ANALYSE VAN TRABECULAIRE BOTPARAMETERS BIJ AROMATASE- DEFICIËNTIE MET HOGE RESOLUTIE X-STRALEN MICROTOMOGRAFIE

Faculteit Farmaceutische, Biomedische en Diergeneeskundige Wetenschappen Onderwijscommissie Biomedische Wetenschappen

ANALYSE VAN TRABECULAIRE BOTPARAMETERS BIJ AROMATASEDEFICIËNTIE MET HOGE RESOLUTIE X-STRALEN MICROTOMOGRAFIE

Door: Tineke De Schutter

Eindverhandeling voorgelegd tot het behalen van de graad van Licentiaat in de Biomedische Wetenschappen

29 juni 2007 Academiejaar 2006-2007

Promotor(en): Prof. Dr. N. De Clerck en Prof. Dr. M. Karperien Co-promotor: Dr. A. Postnov Begeleider: Ir. F. Lakiere en Drs. S. van Gool

Onderzoeksgroep Microtomografie Departement Biomedische Wetenschappen Campus Drie Eiken - Gebouw N Universiteitsplein 1 BE-2610 Antwerpen (Wilrijk)

WOORD VOORAF Maanden van werken en schrijven zijn voorbij gevlogen. Niet zonder de bijhorende problemen, maar wel met de nodige dosis inzet, creativiteit en humor. Ik heb de kans gekregen om in een ongelooflijk vindingrijk labo mijn eindverhandeling te volbrengen, omringd door enorm bekwame mensen, en hiervoor wil ik een aantal mensen speciaal bedanken. Allereerst Prof. Dr. N. De Clerck, de promotor van de eindverhandeling en steeds bereid mij te helpen. Dankzij haar heb ik de kans gekregen om de voorbije maanden in een aangename sfeer te werken en mee te denken in het uitgebreid botonderzoek dat ik mocht verrichten. Bij haar kreeg ik een antwoord op al mijn vragen en haar enthousiasme werkte erg aanstekelijk. Dr. A. Postnov wil ik eveneens bedanken voor zijn onvoorspelbare, en soms onverklaarbare, inzichten in het onderzoek. Ook de uitstap naar Brugge vond ik heel aangenaam en leerrijk. I realy enjoyed our co-operation and I hope you get that new scanner one day. Verder zou ik ook heel graag Drs. S. van Gool hartelijk bedanken voor alle hulp en steun die ze mij gaf. De bezoekjes aan Leiden vond ik fantastisch. De leuke ontspannende babbels tussendoor, de leerrijke tips en de steun waardeer ik enorm. Ir. F. Lakiere wil ik bedanken voor zijn praktische hulp bij het scannen en schrijven. Nora, Andrei, Frank en Sandy, ik heb enorm genoten van het werken in jullie labo, de middagen discussies en besprekingen samen met jullie, jullie professionele aanpak van het onderzoek. Deze waren voor mij ongelooflijk leerrijk en ik heb met veel bewondering naar jullie geluisterd. Dan zijn er nog mijn ouders, Maarten, Ilse, familie en vrienden, die mij veel steun geboden hebben en voor de nodige afleiding zorgden op de juiste (en foute) momenten. En niet te vergeten, Veerle Persy omwille van de hulp met de ratjes. De voorbije vier maanden waren de beste van mijn hele opleiding. Ik kreeg de kans om mee te werken aan een interessant project en heb kunnen proeven van het wetenschappelijk onderzoek. Ik heb veel geleerd, gedacht en geschreven, maar vooral genoten.

Je kunt je leven op twee manieren leven: alsof niets een wonder is en alsof alles een wonder is. A. Einstein

INHOUDSTABEL

LIJST MET AFKORTINGEN

iii

LIJST MET FIGUREN

iv

LIJST MET TABELLEN

vi

SAMENVATTING

vii

ABSTRACT

viii

I. INLEIDING

1

1.

1 1 3 3 4 5

2. 3.

Longitudinale botgroei 1.1 De groeischijf 1.2 Regulatie a. Algemeen b. Oestrogenen c. Regulatie tijdens de puberteit

Longitudinale botgroei bij pathologieën: oestrogeen-deficiëntie syndromen 6 Hypothese 3.1 Situering van het onderzoek 3.2 Doel van het onderzoek

7 7 8

II. MATERIAAL EN METHODE

9

1.

