Aplikovaná biologie rostlinné buňky Biotechnologický potenciál rostlinné buňky Důkaz možnosti kultivace izolovaných rostlinných buněk – náhrada polní produkce konkrétní rostliny cíleně odvozenou (jednobuněčnou) kulturou rostlinných buněk. Znaky takto získaného producenta: nezávislost a podmínkách polní produkce, vysoký stupeň homogenity biologického materiálu, eliminace kontaminantů, eliminace balastní biomasy, získání stavu kontinuální produkce, výhody, které nabízí tento ekvivalent kultury jednobuněčných organismů (využití biosyntetického, biotransformativního, biodegradativního, popř. biosorpčního potenciálu daného buněčného typu), výhody reprodukční aktivity suspenzní buněčné populace, přímá použitelnost fyziologických a genetických manipulací, možnost konstrukce hybridní rostlinné buňky, možnost přípravy haploidních buněčných klonů, teoretická možnost všech experimentálních přístupů buněčné biologie. „Explantátová“ kultura. Otázky volby matečné rostliny, lokalizace a aseptická extrakce orgánového fragmentu- „explantátu“, kultivační podmínky a kultivace explantátu, amorfní aglomerace rostlinných buněk – „kalus“, jeho úpravy a následné kultivace, problematika kultivačních podmínek (kompozice medií atd.), mechanické a enzymové rozvolnění agregovaných forem – primární suspenzní kultura a její primární kultivace. Problematika analytického monitorování znakové aktivity v kontextu indukované buněčné dediferenciace a rediferenciace. Problematika základních požadavků. Stabilita vztahu genotyp – fenotyp. Reprodukovatelná jak reprodukční, tak technologická aktivita v definovaných podmínkách. Stabilita jednobuněčného stavu. Homogenita a stabilita buněčné morfologie, stabilita žádaného stavu buněčné diferenciace. Problematika kultivačních podmínek. Modelová media a jejich variace. Problematika exogenních regulátorů (stimulátorů, inhibitorů) buněčného růstu a reprodukce. Vliv světla. Vliv zdroje uhlíku a fosforu, poměru C:N. Vliv objemu kultury. Problém mikróbní kontaminace. Požadavky kladené na kultivační zařízení. Růstový cyklus a produkční fáze. Základní rozdíly ve srovnání s populacemi jednobuněčných organismů. Chybějící stav tzv. vyváženého růstu. Vnitrobuněčná akumulace nutrientů. Kontinuální změna buněčné fyziologie a biochemie v intervalu růstového cyklu kultury. Možné profily akumulace produktu vs růstová křivka. Problém heterogenity kultury rostlinných buněk- vliv sub-populací. Technologicky významná aktivita. Ilustrující přehled: sekundární metabolity, enzymy, biologicky aktivní peptidy, alergeny, biocidně / biostaticky působící látky, antivirová agens, biotranasformační aktivita, fytoremediační aktivita. Použitelnost principů metabolického inženýrství v optimalizace produkce sekundárních metabolitů. Genetická transformace. DNA transport prostřednictvím T-oblasti plasmidu Ti (Agrobacterium tumefaciens, jedna kopie, determinace onkogenního potenciálu daného taxonu, schopnost genetické kolonizace povrchu rostlinné tkáně). Genové inženýrství rostlin-transgenní rostliny.
