
Al is de WASP niet het eerste apparaat dat petriplaten auto
weinig opmerkingen waarvan er één te verwachten viel,
matisch kan beënten, toch is het mogelijk het eerste apparaat
namelijk dat twee extra posities voor media nog beter zou
dat dit zo doet dat het laboratorium zijn werkwijze minimaal
zijn. Met elf zou bijna de hele routine er zonder wisselen
moet aanpassen. De media, formaat en samenstelling moeten
doorkunnen.
niet gewijzigd worden. De ent-patronen zijn vergelijkbaar maar veel nauwkeuriger en reproduceerbaarder dan met
Na het enten worden de petriplaten in het toestel gesorteerd
manueel enten.
volgens de broedstoof waar ze later geïncubeerd zullen
Uiteindelijk spaart het laboratorium niet alleen tijd bij het
worden, namelijk met of zonder CO2. Schijfjes die gebruikt
uitplaten van de monsters, het wint ook bij het labelen
worden voor de identificatie van bacteriën zoals optochine
en uitlezen. Door ook minder fouten te maken wint men
moeten nog manueel aangebracht worden.
nogmaals tijd en dus geld.
Flocked Swab, whats in a name ‘Flocked – to flock’ is een technische term die staat voor een techniek om vezels aan te brengen op een vast oppervlak. Bij deze werkwijze wordt het plastic (elk materiaal en vorm is mogelijk) staafuiteinde eerst met een dun laagje lijm bedekt waarna het staafje in een speciaal toestel op een hoge positieve lading wordt gebracht. Het ge standaardiseerde vezelmateriaal (netjes dezelfde lengte bijvoorbeeld) wordt op een hoge negatieve lading ge bracht waardoor deze vezeltjes naar de positief geladen
staafjes vliegen. Wegens de wetten van de elektrostatische aantrekking komen de vezeltjes met hun puntjes in de lijm terecht. Daardoor ontstaat een tip die er heel anders uitziet dan deze van een klassiek staafje waar de vezels opgedraaid zijn. De tip wordt fluweelachtig. Doordat alle vezels netjes gericht zijn heeft deze tip heel andere eigenschappen in zake materiaalabsorptie en vrijgave. Dit verklaart dat deze ‘eenvoudige’ techniek in de microbiologie toch andere resultaten oplevert dan een klassiek wattenstaafje.
[6] • Vol 18 • Nr 4 • 2010
