Tenm Teknis Nusional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
PERAN UNIT BIAKAN JARINGAN UNTUK PERTUMBUHAN VIRUS AVIAN INFLUENZA HANIPAH ARIYANI
Balai Penelitian Veteriner, Jln . R .E. Martadinata 30, Bogor 16114
RINGKASAN
Biakan set merupakan media untuk menumbuhkan berbagai macam virus . Berbagai biakan set yang dipakai untuk menumbuhkan virus yang menyerang unggas, misalnya virus Newcastle Disease (ND) dapat tumbuh pada set Chicken Embryo Fibroblast (CEF) . Virus gumboro afau Infectious Bursal Disease (IBD) dapat tumbuh pada set CEF dan Babv Grivet Monkey (BGM) . Virus Avian Influenza (At) tumbuh pada set CEF dan Madin Darby Canine Kidney (MDCK) . Ada dua macam biakan set yang umum dipakai untuk menumbuhkan virus unggas yaitu set primer yang dibuat dari telur ayam Specific Pathogen Free (SPF) tertunas umur 8-10 hari . Set lestari adalah set yang diperoleh dari luar negeri, misalnya : Amerika, Inggris, Australia, Korea dan jugs dapat diperoleh dari antar instansi antara lain : Biofarma, BDA, Nung dan BPMSOH-Gunung Sindur . Makalah ini menjabarkan tentang sifat dua macam biakan set yang dipakai untuk menumbuhkan virus Al . Kata kunci : set primer, set lestari, Avian Influenza MDCK, CEF, AIV . PENDAHULUAN Biakan set afau dikenal dengan biakan jaringan yang ditumbuhkan dalam media khusus dihasilkan dari berbagai macam set tergantung asal organ yang dipakai untuk membuat jaringan tersebut . Ada berbagai macam set anal hewan yang telah dibuat dan dikomersialisasikan saat ini, misalnya sel dari ginjal anjing yang dikembangkan oteh MADIN dan DARBY dapat diperoleh dari Amerika Tissue Culture Collection (ATTC) news(i3atcc .or g . Biakan set yang dikembangkan sesuai dengan Penelitian menunjukkan kebutuhan . umumya virus yang menyerang manusia dapat tumbuh dan berkembang dengan balk juga pada set asal manusia (Hela) afau set moyet (set Vero asal dari epithel monyet Afrika. Virus yang menyerang unggas seperti virus New castle Disease (ND), virus gumboro afau infectious Bursal Disease (1BD) dan Avian Influenza (AI) dapat tumbuh dan berkembang dengan balk pada set Chicken Embr .vo Fibroblast (CEF) yang merupakan sel primer afau sekunder dibuat dari telur ayam Specific Pathogen Free (SPF) tertunas umur 8-10 hari . Virus gumburo dan AI selain pada set CEF dapat juga tumbuh dan berkembang pada set lestari . Set Baby Grivet Xfonkey (BGM) untuk virus gumboro dan set Madin Darbv Canine Kidney (MDCK) untuk virus AI . Set
128
lestari adalah set yang diperoleh dari luar negeri, misalnya : Amerika, Inggris, Australia, Korea dan juga dapat diperoleh dari antar instansi antara lain : Biofarma, BDA, Nung dan BPMSOH-Gunung Sindur. Virus At yang menyebabkan penyakit influenza pada unggas afau yang dikenal dengan sebutan penyakit flu burung adalah virus influenza tipe A yang termasuk dalam famili orthomvxoridae . Virus ini berukuran 80-120 nm (EASTERDAY dkk ., 1991) . Ciri utama dari virus At ini adalah memiliki antigen haemaglutinasi (H) dan antigen neurominidase (N) yang terdapat pada glikoprotein permukaan virus . Pada influenza tipe A terdapat 15 subtipe H (HIH15) dan 9 subtipe N (Nt-N9) yang selanjutnya dapat dibagi kedalam berbagai kombinasi subtipe (MURPHY DAN WEBSTER, 1996) . Semua wabah penyakit At yang sangat pathogen dan menular disebabkan oleh subtipe H5 dan 7 (SWAYNE DAN SUAREZ, 2000) . Hewan jenis unggas termasuk yang peka terhadap virus Al . Penyakit influenza pada unggas bersifat sangat akut dengan gejala klinis berupa kebiru-biruan pada jengger dan pial, leleran hidung dan hipersalivasi . Perdarahan subkutan pada kaki dan paha, perdarahan yang menyebar pada lapisan tubuh bagian tengah dana hingga bagian abdomen, diare dan kematian terjadi secara mendanak,