Aplikovaná biologie živočišné buňky Vývoj organismů obsahujících morfologicky diferenciované jádro vedl v jedné ze dvou základních linii k vývoji heterotrofních buněk a následně jejich makro-organismálních forem – živočichů (Metazoa). Alternativní, sumární označení – buňky metazoí. Buněčný typ, který je výrazně citlivý k mimobuněčným regulujícím vlivům a většinou dostupný jako typ diferencovaný, což v případě cíleně připravených buněčných kultur komplikuje uplatnění buněčné biologie jiných buněčných typů.. Z hlediska aplikované biologie potenciální zdroj: bílkovin regulačních, bílkovin s protinádorovým a antivirovým účinkem, bílkovin krve a protilátek. Obecný princip přípravy tkáňové kultury. Izolace a fragmentace tkáně; enzymové rozvolnění (trypsin, kolagenasa..). Primární inokulum prvního kultivačního prostředí. Proces spojen s obecně vysokým buněčným úhynem, možné převládnutí vitálního buněčného typu, který byl v donorové tkání pod represivní kontrolou atd.. Vliv změny objemu a složení mimobuněčného prostředí (kultivace in vitro vs původní stav intaktní tkáně). Fragilita živočišné buňky, problém mikróbní kontaminace. Nutriční požadavky tkáňové kultury. Značná komplexnost, možná variabilita zdroje C (glykolýza, oxidativní metabolismus), volba komplexu minerálních solí, osmotická stabilizace s ústojnou schopností, význam souboru aminokyselin, vitaminů, purinových a pyrimidinových bazí, stopových prvků (Fe), růstových faktorů a specificky vysoké koncentrace bílkovin (krevního séra). Význam fyzického kontaktu. Častý jev závislosti růstu a reprodukční aktivity na kontaktu buňky s povrchem mikronosiče umožňuje dosažen 3D růstu buněčné populace. Materiály, a modifikace povrchů a další požadavky kladené na komerční nosiče. Míchaná a statická kultivace. Perfúzní reaktory, aplikace dutých vláken. Potenciální použitelnost všech kultivačních uspořádání. Buněčná linie. Vzniká pasážováním primární kultury. Pole finálního růstového fenotypu: a) diploidní buněčná linie: nezměněné chromozomální složení, limitovaný růstový potenciál s fází aktivního a limitovaného růstu; b) heteroploidní buněčné linie: modifikované chromozomální složení, tzv. nelimitovaný buněčný potenciál – „nesmrtelné linie“. Experimentální potenciál obou růstových fenotypů. Vztah růstové fáze vs změna hladiny hlavních biopolymerů. Maximální populační hustota. „Cell banking“: Současný termín pro komplexní problematiku uchovávání populací individuálně izolovaných buněčných linií, např. problemtiku kryoprotekce, mikrobní kontaminace, kompozice medií, aplikace a vliv aditivních komponentů (antiobiotik), lyzogenních stavů, autenticity kultur atd.. Transgenní myš. Ilustrace konstrukce transgenního kmene jako experimentálního biomedicinského modelu. Retrovirový vektorový systém (nevýhody). Mikroinjektáž DNA. Použitelnost stádia blastocystu. Pluripotentní embryonální kmenové buňky (ES). Genové manipulace bez ztráty pluripotence. Transfekce ES buněk DNA vektorem. Chromozomální terčové místo této transfekce.
Interferony Historie poznání jevu autonomní protekce určitých populací živočišných buněk před postupující virovou infekcí. Specifická reakce živočišné buňky na přítomnost cizí nukleové kyseliny – termín interferon. Charakteristika a klasifikace interferonů Skupina proteinů produkovaná určitými diferencovanými typy buněk obratlovců. Druhová vzdálenost producenta vs stupeň homologie AK sekvence. Skupina: INF-α, INF-β a INF-γ. Proteiny INF-α a INF-β jsou syntetizovány je-li producent vystaven kontaktu s virovou částicí nebo replikačnímu produktu virové nukleové kyseliny (dv RNA). Produkce INF-γ je idukována endogenní stimulací (např. mimobuněčnou regulací v rámci procesů určité imunitní odpovědi, která daný typ interferonu použije). Různý objem genetické informace determinující složku interferonů: INFα : 13 genů, INF-β : 2 geny, INF-γ : 1 gen. Relativně velké množství subtypů INF-α : odlišná specifita účinnosti antivirového účinku pro různý buněčný typ při identické virové infekci. Dílčí rozdíly INF-proteinů např. v typu aminocukru. Individuální rozdíly α-, β- a γ- interferonu jsou v molekulové hmotnosti, ctlivosti k pH, hydrofilnímu / hydrofóbnímu charakteru makromolekuly…. Aktuálně působící interferonový soubor : vliv organizmálního typu, buněčného typu producenta, typu induktoru produkce (virová infekce, jiné induktory, stimulace v rámci biosystému daného organismu a další). Producent: lymfoidní buněčný typ. Genové manipulace směřující k cílené konstrukci hybridních interferonů, kombinující vybrané vlastnosti (aktivity) individuálních typů (sestřih DNA sekvenvce) – rozšíření spektra antivirové aktivity, konstrukce nových aktivit v kontextu antivirového a ne-antivirového účinku interferonů. Antivirový účinek Fáze dosažení antivirového