Antigén – szervezetbe bejutó mindazon corpuscularis vagy solubilis idegen struktúra, amely immunreakciót vált ki Antitest – az antigénekkel szemben az immunválasz során termelődött fehérjék (immunglobulinok) Humorális immunválasz – antigénekkel szemben immunglobulinok képződnek
Cél: a kórokozó (testidegen mikroorganizmus) eltávolítása
Immunválasz a felismert antigén eliminálására (semlegesítésére és/vagy lebontására) szerveződik
A kórokozók felismerése
Az immunválasz kialakításában részt vevő komponensek mozgósítása
Tényleges eltávolítás folyamata
Az antigénre nem specifikus sejtes elemek: - különböző típusú fagocitáló sejtek - természetes ölő (NK) sejtek
Az antigénre nem specifikus humorális faktorok: - citokinek - komplement rendszer
Az antigénre specifikus sejtes elem a lymphocyta, mely a felszínén az antigén felismerésére alkalmas receptorkészletet hordoz
Az antigénre specifikus humorális faktorok az immunglobolinok
Antigén kötőhely
Könnyűlánc
Nehézlánc
ASPECIFIKUS (VELESZÜLETETT) IMMUNITÁS
SPECIFIKUS (SZERZETT) IMMUNITÁS
Antigén-independens
Antigén-dependens
Azonnali válasz
Késleltett válasz
NINCS immunológiai memória
VAN immunológiai memória
• • • • •
Primer immunválasz Az immunrendszer első találkozása az adott antigénnel Lassabban alakul ki Alacsonyabb Immunglobulin-szint jön létre Hamarabb lecseng Domináns immunglobulin: IgM
• • • • •
Szekunder immunválasz Második (sokadik) találkozás ugyanazzal az antigénnel Gyorsabban alakul ki (memóriasejtek!) Magasabb Immunglobulin-szint jön létre Tovább perzisztál Domináns immunglobulin: IgG
Szérum ellenanyag mennyisége
Reinfekció
Hetek
antigén - antitest specifikus kapcsolódása
képződő immunkomplex detektálása
•
egyik komponens a betegből származik, a másikat mi adjuk a reakcióközeghez:
•
antigén kimutatás
•
antitest kimutatás
IgG és IgM elkülönítése
A friss fertőzés (IgM) vagy lezajlott fertőzés (IgG) kimutatása
Védőoltás hatékonyságának ellenőrzése
Beküldött minta: teljes vér
IgM – és IgG – Az egyén még nem találkozott a patogénnel Nincs védettség → az egyén fogékony
IgM + és IgG – Akut, friss, az adott patogénnel először fertőződik Kezelés szükséges lehet Teratogén kórokozók és terhességi szűrővizsgálatok! (TORCH)
IgM – és IgG + Régi fertőzés (vagy találkozás a patogénnel), az egyén védett (immunis) Vakcina révén kialakított védettség
IgM + és IgG + Friss fertőzés átfedő szakasza Korábbi fertőzés (vagy találkozás) utáni újabb fertőzés (reinfekció)
Immunkromatográfiás eljárás Agglutináció (flokkuláció) ELISA
› technikai megoldások: Hagyományos (indirekt) Capture Capture – one step Reverz (kompetitív) (hepatitis szerológiában mind fellelhető)
Immunkromatográfiás eljárás www.webshop.vitani.hu
A FAST-STEP DUO ROTA-ADENO TESZTLAP egy síkáramlású, gyors immunkromatográfiás teszt a Rotavírus és az Adenovírus kvalitatív kimutatására humán székletből.