9

Algemeen principe

2.

Opstelling 2.1 De X-stralenbron 2.2 Data acquisitie 2.3 Detectie 2.4 Reconstructie 2.5 Beam hardening effect (BHE)

11 11 12 13 14 15

3.

Beeldanalyse 3.1 CT-Analyser 3.2 Metafysaire analyse 3.3 Epifysaire analyse 3.4 “Whole bone” analyse

16 16 16 17 18

4.

Studieopzet 4.1 Proefdiermodel 4.2 Scanparameters 4.3 Statistiek

19 19 19 20

i

III. RESULATEN

21

1.

21 21 21 22

“Whole bone” analyse 1.1 Volume 1.2 Totaal calcium en Calciumdensiteit 1.3 Lengte

2.

Analyse van trabeculair bot: vrouwelijke dieren

22

3.

Analyse van trabeculair bot: mannelijke dieren

26

4.

Conclusie van de in-vitroanalyse

29

5.

Longitudinale opvolging van trabeculair bot tijdens groei in jonge ratten 30

IV. DISCUSSIE

31

1.

31 31 31 31 32 32

Evaluatie van de gebruikte techniek 1.1 Data acquisitie a. In vitro b. In vivo 1.2 Reconstructie: Beam hardening effect (BHE) 1.3 Analysemethode: keuze van “region of interest” (ROI)

2.

Vergelijking epifyseale en metafyseale analyse

33

3.

Relevantie t.o.v. algemeen botonderzoek

34

4.

Evaluatie van het proefdiermodel

35

5.

6.

Evaluatie van de resultaten 5.1 Vrouwelijke dieren 5.2 Mannelijke dieren 5.3 Groei bij jonge ratjes Conclusie

REFERENTIES

36 36 38 39 40 41

BIJLAGE

ii

LIJST MET AFKORTINGEN ADS

Aromatase Deficiëntie Syndroom

ANOVA

Analysis Of Variance

AR

Androgeen Receptor

BHE

Beam Hardening Effect

BMD

Bone Mineral Density

BMP

Bone Morfogeneic Protein

BV

Bone Volume

CCD

Charge Coupled Device

CT

Computed Tomography

DEXA

Dual Energy X-ray Absorptiometry

ER

Oestrogeen Receptor

FSH

Follikel Stimulerend Hormoon

GH

GroeiHormoon

GHRF

GroeiHormoon Releasing Factor

HH-as

Hypothalamo-Hypofysaire as

IGF-I

Insuline Like Growth Factor I

ISS

Idiopathic Small Stature, idiopatisch kleine gestalte

LH

Lutineïserend Hormoon

LSD

Least Significance Difference

PHV

Peak Height Velocity

PTH

ParaThyroïdHormoon

ROI

Region Of Interest

T4

Thyroxine, schildklierhormoon

TGF-β

Transforming Growth Factor β

VOI

Volume Of Interest

VOO

Volume Of Objects

iii

LIJST MET FIGUREN

Figuur I.1: De groeischijf.

1

Figuur I.2: Serumconcentratie van IGF-I i.f.v. de leeftijd bij de mens, met een piek tijdens de puberteit. Ook de groeisnelheid bereikt dan de hoogste waarde. 2 Figuur I.3: Regulatie van de groeihormoonsecretie volgens de hypothalamus-hypofysaire as.

3

Figuur I.4: Regulatie van de secretie van de gonadale hormonen volgens de hypothalamo-hypofysaire as. 4 Figuur I.5: Stuctuur van exemestane.

8

Figuur II.1: Basisprincipes van micro-CT. (a): schaduwbeeld, de basis voor de constructie van virtuele dwarsdoorsneden (b), die gebruikt worden voor de creatie van een 3D-beeld. 9 Figuur II.2: Het elektromagnetische spectrum.

10

Figuur II.3: Voorstelling van de wet van Lambert-Beer.

10

Figuur II.4: Vergelijking van de attenuatiecoefficiënten (µ) van calcium en water (waaruit zachte weefsels hoofdzakelijk bestaan). Hoe hoger het atoomnummer van een element, hoe hoger ook de attenuatiecoefficiënt. Calcium heeft een hoger atoomnummer dan water waardoor de kans op absorptie van een X-foton toeneemt. 11 Figuur II.5: De X-stralenbron.

