Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.

Brno 2010

Vypracovala: Bc. Krčmová Kristýna

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů, vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF Modelu v Brně. dne:.......................................................... podpis studentky:.........................................................

PODĚKOVÁNÍ: Ráda bych poděkovala profesorovi RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za vedení mé diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Pavle Chalupové a Ing. Michaele Nesvadbové za odborné připomínky při psaní této práce a za praktické rady při práci v laboratoři. Chtěla bych také poděkovat své rodině za trpělivost a podporu. Mé největší díky ovšem patří všem chovatelů německého boxera, kteří mi poskytli vzorky a dovolili mi vyfotografovat psy nebo mi snímky svých psů dali.

ABSTRAKT Německý boxer se vyskytuje ve třech barevných variantách, ale uznané FCI jsou pouze varianty zlatá a žíhaná. Bílá varianta je označená jako nestandard a neměl by být používán v chovu. Podle přítomnosti skvrn je zlatý a žíhaný boxer buďto celoplášťově zbarvený nebo s odznaky. Bílé odznaky se mohou objevovat na hlavě, hrudi, šíji a nohách. Gen pro tyto bílé skvrny ještě nebyl objeven. Kandidátním genem je MITF, který se nachází u psa na 20. chromozomu. Byla osekvenována část tohoto genu, ve které byl již dříve nalezen polymorfismus. Byly nalezeny další dva polymorfismy, z nichž jeden je v korelaci se dříve nalezeným. Klíčová slova: německý boxer, bílé skvrny, MITF, polymorfismus

ABSTRACT Deutscher boxer exists in three variants of coat color, but FCI accepts only fawn or brindle. A white coat color is described as nonstandard a these dogs shouldn´t be used in breeding. The presence of spotting can be either spotty or appear in smudges with or without marks. A white pattern can by arise on the head, chest, neck and feet. The gene for white spotting is not discovered yet. The candidate gene is MITF, which was obtained on canine chromosome 20. Part of this gene, in which was found one polymorfismus, was sequencied. Two others polymorfisms was found. One of them is in the correlation with this one founded before. Key worlds: Deutscher boxer, white spotting, MITF, polymorphism

OBSAH 1

ÚVOD ........................................................................................................................... 8

2

CÍL PRÁCE ................................................................................................................10

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED...........................................................................................11

3.1

Německý boxer ....................................................................................................................11 3.1.1

Historie plemene........................................................................................................... 11

3.1.2

Početní stavy boxerů v ČR ............................................................................................. 12

3.1.3

Plemenný standard boxera ........................................................................................... 12

3.1.4

Zbarvení boxera ............................................................................................................ 12

3.1.5

Dědičnost zbarvení boxera............................................................................................ 14

3.2

Tvorba pigmentu srsti ..........................................................................................................15

3.3

Geny a alely ovlivňující zbarvení...........................................................................................15 3.3.1

A (Agouti) ...................................................................................................................... 16

3.3.2

E (Extension) ................................................................................................................. 19

3.3.3

B (Brown) ...................................................................................................................... 21

3.3.4

K (Black)......................................................................................................................... 22

3.3.5

S (white spotting) .......................................................................................................... 24

3.3.6

M (Merle) ...................................................................................................................... 28

3.3.7

C (Albinismus) ............................................................................................................... 28

3.3.8

G (Greying) .................................................................................................................... 30

3.3.9

D (Dilutes eumelanin) ................................................................................................... 31

3.3.10

T (Ticking, tečkování) .................................................................................................... 32

3.4

L (délka srsti) ........................................................................................................................32

3.5

Testy DNA pro barvu srsti.....................................................................................................32

3.6

Nemoci spojené s barvou srsti..............................................................................................33

3.7

3.6.1

Hluchota........................................................................................................................ 33

3.6.2

Zbarvení duhovky.......................................................................................................... 34

3.6.3

Color dilution alopecia .................................................................................................. 35

Použité metody molekulární genetiky..................................................................................35 3.7.1

Elektroforéza................................................................................................................. 35

3.7.2

Polymerázová řetězová reakce (PCR)............................................................................ 36

3.7.3

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) .................................................... 36

3.7.4

Sekvenování .................................................................................................................. 36

4

MATERIÁLY A METODY ZPRACOVÁNÍ ...........................................................38

4.1

Odběr vzorků .......................................................................................................................38

4.2

Izolace DNA ..........................................................................................................................38 4.2.1

4.3

4.4

PCR.......................................................................................................................................39 4.3.1

Optimalizovaná reakční směs ....................................................................................... 39

4.3.2

Teplotní profil................................................................................................................ 39

RFLP .....................................................................................................................................40 4.4.1

4.5

Postup izolace ............................................................................................................... 38

Reakční směs................................................................................................................. 40

Sekvenování.........................................................................................................................41

4.5.1

Přečištění....................................................................................................................... 41

4.5.2

Kvantifikace PCR produktu............................................................................................ 41

4.5.3

Vlastní sekvenování....................................................................................................... 42

4.5.4

Vyhodnocení sekvenování ............................................................................................ 42

5

VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE ...........................................................................43

5.1

Vyhodnocení izolace DNA a vzorků ......................................................................................43

5.2

Zbarvení boxera ...................................................................................................................43

5.3

Vyhodnocení sekvenování....................................................................................................46

5.4

Hluchota boxera a ostatních plemen....................................................................................50

6

ZÁVĚR........................................................................................................................51

7

SEZNAM LITERATURY .........................................................................................52

8

SEZNAM TABULEK ................................................................................................58

9

SEZNAM OBRÁZKŮ................................................................................................59

1 ÚVOD Zbarvení je u všech zvířat velice důležité, zejména v přírodě, kdy se zvířata potřebují maskovat - vlci mají zbarvení šedé, aby splynuli s lesem, kdežto polární liška zase bílé, aby splynula se sněhem. Nebo naopak mají velice pestré zbarvení, které například u hadů signalizuje jedovatost. Při domestikaci psů si lidé vybírali různé barvy, a jejich použitím v chovu vyšlechtili různé odstíny a vzory barev srsti, které jsou dnes odlišujícími znaky plemen u domestikovaných psů. Naopak u některých plemen křížili psy podle pracovních schopností, ale barva nevyhovovala, proto se křížilo s dalším plemenem. Jako tomu bylo u německého boxera, kdy se křížil americký buldok, který dal boxerovi bílou barvu s bullbeinserem, který mu dal barvu zlatou. Jenže bílá štěňata se stále vyskytovala. To bylo nevhodné, protože by byli v noci vidět. Proto začala krutá selekce, kdy byla všechna bílá štěňata ihned po narození zabíjena. Gen je v podobě recesivní alely v genotypu u barevných boxerů s náprsenkou přenášen stále a při spojení těchto jedinců může docházet k narození bílých štěňat, která jsou recesivními homozygoty. Genetický základ bílých vzorů u boxerů zatím není znám. Byly pouze vyloučeny dva geny EDNRB a KIT (van Hagen et al., 2004). V roce 2007 byl nalezen a zveřejněn první gen, který způsobuje alespoň některé skvrnité vzory u psů. Tímto genem je MITF (Microphthalmia associated transcription factor), který zásadním způsobem ovlivňuje pigmentace. Byly v něm zjištěny potenciální mutace asociované s některými formami skvrnitosti. Žádná příčinná mutace, ale zatím nalezena nebyla (Schmutz, 2009). Analýza vazeb je typicky prováděna sadou mikrosatelitních markerů, které jsou používány k mapování dědičnosti kompletních genomů. V současnosti je mnoho SNP (single nucleotide polymorphism) k získání genotypu v jednotlivém experimentu. Tato technika usnadňuje genetické studie složitých genetických cest v populaci. Bílé skvrny u boxerů jsou monogenetické a semidominatní cesty. Proto byla vybrána sada z 3000 SNP, která je vysoce efektivní v mapování lokusu bílých skvrn u boxerů (Leegwater et al. 2007). Dnes existují různé DNA testy (Vetgen, Vetdnacenter, atd.), pomocí kterých lze určit genotyp barvy psa. Tyto testy využívají zejména chovatelé labradorských retrívrů, 8

za účelem vhodného spojení rodičů a následného narození hnědých štěňat, která jsou vzácná. Bylo by možné tyto testy používat i u německých boxerů, kdy si chovatelé nepřejí bílá štěňata. Stačilo by použít v chovu alespoň jednoho dominantního homozygota. Naopak, pokud by chtěl někdo použít bílého boxera do chovu, mohl by použít jako partnera dominantního homozygota. Všechna štěňata by byla barevná s náprsenkou a pravděpodobně bez nemocí, které jsou spojené s bílou barvou a jsou problémem při páření dvou bílých jedinců.

9

2 CÍL PRÁCE Cílem mé práce je zjistit, jaké geny ovlivňují zbarvení psů a vypracovat vhodnou metodiku testování. Do sledování zahrnout zvířata plemene německý boxer, - minimálně 30 jedinců. Zpracovat literaturu ke genům ovlivňujícím zbarvení srsti u psů. Provést výběr konkrétního genu pro testování zbarvení. Testování genotypů pomocí základních metod molekulární genetiky.

10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Německý boxer 3.1.1 Historie plemene Německý boxer patří do skupiny dogovitých plemen. Dogovití psi byli chování na obranu a lov vysoké zvěře. Velké dogy byly zkříženy s rychlejšími, snadněji zvladatelnými psy. Tyto menší dogy bojovaly s býky v soubojích, při nichž měl pes býka chytnout za mulec, a tím ho porazit. Lidé věřili, že se díky těmto soubojům zlepší chuť masa býka. V první polovině 19. století byly tyto souboje zakázány. V Německu bylo z potomků těchto starých bojových psů, gdaňského a brabantského bullbeinsera, vyšlechtěno nové moderní plemeno s širokými možnostmi využití: boxera (Nijland, 2004). Dalším z předků dnešního německého boxera byl anglický buldog. Slavný chovatel buldoků Friedrich Roberth v roce 1894 napsal článek, který vyšel v místních novinách. Chválil boxera za inteligenci a zevnějšek a stavěl toto plemeno nejvýše ze značného množství plemen, která Roberth vlastnil. Do roka od Roberthovy obhajoby byl v roce 1985 v Mnichově založen klub chovatelů boxerů (Boxerclub). Roberth a hrstka příznivců v lednu 1897 ustavila Německý klub boxerů, který měl svou pobočku také v Čechách. Roberth byl vyzván, aby sestavil plemenný standard. Tento standard byl založen na boxerovi, který byl považován za nejlepšího psa. Jeho jméno bylo Flock St. Salvator (Obr. 1) a zvítězil na první výstavě boxerů v roce 1896 (Obr. 2). Flock je jedním ze čtveřice nejdůležitějších psů použitých k zušlechtění boxerů. Dalšími byli žíhaný pes Wotan, feny rudožlutá Mirzl a skvrnitá Meta v.d.Passage (Obr. 3), která je nesporně pramatkou všech dnešních boxerů (Cavanaugh, 2000).