Pusat Penelitian dan Pengentbangan Peternakan
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
angka morbiditas dan mortalitas mencapai 100% (DAMAYAN'ri dkk ., 2004) . Pada makalah ini dikemukakan tentang sifat-sifat dari dua macam biakan sel primer dan lestari yang dipakai untuk menumbuhkan virus A1 . MATERI DAN METODE Kultur jaringan Kultur jaringan yang dipakai adalah sel Chicken Embryo Fibroblast (CEF) dan Madin Darby Canine Kidney (MDCK) . Media Komposisi media penumbuh biakan sel yang dipergunakan yaitu Dulbelco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Ltd .) yang ditambah dengan 10% Foetal Bovine Serum (FBS) Antibiotik yang dipergunakan : Penicillin 100 iu, Streptomycin 100 mg . HEPES ImM, Sodium bicarbonat 3 .7 gr per liter dan L.Glutamin 1% . Untuk media pemelihara yaitu DMEM dengan komposisi yang sama dengan media penumbuh berbeda dalam penambahan FBS hanya 2% . Larutan penyanggah Larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) yang tidak mengandung Ca" dan Mg" dengan komposisi : NaCI 8 gr ; KC10,2 gr ; Na 2 HPO, 1,15 gr ; KH,P04 0,2 gr ; yang dilarutkan dalam d-H20 sebanyak 1 liter . Disiapkan dalam keadaan steril secara autoclave dengan suhu 121'C selama 30 menit . Larutan Antibiotik Trpysin Versen (ATV) dipergunakan untuk mengangkat sel dari dasar flask lalu memecah menjadi satusatu sel agar sel tidak menyatu atau bergerombol . Komposisi ATV : NaCI 8 gr ; KCl 0,4 gr; Glucose 1,0 gr ; VersenelEDTA 0,50 gr ; Trypsin 0 .50 gr ; NaHC03 0,58 gr; dilarutkan dalam d-1120 sebanyak 1 liter . Antibiotik yang dipergunakan adalah Penicillin 1000 lU, Streptomycin 100 mg . Disiapkan secara steril dengan filterisasi 0 .22 µm . Larutan Eosin (Sigma Ltd .) 0 .25% (25 gr Eosin dilarutkan dalam d-H20 100 ml) . Eosin dipergunakan untuk menghitung
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
jumlah sel yang mati .
karena dapat mewarnai sel-sel
Virus AI Virus AI yang dipergunakan merupakan type A koleksi Balitvet dengan kode Jb 1-1 yang berasal dari wabah Al tahun 2003 pada ayam di daerah Jawa Barat . Virus AI inl merupakan tipe H5NI yang bersifat HPAI (Highly Pathogen Avian Influenza) . Penyiapan sel MDCK Sel MDCK yang disimpan beku dalam liquid nitrogen diambil 1-2 ampul, dicairkan pada suhu 37°C, lalu diputar dengan kecepatan 1000-1500 rpm selama 5 menit sampai terlihat endapan didasar ampul . Endapan sel kemudian dilarutkan dengan media DMEM penumbuh dan dimasukkan kedalam botol biakan jaringan atau flask untuk dibiakan kembali denagan diinkubasikan pada suhu 37°C dalam inkubator dalam kandungan C0 2 5% . Perkembangan sel MDCK diamati setiap hari sampai membentuk monolayer yang siap untuk dipasase kembali atau dipakai untuk inokulasi virus . Penyiapan sel CEF Sel Embrio Fibroblast disiapkan dari organ embrio ayam SPF berumur 8-10 hari, dibuang bagian kepala, sayap, kaki dan organ bagian dalam Oeroan). Embrio dihaluskan dengan gunting dan pinset lalu dicuci beberapa kali dengan larutan PBS steril untuk membuang sel darah merah . Setelah bersih organ yang sudah halus dipindahkan kedalam botol tyrpsin yang diberi batang magnet steril, ditambahkan larutan ATV steril, dilakukan trypsinasi dalam penangas air (waterbath) bermagnet dengan suhu 37°C selama 5-10 menit sampai larutan dalam botol terlihat keruh . Cairan dipindahkan dalam botol steril lain dan ditambahkan 0,5 ml FBS, kemudian simpan dalam tempat dingin (kulkas) sedangkan organ yang belum hancur ditrypsinasi ulang 2-3 kali . Larutan sel disatukan kemudian disaring mempergunakan corong yang telah diberi kawat kasa halus steril dan dipindahkan kedalam tabung sentrifus
129
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