11

Figuur II.6: (a): Spectrum van Brehmsstraling voor verschillende bronspanningen voorgesteld. (b): Spectrum van de X-stralenbron. Dit bestaat zowel uit Brehmsstraling als uit een aantal pieken van karakteristieke X-stralen. 12 Figuur II.7: Twee mogelijke opstellingen van een micro-CT-scanner om schaduwbeelden uit verschillende oriëntaties te bekomen. (a): het object roteert, detector en bron zijn immobiel. (b): de bron en de detector draaien rond het vaste object. 13 Figuur II.8: “Back projection” van een punt: verkleinen van de rotatiehoek zorgt voor een betere zichtbaarheid van details in de virtuele dwarse doorsneden (a: 4 projecties, b: 8 projecties, c: 40 projecties). 13 Figuur II.9: Principe van detectie bij micro-CT. De X-fotonen worden omgezet tot fotonen van het zichtbare licht, die via een glasvezelplaat worden doorgegeven naar de CCD-camera. Er wordt een “floating point matrix” opgesteld die naar de computer wordt gestuurd. 14 Figuur II.10: Omvormen van een tweedimensionale pixel naar een driedimensionale voxel.

14

Figuur II.11: Principe van een “fan beam” reconstructie algoritme om de ideale situatie met parallelle bundels na te bootsen. 15 Figuur II.12: (a): Voorstelling van de analyse volgens de cilindermethode van de metafyse van het femur. (b): Dwarsdoorsnede waarop de fusie van het kraakbeen ter hoogte van de groeischijf in het femur te zien is. 16 Figuur II.13: Analyse van de metafyse met behulp van de cilindermethode in CT-Analyser. De drempel staat ingesteld op grijswaarde 80. 17

iv

Figuur II.14: (a): Drie verschillende doorsneden doorheen het femur ter hoogte van de knie. Linksboven de longitudinale doorsnede, linksonder de dwarsdoorsnede en rechtsonder de sagittale doorsnede. (b): Analyse van het secundaire ossificatiecentrum met behulp van longitudinale doorsneden in CTAnalyser. De epifyse is geselecteerd en de drempel ingesteld op grijswaarde 80. 18

Figuur III.1: Histogrammen van de analyse in de epifyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep.

23

Figuur III.2: Histogrammen van de analyse in de metafyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Vovx. 24 Figuur III.3: Verloop van trabeculair aantal (a) en dikte (b) i.f.v. de afstand tot het referentievlak.

24

Figuur III.4: Groeicurve van de vrouwelijke dieren. Vovx heeft de grootste toename in lengte, ca. 6,5 cm op 3 weken, gevolgd door Ve100, ca. 5,5 cm. 25 Figuur III.5: Histologische coupe van de groeischijven in de tibia. (a): Vp, (b): Ve100, (c): Vovx. De groeischijf bij Vovx is het dikst ten gevolge van de exemestanebehandeling, wat wijst op een toegenomen groei. 25 Figuur III.6: Histologische coupe van de ovaria. (a): Vp, (b): Ve100 (40x). CL: corpus luteum, M: rijpe follikel, C: cyste, pijl: eileiderweefsel. 26 Figuur III.7: Histogrammen van de analyse in de epifyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Me100. 27 Figuur III.8: Histogrammen van de analyse in de metafyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Me100. 27 Figuur III.9: Groeicurve van de mannelijke dieren waaruit blijkt dat de behandelde dieren geen stimulatie van de groei kennen zoals dat bij de vrouwelijke dieren wel het geval is. 28 Figuur III.10: Histologische coupe van de groeischijven in de tibia. (a): Mp, (b): Me100, (c): Me3+3. Er is geen effect van de exemestanebehandeling op de dikte van de groeischijf. 29 Figuur III.11: Histogrammen van de analyse in de epifyse.

30

Figuur III.12: Driedimensionale voorstelling van de groei van de rat (groen: 6 weken, blauw: 7 weken, rood: 8 weken). Een duidelijk maturatieproces is waarneembaar: corticaal bot verdikt, sommige trabekels verdwijnen, overblijvende trabekels worden dikker. 30

v

LIJST MET TABELLEN

Tabel I.1: Enkele doelwitorganen van oestrogenen.