www.vetnetinfo.com
Pozitív
Negatív
Invalid
Definíció: agglutináció alatt a korpuszkuláris antigének ellenanyagokkal történő kapcsolódásakor létrejövő összecsapódást értjük. antigén kimutatás (Streptococcus tipizálás) ellenanyag kimutatás (RPR)
Szubsztrát
(pl.: hepatitis C ellenanyag kimutatás)
1. Szilárd fázis inkubációja, ha a minta tartalmaz Szilárd fázishoz kötött Ag-re sepcifikus antitesteket azok az Ag-hez kötődnek
Szubsztrát
2. Mosási lépés: a minta egyéb komponenseinek eltávolítása 3. Második inkubáció a kikötődött antigén specifikus ellenanyag, enzimmel (tormaperoxidáz) konjugált anti-humán antitesttel való kötődése 4. Szubsztrát hozzáadása után reakcióba lép az enzimmel és látható jelet ad, mely arányos a mintában jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok mennyiségével
Primer antitest
Enzimmel konjugált szekunder antitest
www.piercenet.com
Enzimmel konjugált monoklonális ellenanyaggal kapcsolt rekombináns HBcAg
Szubsztrát Mintában levő specifikus IgM
anti-humán IgM „Capture” antitest
www.activemotif.com
„Capture”=rögzítő
Minta
Enzimmel konjugált ellenanyag
Szubsztrát
Színes végtermék
120 perc Inkubáció 37⁰C Mosás anti-HBs ellenanyag www.piercenet.com
1. Specifikus anti-HBs monoklonális ellenanyag szilárd fázishoz kötve 2. A minta az enzimmel (torma-peroxidáz) konjugált monoklonális ellenanyaggal együtt mérjük fel (a két monoklonális ellenanyag két különböző vírusepitóphoz kötődik) specifikus immunkomplex 3. Egylépéses inkubáció 4. Mosási lépés során a nem kötődött szérumfehérjék eltávolítása 5. A bekötődött HBsAg immunkomplex jelenléte a szubsztrát hozzáadása által színes végtermékké alakul 6. Enzimatikus reakció leállítása termék optikai denzitásának mérése (szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg mennyiségével)
NeutralizálóMinta ellenanyag
Enzimmel konjugált ellenanyag
Szubsztrát
Színes végtermék
120 perc Inkubáció 37⁰C anti-HBs ellenanyag
Mosás
www.piercenet.com
1. Specifikus anti-HBs monoklonális ellenanyag szilárd fázishoz kötve 2. A minta az enzimmel (torma-peroxidáz) konjugált monoklonális ellenanyaggal együtt mérjük fel (a két monoklonális ellenanyag két különböző vírus-epitóphoz kötődik) specifikus immunkomplex 3. Egylépéses inkubáció 4. Mosási lépés során a nem kötődött szérumfehérjék eltávolítása 5. A bekötődött HBsAg immunkomplex jelenléte a szubsztrát hozzáadása által színes végtermékké alakul 6. Enzimatikus reakció leállítása termék optikai denzitásának mérése (szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg mennyiségével)
HbcAb kompetitív ELISA E-jelölt kompetitív ellenanyag
Y
Y Y
*
Y Y
E-jelölt kompetitív ellenanyag
*
Y
YY Y
* **
YYY
Y
Ellenanyag negatív szérum minta
YYY
Ellenanyag pozitív szérum minta
* **
Y
Gesztációs CMV diagnosztika – anyai oldal Anti-CMV IgG:
+
+
–
–
Anti-CMV IgM:
–
2 + független +
–
assay! nincs teendő látens fert.
IgG aviditás teszt
magas aviditás
látens/rekurrens fert. anyai oldalon nincs teendő
ismétlés sz.e. 3 hét
alacsony aviditás
nem jellemezhető
primer fertőzés
primer fertőzés nem zárható ki
magzati/neonatális vizsgálatok
Gesztációs CMV diagnosztika – anyai oldal Anti-CMV IgG:
+
+
–
–
Anti-CMV IgM:
–
2 + független +
–
assay! nincs teendő látens fert.
ismétlés sz.e. 3 hét
IgG aviditás teszt
magas aviditás
alacsony aviditás
nem jellemezhető
Ellenanyagok affinitás érése - ~ 4 hónap alatt megy végbe alacsony aviditású ellenanyagok 6-8 M ureával lemoshatók
Előnye:
egy vizsgálati eljárás során egy reakció közegben adott kórokozó több antigénjével szembeni ellenanyag válasz detektálható, csökkentve ezzel az aspecifikus reakciók zavaró hatását a szerológiai eredmények interpretálásában!
