AUTENTIKASI KENCUR MENGGUNAKAN KOMBINASI SIDIK JARI KCKT DAN KEMOMETRIKA
CAHYA SEPTYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2015 Cahya Septyanti NIM G451124031
RINGKASAN CAHYA SEPTYANTI. Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan MOHAMAD RAFI. Kaempferia galanga yang di Indonesia dikenal sebagai kencur umumnya digunakan dalam obat tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Produk kencur telah dijual komersial sebagai herbal kombinasi (jamu). Selain itu, kencur juga digunakan sebagai herbal tunggal (serbuk kencur) yang dikemas dalam bentuk kapsul atau sachet. K. rotunda (kunci pepet) dan K. pandurata (temu kunci) merupakan spesies yang berkerabat dekat dengan kencur yang tersedia di pasar tradisional Indonesia. Keduanya dimungkinkan sebagai bahan pemalsu bagi kencur. Harga kencur kering di pasar umumnya lebih tinggi dari kunci pepet kering dan temu kunci kering. Ketiganya memiliki warna rimpang yang sama namun berbeda ukuran dan bau. Identifikasi dan autentikasi kencur menjadi sangat sulit jika sudah dalam bentuk serbuk. Jika bahan baku kencur telah terpalsukan maka kualitas, efikasi, dan keamanan produk akhir kencur akan berubah. Oleh karena itu, diperlukan suatu langkah untuk menentukan atau mengonfirmasi identitas dan keaslian kencur yang dikenal dengan istilah autentikasi. Autentikasi dilakukan dengan adanya suatu metode analitik yang tepat untuk menguji kualitas bahan baku kencur untuk mencegah adanya pemalsuan dari spesies yang berkerabat dekat dengannya seperti kunci pepet dan temu kunci. Pemalsuan kencur dilakukan dengan mencampurkan serbuk kencur dengan kunci pepet atau temu kunci. Sistem KCKT terdiri dari kolom C18, program elusi gradien 20-80% metanol dan asam asetat 1% selama 0-60 menit dengan laju alir 1 mL/menit, dan diamati pada 254 nm. Analisis komponen utama (AKU) dan analisis diskriminan (AD) digunakan untuk membangun model identifikasi dan autentikasi sampel. Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah diperoleh dengan analisis sidik jari KCKT. Pada plot AKU, ketiganya dapat terklasifikasi dengan baik namun jika kencur dicampur dengan kunci pepet atau temu kunci tidak terklasifikasi dengan baik. AD dapat membedakan ketiga spesies dengan baik juga ketika dicampur sebagai kencur-kunci pepet dan kencur-temu kunci pada seluruh konsentrasi yang digunakan. Kencur-kunci pepet 5% memiliki sedikit perbedaan dengan 100% kencur. Validasi model AD menggunakan teknik validasi silang leave-one-out (LOOCV). Model memberikan hasil prediksi klasifikasi yang sangat memuaskan (100% terklasifikasi). Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah berhasil dengan metode sidik jari yang dikombinasikan dengan AD. Metode yang dikembangkan ini menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan efisien untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci. Kata kunci: autentikasi, kemometrika, analisis sidik jari KCKT, Kaempferia galanga
SUMMARY CAHYA SEPTYANTI. Authentication of Kaempferia galanga Using HPLC Fingerprint Combined with Chemometrics. Supervised by IRMANIDA BATUBARA and MOHAMAD RAFI. Kaempferia galanga is known as kencur in Indonesia and widely used in folk medicine to treat some diseases. In Indonesia, commercial product of kencur was sold as jamu (Indonesia traditional medicines) along with other medicinal plants. Besides sold as jamu, sometimes kencur also used as a single herb product (kencur powder) which is packaged in capsule or sachet. Some related species of kencur such as K. rotunda (kunci pepet) and K. pandurata (temu kunci) are available in Indonesia local markets and these two plants could be a potential counterfeit of kencur. The price of kencur dry powder in local market generally is more expensive than kunci pepet and temu kunci. These three medicinal plants have similar color in their rhizomes but differ in size and odor. Identification and authentication of kencur will be very difficult if present in powdered form. Adulteration of kencur with some related plants will change the quality, efficacy, and safety of kencur finished products. To overcome this problem, the confirmation of the identity and authenticity of kencur is needed. This purpose will need an appropriate analytical method for evaluating quality of kencur raw material in order to prevent an adulteration with some related plants. Adulteration detection was carried out by mixing kencur powder with kunci pepet or temu kunci. The HPLC system C18 column, methanol and 1% acetic acid with gradient elution program of 20–80% in 0–60 min as mobile phase with a flow rate of 1 mL/min and monitored at 254 nm. Principal component analysis (PCA) and discriminant analysis (DA) were used to construct a model for identification and authentication of the