stavu živočišné buňky: a) Indukovaná syntéza interferonu a jeho mimobuněčné uvolňování; b) kontakt interferonu s receptorovou složkou terčové buněčné populace, transdukce tohoto signálu; komplexní buněčná odpověď na tento signál, tj. dosažení „antivirového stavu“. Antivirový stav: Základní otázky inhibice reprodukčního cyklu viru (obecně). Klíčové poznatky ve vývoji představ o antivirovém stavu jako stavu pohotovosti blokovat další šíření virové infekce. A) Interferonem indukovaná syntéza proteikinasy, fosforylující (po aktivaci dvRNA) eukaryotický iniciační faktor (eIF-2α), což v konečném důsledku znamená inhibici proteosyntézy. B) Interferonem indukovaná syntéza 2-5A synthetasy, jejímž substrátem je ATP, a která katalyzuje (po aktivaci dvRNA) syntézu oligomerů látky 2-5A, ve kterých jsou molekula adenosinu spojené neobvyklou 2‘- 5‘- fosfodiesterovou vazbou. Tyto oligomery aktivují specifickou endoribonukleasu s následnou degradací mRNA – inhibicí proteosyntézy. Přítomnost uvedených enzymů (jejich inaktivních forem) podmiňuje stav, kdy případná virová infekce (takto připravené, neinfikované buňky) aktivuje tento enzymový systém a následný blok proteosyntézy interferuje s reprodukčním cyklem viru a dalším vývojem virové infekce. Ne-antivirový účinek Otázka čistoty preparátů interferonů. Suma dílčích biologických aktivit interferonů, která není specificky spojena s účinkem antivirovým. Interference s růstovou a reprodukční aktivitou, vnitrobuněčnou hladinou enzymů, strukturami buněčného povrchu, imunitními reakcemi (funkce lymfokinů) atd.
Monoklonální protilátky Obranný systém obratlovců Rozlišení vrozené a adaptivní (specifické) imunity. Vrozená imunita: protekce fyzikálně-chemickou bariérou. fagocytozující buňky (neutrofily, eosinofily), zánětlivá odpověď; není specifická vůči antigenu (neschopnost rozlišit antigen), neexistuje paměťový systém, neexistuje posílení opakovanou infekcí. Adaptivní (specifická) imunita: stav imunity specifický k antigenu; dva typy specifické imunitní odpovědi: humorální (produkce protilátky) (HI), buněčná (CMI)-úloha cytotoxicky působících buněk; faktory stimulující imunitní odpověď určují poměr zapojení HI a CMI. Imunogen: vše co stimuluje specifickou imunitní odpověď; imunogenita makromolekul; Antigen = Imunogen – struktura, která váže produkty imunitní odpovědi, velikost, hapten. Imunogen – více antigenních determinant. Epitop = Antigenní determinanta, nejmenší oblast imunogenu umožňující vazbu protilátky (lineární, konformační, nově vytvořená...) Imunogenicita: vysoká // nízká, determinující faktory. T-lymfocyty, B-lymfocyty: stejný původ, kmenové buňky kostní dřeně, individuální proces maturace, diferencované funkce v realizaci imunitní odpovědi; stimulace diferenciaec Blymfocytu v producenta protilátky (charakteristika plazmatických buněk); funkční typy Tlymfocytů: Th, Tc, Tm – lymfocyty. Celková populace B- a T-lymfocytů jednotlivce vs jeho schopnost reagovat na rozsah variability antigenních determinant. Buňky prezentující antigen (APC, 8 typů): ilustrace zpracování antigenu po jeho rozpoznání makrofágem: fagocytóza a degradace imunogenu, membránová integrace fragmentů imunogenu, funkce proteinů MHC v kontaktní interakci makrofág / Th lymfocyt, duální receptorová struktura TH – lymfocytu. Indukce syntézy IL-1 a IL-2 interakcí makrofág / THlymfocyt. Úloha interleukinů. Paralelní model stimulace Tc-lymfocytu interakcí s virovou částicí. Model kontaktní stimulace B-lymfocytů produkce specifické protilátky.Vysvětlení termínu „biotechnologie na bázi imunologie“, v kontextu významu a použitelnosti produktů těchto technologií, tj. specifických bílkovin imunitního systému. Protilátky Komaparace indukované syntézy protilátky a indukované syntézy enzymu (J. Monod). Obecná charakteristika molekuly imunoglobulinu; lehký a těžký řetězec, variabilní oblasti, konstantní oblasti, štěpy po digesci papainem (Fab, Fc, Fv).... Úloha imunoglobulinů IgG, IgM, IgA, IgD a IgE. Inter- a intramolekulové vazebné a vazné interakce. Princip a význam konstrukce chimerických protilátek. Bispecifické a jednořetězcové protilátky. Genetická determinace variabilního segmentu protilátky – variabilita genového vyjádření. Specifita protilátky: jedna varianta genového vyjádření – jedna varianta specifity protilátky – jedna antigenní determinanta. Interakce antigen - protilátka. Klon diferencované plazmatické buňky – producent jedné specifické varianty protilátky. Monoklonální protilátky Köhler / Milsteinův objev způsobu cílené přípravy „optimálního“ producenta protilátky žádané specifity, tj. hybridomu na bázi plazmatické a myelomové buňky. Rámcový obraz přípravy (technologie) produkce monoklonální protilátky. Vývojové trendy, klinická, experimentální a diagnostická použitelnost MP.