(McCcartney) 20 CC, diputar dengan kecepatan 1000-1500 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan tambahkan media penumbuh DMEM pada endapan sel . Larutan sel dimasukkan pada botol biakan jaringan Vlask) dan inkubasikan pada suhu 37°C dengan kandungan CO, 5% . Penyiapan sel untuk pengamatan pertumbuhan dan Inokulasi virus . Jika sel MDCK dan CEF dalam flask sudah tumbuh membuat lapisan secara merata (konfluen) maka media lama dibuang, kemudian sel dicuci dengan larutan PBS steril secara perlahan-lahan, lalu ditripsinasi dengan larutan ATV dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 2-3 menit . Apabila sel sudah terlihat lepas dari dasar flask, maka flask digoyang atau disedot semprotkan beberapa kali dengan mempergunakan pipet 5 ml, agar sel tidak menggerombol dan terpisah satu persatu . ' fambahkan media penumbuh DMEM sebanyak 5 ml. dan pindahkan dalam tabung sentrifus diputar dengan kecepatan 1000-1500 rpm selama 5 mcnit dibuang supernatan dan endapan dilarutkan dengan 5-10 nil media penumbuh . Jumlah sel dihitung dengan niengambil 0,2 ml larutan sel diencerkan dengan 1,8 ml larutan pewarna Eosin 0,25% lalu diteteskan dengan mempergunakan pasteur pippet ke dalam alat penghitung sel (Haemacytonieter) dan dihitung di bawah mikroskop dengan jumlah sel disiapkan sebanyak 1x10 6 per ml . Sel MDCK atau CEF yang telah dihitung dimasukkan ke dalam microplate 96 lubang . Untuk 10 lubang pada baris pertama diisi dengan sel sebanyak 1x105 sel per 100 W per lubang, baris kedua 5x104 , baris ketiga I x 10 4 dan seterusnya Iihat daftar atau tabel . Sel kemudian diinkubasi pada suhu 37°C dalam kandungan CO, 5% . Pengamatan dilakukan setiap hari hingga hari keempat, untuk melihat waktu pembentukan sel monolayer yang terjadi pada masing-masing pengenceran . Disamping itu disiapkan juga sel MDCK dan CEF yang akan diinokulasi dengan virus 4vian Influenza dalam microplate 96 lubang, masing-masing 48 lubang untuk sel CEF dan 48 lubang untuk sel MDCK dengan penghitungan jumlah sel yang sama pada microplate yang sebelumnya .
130
Inokulasi sel Disiapkan 100 TCID50 (Tissue Culture Infected Dose) virus dalam 25 ml media pemelihara DMEM kemudian diinokulasikan ke dalam sel CEF dan MDCK sebanyak 100 pI per lubang dalam plate 96 lubang yang telah disiapkan . Enceran virus diinokulasi sebanyak lima ulangan (5 lubang untuk setiap baris dan 1 lubang dipakai sebagai sel kontrol negatif) . Microplate yang telah diinfeksi inkubasi pada suhu 37°C dengan kandungan CO, 5%. Pengamatan dilakukan setiap hari hingga hari keempat sampai terlihat perubahan CPE yang terjadi pada masingmasing sel . HASIL DAN PEMBAHASAN Jumlah masing-masing pegenceran sel MDCK dan CEF ditampilkan pada Tabel 1 dan 2 . Berdasarkan pengamatan, sel MDCK dengan jumlah kandungan sel ix10 5 pl per lubang dapat membentuk monolayer untuk 10 lubang pada hari pertama setelah pasase . Pada hari kedua sel telah menjadi over growth untuk ke 10 lubang . Sembilan lubang yang berisi sei MDCK 5 x 10 4 W per lubang dapat membentuk monolayer pada hari pertama dan hanya satu lubang saja yang dapat mebentuk monolayer pada hari kedua . Sel MDCK dengan jumlah ini menjadi over growth pada hari keempat . Pada hari pertama setelah dipasase semua lubang (10 lubang) yang berisi sel MDCK 1x104 pi per lubang belum membentuk monolayer, tetapi pada hari kedua 6 dari 10 lubang telah membentuk monolayer. Pada hari ketiga 4 lubang yang tersisa mulai membentuk monolayer dan pada hari keempat sel MDCK masih terlihat utuh . Untuk sel MDCK dengan kandungan sel 5x10' per 100 µl per lubang sampai dengan 5x 10 per 100 µl per lubang tidak dapat membentuk monolayer hingga hari keempat .