samples. Identification, discrimination, and authentication of some closely-related species could be carrying out by chromatographic fingerprint analysis combined with chemometrics. Based on the result obtained, identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci was achieved using HPLC fingerprint analysis. From PCA plot, kencur, kunci pepet, and temu kunci could be classified into their own groups. Unfortunately, the authentication of kencur when it mixed with kunci pepet or temu kunci was couldn’t distinguish well by PCA. DA was able to distinguish the three species as well as all mixed sample of kencur-kunci pepet and kencur-temu kunci in all concentration used. However, kencur-kunci pepet 5% has a small difference with 100% of kencur. Validation of the DA model used a leave-one-out cross-validation technique (LOOCV). The model gave a very satisfactory classification prediction for the test sample (100% classified). Identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci was successfully achieved by our HPLC fingerprint method combined with DA. So the developed method was proved to be an efficient and reliable method for identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci. Keywords: authentication, chemometrics, HPLC fingerprint analysis, Kaempferia galanga
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AUTENTIKASI KENCUR MENGGUNAKAN KOMBINASI SIDIK JARI KCKT DAN KEMOMETRIKA
CAHYA SEPTYANTI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. dr. Irma Herawati Suparto, MS
Judul Tesis : Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika Nama : Cahya Septyanti NIM : G451124031
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Irmanida Batubara, MSi Ketua
Dr Mohamad Rafi, MSi Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Kimia
a.n. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Sekretaris Program Magister
Prof Dr Dyah Iswantini, MSc Agr
Prof Dr Ir Nahrowi, MSc
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
30 November 2015
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini ialah autentikasi, dengan judul Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika. Penelitian dilaksanakan sejak bulan April 2014 sampai Februari 2015 bertempat di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor (PSB IPB). Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Irmanida Batubara, MSi selaku ketua komisi pembimbing dan Dr Mohamad Rafi, MSi sebagai anggota komisi pembimbing yang selalu memberikan motivasi, kritik, dan saran untuk kelancaran penelitian dan penulisan. Terima kasih kepada Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor (PSB IPB) yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan penelitiannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Endi Suhendi yang telah membantu dalam menyediakan alat dan bahan selama penelitian dan Laela Wulansari, SSi yang telah membantu selama pengumpulan data sidik jari KCKT. Ungkapan terima kasih juga dihaturkan untuk kedua orang tua, suami, dan adik penulis yang selalu memberikan dukungan dan kasih sayangnya. Ucapan terima kasih kepada Nurmaida dan Dewi Anggraini S yang senantiasa menyemangati dan berjuang bersama dalam penelitian. Semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan. Bogor, November 2015 Cahya Septyanti
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
1
2 METODE Bahan Alat Prosedur Analisis Data
2 2 2 2
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengoptimuman Kondisi dan Validasi Metode KCKT Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi dan Autentikasi Kencur Identifikasi dan Autentikasi Kencur dari Kunci Pepet dan Temu Kunci Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika
4 4 6 8
4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
11 11 11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR TABEL 1 Sumber sampel 2 Komposisi campuran yang digunakan pada percobaan
3 3
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4
Kromatogram KCKT kencur Wonogiri Kromatogram kencur, temu kunci, dan kunci pepet Kromatogram sidik jari KCKT dari kencur, temu kunci, dan kunci pepet Kromatogram kencur 100%, kencur-temu kunci, dan kencur-kunci pepet 5 Plot AKU dan AD kencur, temu kunci, dan kunci pepet 100% serta campuran sampel
5 6 7 8 10
DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil identifikasi/determinasi tumbuhan 2 Kisaran waktu retensi relatif dan luas puncak relatif dari sampel 3 Pohon filogenik genus Kaempferia berdasarkan kloroplas sekuens DNA
13 14 15
1