5

Tabel I.2: Enkele risicofactoren voor osteoporose.

5

Tabel I.3: Enkele klinische kenmerken van patiënten met een oestrogeendeficiëntie syndromen. “*” geeft de verschillen tussen de twee syndromen aan. 6 Tabel I.4: Oorzaken van een kleine lengte bij kinderen.

Tabel II.1: Schema van het proefdiermodel.

7

19

Tabel III.1: Resultaten van de “whole bone” analyse (gemiddelde per groep ). “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep. 21 Tabel III.2: Resultaten van de analyse van de vrouwelijke ratten (gemiddelde per groep). “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Vovx. 22 Tabel III.3: Resultaten van de analyse van de mannelijke ratten (gemiddelde per groep). “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Me100. 26 Tabel III.4: Analyse van het trabecular bot in de epifyse gedurende de groei van jonge ratjes.

30

vi

SAMENVATTING Oestrogenen spelen een centrale rol in de regulatie van de normale groei van jongens en meisjes. Dit werd duidelijk na de beschrijving van enkele patiënten met een oestrogeendeficiëntie t.g.v. een mutatie in de genen coderend voor aromatase, het enzym dat verantwoordelijk is voor de productie van oestrogenen uit androgenen. Deze patiënten hebben een grote gestalte te wijten aan de afwezigheid van een groeispurt tijdens de puberteit maar een voortdurende groei tijdens het volwassen leven. Er treedt geen epifyseale fusie op. Het nabootsen van een oestrogeendeficiëntie kan bijgevolg een mogelijke therapie zijn voor kinderen met een klein gestalte. Nochtans zijn oestrogenen belangrijk bij de normale botturnover en behoud van de botmassa. Wanneer de oestrogeensynthese geremd wordt bij een therapie, initieel gebruikt om de groei te stimuleren, zou osteopenie (het beginstadium van osteoporose) een ernstig neveneffect kunnen zijn. Om de invloed op het bot te onderzoeken wordt een proefdiermodel opgesteld bestaande uit jonge ratjes (n=36, beide geslachten) behandeld met de irreversibele aromataseremmer exemestane. De behandeling start op de leeftijd van 26 dagen, voor de seksuele maturatie. De vrouwelijke groep wordt 3 weken behandeld en vergeleken met een groep die een ovarectomie ondergaat (i.e. totale oestrogeendepletie). De mannelijke dieren worden ofwel 6 weken behandeld, ofwel 3 weken + 3 weken placebo. Om osteopenie op te sporen zal het trabeculair bot van de rechterfemuren (t.h.v de knie) van de dieren onderzocht worden m.b.v. hoge resolutie X-stralen microtomografie (micro-CT). Dit is een niet-invasieve techniek waarbij virtuele dwarsdoorsneden doorheen een object gecreëerd kunnen worden. Dankzij kwantitatieve beeldanalyse kunnen een aantal parameters bepaald worden, zoals trabeculair aantal en dikte van de trabekels, volume en calciumdensiteit, waardoor de mate van aantasting van het trabeculair bot t.g.v. een aromatase-inhibitie gekwantificeerd kan worden. Zowel metafysair als epifysair bot wordt bekeken. De groei van de normale rat kan worden onderzocht door enkele jonge ratjes wekelijks op te volgen met micro-CT. Analyse van epifysair trabeculair bot kan veranderingen in parameters - bv. trabeculair aantal en dikte - tijdens de groei ophelderen. Een behandeling met exemestane resulteert bij alle dieren in een daling van het gecalcifieerde weefsel, nl. een verdunning en een verlies aan trabekels, bij de vrouwelijke dieren vergelijkbaar met een totale oestrogeendepletie (ovarectomie). Bij de mannelijke ratten is dit eveneens het geval, hoewel deze drie weken langer behandeld worden. Hier is er een opvallende inhaalbeweging van de groep die maar de helft van de periode met exemestane behandeld is: er worden nieuwe, dunne trabekels gevormd om het totale volume gecalcifieerd weefsel op te bouwen. Uit deze studie blijkt duidelijk dat een oestrogeenremmende therapie om de groei te stimuleren, osteopenie kan veroorzaken. Dit vereist ernstige overwegingen wanneer gedacht wordt aan dergelijke therapie.