Obr. 1 Flock St. Salvator

Obr. 2 První výstava boxerů

11

Obr. 3 Meta v. d. Passage

3.1.2 Početní stavy boxerů v ČR Statistické údaje o chovu na stránkách boxerklubu nám říkají, že v roce 2006 se narodilo 727 štěňat, zapsáno jich bylo 547, z toho bylo 272 zlatých, 215 žíhaných a 56 bílých. V roce 2007 se narodilo 538 štěňat, 427 bylo zapsáno, 192 bylo zlatých, 178 žíhaných a 47 bílých. V roce 2008 bylo 713 narozených, 588 zapsaných, 322 zlatých, 212 žíhaných a 54 bílých. Poslední údaj je z roku 2009, kdy se narodilo 492 štěňat, 401 bylo zapsáno, 207 z nich bylo zlatých, 146 žíhaných a 49 bílých. Plemeno německý boxer je v České republice celkem oblíbené. Rozhodně není žádnou raritou. Z těchto dat také plyne, že se narodilo 10,5 % bílých štěňat, což se rozhodně ani neblíží 25 %, která jsou často udávána. Toto číslo by bylo možné jen za předpokladu, že by do chovu byli zařazováni jen heterozygotní jedinci. V Boxerklubu je vedených 120 chovatelských stanic z celé České republiky (Statistika chovu boxera v ČR, 2010). 3.1.3 Plemenný standard boxera První standard z roku 1905, který připouštěl všechny barvy a uváděl výšku psa 50 cm, padl v roce 1920, kdy byla vyřazena bílá a „černá“ barva. Jako plemeno byl boxer uznán v roce 1925 a je dodnes oblíbeným psem, a to nejen v Německu (Německý boxer 2008). Jedním z důvodu, proč se Němci pokoušeli odstranit bílou barvu z chovů boxerů, byla ve 20. letech jejich profese policejních psů. Bílá barva byla nevýhodou, protože bylo snadnější spatřit ji ve tmě. Němci je přestali v roce 1920 registrovat do chovu, protože se domnívali, že tím odstraní alelu pro bílou barvu z genotypu. (Boxer Dog.org., 2009). Boxer je středně velký pes s kvadratickou stavbou těla, má silné končetiny a mohutně vyvinuté svaly. Boxer musí působit sebevědomě, klidně a vyrovnaně. Odedávna je proslulý odolností a věrností svému pánovi i celému domu, ostražitostí a neohrožeností psa obránce. Pro svou rodinu není v žádném případě nebezpečný, vůči cizím lidem je však nedůvěřivý. Při hře bývá veselý a přátelský, ale ve vážných situacích vystupuje neohroženě (Nijland, 2004). 3.1.4 Zbarvení boxera Německý boxer se vyskytuje ve zbarvení plavém, žíhaném a bílém (Obr. 4). Plavá barva se pohybuje od světle hnědé až po mahagonovou. Žíhání je tvořeno černými pruhy probíhajícími ve směru žeber na plavém pozadí. Pruhování může být řídké nebo tak 12

husté, že základní plavá barva sotva prosvítá. Tito psi jsou často nazývání jako černě žíhaní (Obr. 5) (Walker, 2001). Téměř každý jedinec má tmavší zbarvení na hlavě (Dostál 1995). U boxeru existují tři typy barevných znaků – celobarevní, s bílými znaky a bílí. Za konkrétní znakové zbarvení jsou zodpovědné pouze dva geny, gen plné barvy a gen bílé barvy, který způsobuje bílé znaky nebo bílé zbarvení (Obr. 6). Boxer s bílými znaky, který má stejný genotyp jako jiný boxer s bílými znaky, nebude stejný fenotypově. Jeden může mít bílý krk, další může mít bílé pouze ponožky, apod. Geneticky celobarevný boxer může mít malé znaky na packách, hrudníku a na břichu (Tichá, 2003).

Obr. 4 Zbarvení boxera

Obr. 5 Černě žíhaný boxer

Obr. 6 Bílý boxer

13

Obr. 7 Zlatý boxer

3.1.5 Dědičnost zbarvení boxera Gen pro žíhaní je dominantní, což znamená, že stačí, aby nesl alespoň jednu dominantní alelu, a bude žíhaný. Níže jsou různé genetické kombinace, které mohou nastat u boxerů (upraveno dle Walkera, 2001). K

K

k

k

K KK

KK

K Kk

Kk

K KK

KK

K Kk

Kk

Genotyp: 100 % KK

Genotyp: 100 % Kk

Fenotyp: 100 % žíhaných


K

k

k

k

K KK

Kk

K Kk

Kk

K KK

Kk

k kk

kk

Genotyp: 50 % KK a 50 % Kk

Genotyp: 50 % Kk a 50 % kk


Fenotyp: 50 % žíhaných a 50 % zlatých

K

k

k

k

K KK

Kk

k kk

kk

k Kk

kk

k kk

kk

Genotyp: 25 % KK, 50 % Kk a 25 % kk

Genotyp: 100 % kk

Fenotyp: 75 % žíhaných a 25 % zlatých

Fenotyp: 100 % zlatých

Pes s jednou alelou K může být stejně žíhaný, jako ten se dvěma alelami K (protože je tato alela úplně dominantní a nemůžeme tedy fenotypově odlišit heterozygota od dominantního homozygota). Existuje mylná představa, že psi se dvěma alelami K jsou tmavší. To ale není pravda, což nám potvrzuje mnoho velmi tmavě žíhaných psů, kteří dali plavá štěňata, z čehož vyplývá, že jedna jeho alela musela být pro plavou barvu (k) (Walker, 2001). Martinec (2001) popisuje stejnou dědičnost, jen používá název tohoto genu E s alelou e pro zlatou barvu a alelou Ebr pro žíhanou barvu. Stejně je tomu i u bílých znaků, jen s genem S (white spotting – bílé tečkování). Jedinci SS budou celobarevní, jedinci SSw budou mít bílé znaky a jedinci SwSw budou bílí. Použití celobarevného boxera v jakémkoliv spojení garantuje, že ani jedno ze štěňat nebude bílé. Chovatelé, kteří 14

nechtějí mít ve vrhu bílá štěňata, mohou učinit tento jednoduchý krok. Je však nemožné bez testu DNA s jistotou říci, zda je pes geneticky dominantní homozygot a má pouze velmi malé bílé znaky nebo je to heterozygot. Ale použití psa s velmi malými bílými znaky, který by mohl být dominantním homozygotem, je humánnější, než později bílá štěňata utrácet (což je dnes i protizákonné) (Tichá, 2003). Podle 2. odstavce §5 zákona 246/1992 na ochranu proti týrání zvířat se smí utrácet jen slabá, nevyléčitelná, zvířata s těžkým poraněním, genetickou nebo vrozenou vadou, celkově vyčerpaná nebo stará zvířata, jsou-li pro další přežívání spojeny s trvalým utrpením (portal.gov.cz, 2010). Barva není důvodem k utracení.

3.2 Tvorba pigmentu srsti Základem zbarvení srsti je pigment melanin, který vzniká v cytoplazmě melanocytů. Syntetizuje ho tyrozin, který přechází enzymatickou oxidací na bezbarvý chromogen 3,4-dioxyfenylalanin, jehož produkce kontroluje alelou c. Homozygot cc je albínem, což znamená, že má bílou srst, nepigmentovanou kůži, červené oči a sliznice a bílé drápy. Plně pigmentovaný jedinec má nese dominantní alelu C. Důležitý je i gen E, kdy alela E kontroluje produkci černého nebo hnědého eumelaninu, který je tyčinkové struktury, kdežto alela e kontroluje syntézu feomelaninu, který je žlutý nebo červený a má sférický tvar. Melanin nevzniká jen v určitou, u všech psů stejnou, dobu během jejich nitroděložního či postnatálního vývoje. U některých plemen psů začíná syntéza pigmentu dříve, u jiných později. Mění se také množství produkovaného pigmentu. Některá plemena se narodí zbarvená tak, jak zůstávají po celý život, pomineme-li stařecké šedivění. Ale u jiných plemen se během života zbarvení mění. Proto známe plemena, která stářím světlají (kerry blue terier se narodí černý a stářím světlá nebo modrá), jiní se narodí světlí a postupně tmavnou (bělouš českého fouska se narodí čistě bílý s maskou a postupně prokvétá hnědými, pigmentovanými chlupy) (Dostál, 2007).

3.3 Geny a alely ovlivňující zbarvení Genetika zbarvení srsti u psů, stejně jako u ostatních savců, je studována již mnoho let. Little (1957) a Winge (1950) napsali knihy o potencionálních genech, které by mohly vysvětlovat dědičnost zbarvení v rodinách. Jejich hypotézy vycházely z chovatelských 15

dat. Každý z autorů použil jiná písmena k označení různých lokusů se dvěma nebo více alelami. Ale v základu se jejich hypotézy o množství genů s různými efekty velice podobaly. Určité barvy byly u některých plemen důvodem vyřazení z chovu, protože mohly mít zdraví škodlivý efekt nebo jiné nežádoucí efekty. V posledních několika letech nastal velký pokrok v identifikaci genů, které jsou zodpovědné za pigmentaci u psů. K tomu přispěla srovnávací (kompartivní) genomika. Bylo identifikováno sedm genů, určující specifickou barvu kůže u psů nebo různé vzory: melanocortin 1 receptor (MC1R), tyrosinase releated protein 1 (TYRP1), agouti signal peptide (ASIP), melanophilin (MLPH), silver homolog SILV (dříve PMEL17), microphthalmia-associated transcription factor (MITF) a beta-defensin 103 (CBD103). Ačkoliv ještě nebyly určeny všechny alely na každém lokusu, pro mnoho z nich jsou vyvinuty DNA testy. Identifikace těchto alel poskytuje zejména informace o interakcích v tomto komplexu genů, které jsou zodpovědné jak za vývoj pigmentace, tak za vývoj neurologický. Určité geny pro zbarvení také mohou vyvolávat nemoci (Schmutz and Berryere, 2007). Dostál (2007) uvádí, že zbarvení u psů kontroluje celkem 10 genů z celkem 10 lokusů, a ty jsou označovány následujícími písmeny abecedy: A, B, C, D, E, G, M, P, S a T. Některé z těchto genů mají jen dvě kvalitativně odlišné formy – alely, které jsou vůči sobě dominantní a recesivní. Jiné geny jsou vícealelové, a ty pak tvoří celé alelické série se vzájemnou dominancí a recesivitou mezi sebou. Vzájemné interakce mezi těmito geny dávají výsledné zbarvení psů. Genotyp boxera je podle Dostála (2007) Ay B C D E (Ebr) g L m S (s i s w) t. 3.3.1 A (Agouti) Gen ASIP byl identifikován na CFA 24 (Kerns et al., 2004). Berryere et al. (2005) ve svém výzkumu, který zahrnoval třicet sedm plemen, identifikovali Agouti alely u 22 plemen v aminokyselinových změnách A82S a R83H, které se projevily u psů s plavou nebo sobolí srstí. U psů, kteří jsou černí s pálením nebo u trikolórů nalezeny nebyly. Recesivní alela tohoto genu R96C (a) (polymorfizmus c.288C>T) zapříčiňuje černé zbarvení srsti např. u německých ovčáků (Obr. 8). Tato alela byla také identifikována u samojedů a amerických eskymáckých psů (Obr. 9), kteří jsou bílí (Schmutz and Berryere, 2007).

16

Obr. 8 Černý německý ovčák

Alely genu ASIP jsou: a – způsobuje černé zbarvení srsti. Vznikla mutací (c.288C>T) a je příčinou černého zbarvení německých ovčáků a šeltie. Vyskytuje se také u černých jedinců plemen čiperky, belgických ovčáků a puliho. Alela ale byla také identifikována u bílých plemen, jako je samojed a americký eskymácký pes.

Obr. 9 Americký eskymácký pes (www.celysvet.cz)

aw – vlkošedé zbarvení. Sekvence této alely je homologní se sekvencí vlka a sekvence aminokyselin v proteinu je shodná se sekvencí u kojota. Tato alela zapříčiňuje pruhované dorzální chlupy a světle žluté ventrální. Nachází se u některých vlků, kojotů, německých ovčáků a husky.

17

Obr. 10 Vlkošedé zbarvení německého ovčáka (Schmutz, 2009)

at – tato alela kontroluje pálení

Obr. 11 Tricolor gordon setr (Schmutz, 2009)

as – zbarvení tvořící sedlo, v současné době není pro tuto alelu žádný důkaz (Schmutz and Berryere, 2007) ay – kontroluje zbarvení žluté nebo červenohnědé. U některých plemen se setkáváme s příměsí chlupů, které jsou černě zabarvené na konečcích, je-li těchto chlupů více, tak tomuto zbarvení říkáme sobolí (Dostál, 2007). Alela ay, která se běžně nachází u domestikovaných psů, vznikla pravděpodobně mutací z alely aw, která se nachází u jejich předků - vlků. Některá plemena psů, jako jsou jezevčíci, německá doga, čau-čau a francouzští buldočci, normálně nesoucí gen MC1R, v červenožluté variantě barvy srsti místo něj zřejmě nesou alelu Agouti ay spojenou se žlutou srstí (Berryere et al., 2005). Alela ay je recesivní oproti aw, ale částečně dominantní nad alelou at, což znamená, že pes s alelami ayat bude tmavší barvy než pes s alelami ayay (Bowling, 2000).