Vakciny Historie vývoje principu vakcinace na bázi inaktivace (atenuace) infekčního agens (Jennerův experiment) . Základní požadavky: virulentní organismus je kultivovatelný, metoda přípravy a množstí získatelného infečního agens odpovídají všem požadavkům, eliminace virulentní formy infekčního agens z finálního preparátu vakciny je absolutní, vyloučení reverze atenouvané formy do virulentní je absolutní; otázky účinnosti a stability finálního preparátu vakciny jsou řešitelné. „Živé vakciny“ 1. princip: konverze virulentní formy infekčního agens do formy avirulentní delecí / modifikací subgenomu virulence. 2. princip: příprava „nosiče”, který je transformací osazen klíčovou antigenní determinantou ve velké koncentraci Vektorové vakciny Vaccinia virus, avirulentní pro člověka, ds DNA kódující asi 200 proteinů, cytoplasmová replikace, možnost vložení cizího genu, který bude vyjádřen nezávisle na funkcích hostitele. Vložení genetické informace (homologní rekombinací) pro klíčovou antigenní determinantu umožňuje spojení benigní virové infekce s indukcí stavu imunity - tvorby protilátky k indukující antigenní determinantě. Peptidové vakciny Krátké peptidy, fragmenty peptidů s funkí imunogenu (snadno degradovatelné), proto vázané na nosič. DNA-vakciny Imunizace geny, které kódují protekční antigeny určitého viru (např. hepatitidy B). Mechanismus, kterým intramaskulární aplikace DNA vyvolává imunitu není jasný, podobně jako intenzivní průnik DNA do svalové buňky. Možnosti zvýšení imunizačního účinku podáním hypertonických rotoků a dalších agens, které zavádějí DNA i do jiných tkání. Aplikace tzv. biobalistiky. Typ imunity, kterou DNA-vakciny vyvolávají, připomíná imunitu, která se dostavuje po podání tzv. živých vakcin. Risika: možné důsledky integrace cizí DNA do chromozomální DNA s důsledkem chromozomálních aberací nebo inserční mutageneze.