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Tabel 1 . Persentase jumlah set MDCK yang dapat menjadi monolayer yang slap dipergunakan dalam pertumbuhan virus At Jumlah sel (MDCK)
1 (%)
IX105 5x104 IX104 5xIO' 1X10' 5x10' IX10 2
Pengamatan (hari) 2 3 (%) (%)
4
100 100 0 0 0 0
100 100 60 0 0 0
100 100 100 0 0 0
(%) 100 100 100 0 0 0
0 0
0
0 0
0 0
10
Tabel2 . Persentase jumlah set CEF yang dapat menjadi monolayer yang slap dipergunakan dalam pertumbuhan virus At Jumlah set (CEF) 1X10 5x10 4 1x10 4 5x10' 1x10' 5x10 2 1x10 , 10
1 (%)
Pengamatan (hari) 2 3 (%) (%)
100 0
100 0
100 0
4 (%) 100 0
0 0 0 0 0 0
60 0 0 0 0 0
100 0 0 0 0 0
100 0 0 0 0 0
Untuk set CEF 1x10 5 per 100 td per lubang dapat direkomendasikan untuk inokulasi virus AI_ Pada set CEF dengan jumlah ini setelah dipasase semua lubang pada hari pertama telah membentuk monolayer dan masih tampak baik sampai hari keempat . Set CEF dengan jumlah 5x10 4 per 100 µl per lubang sampai dengan 5x10 2 per 100 td per lubang tidak dapat membentuk monolayer hingga hari keempat pengamatan . Hasil inokulasi virus At pada set MDCK dan CEF ditampilkan pada Tabel 3 dan 4 . Pada hari pertama pengamatan setelah infeksi baik set MDCK maupun CEF masih tampak normal dan belum tumbuh CPE, sedangkan pada hari kedua barulah tumbuh dan terlihat CPE . Timbulnya CPE pada set MDCK dan CEF sejalan dengan lamanya masa inkubasi virus yaitu semakin lama inkubasi akan semakin banyak CPE yang timbul . Pada set MDCK pada hari kedua
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
setelah infeksi mulai terlihat CPE dari lubang microplate dengan kandungan 5x10 per 100 µl per lubang sampai dengan 5x10 ; per 100 µl per lubang . Mulai dari lubang dengan kandungan set 1x10 3 per 100 µl per lubang sampai dengan 5x10 per 100 µl per lubang tidak dapat dibaca (tidak jelas timbul CPE) dikarenakan kandungan set yang terlalu sedikit . Pada hari keempat setelah infeksi semua set monolayer menjadi rusak karena terinfeksi oleh virus A1 . Tabel3 . Persentase efek sitopatik (CPE) pads set MDCK setelah diinfeksi oleh virus At Jumlah set (MDCK)
0 0
10, 5x104 Ix10 4 5x10' 1X10' 5x10 1 1x10 , 10
Tabel 4 .
1 (%)
0 0 0 0 0 0
Pengamatan (hari; 2 3 (%) (%) 100 100 100 100 0 0 0 0
100 100
4 (%) 100 100
100 100 0 0 0 0
100 100 0 0 0 0
Persentase efek sitopatik (CPE) pads set CEF setelah diinfeksi oleh virus At
Jumlah set (CEF)
Pengamatan (hari ; 1 (°/a)
2
105 5x104
0 0
(%) 100 100
Ix10 4 5x10' 1x10' 5x10 , 1x10 , 10
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
3 (%) 100 100
4 (%) 100 100
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
Untuk set CEF pada hari kedua mulai terlihat CPE setelah infeksi yang dimulai dari lubang microplate dengan kandungan set 1 x 105 per 100 µd per lubang dan 5x 104 per 100 µl per lubang . Set CEF Ix104 per 100 µl per lubang sampai dengan 5x10 per 100 µl per lubang tidak terbaca (tidak jelas CPE) karena set terlalu sedikit . Sementara lubang miroplate yang berisi set MDCK dan CEF tanpa diinokulasi dengan virus AI (sebagai kontrol negatip) tidak satupun yang menunjukkan infeksi virus At artinya bahwa
131
Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertaman 2006
jaringan CEF tersebut tidak terkontaminasi oleh virus . Pada Gambar I dan 2 ditampilkan set MDCK dan CEF yang tidak diinfeksi oleh virus AI . Tampak pada set MDCK dan CEF masih terlihat utuh sampai pada hari keempat . Sedangkan pada Gambar 3 dan 4 ditampilkan set MDCK dan CEF yang terinfeksi oleh virus At, setelah empat hari infeksi set MDCK dan CEF mulai rusak dan in ati . dari Dalam pengerjaan mulai pembuatan media, penyiapan set sampai dengan inokulasi set ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu kontaminasi . Hal ini seringkali ter. jadi pada saat penyiapan set virus . Peralatan yang dan inokulasi dipergunakan scperti : botol media, tip, gunting, pinset dan sebagainya harus steril . penumbuh dan seperti media Media pemelihara DMEM harus terlebih dahulu diuji sterilitas dalam blood agar . Setelah empat sampai tujuh hari media tersebut tidak terkontaminasi, maka media penumbuh dan pemelihara DMEM dapat dipergunakan umuk menyiapkan set CEF dan MDCK untuk pengerjaan inokulasi virus .