18

Obr. 12 Žluté zbarvení u plemene mops (Schmutz 2009)

Typ pigmentu syntetizovaný u savců, žlutočervený feomelanin nebo černohnědý eumelanin závisí na interakci mezi Agouti proteinem a alelou genu MC1R. Pokud je alela genu MC1R funkční (což je děděno dominantně (Kerns et al., 2007)), tak tlumí projev proteinu Agouti a podporuje syntézu eumelaninu, namísto feomelaninu. Pokud tato alela ztratí svou funkci (což je děděno recesivně (Kerns et al., 2007)), tak se zvýší projev proteinu Agouti a podpoří se syntéza feomelaninu namísto eumelaninu (Berryere et al., 2005). 3.3.2 E (Extension) MC1R byl prvním genem studovaným molekulárními metodami v genetice psů. Byl mapován na 5. chromozomu (Schmutz and Berryere, 2007). MC1R se nachází na Extension lokusu u mnoha druhů savců. Polymorfizmus (914 C>T) způsobující ztrátu funkce tohoto genu, zapříčiňuje čistě červené zbarvení srsti. Bylo odhaleno šest variant sekvencí, z nichž dvě S90G a R306ter (914C>T), kdy vzniká stop kodon místo argininu, částečně korelují s černohnědou a červenožlutou srstí (Newton et al., 2000). E – původní dominantní divoká alela (Schmutz and Berryere, 2007).

19

Obr. 13 Genotyp E/E u velkého münsterlandského ohaře (www.greatdogsite.com)

e – normální rozložení světlého pigmentu v srsti. Tato alela omezuje tvorbu tmavé pigmentace, ať má takový jedinec jakýkoliv genotyp v genu A. Alela kontroluje pouze pigmentaci srsti. Pigmentace nosu, kůže, pysků, sliznic a víček není ovlivněna, a proto zůstávají tyto části tmavé (Dostál, 2007). Tato alela je následkem ztráty funkce genu MC1R, což zapříčiní to, že se bude výhradně produkovat červený/žlutý feomelanin (Newton et al., 2000), který se projeví krémovou barvou. Bílí knírači nesou genotyp e/e (Obr.14). Rodiče těchto kníračů mohou být zbarveni jako pepř a sůl. Je tedy vidět, že všechen feomelanin je zředěn až na bílou nebo stříbrnou (Schmutz, 2009).

Obr. 14 Bílý malý knírač (Schmutz, 2009)

EM – melanistická maska – černá maska je charakteristickým vzorem u červených, žlutých, světle hnědých nebo plavých psů. Představuje černou barvu čumáku, která může pokrývat obličejovou část až k uším (Obr. 15). Melanistická maska je dominantně dědičná autozomální cestou. Všichni psi s melanistickou maskou měli nejméně jednu kopii

záměny

valinu

za

metionin

na

aminokyselině

264,

která

vznikla

jednonukleotidovou substitucí (799A>G), a žádný nebyl homozygotem pro stop kodon R306ter (Schmutz et al. 2003). U psů s bílým čumákem, kteří v této oblasti neprodukují melanin, se maska neprojeví, i když ponesou tuto alelu. 20

Obr. 15 Maska u plavého boxera

Všichni psi, kteří mají barvu srsti černou, hnědou nebo šedou (ať už jednobarevnou nebo skrvnitou), ji zdědili dominantně a mají nejméně jednu alelu E nebo EM. K tomu mají také nejméně jednu alelu KB (Schmutz and Berryere 2007). Dříve se předpokládalo, že v této sérii také existuje alela Ebr, která je zodpovědná za žíhání (Dostál 2007). Dnes ale víme, že tato alela, zodpovědná za ukládání dvojího pigmentu - černého a žlutého v pruzích, patří do série genu CBD103 pod názvem kbr (Kerns et al. 2007). 3.3.3 B (Brown) .TYRP1 je genem zapříčiňujícím hnědou barvu srsti. Byl nalezen na chromozomu 11 (Schmutz et al., 2002). Newton et al. (2000) popsali a prozkoumali předčasný stop kodon, který se projevil u všech psů s červenou nebo žlutou srstí. Psi s černou nebo hnědou srstí tento promotor stop kodonu nenesli nebo byli heterozygoty. Schmutz et al. (2002) našli tři relativně běžné polymorfismy DNA u hnědých psů. Dva polymorfismy byly nalezeny na exonu 5. První z nich zapříčiňující alelu (bs) obsahuje stop kodon v exonu 5 (Q331ter) (c.991C>T), druhý (bd) obsahuje deleci prolinu v exonu 5 (345delP) (c.1033-6 deleted). Třetí polymorfismus (bc) je substitucí v exonu 2 způsobující záměnu tyminu za cysteinu (S41C) (c.121T>C). Jeden polymorfismus byl nalezen v exonu 7, a ačkoliv to nebyla záměna aminokyselin, byl užitečný pro mapování TYRP1. Všichni hnědí psi nesli dva nebo více těchto polymorfismů, pravděpodobně zasahující do funkce TYRP1, kdežto žádný z černých psů nenesl tyto varianty. Proto se předpokládá, že všechny tři alely ovlivňují produkci eumelaninu a způsobují záměnu černého pigmentu za hnědý. Psi s černým nosem a hnědým nosem, kteří byli červení, 21

žlutí, zlatí, světle oranžový nebo oranžový, byli homozygoti pro stop kodon R306X genu MC1R ukazující jeho spojení s fenotypem této barvy srsti. Černý nebo hnědý nos naprosto koreloval s absencí nebo přítomností dříve popsaných tří variant TYRP1. Hnědá barva se dědí recesivně vůči černé. Byly detekovány tři alely bs, bd a bc.

Obr. 16 Genotyp bs/bs u anglického setra

Obr. 17 Genotyp bd/bd u dobrmana

Obr. 18 Genotyp bc/bc u italského chrtíka

VŠECHNY TŘI OBRÁZKY JSOU Z WEBOVÉ STRÁNKY WWW. KRMIVO -BRIT.CZ

3.3.4 K (Black) Gen CBD103 je třetím důležitým genem vedle MC1R a ASIP a byl nalezen na 16 chromozomu. Kóduje ligand-receptor systém, který přepíná mezi syntézami eumelaninu a feomelaninu. Studie vzájemného působení ukázaly, že Extension je epistatický nad Agouti a K. Epistatická příbuznost mezi Agouti a K záleží na tom, které alely těchto genů se mezi sebou budou testovat. Na lokusu K jsou tři alely, které jsou vůči sobě dominantní v tomto pořadí: KB → kbr → ky. Žíhání u psů je tvořeno střídajícími se pruhy feomelaninu a eumelaninu. Při převaze eumelaninu se pes jeví jako černý. KB – černí jedinci jsou fenotypově stejní jako psi, u kterých gen Agouti ztratil svou funkci (nonagouti)

22

Obr. 19 Černá německá doga (www.celysvet.cz)

kbr – žíhání, které se vyskytuje u různých plemen psů, jako je boxer, greyhound, francouzský buldoček atd., je některými autory spojováno s variantami Agouti, jiní si myslí, že ji zapříčiňuje varianta MC1R (Kerns et al., 2007). Za přítomnosti alely ay se projeví žíhání po celém těle. V přítomnosti at/at se žíhání projeví pouze na břichu (Berryere et al., 2005).

Obr. 20 Žíhaný whippet (Schmutz ,2009)

ky – žlutý, jedinci jsou stejní jako psi, u kterých ztratil funkci Mc1R Interakce mezi alelami na lokusu K a těmi na Agouti a MC1R odhalují jednoduchou genetiku, která vysvětluje všechny známé eumelanicko-feomelanické varianty a pomáhá odhalit, jak selektovat morfologické znaky u různých plemen domácích psů. V tabulce č. 1 je vyjádřen epistatický vztah mezi ASIP, K lokusem a MC1R. Z této tabulky vyplývá, že žíhání se projeví, pouze pokud v genotypu psa je přítomna alela E (Kerns et al., 2007). Tab. 1 Epistatická příbuznost mezi alelami Agouti, K, a Extension (Kerns et al., 2007) 23

Agouti

K

Extension

Fenotyp

Vzorek od:

at/at

k/k

+/+

černý s

německý ovčák

pálením t

a /a

t

k/k

e/e

žlutý

afghánský chrt

ay/ay

k/k

e/e

žlutý

afghánský chrt

ay/ay

kbr/kbr

e/e

žlutý

afghánský chrt

at/at

kbr/kbr

+/+

černý, žíhané

stafordšírský

tečky

bullteriér

žlutý

francouzský

at/at

kbr/kbr

e/e

buldoček at/at

KB/KB

černý

+/+

černý labrador retriever

at/at

KB/KB

e/e

žlutý

žlutý labrador retriever

ay/ay

k/k

E+/+

žlutý

boxer

ay/ay

kbr/kbr

+/+

žíhaný

boxer

ay/ay

KB/KB

+/+

černá

německá doga

ay/ay

KB/KB

e/e

žlutý

pudl

3.3.5 S (white spotting) Lokus S „white spotting“ kontroluje strakatost u psů. Bílé skvrny se mohou vyskytovat jen na některé části těla (náprsenka, lysinka a punčošky) (Obr. 21). Geneticky je kontrolován výskyt a velikost bílé skvrny. Ta může být i tak veliká, že bude pokrývat téměř celé tělo jedince. V takovém případě jde o jednu bílou skvrnu. Není to však albinismus, protože takový jedinec má tmavé oko, tmavý nos i pigmentované sliznice. Alela si kontroluje výskyt bílé na ploše těla menší než 20% celkové plochy kůže (Dostál, 2007). Nejextrémnější alela sw nalezená u dalmatinů, anglických setrů, bílých bullteriérů, bílých boxerů, atd. U těchto psů je vždy barva srsti bílá. Většina kůže je bez pigmentů. Může se vytvořit několik barevných skvrn, zejména kolem očí a uší (Obr. 22). Někteří jedinci jsou celoplášťově bílí, jiní mají malé skvrny po celém těle (Obr. 23) (Cattanach, 1999). Podle Dostála (1995) alela sw byla selekcí postupně z populací boxera odstraněna. 24

Proto se jedinci s větší bílou plochou již prakticky nevyskytují. Podle Tiché (2003) a statistiky chovu z boxerklubu je však vidět, že alela sw rozhodně z populace odstraněna nebyla a bílá štěňata se rodí stále více. To je zapříčiněno tím, že ve výstavním kruhu jsou cennější zvířata, která mají bílou náprsenku, a tato zvířata samozřejmě alelu pro bílou barvu nesou a mohou nám dávat homozygoty bílé barvy. Kdyby v chovech zůstalo více celoplášťově zbarvených zvířat, bylo by možné bílá štěňata z populace odstranit humánně, a ne tím, že by se ihned po narození zabíjela (Vlha J., 2009).

Obr. 21 Žíhaný boxer se znaky

Obr. 22 Bílí boxeři se skvrnami

Obr. 23 Bílý boxer se skvrnami po celém těle

Do roku 2006 nebyl identifikován žádný gen způsobující skvrnité vzory u psů. Metallinos & Rine (2000) byly jedni z prvních, kteří se pokusili najít gen spojený se skvrnitostí. Pro studii využili rodinu psů, u které se projevovali znaky. Vyloučili oba dva geny, jak EDNRB, tak KIT, jako geny způsobující bílé znaky na spodní straně těla u velkého množství border kolií, které byly segregovány jako autozomálně recesivní znaky u kříženců F1 generace novofoundlandů s border kolií (Schmutz & Berryere, 2007). Stejně tak van Hagen et al. (2004) vyloučili tyto geny jako původce bílých znaků u boxerů. V roce 2006 byl objeven na 20. chromozomu gen MITF. Rothschild et al. (2006) prokázali, že tento gen zapříčiňuje skvrny strakatých nebo nepravidelných vzorů u kříženců. Také způsobuje Landseerský vzor u novofoundlandských psů (Obr. 24, 25). Identifikovali mutaci v intronu 3. Další studie předložené Karlsonem et al. (2007) ukázaly, že MITF je gen způsobující formy celobarevné, s odznaky a celé bílé u boxerů a bull teriérů. Objevili dvě formy mutace v oblasti MITF působící na pigmentaci, které jsou nezbytné pro vznik bílé barvy u těchto plemen. Jednou z nich je tzv. SINE (short interpsersed nukleotide element) a druhou je LP (lenght polymorphism), což je řetězec opakujících se alel, které se liší v délce u různě skvrnitých psů. Jejich údaje naznačují, že 25

LP je delší u plemen s bílými znaky, než u psů bez bílé barvy. Bílé skvrny u boxerů jsou monogenní a semidominantní (Leegwater et al., 2007). Recesivní alela kontroluje bílou skvrnitost u psů a je-li pes homozygotní, má značné množství bílé barvy. Když má dominantní alelu, tak bílé znaky nejsou přítomny nebo jsou minimální, obvykle na nohou, špičce ocasu nebo hrudníku. Mohou existovat i jiné geny, podílející se na skvrnitosti, ale k jejich zjištění je zapotřebí dalšího výzkumu (Schmutz et al., 2009). Bylo nalezeno 10 genů s mutacemi, které zapříčiňují bílé skvrny u myší. Dodnes bylo testováno devět kandidátních genů spojených se skvrnitostí u psů, zahrnující SOX10, MCOLN3, EDN3, KITLG, PAX3, MITF, ASIP, ADAMTS20 a SNAI1. Tyto geny byly buďto vyřazeny (SOX10, MCOLN3, EDN3, KITLG a PAX3), neinformativní u plemen v této studii (ASIP, ADAMTS20 a SNAI1) nebo stále studované (MITF) (Rotschild et al., 2006).