1 PENDAHULUAN Kaempferia galanga yang di Indonesia dikenal sebagai kencur umumnya digunakan dalam obat tradisional untuk mengobati penyakit rematik, batuk, disentri, diare, dan sakit perut. Tanaman ini yang telah dilaporkan memiliki beberapa aktivitas biologis seperti antimikrob (Lakshmanan et al. 2011), antioksidan (Mekseepralard et al. 2010), pengusir nyamuk dan larva (Sutthanont et al. 2010), analgesik (Ridtitid et al. 2008), dan antialergi (Tewtrakul & Subhadhirasakul 2007). Produk kencur telah dijual komersial sebagai herbal kombinasi (jamu) diantaranya untuk jamu perawatan kesehatan wanita, jamu penyegar, jamu pelancar peredaran darah, dan jamu yang berkhasiat menguatkan tubuh (Roemantyo dan Soekarman 1996). Selain itu, kencur juga digunakan sebagai herbal tunggal (serbuk kencur) yang dikemas dalam bentuk kapsul atau sachet. Etil-p-metoksi sinamat dan etil sinamat dari ekstrak kencur berperan penting dalam bioaktivitas tersebut (Umar et al. 2012). K. rotunda (kunci pepet) dan K. pandurata (temu kunci) merupakan spesies yang berkerabat dekat dengan kencur yang tersedia di pasar tradisional Indonesia. Keduanya dimungkinkan sebagai bahan pemalsu (adulterant) bagi kencur karena adanya kemiripan dalam hal warna rimpang yang putih kekuningan. Membedakan ketiganya jika masih dalam bentuk rimpang tidaklah sulit karena ukuran dan bau rimpang masing-masing sangat berbeda, akan tetapi akan menjadi sangat sulit jika sudah dalam bentuk serbuk. Harga kencur kering di pasar umumnya lebih tinggi dari kunci pepet kering, dan temu kunci kering. Hal ini berarti kunci pepet dan temu kunci dimungkinkan untuk digunakan sebagai pemalsu untuk kencur. Jika bahan baku kencur telah terpalsukan (teradulterasi) maka kualitas, efikasi, dan keamanan produk akhir kencur akan berubah. Oleh karena itu, diperlukan suatu langkah untuk menentukan atau mengonfirmasi identitas dan keaslian kencur yang dikenal dengan istilah autentikasi. Autentikasi dilakukan dengan adanya suatu metode analitik yang tepat untuk menguji kualitas bahan baku kencur untuk mencegah adanya pemalsuan dari spesies yang berkerabat dekat dengannya seperti kunci pepet dan temu kunci. Identifikasi, autentikasi, dan diskriminasi spesies tumbuhan dalam 1 genus yang merupakan bagian dari kontrol kualitas obat herbal dapat dilakukan dengan metode sidik jari senyawa kimia. Beberapa teknik analisis seperti kromatografi (KLT, KG, KCKT/UPLC) dan spektrometri (UV-tampak, inframerah, RMI, SM) atau gabungan kromatografi-spektrometri (KG-SM dan KC-SM) dapat digunakan untuk analisis sidik jari (Liang et al. 2004). KCKT dengan detektor diode array (KCKT-DAD) merupakan pilihan yang lebih baik untuk pengembangan analisis sidik jari kimia karena teknik ini memiliki efisiensi pemisahan dan sensitivitas deteksi yang tinggi (Zou et al. 2006; Li et al. 2010). Analisis sidik jari kimia mampu menyajikan profil karakteristik kimia sampel dengan rinci akan tetapi akan mengandung data yang besar. Kemometrika, dalam hal ini analisis multivariat diperlukan untuk mengolah data tersebut dengan tujuan identifikasi, autentikasi, atau diskriminasi suatu sampel. Kombinasi sidik jari kromatografi dan analisis multivariat telah digunakan secara luas untuk identifikasi, autentikasi, dan diskriminasi dari berbagai tanaman obat termasuk beberapa genus Aconitum (Zhao et al. 2009), Epimedium (Wang et al. 2012), dan
2 Panax (Yang et al. 2013), Zingiber (Rafi et al. 2013), dan Curcuma (Rafi et al. 2015). Hingga saat ini belum ditemukan adanya publikasi yang terkait dengan penggunaan sidik jari KCKT yang dikombinasikan dengan kemometrika untuk genus Kaempferia yang bertujuan untuk identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi. Oleh karena itu, penelitian ini mengembangkan metode analisis sidik jari KCKT yang dikombinasikan dengan kemometrika untuk identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi kencur dari spesies yang berkerabat dekat (kunci pepet dan temu kunci). Metode ini diharapkan dapat menjadi metode yang dapat dipercaya, efisien, dan praktis untuk identifikasi dan autentikasi bahan baku kencur.
2 METODE Bahan Dua puluh satu sampel yang digunakan terdiri atas kencur dari 9 daerah, dari 6 daerah, kunci pepet dan temu kunci dari 6 daerah di pulau Jawa, Indonesia (Tabel 1). Semua sampel telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Indonesia (Lampiran 1) dan voucher spesimen disimpan di Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor, Indonesia. Bahan kimia yang digunakan ialah metanol, asetonitril, dan asam asetat dengan HPLC grade (Merck, Darmstadt, Jerman) serta air (Ikapharmindo Putramas, Jakarta, Indonesia). Filter membran Ekicrodisc 25 R (ukuran pori 0.45μm) diperoleh dari Gelman Science Japan Co. (Tokyo, Jepang).
Alat Alat-alat yang digunakan antara lain neraca analitik, dan sistem KCKT LC20A (Shimadzu, Tokyo, Jepang) dengan detector UV diode array dan kolom Shim-pack VP-ODS C18 (150 nm × 4.6 mm i.d) (Shimadzu, Tokyo, Jepang) serta peranti lunak statistika XLSTAT 2012.2.02 (Addinsoft, New York, USA).