1. Nagy tisztaságú, rekombináns Ag-ek a nitrocellulóz membránhoz kötve 2. A vizsgálandó mintában levő, adott Ag-re specifikus antitestek kötődése 3. Mosási lépések célja a nem kötődött komponensek eltávolítása 4. Torma-peroxidáz enzimmel konjugált anti-human IgG/IgM ellenanyag kötődése 5. Szubsztrát oldhatatlan színes csapadékot képez www.mikrogen.de
6. Megjelent sávok értékelése
Definíciója: antigén-antitest komplex kialakulását fluoreszkáló anyagok FITC (fluoreszcein-izotiocianát) által tesszük láthatóvá. Direkt IF-vizsgálat során a fluoreszcens jelet adó ellenanyagok közvetlenül a keresett molekulához (kórokozó antigénje) kötődnek. Indirekt IF-vizsgálat esetében a fluorokrómmal jelzett ellenanyagok egy másik a keresett molekulára specifikus ellenanyag molekulához kötődnek.
Módszer: indirekt antigén (CMV pp65 mátrix proteinje) kimutatása CMV fertőzött leukocitákban Minta: heparinnal alvadásgátolt teljes vér
Immunszupprimált betegek esetében súlyos CMV fertőzés esetében is késik az ellenanyagválasz! PCR: költségesebb és időigényesebb
1. 2. 3. 4.
5.
Leukociták kivonása a teljes vérből vörösvértestek lízise által Kenetkészítés – citocentrifuga Fixálás – formalin tartalmú oldattal Permeabilizálás – CMV pp65 antigén hozzáférhetővé tétele a specifikus ellenanyag számára Festés – anti-CMV pp65 monoklonális ellenanyag kötődése, majd a FITC-al konjugált ellenanyag kötődése
Antitestek Antigének
Mosás FITC konjugált antitest
Mosás
Értékelés
Értékelés – Fluoreszcens mikroszkóp UV-fény gerjesztő hatása által a FITCmolekula zöldesen fluoreszkáló látható fényt bocsát ki pozitív eredmény esetében (vizsgálati mintában jelen van a keresett antigén) A konjugátumhoz EVANS BLUE sejtek fehérjéinek jelölésére alkalmas festéket adunk, így a citoplazma fehérjéinek vörös fluoreszkálása háttérként, nagy mértékben segíti az értékelést!
www.leicabiosystems.com
www.biomerieux-industry.com
www.ebay.com
- teljesen automatizált rendszer
Eredmények: •Vizsgálati minta és a hitelesítő (standard) minta fluoreszcencia értékeinek összehasonlítása --> RFV=Relative Fluorescence Value •Összehasonlítás a küszöbértékkel: > v. = küszöbérték: + < küszöbérték: -
A pipettahegy (SPR) felülete specifikus monoklonális antitesttel bevont, s egyben pipettázó funkciót is ellát.
Meghatározandó mikroorganizmus www.biomerieux-diagnostics.com www.biomerieux-industry.com
Egyéb immunkompetens molekulák
• Mosási lépések
monoklonális antitesttel bevont pipettahegyek felületén megkötődnek az antigének
• az SPR csak függőleges irányban mozog • a mérőtálca mozgása biztosítja a megfelelő reagensek elérhetőségét www.biomerieux-industry.com
www.biomerieux-industry.com
• Több mosási folyamat után a 2. poliklonális antitest hozzákötődik az előzőleg megkötött antigénekhez • Az 5. Cellában van az enzimmel jelzett konjugátum
Alkalikus-foszfatázzal konjugált antitest Kromogén szubsztrátum (4-metilumbelliferilfoszfát))
Egy „szendvics” komplex alakul ki, amely az enzim kromogén
szubsztrátjával fluoreszkáló vegyületet alkot, és ennek a fluoreszcenciáját méri a készülék 450 nm-en
www.biomerieux-industry.com
Befogott antigén Kötött antitest
Streptavidin + Phycoerythrin (PE) Biotinált másodlagos antitest Antigen Az antigénre specifikus immobilizált antitestek a bead felszínén BEAD www.illumina.com
www. scinecedirect.com
www.evans.amedd.army.mil