Obr. 24 Landseerský vzor (www.dogsindepth.cz)

Obr. 25 Landseerský vzor 1 (www.dogbreedinfo.cz)

Bylo nalezeno několik isoforem, které se liší v poslední aminoskupině na exonu 1. Byly nazvány: MITF-M, MITF-A, MITF-C a MITF-H. Tyto isoformy ovlivňují aktivaci transkripce a působí na vazbu DNA. MITF-M omezuje funkci melanocytů. MITF-A je častější a obohacuje RPE (retinal pigment epithelium – pigmentovaná vrstva buněk okolo sítnice). MITF-C a MITF-H se téměř nevyskytují, a ještě není zjištěno, jakou mají funkci. Obě isoformy MITF-M i MITF-H označovány jako verze (-) a (+). Stále zůstává několik otázek. Např.: Zda mutace v genu MITF zapříčiňují ztrátu melanocytů ve stáří a poruchy pigmentace tvořící bílé skvrny? Jsou některé geny způsobující zbarvení srsti ovlivněny tímto genem? Dává MITF nějaké signály melanocytům? Které mutace genu zapříčiňují změnu melanocytů (Gooding, 2000).

26

Obr. 26 Psí chromosom 20 (www.canine-gene-project.de/Ideogram.html)

Mutace v tomto genu u lidí zapříčiňuje Waardenburg syndrom, který je charakteristický

hypopigmentací

a

hluchotou

(Leegwater

et

al.,

2007).

Charakteristickými projevy této nemoci jsou: široká základna nosu (papouščí nos), porucha pigmentace, jako jsou dvě odlišně zbarvené oči (jedno modré a druhé hnědé), bílé obočí řasy, předčasné šedivění vlasů a určitý stupeň hlemýžďovité hluchoty (NCBI, 2007). Tato nemoc byla pojmenována po Petru Johannesovi Waardenburgovi, německém očním lékaři, který si v roce 1947, jako první všiml u lidí s odlišně barevnýma očima častých problémů se sluchem (Bason et al., 2002). Několik typů Waardenburgova syndromu je dědičných. Prováděly se výzkumy několika generací rodin s typickým projevem, které měli jeden nebo více příznaků hluchoty. Typ I této choroby je charakterizován složeným víčkem, zatímco typ II nemá tento příznak, ale místo toho má častější výskyt hluchoty (NCBI, 2007). Typ III je stejný jako typ I, navíc zahrnuje zkrácení svalů. Typ IV je také stejný jako typ I, ale dalším příznakem je malformace trávícího traktu (Bason et al., 2002).

Obr. 27 Sourozenci s Waardenburg syndromem (www.emedicine.medscape.com)

U myší mutace v MITF ovlivňují různý stupeň nedostatku melanocytů, který se projevuje od skvrnitosti přes zředění barvy až po bílou srst. Některé mutace také vedou 27

k RPE (Bauer et al., 2009). Dalšími defekty jsou malé oči, vstřebávání sekundární vrstvy kostní tkáně a snížení imunity (Hodgkinson et al., 1993). 3.3.6 M (Merle) Gen pro merle zbarvení SILV byl nalezen na CFA10. Byla nalezena SINE v rozmezí exonů 10 a 11, která zapříčiňuje fenotyp merle u mnoha plemen. Merle, je charakterizováno skvrnami zředěného pigmentu smíchaného s normálním melaninem (Clark et al., 2006). Často se u těchto jedinců vyskytují modré oči (Hédan et al., 2006). Pro několik plemen je to standardní zbarvení (např. pro šeltii, australského ovčáka, welsh corgi, jezevčíky, catahoula leopardího psa, bergamasca a pyrenejského ovčáka). Ačkoliv merle není akceptovanou barvou u německých dog, tak žádoucí vzor harlekýn vyplývá z interakce merle lokusu a harlekýn lokusu. Merle je děděno autozomální cestou s neúplnou dominancí. Dominantní homozygoti jsou celí bílí, heterozygoti mají merle zbarvení a recesivní homozygoti mají normální zbarvení (Obr. 28) Heterozygoti nebo homozygoti pro merle představují širokou škálu sluchových a očních abnormalit (Clark et al., 2006).

Obr. 28 Normální, merle a bílé zbarvení šeltie (Clark et al., 2006)

3.3.7 C (Albinismus) Dominantní alela je pravděpodobně strukturálním genem pro tyrozinázu (enzym podílející se na syntéze melaninu z tyrozinu) (Bowling, 2000). U albínů tento enzym nemůže být tvořen, a proto nemůže být produkován melanin (Bowling, 2000). Tyrozináza byla mapována na chromozomu CFA21 v exonu 1. V exonu 4 byly nalezeny dva polymorfismy R408Q a L438F vedoucí k záměně aminokyselin (Schmutz and Berryere, 2007). 28

C – dominantní alela umožňuje, aby se normálně projevil pigment a je pravděpodobně genem pro tyrozinázu. ca – recesivní alela, která zcela zamezuje v homozygotní formě vzniku jakéhokoliv melaninu v srsti nebo duhovce očí, které jsou potom červené nebo růžové (Bowling, 2000), bez pigmentace na nose a polštářcích. Existují albinotické rodové linie dobrmanů. Kompletní kód sekvence tyrozinázy u těchto dobrmanů byl porovnán se sekvencí pudla krémové barvy, ale neukázal žádný polymorfismus, který by vysvětloval albinismus u těchto zvířat (Schmutz and Berryere, 2007). Bílou barvu u dobrmanů by mohla zapříčiňovat alela cp, která se vyskytuje u jiných zvířat. Tato barva je recesivně dědičná. Dalším charakteristickým albinem je tato lhasa apso (Obr. 28), u kterého také nenašli mutaci v kódující sekvenci Tyrozinázy. Po spojení s normálně barevným psem měla štěňata normálně zbarvená a s barevným nosem (Schmutz, 2009).

Obr. 29 Albino lhasa apso (Schmutz 2009)

cch – činčila – šedé nebo vlčí zbarvení ce – extrémní ředění, nachází se u některých bílých psích plemen, jako např. West highland terier, oči mohou být světlé ch – Himalyan, u psů není znám, v homozygotní formě dává vznik eumelaninu v závislosti na teplotě kůže cp – Platinum, je opticky podobný albínům, ale zachovává si velmi slabou aktivitu tyrozinázy, a má lesklou srst. Zřejmě se vyskytuje u bílých dobrmanů s modrýma očima (Bowling, 2000) 29

Obr. 30 Albino dobrman (www.whitedobes.com)

cb – cornaz, modrooký albín (Dostál, 2007) 3.3.8 G (Greying) Šedivění začíná na různých částech těla, a v různém věku u plemen, které představují progresivní šedivění. Některým psům se jako reakce na vakcinaci nebo injekci barva tohoto místa vrátí do tmavého juvenilního pigmentu. Po pár měsících toto místo opět zesvětlá. U koní byla tato alela nalezena na chromozomu ECA25q, který koresponduje s HSA9q a významná část tohoto chromozomu koresponduje se psím chromozomem 11. Proto by se hledání lokusu G u psů mělo zaměřit na tento chromozom (Schmutz and Berryere, 2007).

Obr. 31 Tito puli se narodili jako černí, odstup mezi nimi je rok (Berryere, 2009)

Efekt tohoto genu je velmi složitý. Není zcela jasné, zdali je alela G úplně či neúplně dominantní nad alelou g, která kontroluje normální pigmentaci osrstění až do stařeckého šedivění (Dostál, 2007). 30

3.3.9 D (Dilutes eumelanin) Gen pro ředění eumelaninu MLPH se nachází na CFA25. Někteří psi se rodí šedí a časem modrají. Jiní psi během několika měsíců přecházejí z černé na šedou. Obě tyto varianty zapříčiňují dědičné modifikace eumelaninu i feomelaninu, kdy dochází k zesvětlení srsti. U feomelaninu tato změna není tak dramatická jako u zředění eumelaninu (Schmutz and Berryere, 2007). Zředění zřejmě způsobuje shlukování pigmentových granulí v chlupech (Bowling, 2000). Philipp et al. (2005) nalezli při sekvenování psího genu MLPH u plemene německý pinč mutaci v exonu 7 (R199H) a u plemene dobrman, stejně tak i u velkého münsterlanda s BHFD (black hair follicular dysplasia), sadu SNP okolo exonu 2. U dobrmanů je zředění spojováno s rozšiřující se nemocí color dilution alopecia (CPA), která se také nazývá syndromem modrého dobrmana (Obr. 32). Mutace byly také nalezeny u myší na exonu 2, kde dochází k záměně C>T a u dětí jako mutace R35W na konci exonu 2, která způsobuje určitou formu albinismu. U psů zatím nalezeny nebyly (Schmutz and Berryere, 2007).

Obr. 32 Modrý dobrman (Philipp et al. 2005)

D – kontroluje normální hustotu granulí v chlupech a je dominantní nad alelou d d – kontroluje řídké rozvrstvení granulí v chlupech, a je recesivní k alele D U kořene chlupu je vždy poněkud řidší rozvrstvení granulí. Proto se nám chlupy jeví u kořene světlejší než na konečcích, kde je rozvrstvení granulí hustší (Dostál, 2007).

31

3.3.10 T (Ticking, tečkování) Tečkování se nachází například u dalmatinů. Jsou to drobné tečky na bílém pozadí. Tyto tečky se neukážou při narození, ale začínají se objevovat až po pár týdnech (Schmutz and Berryere, 2007).

Obr. 33 Tečkovaný dalmatin (Berryere, 2009)

Na lokusu T se vyskytují dvě alely – T kontroluje tečkování a je dominantní nad alelou t, která kontroluje čistě bílé zbarvení (Dostál, 2007).

3.4 L (délka srsti) Mnoho let je známo, že délka srsti u psů je ovlivněna několika geny, ale žádný z nich zatím nebyl identifikován. Analýza sekvence genu Fibroblast growth factor 5 (FGF5) u dlouhosrstých a krátkosrstých psů plemene korgi identifikovala mutace ve dvou kódujících oblastech (Housley and Venta, 2006). Délka srsti je děděna recesivně autozomální cestou. Alela N zapříčiňuje krátkou srst a je dominantní nad alelou F, která svou mutací zapříčiňuje dlouhou srst (Vetdnacenter, 2010). Drögemüller, et al.(2007) našli mutace v genu FGF5 u koček (c.194C>A), (c.182T>A), (c.474delT) a (c.475A>C), zapříčiňující dlouhou srst. Kočky s krátkou srstí neměly žádnou nebo jednu kopii této alely.

3.5 Testy DNA pro barvu srsti Tyto testy se provádí v zahraničí například Vetdnacenter na Michiganské státní univerzitě nebo také Vetgen z Michiganu. Obě instituce provádí testy na alely E, Em, B, D, KB, ay, a a délku srsti. Vetgen navíc provádí test na alelu ky. Cena testu za jeden lokus 32

se pohybuje kolem 50$. Dalším centrem je HealthGene z Toronta. V České republice žádná firma testy DNA pro barvu srsti psů komerčně neprovádí.