vii

ABSTRACT Estrogen plays a major role in the regulation of normal growth in boys and girls. This is confirmed by case reports of patients with estrogen deficiency caused by mutations in the gene encoding for aromatase, an enzyme responsible for the production of estrogen from androgen. Patients have an extremely tall stature resulting from the absence of a pubertal growth spurt, combined with a continuous growth lasting into adulthood. No growth plate fusion occurs. Consequently, if an estrogen deficiency can be induced, it might represent a possible therapy for stimulating growth in children with a small stature. However, estrogen is crucial for normal bone turnover and homeostasis of the bone mass. Therefore, when estrogen synthesis is blocked in a therapy to stimulate growth, osteopenia (i.e. the initial phase of osteoporosis) could be a serious side effect. To examine the influence on bone, an animal model was developed in young rats (n=36, male and female) treated with the irreversible aromatase inhibitor exemestane. Drug administration started at the age of 26 days, before sexual maturation. The female group was treated for 3 weeks and compared to a group with ovariectomy (i.e. total estrogen depletion). One male group was treated for 6 weeks, another group for 3 weeks + 3 weeks placebo. To evaluate the presence of osteopenia, the trabecular architecture of the right knee (femur) of the animals was investigated by high resolution X-ray microtomography (micro-CT). Micro-CT is a non-invasive technique creating virtual slices throughout an object. Quantitative image analysis resulted in bone parameters such as trabecular number and thickness, volume and calcium density. These data can quantify the level of impairement of the trabecular bone by an aromatase block. Both metafyseal and epifyseal cancellous bone were examined. As a reference, normal growth of the rat was examined by a weekly follow-up of young rats by micro-CT. Analysis of the epifyseal cancellous bone can identify transformations - of eg. trabecular thickness and number - during growth. In all animals, treatment with exemestane resulted in a reduction of calcified tissue (osteopenia), namely a thinning and loss of trabeculae, as compared to bones from the group with ovariectomy. A similar observation was made in the male group, treated 3 weeks longer than the females. In the male group, administration of exemestane for half of the period, resulted in a remarkable catch-up: de novo formation of thin trabeculae occured to rebuild the amount of calcified tissue. The present results clearly show that inhibition of oestrogen synthesis, applied as a therapy to stimulate growth, can cause osteopenia. This requires serious consideration when starting a growth enhancing therapy in children.

viii

I. INLEIDING 1. Longitudinale botgroei 1.1 De groeischijf Ter hoogte van de epifyse van lange beenderen, is er een sterk georganiseerde kraakbeenstructuur aanwezig: de groeischijf. Deze is verantwoordelijk voor de longitudinale groei en voor de vorming van trabeculair bot dankzij een gecoördineerd proces van enchondrale ossificatie (Cowin, 2001; Robson et al, 2002). Hierbij zal het kraakbeen mineraliseren tot bot. Longitudinale groei is een gecompliceerd proces dat plaatsvindt in de groeischijf en het resultaat is van chondrocytproliferatie en chondrocytdifferentiatie met productie van extracellulaire matrixproteïnen. In de groeischijf kunnen vijf zones onderscheiden worden (fig. I.1). Aan het epifyseale uiteinde zit een reservezone waarin talrijk rustende chondrocyten aanwezig zijn (i.e. normaal kraakbeen). De daaropvolgende proliferatiezone bevat delende chondrocyten in typische rijtjes georiënteerd. De belangrijkste prikkel die zorgt voor de overgang van rustende naar delende chondrocyten is het groeihormoon of somatotropine. Hierna volgt een overgangszone waarin de delingscapaciteit afneemt en de chondrocyten beginnen te differentiëren. De cellen worden hypertrofisch en er blijven slechts enkele strengen van de kraakbeenmatrix over. Er volgt geprogrammeerde celdood van de gemineraliseerde chondrocyten en de ongeresorbeerde kraakbeensepta vormen een substraat waarop osteoblasten zich kunnen vasthechten. In deze zone van botvorming wordt spongieus bot gevormd (van der Eerden et al, 2003; Junqueira et al, 2004).