Bioinsekticidy Odhad celkového počtu druhů hmyzu se blíží milionu. Prostředky chemické a další likvidace zaměřeny asi na 300 druhů. Ekotoxikologický problém – motivace zájmu o alternativní prostředek - bioinsekticid. Zdroj: entomopatogenní mikroflora (viz primární poznatky Bassi, Pasteur, Mečnikov). Podstata: inhibující reprodukce infikujicího mikroorganismu, intoxikace jeho produktem. Toxická složka mikroorganismu: exotoxin (produkce do mimobuněčného prostředí), vnitrobuněčný endotoxin. Bakteriální taxony, které jsou předmětem experimentálního i komerčního zájmu: Bacillus thuringiensis, Bacillus popilliae, Bacillus sphaericus... Bacillus thuringiensis Relativně velké množství sledovaných kmenů, velká nabídka poddruhů. Daný soubor taxonů: individualita toxické složky, a to v typu bakteriálního toxinu(ů) i terčovém druhu hmyzu. Obecná charakteristika toxické složky: vývoj parasporálního (proteinového, 95 %) krystalu toxinu (inkluze), synchronizovaný s procesem sporogeneze. Asi 150 identifikovaných proteinů (Cry rodina). Degradace parasporálního krystalu v alkalickém prostředí. Cry proteiny dále kategorizovány do podtříd (A,B,C....) a pdskupin (a,b,c....). rychlý vývoj dokumentace genetické determinace tohoto souboru a nová klasifikace založena na stanoveném stupni evoluční divergence vývoj fylogenetického obrazce na bázi komparace AK sekvencí Cry bílkovin (% vyjádření identity; demarkace: 95, 78 a 45% homologie, určení označení Cry1, Cry1A....). Parasporální krystal neobsahuje aktivní formu insekticidu. Solubilizací (alkalické prostředí) získán protoxin (asi 139 kDa), aktivace v trávicím traktu hmyzu (kombinace působení alkalického prostředí a specifické proteásy; aktivní toxin asi 65 kDa. Mechanismus toxického působení: tvorba pórů (iontových kanálů) membrány buněk epitelu trávicího traktu. následný únik ATP a dalších malých molekul zástava metabolizmu, dehydratace buněčná smrt epitelu. Aplikace: omezující vazba na vstup protoxinu do určitého segmentu trávicí soustavy; podmínky solubilizace; kombinace se složkou atraktantu zvyšující pravděpodobnost kontaktu hmyz / protoxin. Druh hmyzu kontaktujícího určitou rostlinu nabízí možnost cílené přípravy rostliny transgenní, produkující entomopatogenního toxinu, který je pro daný druh hmyzu specifický. Dalším faktorem limitujícím aplikaci bioinskticidů (tohoto modelu) jsou fáze citlivosti a necitlivosti v ontogentickém vývoji hmyzu. Ilustrace principu technologie přípravy protoxinu B. thuringiensis subsp. kurstaki. Cíle genových manipulací. Kontinuální syntéza optimalizovaného toxinu, nezávislá na procesu sporogeneze, toxinu exportovatelného. Problematika jiné promotorové kontroly. Experimentální klonování Cry genů. Ilustrace příkladů entomopatogenních virů, vláknitých hub a prvoků. Ilustrace technologie výroby bioinsekticidů, jako specifického typu biotechnologie.
Konstrukce hybridních a umělých buněk Indukovaná fúze protoplastů Metoda přípravy vnitrodruhových a mezidruhových hybridů celých buněk, buněk a organel, popř. buněk a umělých kompartmentů. Překonání přirozené bariéry, která chrání buněčnou funkční individualitu. Rozšíření možnosti rekombinace genotypu. Charakteristika: příprava protoplastů a jejich fúze je univerzálně možná; umožnění rekombinace genetického materiálu organismů, u kterých přirozené mechanismy jeho přenosu nefungují; strukturně rovnocenné uplatnění buněk rodičů; hybridní buňku lze konstruovat z většího počtu buněk; možnost vnést organely nebo umělé kompartmenty do vnitrobuněčného prostředí druhově vzdálených buněk; možnost asymetrické fúze (fúze protoplastu obsahujícího a neobsahujícího jadernou DNA) – cytodukce (cybrid). Metodické fáze: příprava protoplastů – vlastní fúze – resyntéza buněčné stěny hybridního protoplastu – isolace hybridní buňky – vývoj a identifikace hybridního klonu. Hybridom - nová organizmální forma, problematika odhadu jejího fenotypu: vliv aktivity dvou genomů ve smíšeném vnitrobuněčném prostředí, vliv fáze buněčného cyklu obou rodičů v čase jejich fúze, vliv druhové vzdálenosti, vliv složitosti reorganizace vnitrobuněčného prostředí. Čas fúze difuzních a diferencovaných buněčných jader (heterokaryont, heteroploid (diploid), aneuploid. Proces fúze a jeho indukce. Agregace protoplastů, destabilizace membrán, vlastní splynutí membrán v místě jejich kontaktu. Indukce fúze: komplexní zásah, překonání stejného povrchového náboje protoplastů, změna hladiny membránových bílkovin / jejich indukovaná reorientace (přeskupení), destabilizace lipidové složky membrány. Fúzogeny: Modelová ilustrace použití polyethylenglykolu, vliv molekulové hmotnosti, dvojmocných kationtů. Technika elektofúze. Aplikace v přípravě optimalizovaných producentů malých a velkých molekul. Detekce hybridomu. Komplementarita genetických znaků, selekční prostředí. Umělé kompartmenty Konstrukce lipozomů jako sférických kompartmentů separovaných umělou membránou (specifická forma polymolekulové agregace). Ilustrace koncepce „buněčného minimalizmu“, který eliminuje vše, co je z hlediska aplikace této struktury nepotřebné. Výrazné zvýšení účinnosti žádaného procesu. Stavební materiál umělých membrán: (především) jednoduché lipidy, dále polymery na bázi celulózy, polyakryláty, polyuretany... Ilustrace základních směrů (metod) přípravy uni- a multilamelárních lipozomů. Modifikace umělé membrány. Enkapsulace enzymové funkce. Aplikace (ilustrace modelových příkladů): Prostředek cílené dispenzace léčiv, detoxikace, diagnostiky.Celková biochemická aktivita umělého kompartmentu, podobně jako buňky přirozené, je vždy sumou vlastností všech přítomných struktur i biochemických aktivit. Cílená konstrukce vnitřního prostředí umělé buňky, ale i konstrukce povrchové struktury, sleduje navrženou prostorovou lokalizaci dílčích funkcí, která určuje (optimalizuje) posloupnost individuálních dějů.