3.6 Nemoci spojené s barvou srsti 3.6.1 Hluchota Nejrozšířenější je u dalmatinů. V USA je postiženo 30 % populace. Dědičnost hluchoty u tohoto plemene je neznámá. Z 266 psů bylo 18,1 % postiženo jednostranně a 7,5 % oboustranně (Cargill et al., 2004). Jednostrannou hluchotu může prokázat test BAER. Hluchota je spojena se dvěma alelami (Tab. 2). Jednou z nich je dominantní alela M (která se nachází u kolií, welsh korgi pembroke a harlekýnské německé dogy), která v homozygotním stavu projeví jedince jako celého bílého. Ti mohou být slepí, hluší nebo jinak nemocní. Druhou alelou je recesivní sw, typická pro dalmatiny, anglické setry, bílé bulteriéry, bílé boxery a další. Jejich srst je celá bílá nebo se skvrnami. Objasnění těchto pigmentovaných/nepigmentovaných vzorů je vodítkem pro vysvětlení spojitosti mezi bílou barvou srsti a hluchotou (Cattanach, 1999). U postižených psů se totiž ukázala absence melanocytů ve stria vascularis (součást vnitřního ucha), a tyto buňky potom ovlivňují koncentraci iontů v hlemýždi. Také dalmatini s modrým okem jsou ke hluchotě náchylnější než dalmatini s hnědýma očima (tab. 3). A třetím znakem spojitosti hluchoty s pigmentací je, že dalmatini se skvrnami mají menší náchylnost ke hluchotě než dalmatini bez skvrn. Barva skvrn nehraje roli. Způsob dědičnosti u dalmatinů ještě nebyl odhalen. Při páření dvou zdravých jedinců se narodil hluchý jedinec, což vylučuje dominantní alelu pro hluchotu. Vyloučení recesivní autozomální alely není možné, protože se nikdy nepářili dva oboustranně hluší jedinci. Když byli páření dva jednostranně hluší jedinci, tak produkovali normálně slyšící potomstvo. To ale stále nevylučuje recesivní autozomální alely (Cargill et al., 2004). Tab. 2 Plemena s hluchotou, která je přisuzována alelám s a M (Cattanach, 1999) Plemeno dalmatin bílí bulteriér anglický setr

Oboustranná hluchota 8,0 % 1,5 % 2,4 %

Jednostranná hluchota 21,8 % 17,5 % 12,7 % 33

Normální Počet psů 70,2 % 4566* 81,0 % 269 84,9 % 370

Genotyp sw sw sw sw sw sw

anglický kokršpaněl barevný bulteriér

1,8 % 0,0 %

australský honácký pes dunker

2,9 % 75,0 %

7,0 % 2,1 %

91,2 % 97,9 %

388 232

sp sp + sw ?

8,5 %

88,6 % 25,0 %

70 ?

M+ MM

-

3.6.2 Zbarvení duhovky Zbarvení oka je výsledkem spolupůsobení genů kontrolujících zbarvení srsti psů a modifikujících polygenů. Alely b a d kontrolují zesvětlené zbarvení oka. Tmavší zbarvení oka je dominantní nad zbarvením světlejším. Vlivem redukce pigmentace u pseudoalbínů pozorujeme oko modré nebo červenomodré a u úplných albínů červené. U merle zbarvených jedinců je modré oko způsobeno redukcí pigmentace oka, která je spojená s redukcí pigmentace osrstění. U plemen jako je pudlpointr nebo sibiřský husky, ale i dalších plemen, světlé oko s redukcí pigmentace osrstění nesouvisí. U savců všeobecně je popisován vliv genu P (pink-eyed dilution) na zbarvení oka. Alela P kontroluje normální zbarvení oka. Alela p kontroluje značné zesvětlení oka na modro červené nebo hnědě červené. Alela cb a alela p spolu vzájemně reagují tak, že vzniká pseudoalbín, který má téměř bílé osrstění a růžové oči (Dostál, 2007). Modré oko se také nachází u boxera (Obr. 33, 34), který nemá dříve zmiňované alely. U těchto jedinců je nevybarvenost duhovky zřejmě zapříčiněna alelou sw, protože mutace v genu MITF (Waardenberg syndrom a Tietz syndom) u lidí způsobují hypopigmentaci (Smith et al., 2000).

Obr. 34 Jedno modré oko

Obr. 35 Obě oči modré

Tab. 3 Vztah modrých očí ke hluchotě u dalmatinů (Cattanach, 1999) 34

Autoři

Barva očí

Jednostraná hluchota 20,3% 30,3% 43,8%

Normální

hnědé/hnědé hnědé/modré modré/modré

Oboustraná hluchota 6,9% 18,4% 12,5%

72,8% 51,3% 43,8%

Počet psů 915 76 32

Strain et al (1992)

Holliday et al (1992)

hnědé/hnědé hnědé/modré modré/modré

5,6% 15,8% 22,2%

18,8% 39,5% 33,3%

75,5% 44,7% 44,4%

799 76 27

3.6.3 Color dilution alopecia Tato nemoc se projevuje se postupnou ztrátou chlupů, která je někdy doprovázena opakovanou bakteriální infekcí chlupových folikulů. Shluk melanosomů vyskytující se v melanocytech kůže a vlasových folikulů, vyústí v makromelanosomy v chlupových jamkách, které se následně zlomí při nově vznikající z kůže. Napadená kůže CDA postižených psů je často suchá a šupinatá, náchylná ke spálení nebo omrzlinám. BHFD je formou alopecie, kdy je postižená pouze plocha s černou srstí, projevuje se stejně jako CDA (Philipp et al., 2005).

Obr. 36 CDA (http://commons.wikimedia.org/wiki)

3.7 Použité metody molekulární genetiky 3.7.1 Elektroforéza Technika na separaci nukleových kyselin. Je to fyzikálně-chemická metoda pro dělení látek v elektrickém poli. Zařízení se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, vlastního držáku gelu, ve kterém bude k separaci docházet, a externího zdroje stejnosměrného napětí. 35

3.7.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Při zahřátí se DNA denaturuje na jednotlivé řetězce. Na každý z nich se připojí jeden primer, který ohraničí cílovou sekvenci z každé strany. Pomocí DNA polymerázy se z nukleotidů vytvoří komplementárně nový řetězec, vzniknou tak dva duplexy, které se opět

při

denaturaci

separují.

Proces

se

opakuje

mnohokrát,

tím

dochází

k exponenciálnímu růstu počtu kopií původní sekvence (Řehout a kol., 2005). 3.7.3 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Štěpením genomové DNA určitou restrikční endonukleázou se vytvoří různý počet a délka restrikčních fragmentů. Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů u různých jedinců lze snadno detekovat gelovou elektroforézou (Šmarda a kol., 2005). 3.7.4 Sekvenování Prováděli jsme metodu podle Sangera, která je v současné době nejběžnější metodou sekvenování DNA. Sekvenují se krátké sekvence jednovláknové DNA, která je matricí. DNA-polymeráza má schopnost vytvářet přesné kopie molekuly DNA a specificky syntetizovat řetězce DNA ve směru 5´→ 3´od primeru s volnou 3´-OH skupinou. Syntéza řetězce na matricové DNA je zahájena od místa, ke kterému je připojen sekvenčně specifický primer pro sekvenování, a ukončena v místě, v němž je do rostoucího řetězce inkorporován místo normálního deoxyribonukleosidtrifosfátu (dNTP) jeho analog 2´,3´-dideoxyribonukleosidtrifostát (ddNTP), postrádající 3´-OH skupinu. Ten má po začlenění do rostoucího řetězce DNA funkci koncového inhibitoru (terminátoru) syntézy DNA, jelikož DNA-polymeráza k němu nemůže v důsledku nepřítomnosti 3´-OH skupiny připojit další nukleotid. Fluorescenční barviva jsou navázaná na jednotlivé ddNTP (Šmarda a kol. 2005), kterých jsou čtyři druhy – ddTTP, ddGTP, ddATP a ddCTP. Jelikož jsou v každé reakci namíchány vždy a ddNTP, je vždy věcí náhody, kdy se některý ddNTP vmezeří do syntézy, a kde se tedy nový řetězec ukončí. Vždy je to na pozici, kde by v normální sekvenci byla normální forma nukleotidu (pokud se vmezeří ddGTP, tak nový řetězec bude končit v místě, kde se normálně nachází báze G) (Doleža,l 2009). Vhodně zvolený poměr mezi ddNTP a odpovídajícím dNTP (1:100) v reakční směsi rozhoduje o tom, jak dlouhé řetězce, náhodně zakončené v místech začlenění ddNTP, budou DNA-polymerázou syntetizovány (Šmarda a kol., 36

2005). Analýza reakce se provádí pomocí kapilární elektroforézy (Obr. 37), kdy fragmenty se na základě velikosti rozdělí tím, jak putují kapilárou a na konci kapiláry je detektor, který je schopný zaznamenat barvu právě projíždějícího nukleotidu. Výsledkem je sekvence barevně odlišených nukleotidů (Obr. 42) (Doležal, 2009).

Obr. 37 Kapilární elektroforéza (Doležal 2009)

37

4 MATERIÁLY A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Odběr vzorků Celkem bylo odebráno 29 žíhaných, 31 zlatých a 34 bílých německých boxerů. Bylo zaznamenáno jméno, pohlaví a barva + odznaky. Ve většině případů byla vytvořena fotografická dokumentace.

4.2 Izolace DNA DNA byla izolována pomocí JETQUICK® Tissue DNA Spin Kit z bukální sliznice, která byla odebrána kartáčky Cytobrush. 4.2.1 Postup izolace -Odstřižené kartáčky vloženy do Eppendorfovy zkumavky, přidáno 200 µl pufru T1 a vortexováno 10 s. -Přidáno 25 µl proteinázy K, vortexováno 15 s., centrifugováno a inkubováno 2 hodiny při 56 °C, po 1 hodině centrifugováno. -Přidáno 200 µl pufru T2, vortexováno 15 s. a inkubováno 10 minut při 70°C. -Roztok zchlazen na ledu 1 minutu a přidáno 200 µl 90% etanolu, vortexováno 15 s., centrifugováno. -Kolonka byla vložena do centrifugační zkumavky a byla do ní přepipetována směs, získaná v předchozím kroku, a centrifugováno 1min při 10 000 rpm. -Obsah centrifugační zkumavky byl vylit, přidáno 500 µl pufru TX, centrifugováno 1 minutu při 10 000 rpm. -Obsah znovu vylit, přidáno 500 µl pufru T3, centrifugováno 1 minutu při 10 000 rpm. -Prázdná kolonka centrifugována 2 minuty při 14 000 rpm. pro dokonalé odstranění T3 pufru. -Kolonka umístěna do sterilní Eppendorfovy zkumavky, přidáno 100 µl 10mM Tris – HCl pufru, předehřátého na 70°C. -Inkubováno 2 minuty při pokojové teplotě. -Centrifugováno 2 minuty při 10 000 rpm. DNA se nacházela v roztoku uvnitř Eppendorfovy zkumavky. 38

-Výsledek izolace byl ověřen na 1,5% agarózovém gelu v pufru TBE , vizualizace pomocí ethidium bromidu a UV světla.

Obr. 38 Výsledek izolace DNA

DNA byla uchována při -20 °C pro následné analýzy.

4.3 PCR Reakční směs byla optimalizována pro termální cykler PTC 200TM (MJ Research). 4.3.1 Optimalizovaná reakční směs Celkové množství 15µl: 6 µl

H2O Primer A

0,3 µl

Primer B

0,3 µl

hot star mix

7,2 µl

DNA

1,2 µl

4.3.2 Teplotní profil -

úvodní denaturace 95°C/15 minut

-

30x denaturace annealing elongace

-

94°C/30 sekund 56°C/30 sekund 72°C/30 sekund

závěrečná elongace72°C/7 minut 39

-

konec4°C Výsledek PCR byl ověřen na 3% agarózovém gelu (pufr TBE). Vizualizace

provedena ethidium bromidem při UV světle.

Obr. 39 Výsledek PCR

4.4 RFLP PCR produkt byl štěpen restrikční endonukleázou BfaI, která štěpí nukleotidy v bodě c/taq. 4.4.1 Reakční směs Celkový objem 15 µl: H2O

8,4µl

PCR produkt

5 µl

enzym BfaI.

0,1µl

Pufr Tango

1,5µl

Inkubováno přes noc při 37°C. Naneseno na 3% agarózový gel a vizualizováno ehtidium bromidem při UV světle.