direkomendasikan adalah Ix10 4 100 µl per lubang . Pada set CEF hanyajumlah Ix10 5 per 100 pl per lubang yang dapat direkomendasikan untuk inokulasi virus Avian Influenza, karena kurang dari jumlah tersebut set CEF tidak dapat membentuk monolayer hingga hari ke empat .
KESIMPULAN
PAUL J . 1975 . Cell DAN tissue Culture . 5 thend .
Berdasarkan uraian diatas set lestari MDCK yang dapat direkomendasikan untuk inokulasi virus Avian Influenza yaitu dengan jumlah 5x10 4 per 100 µl per lubang dan 5x10' per 100 µd per lubang . Denganjumlah 5x104 per 100 pl per lubang berdasarkan pengamatan set MDCK dapat monolaver membentuk dalam waktu satu hari setelah dipasase dan set tersebut masih membentuk monolayer (belum rusak) hingga hari ke empat, yang mana pengamatan CPE untuk virus Avian Influenza herakhir karena pada hari ke empat semua set telah rusak terinfeksi oleh virus Avian Inhue,nza . Llntuk jumlah 5x10' 100 µl per lubang dapat pula direkomendasikan karena set MDCK dapat membentuk monolayer pada hari ke dua setelah dipasase . Bila set MDCK cukup banyak dan dibutuhkan segera maka jumlah yang dapat direkomendasikan adalah 5x10 4 100 Itl per lubang, sedangkan jika set tidak yang dapat mencukupi maka jumlah
132
UCAPAN TERIMA KASIH penulis Pada kesempatan ini mengucapkan terimakasih kepada ibu drh . Lies Parede MSc ., PhD ., ibu drh . Tatty Syafriati MSc ., dan bapak Kusmaedi atas bantuan dan saran dalam pembuatan tulisan ini . DAFTAR PUSTAKA ANONIM . 1978 . Manual of Veteriner Investigation
Laboratory Technicues . 2nd ed . Part 8 . Virologi Ministry of Agriculture Fishenis DAN Food . ANONIM . 1984 . Manual of Veteriner Investigation
Laboratory Technicues . Vol. 1 :172-187 . ANONI%I . 1948 . Difco Manual of Culture Media
DAN Reagent . Difco Michigan :24, 218 .
Lab .
Detroit,
Churchill, Livingstone . NY ; 9, 124. A . 2001 . Beberapa Kendala pada Biakan Jaringan Tissue Culture . Pross . T .T . Non lungs . Hal : 197204.
MARIA H .A . DAN HANIFAH
ALEXANDER . D .J . 1988 . Criteria for the defination
of pathogenicity of avian Influenza Proc . Of the Second Viruses . International Symposium on Avian Influenza . Georgia, USA ., September 3-5, 1986, pp . 228-245 . DAMAYANTI R ., NLP . 1 . DHARMAYANTi, R . INDRLANI, T . SYFRIATI, L . PAREDE, A. DAN D .ARMINTO . 2004a . WIYONO
Gambaran klinis dan patologis ayam yang terserang flu burung sangat patogenik (HPAI) di beberapa peternakan di Jawa Timor dan Jawa Barat . SWAYANE, D .E . AND SUAAREZ D .L . 2000 . Highly
patogenic avian influenza . In :Deseases of Poultry : word trade and public health implications . BEARD CW and Me . NULTY MS (Eds) . Rev . Sci . Tech . Int . Epiz . 19 (2) : 463-482 .
Pasat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