Prosedur Analisis Data Preparasi Sampel Rimpang segar dicuci dengan air bersih, ditiriskan, dipotong kecil-kecil, dan dikeringkan dalam oven 50oC. Setelah itu, rimpang kering digiling dan diayak menggunakan pengayak 40 mesh agar diperoleh bentuk serbuk. Preparasi Sampel untuk Pembuatan Sidik Jari KCKT Ditimbang sebanyak 250 mg sampel serbuk (kencur, kunci pepet, dan temu kunci) kemudian diekstraksi menggunakan ultrasonikasi dengan 5 mL metanol selama 30 menit. Ekstrak sampel disaring dengan filter membran 0.45 μm sebelum diinjeksikan dalam sistem KCKT. Deteksi adulterasi dilakukan dengan mencampurkan serbuk kencur dengan kunci pepet atau temu kunci. Sumber sampel kencur dikelompokkan dalam 3
3 kategori yaitu konsentrasi komponen mayor tinggi (T), komponen mayor sedang (S), dan komponen mayor rendah (R). Kombinasi sampel kencur dengan kunci pepet atau temu kunci dilakukan sesuai komposisi pada Tabel 2. Tabel 1 Sumber sampel Spesies Kaempferia galanga
Kaempferia pandurata
Kaempferia rotunda
Kode sampel
Sumber (Daerah)
KG-1 KG-2 KG-3 KG-4 KG-5 KG-6 KG-7 KG-8 KG-9 KP-1 KP-2 KP-3 KP-4 KP-5 KP-6 KR-1 KR-2
Bogor, Jawa Barat Sumedang, Jawa Barat Karang anyar, Jawa Tengah Solo, Jawa Tengah Purworejo, Jawa Tengah
KR-3 KR-4 KR-5 KR-6
Bekasi, Jawa Barat Solo, Jawa Tengah Solo, Jawa Tengah Karang anyar, Jawa Tengah
Wonogiri, Jawa Tengah Wonogiri, Jawa Tengah Pacitan, Jawa Timur Pacitan, Jawa Timur
Bogor, Jawa Barat Bekasi, Jawa Barat Sumedang, Jawa Barat Wonogiri, Jawa Tengah Pacitan, Jawa Timur Ponorogo, Jawa Timur
Bogor, Jawa Barat Bekasi, Jawa Barat
Tabel 2 Komposisi campuran yang digunakan pada percobaan Kencur S-95 S-75 S-50 R-95 R-75 R-50
Komposisi (%) Kunci pepet Kencur 5 T-95 25 T-75 50 T-50 5 S-95 25 S-75 50 S-50
Temu kunci 5 25 50 5 25 50
Keterangan: T = konsentrasi komponen mayor tinggi, S = sedang, R = rendah
Peralatan dan Kondisi Kromatografi Sistem KCKT terdiri dari pengumpan mikro dengan syringe gas tight, klep mikroinjeksi sebagai injektor, kolom C18, dan detektor DAD. Suhu kolom sesuai suhu kamar dan laju alir fase gerak 1.0 ml/menit. Pengoptimuman sidik jari
4 KCKT diperoleh dengan mengombinasikan eluen asam asetat (CH3COOH) 1% dimodifikasi dengan pelarut organik yaitu asetonitril (ACN) atau metanol (MeOH) dengan sistem elusi gradien dan deteksi pada panjang gelombang 200−400 nm. Sebanyak 20 μL ekstrak kencur yang telah dipreparasi diinjeksikan ke dalam setiap kondisi yang telah disebutkan. Waktu analisis total, jumlah puncak, dan resolusi masing-masing puncak digunakan sebagai variabel untuk menentukan kondisi optimum analisis. Selanjutnya, sampel kunci pepet dan temu kunci (Tabel 1) dan campuran sampel dengan komposisi lainnya (Tabel 2) diinjeksikan dengan sistem KCKT pada kondisi optimum analisis. Validasi metode analitik dilakukan dengan parameter kedapatulangan dan stabilitas terhadap waktu retensi relatif dan luas puncak relatif. Kedapatulangan metode ditentukan dengan injeksi 5 larutan sampel yang disiapkan. Stabilitas metode diuji berdasarkan analisis larutan sampel pada 0, 4, 8, dan 12 jam. Simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif dan luas puncak relatif puncak mayor ditentukan untuk kedua parameter tersebut. Autentikasi Kencur Data yang diperoleh dari profil kromatografi sampel kencur, kunci pepet, temu kunci, serta campuran sampel dievaluasi menggunakan analisis kemometrika multivariat. Waktu retensi relatif kencur setiap puncak khas dihitung dengan membandingan waktu retensi setiap puncak terhadap waktu retensi puncak tertinggi. Dihitung juga luas puncak relatif setiap puncak khas terhadap luas puncak tertinggi. Autentikasi dilakukan dengan mengelompokkan luas puncak relatif puncak mayor kromatogram. Model divalidasi dengan LOOCV (leave-oneout cross-validation) dengan piranti lunak XLSTAT 2012.2.02 (Addinsoft, New York, USA).
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengoptimuman Kondisi dan Validasi Metode KCKT Kondisi optimum pembuatan sidik jari KCKT kencur diawali dengan preparasi sampelnya. Kencur yang digunakan ialah kencur yang berasal dari daerah Wonogiri, Jawa Tengah. Daerah ini dipilih karena memberikan intensitas sinyal setiap puncak mayor yang tertinggi dari daerah lainnya. Kencur diekstraksi dengan ultrasonikasi supaya seluruh komponen kimia (senyawa mayor dan minor) akan terdeteksi pada sidik jari kromatografi dengan waktu ekstraksi yang tidak terlalu lama. Pemilihan nisbah serbuk:pelarut 250 mg dalam 5 mL metanol dan waktu ekstraksi selama 30 menit berdasarkan percobaan jumlah serbuk dan waktu ekstraksi yang memberikan intensitas puncak mayor yang optimum terbaca pada kromatogram. Pengoptimuman kondisi KCKT sangat penting dilakukan dalam analisis sidik jari kromatografi. Hal ini bertujuan agar diperoleh pemisahan analat dengan resolusi dan baseline yang baik. Menurut Dejaegher et al. (2010), pemisahan yang baik untuk analisis kualitatif ialah yang memberikan jumlah puncak (n)
5 maksimum dan pemisahan antar puncak yang jelas (resolusi > 1.5). Pada penelitian ini, pemisahan analat optimum diperoleh dengan elusi gradien 20-80% metanol dan asam asetat 1% dalam air. Kondisi tersebut memberikan nilai resolusi 7 puncak mayor lebih besar dari 1.5 dan waktu analisis selama 1 jam (Gambar 1). Pemilihan sistem elusi gradien karena ekstrak sampel mengandung komponen kimia yang kompleks. Sistem elusi isokratik umumnya tidak dapat memberikan pemisahan yang baik dan jumlah puncak mayor lebih sedikit sehingga tidak memberikan informasi yang cukup dalam analisis sidik jari kromatografi. Panjang gelombang yang dipilih ialah 254 nm karena pada panjang gelombang ini seluruh puncak mayor dapat terbedakan dengan baik dan memberikan baseline yang lurus sehingga sensitivitasnya lebih tinggi dari panjang gelombang lain.