40

Obr. 40 Výsledek štěpení

4.5 Sekvenování 4.5.1 Přečištění Přečišťujeme, abychom odstranili nezačleněné terminátory, které by nám mohly zkreslit výsledek. Toto přečištění se provádí pomocí MinEluteTM PCR Purigication Kit (QIAGEN) -přes kolonky -přidání pufrů -PBI (5x množství PCR produktu) → stočit 1 min. při 13 000 rpm. → vylít -750µl PE → stočit 1 min. při 13 000 rpm. → vylít a znovu stočit -do čistých zkumavek vložíme kolonku + 10µl EB elučního pufru → 10 minut inkubovat při laboratorní teplotě → stočit 4.5.2 Kvantifikace PCR produktu -1µl 6x DNA LOADING DYE – ke vzorkům -v každé jamce používáme snižující se množství markeru M50, již smíchané s L.D. 20 µl markeru

3 µl vzorku č. 4

10 µl markeru

3 µl vzorku č. 18

5 µl markeru

3 µl vzorku č. 30

2,5 µl markeru 1,25 µl marekur 0,63 µl markeru 41

-elektroforéza 85V 45-60 minut

Obr. 41 Výsledek kvantifikace PCR produktu

4.5.3 Vlastní sekvenování -Big Dye® Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit (APPLIED BIOSYSTEMS) -primer A, reagent Ready Reaction Mix -Teplotní profil sekvenační reakce: 95/1´- (96/10´´ - 50/5´´ - 60/4´) 25 x 4/00 -přečištění sekvenační reakce kitem Jelikož byl produkt větší než 600 bp, sekvenovali jsme i z druhé strany primerem B. 4.5.4 Vyhodnocení sekvenování -porovnání sekvence pomocí programu ClustalW2 [online] www.ebi.ac.uk

Obr. 42 SNP dle Rothschilda C/T

42

5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE 5.1 Vyhodnocení izolace DNA a vzorků Celkem bylo izolováno 92 vzorků, z čehož bylo 35 bílých, 29 žíhaných a 28 zlatých boxerů.

5.2 Zbarvení boxera U boxerů dominantní homozygot nemá prakticky žádné bílé odznaky a recesivní homozygot je prakticky celý bílý. Heterozygot je s bílými odznaky na hlavě, hrudi, krku nebo břichu (Schmutz et al. 2009). Toto se potvrdilo i v této práci, kdy všichni bílí psi, jak bez znaků (Obr. 42), tak i se znaky (Obr. 43), se projevili jako recesivní homozygoti s/s. Heterozygoti S/s jsou většinou psi s velkými bílými odznaky (Obr. 44), ale též byla testována fena s malými odznaky na hlavě (Obr. 45), která je také heterozygot. Psi bez odznaků (Obr. 46) jsou dominantní homozygoti S/S, občas mohou mít malé odznaky (Obr. 47). Byly nalezeny dva nové polymorfismy v intronu 3 genu MITF (c.478-212T>C) a (c.478-181A>G). Rothschild et al.,(2006) testovali plemeno čiperka, bígl a novofundlandské psy. Našli jeden polymorfismus v intronu 3 genu MITF (c.478227C>T). Celobarevně zbarvená zvířata (SS) byla CC, heterozygoti (Ss) byli CT a skvrnitá zvířata (ss) byla TT. Genotypy jsou tedy stejné jako naše, což ukazuje, že tento MITF marker může předpovídat skvrnitost u těchto plemen. Podle Rotschilda et al. (2006) jiná plemena (německá doga a americký stafordšírský bulteriér) neukazovali spojitost mezi MITF a skvrnitostí. Křivánková (1999) píše, že se bílé zbarvení nachází až u 25 % boxerů. To by bylo možné, pokud by všichni boxeři v chovu byli pouze heterozygoti nesoucí alelu pro bílou barvu. V chovu se ovšem také používají dominantní homozygoti, kteří alelu bílou barvu nenesou, a proto nikdy bílá štěňata nedávají. Takže toto číslo musí být menší. I ze statistik Boxerklubu vyplývá, že se ve skutečnosti se rodí v průměru 10,5 % bílých jedinců.

43

Obr. 43 Recesivní homozygot bez znaků

Obr. 45 Heterozygot s velkými odznaky

Obr. 47 Dominantní homozygot téměř bez odznaků

Obr. 44 Recesivní homozygot s odznakem

Obr. 46 Heterozygot s malým odznakem na hlavě, ale velkou náprsenkou

Obr. 48 Dominantní homozygot s malými odznaky

SNP dle Rotschilda: štěpení restrikční endonukleázou BfaI: AA - 551, 131, Aa 551, 293, 258, 131, aa - 293, 258, 131

44

Obr. 49 Genotypy žíhaných boxerů

SNP NOVÉ: štěpení restrikční endonukleázou MspI: S/S- 682 bp, S/s - 682, 278, 404 a s/s- 278, 404

Heterozygot

Dominantní

Recesivní

homozygot

homozygot

Obr. 50 Genotypy vybraných boxerů všech barev

Tab. 4 Relativní frekvence genotypů a relativní frekvence alel Barva

Počet psů

s/s

S/s

S/S

s

S

žíhaná

29

0

0,655

0,345

0,33

0,67

zlatá

28

0

0,607

0,393

0,30

0,70

bílá

35

1

0

0

1

0

45

5.3 Vyhodnocení sekvenování Byli osekvenováni tři psi: vzorek č. 4 = žíhaný pes (S/S) vzorek č. 18 = zlatá fena (S/S) vzorek č. 30 = bílý pes (s/s). Ke srovnání byla použita referenční sekvence 682 bp. MITF 2A

MITF 1A

CTGAAGGCTGTGGGAGTGAGTCTCGAGAGAAAACAAAGAAATGGCAGCCATCATTCAGATGAGGTTTCCTGGTTCATCTTTGCTTTTTGG GGGAGGCAGTTGAACCTCTGTAACACTTTAGAGCATGAGTTCAAGTTGTGGCTCTCACTCTCTTCCCATATGACATTCGGCAAATTGCTT CTCATTTATCTCACCTGGAAAATTCATGTTAATAGTACCTACATTGATAGGGTTATTGTGAGGGAGCAAAATAATTTAACCCATCAAAAA CCCTGAACCGGGTGCCTGGCACCTAGTAATCCCTCCCTAAGTGCTGGTTGCAGGTGTCATCATTGTCACCTGTTAGTGTCAGTGACTTTC AGTAATGTTCATATTTGGGAGGAAGAGGACGGTAGTTTCTCAGAATCTAACTGAAGAGCATTAGTGCTTAGGGTAAAAAAAGACCGTGGA TCTCTCTTTGGGTGGCTTTGCACAGTTTTTGCTTACATTTATCTCTCTTCCATTGCCCTTTTTCCTACAGATGGATGATGTAATTGATGA CATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAAGAAATCCTGGGATTGATGGATCCTGCTTTGCAAATGGCAAATACGGTATTGATGACTTT TTTTTTTTTTTTAAAGAAAATCTTGAGATATTTCCAGTGTTCTCTCCCTTTC MITF 1B

MITF 2B

Tab. 5 Výsledky sekvenování: ref_sek

4

18

30

1.SNP dle Rotschilda(C/T)

T

CC

CC

TT

2. SNP Nové (C/T)

C

TT

TT

CC

3.SNP Nové (A/G)

A

AA

AA

GG

46

Obr. 51 SNP dle Rotschilda C/T

Obr. 52 SNP Nové C/T

47

Obr. 53 SNP Nové A/G

ref_sekvence SKR4708_4_MITF_2A

CTGAAGGCTGTGGGAGTGAGTCTCGAGAGAAAACAAAGAAATGGCAGCCATCATTCAGAT 60 ------------------------------------------------------------


GAGGTTTCCTGGTTCATCTTTGCTTTTTGGGGGAGGCAGTTGAACCTCTGTAACACTTTA 120 --GGTTTCCTGGTTCATCTTTGCTTTTTGGGGGAGGCAGTTGAACCTCTGTAACACTTTA 58 **********************************************************


GAGCATGAGTTCAAGTTGTGGCTCTCACTCTCTTCCCATATGACATTCGGCAAATTGCTT 180 GAGCATGAGTTCAAGTTGTGGCTCTCACTCTCTTCCCATATGACATTCGGCAAATTGCTT 118 ************************************************************


CTCATTTATCTCACCTGGAAAATTCATGTTAATAGTACCTACATTGATAGGGTTATTGTG 240 CTCATTTATCTCACCTGGAAAATTCATGTTAATAGTACCTACATTGATAGGGTTATTGTG 178 ************************************************************


AGGGAGCAAAATAATTTAACCCATCAAAAACCCTGAACCGGGTGCCTGGCACCTAGTAAT 300 AGGGAGCAAAATAATTTAACCCATCAAAAACCCTGAACTGGGTGCCTGGCACCCAGTAAT 238 ************************************** ************** ******


CCCTCCCTAAGTGCTGGTTGCAGGTGTCATCATTGTCACCTGTTAGTGTCAGTGACTTTC 360 CCCTCCCTAAGTGCTGGTTGCAGGTGTCATCATTGTCACCTGTTAGTGTCAGTGACTTTC 298 ************************************************************


AGTAATGTTCATATTTGGGAGGAAGAGGACGGTAGTTTCTCAGAATCTAACTGAAGAGCA 420 AGTAATGTTCATATTTGGGAGGAAGAGGACGGTAGTTTCTCAGAATCTAACTGAAGAGCA 358 ************************************************************


TTAGTGCTTAGGGTAAAAAAAGACCGTGGATCTCTCTTTGGGTGGCTTTGCACAGTTTTT 480 TTAGTGCTTAGGGTAAAAAAAGACCGTGGATCTCTCTTTGGGTGGCTTTGCACAGTTTTT 418 ************************************************************


GCTTACATTTATCTCTCTTCCATTGCCCTTTTTCCTACAGATGGATGATGTAATTGATGA 540 GCTTACATTTATCTCTCTTCCATTGCCCTTTTTCCTACAGATGGATGATGTAATTGATGA 478 ************************************************************

48


CATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAAGAAATCCTGGGATTGATGGATCCTGCTTT 600 CATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAAGAAATCCTGGGATTGATGGATCCTGCTTT 538 ************************************************************


GCAAATGGCAAATACGGTATTGATGACTTTTTTTTTTTTTTTAAAGAAAATCTTGAGATA 660 GCAAATGGCAAATACGGTATTGATGACTTTTTTTTTTTTTATA----------------- 581 **************************************** **


TTTCCAGTGTTCTCTCCCTTTC 682 ----------------------

Obr. 54 Srovnání referenční sekvence a vzorku č. 4


CTGAAGGCTGTGGGAGTGAGTCTCGAGAGAAAACAAAGAAATGGCAGCCATCATTCAGAT 60 -------------------------------------------------ATCATTCAGAT 11 ***********


GAGGTTTCCTGGTTCATCTTTGCTTTTTGGGGGAGGCAGTTGAACCTCTGTAACACTTTA 120 GAGGTTTCCTGGTTCATCTTTGCTTTTTGGGGGAGGCAGTTGAACCTCTGTAACACTTTA 71 ************************************************************


GAGCATGAGTTCAAGTTGTGGCTCTCACTCTCTTCCCATATGACATTCGGCAAATTGCTT 180 GAGCATGAGTTCAAGTTGTGGCTCTCACTCTCTTCCCATATGACATTCGGCAAATTGCTT 131 ************************************************************


CTCATTTATCTCACCTGGAAAATTCATGTTAATAGTACCTACATTGATAGGGTTATTGTG 240 CTCATTTATCTCACCTGGAAAATTCATGTTAATAGTACCTACATTGATAGGGTTATTGTG 191 ************************************************************


AGGGAGCAAAATAATTTAACCCATCAAAAACCCTGAACCGGGTGCCTGGCACCTAGTAAT 300 AGGGAGCGAAATAATTTAACCCATCAAAAACCCTGAACCGGGTGCCTGGCACCTAGTAAT 251 ******* ****************************************************


CCCTCCCTAAGTGCTGGTTGCAGGTGTCATCATTGTCACCTGTTAGTGTCAGTGACTTTC 360 CCCTCCCTAAGTGCTGGTTGCAGGTGTCATCATTGTCACCTGTTAGTGTCAGTGACTTTC 311 ************************************************************


AGTAATGTTCATATTTGGGAGGAAGAGGACGGTAGTTTCTCAGAATCTAACTGAAGAGCA 420 AGTAATGTTCATATTTGGGAGGAAGAGGACGGTAGTTTCTCAGAATCTAACTGAAGAGCA 371 ************************************************************


TTAGTGCTTAGGGTAAAAAAAGACCGTGGATCTCTCTTTGGGTGGCTTTGCACAGTTTTT 480 TTAGTGCTTAGGGTAAAAAAAGACCGTGGATCTCTCTTTGGGTGGCTTTGCACAGTTTTT 431 ************************************************************


GCTTACATTTATCTCTCTTCCATTGCCCTTTTTCCTACAGATGGATGATGTAATTGATGA 540 GCTTACATTTATCTCTCTTCCATTGCCCTTTTTCCTACAGATGGATGATGTAATTGATGA 491 ************************************************************


CATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAAGAAATCCTGGGATTGATGGATCCTGCTTT 600 CATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAAGAAATCCTGGGATTGATGGATCCTGCTTT 551 ************************************************************