Imobilizace enzymů a buněk Imobilizace enzymů Primární záměr: náhrada rozpustného enzymu jeho nerozpustnou formou. Zachování biokatalytické aktivity, opakované použití enzymového preparátu. V dalším: využití fyzického kontaktu bílkovinné makromolekuly s abiotickým povrchem, který modifikuje sledovanou vlastnost proteinu (tj. jeho stabilitu, požadavky na podmínky enzymové reakce, substrátovou specifitu, citlivost k inhibitoru). Imobilizovaný enzym. Biokatalyzátor, který byl fyzicky upoután, prostorově lokalizován, nebo chemicky modifikován za vzniku nerozpustné formy, a to nezávisle na jeho zdroji a čistotě. Principy imobilizační metodologie. A) Fixace (zabudování) preparátu v prostředí polymerní matrice, které: a) kombinuje vlastní imobilizaci s reakcí příslužných monomerů; b) používá alginát, karagen v kombinaci s tvorbou iontové sítě; c) používá termoreverzibilní gely přírodních polymerů. B) Upoutání makromolekuly na povrch abiotického nosiče, a to: a) adsorpcí; b) fyzikálně-chemickou (polární) vazbou; c) kovalentní vazbou mezi reaktivními skupinami buněčného povrchu a skupinou povrchu nosiče (modifikace distanční spojkou).C) Imobilizace bez použití preformovaného nosiče, a to: a) agregací na základě polární interakce povrchových struktur buňky s flokulačním činidlem; b) agregací „zesítěním“ bifunkčním činidlem.D) Enkapsulace - uzavření enzymu do kompartmentu uměle vytvořeného pouzdra; lze uvést jako samostatný princip, rovněž problematika umělých kompartmentů. Ilustrace použitelnosti některých typů polymerních nosičů: Hydroxyalkymetakrylátové gely; deriváty celulózy; polyaminy; polyamidy; sorbenty polyesterového typu; sorbenty polyfenylenoxidového typu; silikáty a další.Celkově velká nabídka individuálních metodických variant (vliv značné nabídky nosičů). Možnost vzájemné kombinace imobilizačních principů. Výhody a nevýhody individuálních imobilizačních metod. Problematika volby metody. Charakteristika preparátu imobilizovaného enzymu. Důležitost poznání změn indukovaných imobilizací. Imobilizace buněk a podbuněčných struktur Primárně motivována snahou nahradit preparát imobilizovaného enzymu imobilizací jeho producenta. Mylná představa výhradně pozitivního vlivu nativního prostředí buňky vs vnitrobuněčná hladina znakového enzymu. Obecná možnost výrazného zvýšení buněčné koncentrace. Problém nežádoucích enzymových aktivit. Závislost a nezávislost aplikace preparátu na buněčné reprodukci. Cytodynamický efekt – změna morfologie rostoucí, imobilizované buňky. Buněčná imobilizace není omezena buněčným typem a metodou imobilizace, avšak individuální principy imobilizace mohou mít výrazně intenzivnější vliv na finální aktivitu, stav preparátu a poločas jeho použitelnosti (znakové aktivity), než je tomu v případě imobilizace enzymů. Imobilizace obecně neomezuje potenciál buněčné biosyntézy, biodegradace, biotransformace a biosorpce / bioakumulace. Imobilizace celých buněk umožňuje dosáhnout cílené prostorové lokalizace určitých sub – populací, a podobně jako imobilizace enzymů realizovat ko-imobilizace. Buněčná imobilizace používá stejných imobilizačních principů jako imobilizace enzymů. Není ideální technika imobilizace. Buněčná permeabilizace (ilustrace principů) – většinou nutná, doprovázející metodologie.Fyziologické kategorie imobilizovaných buněk. Z hlediska vlastní imobilizace není žádné omezení v kategorii buněk: aktivně rostoucích, klidových, buněk s vratnou nebo nevratnou inhibicí buněčného dělení a buněk chemicky nebo fyzikálně-chemicky ošetřených (např. permeabilizovaných). Imobilizace protoplastů a izolovaných organel.