Gambar 1 Kromatogram KCKT kencur wonogiri. Kolom yang digunakan: Shimpack VP-ODS C18 (150 nm × 4.6 mm i.d) (Shimadzu, Tokyo, Jepang). Fase gerak terdiri dari methanol dan asam asetat 1% dalam air menggunakan program elusi gradien 20−80% (A) selama 0-60 menit dengan laju alir 1 mL/menit dan panjang gelombang deteksi 254 nm Sistem kromatografi optimum yang telah diperoleh kemudian divalidasi terlebih dahulu sebelum digunakan untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci. Parameter kedapatulangan dan stabilitas cukup mewakili validasi metode untuk analisis kualitatif. Kedapatulangan dilakukan untuk melihat kedapatulangan metode uji. Pada penelitian ini diperoleh simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif untuk semua puncak mayor dari uji kedapatulangan dengan kisaran 0–0.18% sedangkan untuk luas puncak relatif sebesar 0–5.95%. Uji stabilitas dilakukan untuk melihat stabilitas dari sampel uji. Simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif dan luas puncak relatif dari uji stabilitas yang diperoleh kurang dari 1.33% dan 1.94%. Perbedaan waktu retensi menunjukkan ketidakpastian dalam perhitungan waktu retensi di antara kromatogram. Suatu metode analitik dikatakan valid jika nilai simpangan baku relatif kurang dari 5% (Taverniers et al. 2004). Meskipun ada satu puncak mayor yang memberikan simpangan baku relatif dari luas puncak relatif lebih besar dari
6 5%, puncak mayor lain sesuai dengan standar validasi metode yang berlaku. Oleh karena itu, hasil uji kinerja analitik menunjukkan bahwa pengembangan metode sidik jari KCKT secara kualitatif ini dapat dipercaya dan valid. Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi dan Autentikasi Kencur Metode sidik jari KCKT yang telah dikembangkan kemudian diaplikasikan pada 21 sampel tunggal yang terdiri dari 9 sampel kencur, 6 sampel kunci pepet, dan 6 sampel temu kunci. Kromatogram sampel kencur, kunci pepet, dan temu kunci tunggal ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Kromatogram kencur (a), temu kunci (b), dan kunci pepet (c). Lokasi: kencur Bogor (a1), Sumedang (a2), Karang anyar (a3), Solo (a4), Purworejo (a5), Wonogiri 1 (a6), Wonogiri 2 (a7), Pacitan 1 (a8), Pacitan 2 (a9); temu kunci Bogor (b1), Bekasi (b2), Sumedang (b3), Wonogiri (b4), Pacitan (b5), Ponorogo (b6); kunci pepet Bogor (c1), Bekasi 1 (c2), Bekasi 2 (c3), Solo 1 (c4), Solo 2 (c5), Karang anyar (c6) Puncak yang ada dalam semua sampel dan memberikan sinyal cukup besar dalam setiap kromatogram sampel digunakan sebagai puncak mayor. Pendekatan sidik jari yang khas digunakan dengan normalisasi waktu retensi dan luas puncak untuk
7 menghitung waktu retensi relatif dan luas puncak relatif setiap puncak mayor terhadap puncak pembanding. Puncak pembanding yang dipilih adalah puncak 4 (Gambar 3) karena memberikan luas puncak tertinggi dalam kromatogram sidik jari kencur. Nilai waktu retensi relatif setiap puncak mayor relatif konsisten (Lampiran 2), artinya waktu retensi relatif merupakan variabel yang cocok digunakan dalam identifikasi sampel. Sebaliknya, nilai luas puncak relatif bervariasi (Lampiran 2) di antara sampel yang menunjukkan perbedaan konsentrasi senyawa kimia setiap sampel. Hal ini dikarenakan kondisi lingkungan tanaman yang berbeda antar daerah sampel.