GCAAATGGCAAATACGGTATTGATGACTTTTTTTTTTTTTTTAAAGAAAATCTTGAGATA 660 GCAAATGGCAAATACGGTATTGATGACTTTTTTTTTTTTTT-AAAGAAAA---------- 600 ***************************************** ********


TTTCCAGTGTTCTCTCCCTTTC 682 ----------------------

Obr. 55 Srovnání referenční sekvence a vzorku č. 30

49

5.4 Hluchota boxera a ostatních plemen Hluchota u boxera prozatím nebyla nikdy vědecky zkoumána. Někteří chovatelé, jako např. Garton T. & BML (1997) uvádí, že je pod 10% pouze oboustranně hluchých bílých boxerů. V klubu bílých boxerů je 43 psů, z nichž je 5 hluchých a 44 fen, z nichž je hluchá pouze jedna. Tyto čísla ukazují na 6,9 % hluchých jedinců. Pejšová (2010) V našem výzkumu byli hluší 3 z 35 bílých boxerů, což je 8,6 %. Z čehož vyplývá, že hluchých bílých boxerů je opravdu pod 10 %. V tabulce č. 6 jsou uvedena procenta hluchých jedinců u ostatních plemen podle Straina (2003). Jedno modré oko se nacházelo u tří bílých boxerů a u dvou bylo modré jen z části. Ani jeden z těchto psů nebyl hluchý. Na stránkách klubu bílého boxera je pes s oběma modrýma očima a také není hluchý (Pejšová 2010). U boxera tedy nemá modré oko vliv na hluchotu, oproti dalmatinovi, u kterého má modré oko na hluchotu určitý vliv (Tab. 3). Tab. 6 Rozšíření hluchoty u 11 300 psů vybraných plemen (Strain G.M. 2003) Plemeno

Počet

Slyšící %

jedinců

Jednostranně Oboustranně Hluší hluší (U) %

hluší (D) %

(U+D) %

dalmatin

5333

70,1

21,9

8

29,9

anglický setr

3656

92,1

6,5

1,4

7,9

anglický

1136

93,1

5,9

1,1

6,9

665

89

9,9

1,1

11

bílí 346

80,1

18

2

19,9

barevní 311

98,7

1,3

0,0

1,3

296

85,5

12,2

2,4

14,5

whippet

80

98,8

0,0

1,3

1,3

catahoula

78

37,2

23,1

39,7

62,8

56

83,9

7,1

8,9

16,1

kokršpaněl bulteriér

australský honácký pes

leopardí pes jack russel terier

50

6 ZÁVĚR Tato práce byla zaměřena na prozkoumání krátké sekvence genu MITF, kde byly nalezeny dva polymorfismy v intronu, což je nekódující úsek DNA a posttranskripčními úpravami se vyštěpí. Dále bylo zjištěno, že všichni bílí psi byli recesivní homozygoti, celoplášťově zbarvení nebo psi s malými bílými odznaky byli dominantní homozygoti a psi s většími odznaky byli heterozygoti. Proto doporučuji chovatelům, kteří nechtějí mít bílá štěňata, aby měli v rodičovském páru alespoň jednoho psa bez odznaků. Pokud by se prováděly testy DNA na barvu srsti, mohli by se zařadit do chovu i bílí boxeři, protože při spojení s dominantním homozygotem by vždy dávali pouze štěňata s odznaky. Při průzkumu bylo také zjištěno, že hluchota spojená s bílou barvou není u bílých boxerů tak rozšířená, jako např. u dalmatinů. Ovšem tyto výsledky mohou zkreslovat početní stavy zkoumaných psů, protože bílých boxerů není tolik jako dalmatinů, kteří se v jiné barvě nevyskytují.

51

7 SEZNAM LITERATURY Bauer G.L., Praetorius Ch., Bergsteinsdóttir K., Hallson J.H., Gísladóttir B.K., Schepsky A., Swing D.A., O´Sullivan T.N., Arnheiter H., Bismuth K., Debbache J., Fletcher C., Warming S., Copeland N.G., Jenkins N.A. & Steingrímsson E. The role of MITF phosphorylation sites during coat color and eye development in mice analyzed by bacterial artificial chromosome transgene rescue. Genetics Society of America, 2009 October, vol. 183, no. 2, str. 581-94 Berryere T.G., Kerns J.A., Barsh G.S. & Schmutz S.M. Association of an agouti allele with fawn or sable chat colour in domestic dogs. Mammalian Genome, 2005 April, vol. 16, no. 4, str. 262-72 Bismuth K., Maric D. & Arheiter H. MITF and cell proliferation: the role of alternative splice forms. Pigment Cell Res., 2005 October, vol. 18; no. 5, str. 349-59 Bowling S.A. (2000): Genetika psí barvy, [online] 2000-1-3 [cit. 2010-3-29]. URL Boxer Dog. org. The history and facts about the white boxer, [online] 2009 [cit. 2010-39] URL Cargill E.J., Famula T.R., Strain G.M. & Murphy K.E. Heritability and Segregation Analysis of Deafness in U.S. Dalmatians. Genetics Society of America, 2004 March, vol. 166, no. 3, str. 1385-93 Cattanach B.M. The dalmatian dilemma - White Coat Colour and Deafness, Journal Small Animal Pract., 1999 April, vol. 40, no. 4, str.193-200 Cavanaugh E.W.: Německý boxer. Přeložila Eva Horová, 1. vydání ve Fortuna Print v Praze, 2000, ISBN: 80-86144-42-9 Clark L.A., Wahl J.M., Rees Ch.A. & Murphy K.E. Retrotransposon insertion in SILV is responsible for merle patterning of the domestic dog. The National Academy of Sciences, 2006 January, vol. 103, no. 5, str. 1376-81.

52

Doležal T. Sangerova metoda sekvenování . [online] Katedra molekulární biologie. Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích. 2009 [2010-3-28] URL Dostál J.: Chov psů – genetika v kynologické praxi. 1. vydání v nakladatelství DONA v Českých Budějovicích, 1995. ISBN: 80-85463-58-X Dostál J.: Genetika a šlechtění plemen psů. 1. vydání v nakladatelství DONA v Českých Budějovicích, 2007. 261 s. ISBN 978-80-7322-104-1. Drögemüller C., Rüfenacht S., Wichert B. & Leeb T. Mutations within the FGF5 gene are associated with hair length in cats. Animal Genetics, 2007 June, vol. 38, no. 3, str. 218-21 Garton T. & BML (Boxer Mailing List). White Boxer General Information. [online] Boxer buddies. 1997 July,[cit. 2010-2-9] URL Gooding, C.R. Mitf from neural crest to melanoma: signal transdution and transcription in the melanocyte lineage. Genes & Development, 2000 July, vol. 14, no. 14, str. 1712-28 Canine DNA Testing. [online] HealthGene, 2000, [cit. 2010-4-11] URL Hédan B., Corre S., Hitte Ch. Dréano S., Vilboux T., Derrien T., Denis B., Galibert F., Galibert M.D. & André C. Coat colour in dogs: identification of the Merle locus in the Australian shepherd breed. BioMed Central Vet Res., 2006 February, vol. 27, no. 2, str. 9 Hodgkinson C.A., Moore K.J., Nakayama A., Steingrímsson E., Copeland N.G., Jenkins N.A. & Amheiter H. Mutations at the mouse microphthalmia locus are associated with defects in a gene encoding a novel basic-helix-loop-helix-zipper protein. Cell. 1993 July, vol.74, no. 2, str. 395-404 Housley D.J.E. & Venta P.J. The long and the short of it: evidence that FGF5 is a major determinant of canine ´hair´-itability. Animal Genetics, 2006 August, vol. 37, no. 4, str. 309-15 53

Karlson E.K., Baranowska I., Wade C.M., Salmon Hillbertz N.H., Zody M.C., Anderson N., Biagi T.M., Patterson N., Pielberg G.R., Kulbokas E.J. 3rd, Comstock K.E., Keller E.T., Mesirov J.P., von Euler H., Kämpe O., Hedhammar A., Lander E.S., Andersson G., Andersson L. & Lindblad-Toh K. Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association. Nattional Genetics, 2007 November, vol. 39, no. 11, str. 13218 Kerns J.A., Newton J., Berryere T.G., Rubin E.M., Cheng J.F., Schmutz S.M. & Barsh G.S. Characterization of the dog Agouti gene and a nonagouti mutation in German Shepherd Dogs. Mammalian Genome, 2004 October, vol. 15, no. 10, str. 798-808 Kerns J.A., Cargill E.J., Clark L.A., Candille S.I., Berryere T.G., Olivier M., Lust G., Schmutz S.M., Murphy K.E. & Barsh G.S. Linkage and segregation analysis of black and brindle coat color in domestic dogs. Genetics, 2007 July, vol. 176, no. 3, str. 1679-89 Křivánková L. Problém zvaný bílý boxer. Zpravodaj Boxerklubu ČR, 1999, roč. 57,č. 3, str. 6-7 Leegwater P.A., Van Hagen M.A. & Van Oost B.A. Localization of White Spotting Locus in Boxer Dogs on CFA20 by Genome-Wide Linkage Analysis with 1500 SNPs. Journal of Heredity, 2007, vol. 98, no. 5, str. 549-52 Martinec J. Dědičnost zbarvení u boxera, [online] Alros Canis, 2001-8-4 [cit. 2010-3-10] URL Mosby´s Medcical Dictionary [online] Farlex 2010 URL Newton J.M., Wikie A.L., He L., Jordan S.A., Metallionos D.L., Holmes N.G., Jackson I.J. & Barsh G.S. Melanocortin 1 receptor variation in the domestic dog. Mammalian Genome, 2000 January, vol. 11, no. 1, str. 24-30 Německý boxer [online] eFauna, 2008 [cit. 2009-11-10] URL NCBI Waardenburg syndrom. [online] Bookself, Genes and Disease, 2007 [cit. 2010-42] URL 54

Pejšová K. Naši psi, naše feny. [online] Bílý boxer., poslední aktualizace 2010-3-16, [cit. 2010-3-20] URL Philipp U., Hamann H., Mecklenburg L., Nishino S., Mignot E., Günzel-Apel A.R., Schmutz S.M. & Leeb T. Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute coat color in dogs. BMC Genetics, 2005 June, vol. 16, no. 6, str. 34 Rosypal S., Beneš J., Beneš K., Buchar J., Heráň I., Homola J., Hůrka K., Kubišta V., Kovaček Z., Linc R., Losos B., Mladá J., Mladý F., Novotný I., Pavlová L., Pikálek P., Romanovský A., Slavíková Z., Slavíková J., Šašek V., Šebánek J., Šmarda J., Štys P. & Urban Z. Přehled biologie 3. vydání, 2. vydání v nakladatelství Scientia, 1998, ISBN: 807183-110-7 Rothschild M.F., van Cleave P.S., Glenn K.L., Carlstrom L.P. & Ellinwood N.M. Association of MITF with white spotting in Beagle crosses and Newfoundland dogs. Animal Genetic, 2006 October, vol. 37, no. 6, str. 606-7 Řehout V., Čítek J., Hradecká E. Genetika II, 1. vydání Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích, 2005 ISBN: 80-7040-774-3 Smith S.D., Kelley P.M., Kenyon J.B. & Hoover D. Tietz syndrome (hypopigmentation/deafness) caused by mutation of MITF. Journal of Medical Genetics, 2000 June, vol. 37, no. 6, str. 446-8 Schmutz S.M., Berryere T.G., Goldfinch A.D. TYRP1 and MC1R genotypes and their effects on coat color in dogs. Mammalian Genome, 2002 July, vol. 13, no. 7, str. 380-7 Schmutz S.M, Berryere T.G., Ellinwood N.M., Kerns J.A. & Barsh G.S. MC1R studies in dogs with melanistic mask or brindle patterns. Journal of Heredity, 2003 JanuaryFebruary, vol. 94, no. 1, str. 69-73 Schmutz S.M. and Berryere T.G. Genes affecting coat colour and pattern in domestic dogs: a review. Animal Genetics, 2007 December, vol. 38, no. 6, str. 539-49. 55