Fixace atmosférického dusíku Schopnost fixace a utilizace molekuly N2: vlastnost taxonomicky vzdálených mikroorganismů, individuálních buněčných typů (bakterií, sinic, aktinomycet), tzv.. mikroorganismů diazotrofních. Fixace N2: podstatou schopnosti je redukce N2, katalyzovaná enzymovým systémem nitrogenasy. Dva základní metaloproteinové komponety I a II. I: komplex dvou α a dvou β podjednotek (α2 β2) (50-60 kDa) + 24 molekul železa, dvou molekul molybdenu a Fe-Mo kofaktoru (FeMoCo). II: dvě odlišné bílkovinné podjednotky α + asociované molekuly železa. Vazná míst pro Mg2+ a ATP. Oba komponenty jsou nevratně inaktivovatelné kyslíkem. Katalyzovaná reakce: N2 + 16 MgATP + 8H+ + 8e- 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi. Energetická náročnost, dependentní tvorba vodíku, proces závislý na přítomnosti ferrodoxinú a flavodoxinů (shopnost systému redukovat acetylen na ethylen). Funkce systému závislá na asociovaných funkcích asi 20 proteinů. Genetická determinace procesu a regulace genového vyjádření: (Klebsiella pneumoniae) Geny determinující individuální komponenty tvoří souvislý blok (nif) individuálních operonů (asi 24 kb bakteriálního genomu) s jednotným způsobem regulace. Regulující aparát je podřízen centrálnímu regulačnímu systému, který u prokaryotního modelu participuje na řízení biokonverzí dusíkatých látek. Model zajišťuje (v běžných podmínkách ) represi fixace N2. Dereprese nif-regulonu např. pouze v anaerobním prostředí, v suboptimálních teplotách, při nizké vnitrobuněčné koncentraci vázaného dusíku (význam dostatečné koncentrace zdroje C).Centrální (nadřazený) regulační systém je determinován geny: ntrA, ntrB a ntrC. Jejich produkty reagují (ilustrace) na vnitrobuněčnou koncentraci NH4+. Nedostatek vázaného dusíku iniciace transkripce genů nif. K aktivaci a represi je citlivý operon LA nif-regulonu) Stav aktivace / represe je dána vzorcem alternativních interakcí produktů ntrA, B a C (ilustrace). Problematika klonování genetické informace, determinující proces fixace atmosférického N2. Model K. pneumoniae, (ilustrace limitujících skutečností). Důvody omezené použitelnosti této bakteriální formy genetické determinace a řízení procesu fixace N2. Další modelové taxony fixující N2 Druhy rodů: Azospirillum, Herbaspirillum. Mikroaerofilní fixace: Azobacter, Azomonas, Azotococcus a další. Fakultativně aerobní fixace: Bacillus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum (aerobní růst na vázaném dusíku, fixace N2 výhradně za podmínek anaerobních. Striktně anaerobní: Clostridium; (genomika genového shluku nif) Z uvedeného a zároveň agronomického hlediska je významné postavení rodu Rhizobium; heterotrofní bakteriální symbiont s reprodukcí v aerobních i anaerobních podmínkách. Schopnost biologicky složité symbiózy buněčné populace daného taxonu s rostlinou v její kořenové části – tvorba organizovaných struktur (nodulace). Fixace N2 v tomto uspořádání vyžaduje přesně koordinované vyjádření genů bakteriálního i rostlinného genomu a celý proces je z více aspektů odlišný od modelu K. pneumoniae. Rostlinný transgen. Konfrontace záměru vybavit genom rostlinné buňky informací determinující bakteriální fixaci atmosferického dusíku s omezujícími skutečnostmi modelu Klebsiella a Rhizobium a vlastního aparátu transformace (model Ti plasmidu, A. tumefaciens)