c b a
Waktu (menit) Gambar 3 Kromatogram sidik jari KCKT dari kencur (a), temu kunci (b), dan kunci pepet (c) Identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi dari beberapa spesies yang berkerabat dekat dapat dilakukan dengan analisis sidik jari kromatografi. Perbandingan kromatogram sidik jari untuk semua sampel yang diuji menunjukkan bahwa hampir semua puncak mayor yang diperoleh dari ketiga spesies tidak bertumpang tindih. Puncak mayor (1, 3, 5, 13, 14, dan 15) dari kencur tidak muncul dalam temu kunci dan kunci pepet. Begitu juga puncak mayor temu kunci (2, 8, 9, 10, 11, 12, dan 19) dan kunci pepet (6, 7, 16, 17, dan 18) tidak muncul dalam sampel lainnya sehingga seluruh puncak mayor dari setiap spesies tersebut merupakan puncak yang khas. Meskipun puncak no. 4 ada pada kencur dan temu kunci, puncak ini umumnya menunjukkan tinggi puncak yang dominan pada kencur. Oleh karena itu, puncak no. 4 pun dapat digunakan sebagai puncak karakteristik dari kencur. Hal yang sama juga terjadi pada puncak no. 15 kencur terhadap puncak no.16 pada kunci pepet. Semua puncak khas dalam kromatogram sidik jari dari setiap sampel ini dapat digunakan untuk identifikasi, diskriminasi, autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci (Gambar 3). Adanya puncak karakteristik dari setiap spesies sangat membantu dalam pendeteksian jika terjadi adulterasi kencur oleh kunci pepet dan temu kunci. Jika kencur teradulterasi oleh kunci pepet dan temu kunci dengan konsentrasi 5, 25, dan 50%, kromatogram sidik jari dapat membedakan kencur tunggal dari kencur yang tercampur dengan kunci pepet dan temu kunci. Adanya puncak karakteristik dari kunci pepet dan temu kunci memberikan perbedaan pada kromatogram sidik jari yang diperoleh (Gambar 4). Konsentrasi adulteran (kunci pepet dan temu
8 kunci) menyebabkan perubahan yang signifikan pada kromatogram kencur (Gambar 4a). Intensitas puncak mayor dari kencur menurun secara linear sedangkan intensitas puncak mayor dan kunci pepet meningkat linear dengan meningkatnya konsentrasi adulteran (Gambar 4b & 4c). Berdasarkan hasil yang diperoleh, identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah diperoleh menggunakan analisis sidik jari KCKT.
a
b
c
Waktu (menit) Gambar 4 Kromatogram kencur 100%, kencur-temu kunci, dan kencur-kunci pepet (a), campuran kencur-temu kunci (b), dan campuran kencurkunci pepet (c). Sampel: kencur 100% (a1, b1, & c1), kencur-temu kunci 5% (a2 & b2), 25% (a3 & b3), 50% (a4 & b4), temu kunci 100% (a5 & b5), kencur-kunci pepet 5% (a6 & c2), 25% (a7 & c3), 50% (a8 & c4), dan kunci pepet 100% (a9 & c5) Identifikasi dan Autentikasi Kencur dari Kunci Pepet dan Temu Kunci Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika Kombinasi sidik jari KCKT dan kemometrika dalam hal ini analisis multivariat digunakan untuk mengonfirmasi hasil yang diperoleh untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci dari pengamatan kromatogram sidik jari yang khas. Kombinasi ini merupakan metode yang paling sering digunakan untuk identifikasi, autentikasi, dan autentikasi spesies tanaman obat. Teknik analisis multivariat yang digunakan dalam
9 penelitian ini adalah analisis komponen utama (AKU) dan analisis diskriminan (AD). Pada analisis multivariat, AKU merupakan contoh pengenalan pola tidak terawasi dan merupakan metode yang paling sering digunakan untuk mereduksi data. AKU dapat mereduksi jumlah variabel dan akan memberikan informasi baru setelah reduksi dari set data. Hasil dari analisis AKU ialah variabel baru yang disebut komponen utama (KU) dari transformasi data aslinya. Umumnya, dua KU sering digunakan untuk membuat plot AKU karena KU tersebut memberikan variasi data paling besar. Kemiripan obyek dan kecenderungan pengelompokan ditunjukkan dalam plot AKU. Pada penelitian ini, AKU digunakan untuk identifikasi dan autentikasi seluruh sampel berdasarkan luas puncak dari 19 puncak mayor. AKU dilakukan pada 33 obyek × 19 matriks data. Gambar 5b menunjukkan plot AKU dengan 2 KU pertama, keragaman total dari campuran sampel yang dihasilkan sebesar 64.80% (KU1 = 30.06% dan KU2 = 34.74%). Berdasarkan plot AKU, sampel kencur, temu kunci, dan kunci pepet dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok berbeda (Gambar 5a & 5b). Hal yang sama untuk autentikasi kencur jika teradulterasi dengan temu kunci, semua campuran sampel dapat dibedakan dengan baik (Gambar 5b). Namun, pada campuran kencur-temu kunci 5% terlihat bahwa jarak antara campuran tersebut dengan kencur 100% sangat dekat. Metode AKU juga tidak dapat membedakan campuran kencur dan kunci pepet dengan baik. Hal ini karena luas puncak mayor kunci pepet tunggal sangat kecil dibandingkan luas puncak mayor kencur (Gambar 3a dan 3c). Oleh karena itu, AKU dapat mendiskriminasikan ketiga spesies namun tidak berhasil dalam autentikasi kencur khususnya jika kencur teradulterasi oleh kunci pepet. AD merupakan teknik pengenalan pola lainnya yang sangat baik dan umum digunakan untuk diskriminasi tumbuhan yang berkerabat dekat. Metode ini akan membentuk suatu fungsi diskriminan (FD) untuk setiap kelompok dengan mencari kombinasi linear dari data yang akan memberikan pemisahan dari dua atau lebih kelompok observasi. Pada penelitian ini, model prediksi AD digunakan untuk memperoleh diskriminasi yang jelas antara ketiga sampel dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci. Model ini juga menggunakan 19 puncak mayor sebagai variabel. Keragaman total yang diperoleh sebesar 98.91% (F1 = 94.59% dan F2 = 3.32%). Gambar 5c dan 5d menunjukkan bahwa AD telah dapat mengelompokkan ketiga spesies tunggal serta campuran kencur-temu kunci dan kencur-kunci pepet pada semua konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini. Namun, kencur-kunci pepet 5% memiliki perbedaan yang kecil dengan kencur 100%. Hal ini karena luas puncak mayor kunci pepet tunggal sangat kecil (Gambar 3a dan 3c). Luas puncak kunci pepet yang sangat kecil ini membuat perubahan komposisi kunci pepet 5% tidak memberikan perbedaan signifikan pada komposisi senyawa adulteran dalam campuran (Gambar 4c1 & 4c2).