Schmutz S.M. Genetics of Coat Color and Type in dogs. [online] University of Saskatchewan, Canada, poslední aktualizace 2010-3-4, [cit. 2010-3-12] URL Schmutz S.M., Berryere T.G. & Dreger D.L. MITF and White Spotting in Dogs: A Population Study. Journal of Heredity, 2009, vol. 100, str. 66-74 Schwartz R.A., Jozwiak S., Krantz I. Waardenburg syndrome. [online] eMedicine, 2009 [cit. 2010-1-10] URL Statistika chovu německého boxera v ČR – přehled vrhů [online] Boxerklub ČR, 2010, [cit. 2010-4-10] Strain G.M. Deafness prevalence and pigmentation and gender associations in dog breeds at risk. The Veterinary Journal, 2004 January, vol. 167, no. 1, str. 23-32 Šmarda J., Doškař J., Pantíček R., Růžičková V., Koptíková J. Metody molekulární biologie, 1. vydání MU Brno, 2005, 194 str., ISBN-10: 80-210-3841-1 TICHÁ L. Genetika v barvě srsti. [online] poslední aktualizace 2010-3-16, [cit. 2010-320] URL < http://www.bilyboxer.info/zajimavo.html> van Hagen M.A.E., van der Kolk J., Barendse M.A.M., Imholz S., Leegwater P.A.J., Knol B.W. & van Oost B.A. Analysis of the inheritance of white spotting and the evaluation of KIT and EDNRB as spotting loci in Dutch boxer dogs. Journal of Heredity, 2004 November-December, vol. 95, no. 6, str. 526-31 Vetgen Coat lenght. [online] 2009 [cit. 2010-3-15] URL Vetdnacenter Coat Lenght Test for Other Canine Breeds, [online] 2010 [cit. 2010-3-15] URL Vlha J. Ústní sdělení. Nepublikováno. 28. 9. 2009 Walker J. Coat color inheritance. [online] Newcastleboxers 2001 [cit. 2010-3-12] URL 56

Zákon č. 246/1992 Na ochranu zvířat proti týrání §5 odstavec 2, [online] Portál veřejné správy České republiky, 2010 [cit. 2010-3-25] URL

57

8 SEZNAM TABULEK Tab. 1. Epistatická příbuznost mezi alelami Agouti, K, a Extension (Kerns et al. 2007) ..23 Tab. 2. Plemena s hluchotou přisuzující alelám s a M (Cattanach 1999)...........................33 Tab. 3. Vztah modrých očí ke hluchotě u dalmatinů (Cattanach 1999) .............................34 Tab. 4. Relativní frekvence genotypů a relativní frekvence alel ........................................45 Tab. 5. Výsledky sekvenování............................................................................................46 Tab. 6. Rozšíření hluchoty u 11 300 psů vybraných plemen (Strain G.M. 2003)..............50

58

SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1

Flock St. Salvator ................................................................................................11

Obr. 2

První výstava boxerů ...........................................................................................11

Obr. 3

Meta v. d. Passage ...............................................................................................11

Obr. 4

Zbarvení boxera...................................................................................................13

Obr. 5

Černě žíhaný boxer ..............................................................................................13

Obr. 6

Bílý boxer.............................................................................................................13

Obr. 7

Zlatý boxer ...........................................................................................................13

Obr. 8

Černý německý ovčák ..........................................................................................17

Obr. 9

Americký eskymácký pes (www.celysvet.cz) ........................................................17

Obr. 10 Vlkošedé zbarvení německého ovčáka (Schmutz, 2009) .......................................18 Obr. 11 Tricolor gordon setr (Schmutz, 2009) .................................................................18 Obr. 12 Žluté zbarvení u plemene mops (Schmutz 2009) .................................................19 Obr. 13 Genotyp E/E u velkého münsterlandského ohaře (www.greatdogsite.com)........20 Obr. 14 Bílý malý knírač (Schmutz, 2009)........................................................................20 Obr. 15 Maska u plavého boxera......................................................................................21 Obr. 16 Genotyp bs/bs u anglického setra .........................................................................22 Obr. 17 Genotyp bd/bd u dobrmana ..................................................................................22 Obr. 18 Genotyp bc/bc u italského chrtíka.........................................................................22 Obr. 19 Černá německá doga (www.celysvet.cz)..............................................................23 Obr. 20 Žíhaný whippet (Schmutz ,2009) .........................................................................23 Obr. 21 Žíhaný boxer se znaky..........................................................................................25 Obr. 22 Bílí boxeři se skvrnami ........................................................................................25 Obr. 23 Bílý boxer se skvrnami po celém těle...................................................................25 Obr. 24 Landseerský vzor (www.dogsindepth.cz).............................................................26 Obr. 25 Landseerský vzor 1 (www.dogbreedinfo.cz) ........................................................26 Obr. 26 Psí chromosom 20 (www.canine-gene-project.de/Ideogram.html) .....................27 Obr. 27 Sourozenci s Waardenburg syndromem (www.emedicine.medscape.com) .........27 Obr. 28 Normální, merle a bílé zbarvení šeltie (Clark et al., 2006).................................28 Obr. 29 Albino lhasa apso (Schmutz 2009) ......................................................................29 Obr. 30 Albino dobrman (www.whitedobes.com).............................................................30 Obr. 31 Tito puli se narodili jako černí, odstup mezi nimi je rok (Berryere, 2009) .........30 59

Obr. 32 Modrý dobrman (Philipp et al. 2005)..................................................................31 Obr. 33 Tečkovaný dalmatin (Berryere, 2009) .................................................................32 Obr. 34 Jedno modré oko..................................................................................................34 Obr. 35 Obě oči modré .....................................................................................................34 Obr. 36 CDA (http://commons.wikimedia.org/wiki).........................................................35 Obr. 37 Kapilární elektroforéza (Doležal 2009) ..............................................................37 Obr. 38 Výsledek izolace DNA..........................................................................................39 Obr. 39 Výsledek PCR ......................................................................................................40 Obr. 40 Výsledek štěpení...................................................................................................41 Obr. 41 Výsledek kvantifikace PCR produktu...................................................................42 Obr. 42 SNP dle Rothschilda C/T .....................................................................................42 Obr. 43 Recesivní homozygot bez znaků ...........................................................................44 Obr. 44 Recesivní homozygot s odznakem ........................................................................44 Obr. 45 Heterozygot s velkými odznaky............................................................................44 Obr. 46 Heterozygot s malým odznakem na hlavě, ale velkou náprsenkou......................44 Obr. 47 Dominantní homozygot téměř bez odznaků .........................................................44 Obr. 48 Dominantní homozygot s malými odznaky ..........................................................44 Obr. 49 Genotypy žíhaných boxerů...................................................................................45 Obr. 50 Genotypy vybraných boxerů všech barev ............................................................45 Obr. 51 SNP dle Rotschilda C/T .......................................................................................47 Obr. 52 SNP Nové C/T......................................................................................................47 Obr. 53 SNP Nové A/G .....................................................................................................48 Obr. 54 Srovnání referenční sekvence a vzorku č. 4.........................................................49 Obr. 55 Srovnání referenční sekvence a vzorku č. 30.......................................................49

60

PŘÍLOHY

SEZNAM PŘÍLOH:

Příloha I

Slovník pojmů

Příloha II

Dvě rodiny boxera Vrh F Ze Zubštejna Vrh B Wizartow Vysvětlivky

I

I. Slovník pojmů Pokud není uvedeno jinak, byl použit interaktivní genetický slovník zveřejněný na webových

stránkách

Agronomické

fakulty

Mendelovy

univerzity

v

Brně

(http://umfgz.af.mendelu.cz/cz/vyuka/vyukove_prezentace#): Adenin – purinová báze nalézající se v nukleových kyselinách Alela – jedna z různých forem genu nebo sekvence DNA, nachází se v lokusu Autozom – somatický chromozom, který není pohlavní nebo mitochondriální Cytozin – pyrimidinová báze nacházející se v nukleových kyselinách Dědičnost – schopnost organizmu zabezpečovat materiální a funkční spojitost mezi generacemi buněk a jedinců a podmiňovat specifický charakter individuálního vývoje organizmu v určitých podmínkách vnějšího prostředí. Skutečnost, že se potomci podobají svým rodičům a blízkým příbuzným více než ostatním jedincům. Diploidní počet chromozomů – dvě chromozomové sady v jádře buňky, tzn., že se každý typ chromozomu nachází dvakrát (2n), kromě pohlavních, ty jsou haploidní Dominantní – jedna alela maskuje projev jiné téhož genu pro jednu vlastnost Epistáze – interakce, kdy jeden gen potlačuje expresi druhého genu na jiném lokusu Exon – segment nerozděleného úseku genu, který je přepisován do mRNA F1 generace – první filiální generace, vzniká pářením dvou jedinců Fenotyp – soubor charakteristických a fyziologických znaků a vlastností organismu, a na jeho vytváření se podílí vliv vnějšího prostředí Gen – základní fyzikální a funkční jednotka dědičnosti, která nese genetickou informaci z jedné generace do další Genetický kód – po sobě jdoucí kodony sekvence mRNA, které specifikují sekvenci aminokyselin pro syntézu proteinu

II Genom – Celkový genetický materiál prokaryotů a virů, tj. kompletní sada DNA sekvence organizmu, u eukaryotů je definován jako sada genů, přítomných v jedné úplné haploidní sadě chromozomů. Genotyp – konkrétní sestava alel na konkrétním lokusu či více lokusech Guanin – purinová báze nalézající se v nukleových kyselinách Haploidní – stav, kdy buňka nebo organismus mají pouze poloviční sadu chromozomů Heterozygotní – mající dvě různé alely, pro jednu konkrétní vlastnost na obou homologních chromozomech Homozygotní – genotyp mající dvě identické alely pro jednu konkrétní vlastnost na obou chromozomech Hypostatický gen – gen, jehož exprese je maskována účinkem epistatického genu Intron – Nekódující úsek DNA u eukaryontů. Sekvence DNA složených (mozaikových) genů, které se po transkripční úpravě primárního transkriptu vyštěpují a nezůstávají ve výsledné mRNA, která sestává pouze z exonů. Kodon – nukleotidový triplet v mRNA, specifikující aminokyselinu, která má být vložena na specifické místo při formování polypeptidu během translace, nebo kóduje iniciační či terminační signál Komplementarita – vlastnost dvou řetězců nukleové kyseliny, které mají takovou sekvenci bazí, že můžou tvořit antiparalelní duplex, kde se adenin váže na tymin (případně na uracil) a guanin na cytosin Lokus – místo na chromozomech nebo DNA, kde je umístěn určitý gen mRNA – transkribovaná z genu, která slouží při translaci jako templát genetické informace pro tvorbu proteinu Monogenní – zapříčiněná jedním genem

III Mutace – dědičná změna v sekvenci nukleotidů DNA. Mutace mohou být přeneseny z generace na generaci. Příkladem mutace je delece (vymazání), substituce (záměna), atd. Nukleotid – podjednotka nukleotidového řetězce tvořená dusíkatou bází (puriny – A, G a pirimidiny T/U, C), cukru (ribóza, 2-deosyribóza) a fosfátu Polymorfismus – výskyt současně více alel jednoho lokusu, s frekvencí vyšší než 1% v populaci Postnatální vývoj – údobí vlastního života po narození (Rozsypal et al. 1998) Primer – krátká sekvence RNA, který se váže na templátový řetězec DNA, a na který je schopna DNA– polymeráza začít napojovat nukleotidy. Promotor – část molekuly DNA, která je nutná k transkripci genu Protein (bílkovina) – molekula složená z jednoho nebo více polypeptidových řetězců, které jsou lineárními řetězci aminokyselin kovalentně spojených peptidickou vazbou. Recesivní alela – alela, jejíž fenotypový efekt není projeven v heterozygotním genotypu Restrikční endonukleáza – enzym, který se specificky váže na DNA a štěpí ji ve specifických místech nacházejících se uvnitř, nebo blízko rozpoznávací sekvence. Semidominantní – neúplně dominatní SNP – polymorfismus mezi dvěma genomy, který je založení na deleci, inserci nebo záměně jednoho nukleotidu (Mosby´s Medical Dictionary, 2009) Strukturní gen – úsek molekuly DNA nebo RNA (u RNA virů), který kóduje primární strukturu jedné molekuly peptidu, jako produkt překladu genetické informace. Strukturní geny mohou být jednoduché nebo složené. Templát – původní řetězec DNA, který slouží jako matrice pro syntézu nového komplementárního vlákna DNA. Thymin – pyrimidinová báze obsažená v deoxyribonukleových kyselinách

IV Transkripce – přepis genetické informace z DNA do RNA pomocí enzymu RNApolymeráza Translace – překlad genetické informace ze sekvence mRNA do sekvence aminokyselin, pomocí genetického kódu Uracil – pyrimidinová báze obsažená v deoxyribonukleových kyselinách

V

II. Dvě rodiny boxera

Vrh F Ze Zubštejna

Vrh B Wizartow

Vysvětlivky

Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů

Recommend Documents