Mnohobuněčná konsorcia Funkční a existenční autonomie jednobuněčného organismu: schopnost autoreprodukce, autooprav, autoindukce vlastní destrukce, realizace vlastního programu adaptce. Jednobuněčný organismus je mimořádně interaktivní, je schopen účasti ve složitých kolektivních aktivitách, a je stavební jednotkou mnohobuněčných společenstev; 95% mikroflory našeho prostředí (včetně mikroflory, které je funkční i aditivní součástí makroorganismů) soustředěno v mnohobuněčných konsorciích: koloniích, buněčných agregátech, přirozených biofilmech. Společné znaky: spontánní vznik autoorganizací; systémy kolektivní; biochemická diferenciace, dělba funkcí; mimobuněčná regulace; velká variabilit 3D stavby; fyzický kontakt s jiným povrchem (buněčným, mezibuněčnou hmotou, nosičem). KOLONIE: Individualita morfogeneze monovrsty. Určující vliv dostupnosti nutrientů a toxických složek. Heterogenita buněčných fenotypů. Mezibuněčný přenos genetické informace. Adaptivní mutageneze. BUNĚČNÉ AGREGÁTY: Vymezující znaky: spontánní rozhodnutí, rychlost, nezávislost na reprodukci. Stav agregátu je přechodný, vratný, homotypický, heterotypický, sekvenční agregace, koagregace; otevřená otázka buněčná diferenciace v rámci agregátu; Vztah něčné agregace k tzv.sexuální aglutinaci. PŘIROZENÉ BIOFILMY: sekvence fází vlastní morfogenese. Univerzální schopnost plošné kolonizce. Vliv podmínek (přítomnost AK, skladbu nutrientů, stresové podmínky, teplota, pH, další taxony atd); povrchové kolonizace v taxonomické závislosti. Časné fáze vývoje (buněčná adhese), fáze vratných a nevratných kontaktů, fáze produkce mimobuněčné polymerní hmoty. Význam vlivu proměnlivosti buněčného povrchu. Vazebná disposice buňky-spektra dílčí vazebná aktivity; závislost na podmínkách prostředí (iontová síla, fluidní dynamika atd.), tvarové interakce, textura povrchů. Problém kontaktu dvou zcela odlišných povrchů. Problém primárních vazebných interakcí (buňka –nosič) - problém kontaktu dvou zcela odlišných povrchů. Kombinace specifických a nespecifických interakcí. Dosah vazebné interakce. Vliv stérického působení polymerů. Základní charakteristiky biotického a abiotického povrchu. Kultivační podmínky ovlivňující hydrofobicitu buněčného povrchu. Biochemická interakce subpopulací. Mimobuněčný produkt je signální molekulou, komunikace sub populací, transport signálních molekul. Možnosti regulace mechanismem QS. Individualita vzorce bariér distribuce signálních molekul. Mezibuněčná signalizace v informačně (chemicky) bohatém prostředí-vysoká koncentrace fyziologicky působících komponentů. Terčové populace signálních molekul, modifikace / eliminace signální molekuly prostředím biofilmu. Genetická interakce subpopulací. Biofilm jako prostředí mezibuněčného přenosu genetické informace. Otázky intenzity přenosů v prostředí biofilmu, optimální prostorový kontakt donora a recipienta. Převládající mechanismus přenosu, zóny intenzivních přenosů. Vliv stresorů s následným uvolněním DNA. Indukované přenosy. Konceptuální modely biofilmů. Teorie vlivu hladiny nutrientů na architekturu biofilmu. Model heterogenní mozaiky. Model kompaktního biofilmu. Metodologie studia struktury biofilmu. Architektura je výsledkem aditivního působení faktorů fyziologických a fyzikálněchemických. Hypotetický vztah mezi počtem působících faktorů a jejich individuálním významem. Zóny aktivní reprodukce, zóny klidové, proměnlivost lokalizovaných funkcí. Populace suspenzní / populace agregované. Problém generalizace poznatků z hlediska individuality obou populačních stavů. Disposice buňky (genetického programu ?) pro stav suspenzní a stav mnohobuněčný.
.