10
Gambar 5 Plot AKU kencur, temu kunci, dan kunci pepet 100% (a), plot AKU 100% sampel dan campuran sampel (b); plot AD sampel 100% (c) dan plot AD100% sampel dan campuran sampel Berdasarkan analisis sidik jari kromatogram dan pola pengelompokkan analisis multivariat ketiga sampel, dapat teramati bahwa pola sampel kencur lebih dekat dengan kunci pepet daripada temu kunci. Hal ini sesuai dengan pohon filogenik genus Kaempferia yang telah dibuat oleh Techaprasan et al. (2010) berdasarkan kloroplas sekuens DNA (Lampiran 3). Validasi model AD dengan jumlah sampel sedikit umumnya dilakukan dengan teknik validasi silang. Kemampuan prediksi model telah diuji dengan menggunakan validasi leave-one-out cross (LOOCV). LOOCV merupakan pendekatan yang paling umum dengan mengeluarkan satu sampel pada suatu waktu. Prosedur ini diulang sampai semua objek telah dikeluarkan secara bergilir. LOOCV terklasifikasi sangat baik pada 100% sampel yang digunakan dalam penelitian ini. Hasil ini menunjukkan bahwa model memberikan prediksi klasifikasi yang sangat memuaskan untuk sampel uji.
11
4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah dilakukan dengan metode sidik jari KCKT. Autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci dilakukan dengan pengamatan puncak karakteristik dari kromatogram sidik jari pada setiap sampel yang digunakan serta kombinasi dengan kemometrika (AD). Metode yang dikembangkan ini menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan efisien untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci.
Saran Identifikasi puncak karakteristik dari kencur, kunci pepet, dan temu kunci dengan KC-SM diperlukan. Hal ini bertujuan memberi tambahan informasi senyawa penciri pada setiap sampel dan lebih memudahkan dalam autentikasi kencur terhadap spesies yang berkerabat dekat.
DAFTAR PUSTAKA Dejaegher B, Alaerts G, Matthijs N. 2010. Methodology to Develop Liquid Chromatographic Fingerprints for the Quality Control of Herbal Medicines. Acta Chromatogr. 22(2):237–258.doi:10.1556/AChrom.22.2010.2.7. Lakshmanan D, Werngren J, Jose L, Suja KP, Nair MS, Varma RL, Mundayoor S, Hoffner S, Kumar RA. 2011. Ethyl p-methoxycinnamate isolated from a traditional anti-tuberculosis medicinal herb inhibits drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis in vitro. Fitoterapia 82:757– 761.doi:10.1016/j.fitote.2011.03.006. Li Y, Wu T, Zhu ZH, Wan LL, Yu Q, Li XX, Cheng ZH, Guo C. 2010. Combinative method using HPLC fingerprint and quantitative analyses forquality consistency evaluation of an herbal medicinal preparation produced by different manufacturers. J Pharm Bio Med Anal. 52:597602.doi:10.1016/j.jpba.2010.01.018. Liang ZY, Xie P, Chan K. 2004. Quality control of herbal medicines. J J Chromb. 812:53-70.doi:10.1016/j.jchromb.2004.08.041. Mekseepralard C, Kamkaen N, Wilkinson JM. 2010. Antimicrobial and antioxidant activities of traditional Thai herbal remedies for aphthous ulcers. Phytother Res. 24:1514–1519.doi:10.1002/ptr.3158. Rafi M, Wulansari L, Heryanto R, Darusman LK, Lim LW, Takeuchi T. 2015. Curcuminoid’s Content and Fingerprint Analysis for Authentication and Discrimination of Curcuma xanthorrhiza from Curcuma longa by HighPerformance Liquid Chromatography-Diode Array Detector. Food Anal Methods 8(9):2185-2193.doi:10.1007/s12161-015-0110-1.
12 Rafi M, Lim LW, Takeuchi T, Darusman LK. 2013. Capillary liquid chromatographic fingerprint used for discrimination of Zingiber montanum from related species. Anal Bioanal Chem. 405:6599-5503.doi: 10.1007/s00216013-7083-y. Ridtitid W, Sae-Wong C, Reanmongkol W, Wongnawa M. 2008. Antinociceptive activity of the methanolic extract of Kaempferia galanga Linn. in experimental animals. J Ethnopharmacol.118:225–230.doi:10.1016/j.jep.2008.04.002. Roemantyo HS, Soekarman. 1996. Sekilas pemanfaatan kencur pada jamu kemasan (jamu products containing Kaempferia galanga L.). Warta Tumbuhan Obat Indonesia [internet].[diunduh 2013 Okt 26];3(2): 15-16. Tersedia pada: http//ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/wtoi/article/view/2780. Sutthanont N, Choochote W, Tuetun B, Junkum A, Jitpakdi A, Chaithong U, Riyong D, Pitasawat B. 2010. Chemical composition and larvicidal activity of edible plant-derived essential oils against the pyrethroid-susceptible and resistant strains of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Vector Ecol. 35:106– 115.doi:10.1111/j/1948-7134.2010.00036.x. Taverniers I, De Loose M, Van Bockstaele E. 2004. Trends in quality in the analytical laboratory. II. Analytical method validation and quality assurance. Trends Anal Chem. 23 (8):535-552.doi:10.1016/j.trac.2004.04.001. Techaprasan J, Klinbunga S, Ngamriabsakul C, Jenjittikul T. 2010. Genetic variation of Kaempferia (Zingiberaceae) in Thailand based on chloroplast DNA (psbA-trnH and petA-psbJ) sequences. Genet Mol Res. 9(4):19571973.doi:10.4238/vol9-4gmr873 Tewtrakul S, Subhadhirasakul S. 2007. Anti-Allergic activity of some selected plants in the Zingiberaceae family. J. Ethnopharmacol. 109:535– 538.doi:10.1016/j.jep.2006.08.010. Umar MI, Asmawi MZ, Sadikun A, Atangwho IJ, Yam MF, Altaf R, Ahmed A. 2012. Bioactivity-guided isolation of ethyl-p-methoxycinnamate, an antiinflammatory constituent, from Kaempferia galanga L. extracts. Molecules 17: 8720-8734.doi:10.3390/molecules17078720. Wang L, Wang X, Kong L. 2012. Automatic authentication and distinction of Epimedium koreanum and Epimedium wushanense with HPLC fingerprint analysis assisted by pattern recognition techniques. Biochem. Sys. Eco. 40:138145.doi:10.1016/j.bse.2011.10.014. Yang DY, Lee SW, Kim YO, Sohn S, Kim YC, Hyun DY, Hong YP, Shin YS. 2013. HPLC-based metabolic profilling and quality control of leaves of different Panax species. J Gingseng Res. 37:248253.doi:10.5142/jgr.2013.37.248. Zhao Y, Zhang Y, Lin R, Sun W. 2009. An expeditious HPLC method to distinguish Aconitum kusnezoffi from related species. Fitoterapia 80:333338.doi:10.1016/j.fitote.2009.04.005. Zou HB, Yag GS, Du AQ, Yuan JR, Qin ZR, Xia YY, Aboul-Enein HY. 2006. Combinational numeral fingerprint spectra of Glycyrrhiza and analysis of common peak ratio invariableness in HPLC. Biomed Chromatogr. 20:642655.doi:10.1002/bmc.639.
13 Lampiran 1 Hasil identifikasi/determinasi tumbuhan
Keterangan: sampel no. 9 & 10 tidak digunakan
14
Lampiran 2 Kisaran waktu retensi relatif (RRT) dan luas puncak relatif (RPA) dari sampel
15
Lampiran 3 Pohon filogenik genus Kaempferia berdasarkan kloroplas sekuens DNA (Techaprasan et al. 2010)
K. galanga
K. rotunda
K. pandurata
16
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 8 September 1990 sebagai anak sulung dari pasangan Muji Waluyo dan Rachmawati. Pendidikan Sarjana ditempuh di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, lulus pada tahun 2012. Kesempatan untuk melanjutkan ke program magister di Program Studi Kimia pada Program Pascasarjana IPB diperoleh pada tahun 2012. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh pada tahun 2013 dari program Fresh graduate Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Republik Indonesia. Penulis bekerja paruh waktu sebagai pengajar bidang studi kimia SMA di bimbingan belajar Nurul Fikri di Bogor sejak tahun 2012. Penulis juga aktif menjadi asisten praktikum di laboratorium kimia IPB saat pendidikan sarjana serta pernah menjadi penanggung jawab praktikum di laboratorium kimia IPB saat pendidikan magister. Saat mengikuti program sarjana, penulis pernah menjadi pemakalah poster pada seminar nasional tanaman obat “POKJANAS TOI XLII” di Universitas Jenderal Achmad Yani (UNJANI), Cimahi, Bandung pada tahun 2012. Selama mengikuti program S-2, penulis berperan aktif dalam seminar internasional temulawak (IST3) yang diselenggarakan oleh Pusat Studi Biofarmaka IPB tahun 2015 sebagai penyaji poster. Artikel yang berjudul “HPLC Fingerprint Analysis Combined with Chemometrics for Authentication of Kaempferia galanga from Related Species” sedang dalam proses review pada jurnal Indonesian Journal of Chemistry. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari program S-2 penulis.