Epifyse

Metafyse Diafyse

Figuur I.1: De groeischijf.

1

INLEIDING

Het proces van longitudinale groei bestaat uit verschillende fasen. Tijdens het foetale leven tot circa drie jaar na de geboorte is de groeisnelheid hoog (van der Eerden et al, 2003). Daarna volgt een periode waarin de groeisnelheid progressief vertraagt maar nooit stilvalt (zie curves in bijlage: fig. B.1, 2, 3, 4). Zowel jongens als meisjes groeien ongeveer 5-6 cm per jaar. Tijdens de puberteit bereikt de groeisnelheid zijn piek, de “peak height velocity” (PHV). Jongens zijn 14 jaar als hun PHV 10,3 cm per jaar bedraagt, meisjes bereiken deze al op 12-jarige leeftijd (PHV 9 cm per jaar) (Marshall et al, 1969, 1970; fig. I.2). In de volksmond is dit “de groeispurt”, die circa 15% van de totale lengte van een persoon uitmaakt. Op het einde van de puberteit zal al het kraakbeen in de groeischijf ossificeren en gaan de chondrocyten in apoptose, de zogenaamde sluiting van de groeischijf of epifyseale fusie. Hierna is geen verdere groei meer mogelijk (Juul, 2001; van der Eerden et al, 2003).

Figuur I.2: Serumconcentratie van IGF-I i.f.v. de leeftijd bij de mens, met een piek tijdens de puberteit. Ook de groeisnelheid bereikt dan de hoogste waarde.

Bij de mens wordt een merkwaardig proces gezien, de zogenaamde “catch up” groei. Dit treedt op bij kinderen die ernstig ziek geweest zijn (groeihormoondeficiëntie, syndroom van cushing,…), of een periode van malnutritie of anorexia kenden waardoor ze een groeiretardatie opgelopen hebben. Na deze ziekteperiode beginnen de kinderen te groeien, zelfs sneller dan normaal, waardoor ze toch een normale lengte bereiken. Het mechanisme hiervoor ligt intrinsiek in de groeischijf: de chondrocyten hebben een maximum aantal celdelingen en bij elke celdeling wordt de cel ouder (scenescentie). Als er een groeiretardatie optreedt, wordt chondrocytproliferatie onderdrukt maar eens de ziekteperiode voorbij is, hebben de chondrocyten een groter proliferatiepotentieel waardoor de groeisnelheid hoger is dan ervoor (van der Eerden et al, 2003).

2

INLEIDING

1.2 Regulatie A.

ALGEMEEN Er zijn enorm veel factoren die de groei reguleren. Niet alleen genetische, psychosociale en omgevingsfactoren (zoals voeding) zijn belangrijk, maar vooral de multipele hormonen die op het bot een invloed hebben (Robson et al, 2002). Allereerst is er het groeihormoon (GH) of somatotropine, dat wordt geproduceerd in de hypofyse. Deze productie wordt strikt gereguleerd door groeihormoon “releasing factor” (GHRF) en somatostatine die beide door de hypothalamus worden vrijgesteld (fig. I.3) (Berne et al, 1998). Groeihormoon heeft een rechtstreeks effect op de groeischijf, o.a. door stimulatie van chondrocytproliferatie (Werther et al, 1993). Daarnaast heeft het een indirect effect op de groei door stimulatie van de synthese en secretie van “insulin-like growth factor I” (IGF-I) (Salmon et al, 1957). Ook andere hormonen, zoals schildklierhormoon (thyroxine of T4) en parathyroïdhormoon (PTH), hebben een invloed op de lengtegroei (Ohlsson et al, 1993; Robson et al, 2002; Nilsson et al, 2005).

Figuur I.3: Regulatie van de groeihormoonsecretie hypofysaire as.

volgens de hypothalamus-

Naast hormonen zijn er ook groeifactoren, bijvoorbeeld “bone morphogeneic protein” (BMP) en “transforming growth factor β” (TGF-β), die een belangrijke rol spelen in de regulatie van groei (van der Eerden et al, 2003). Deze factoren kunnen lokaal in een weefsel geproduceerd worden om autocrien, paracrien of zelfs intracrien een effect te hebben. Dit effect kan een differentiatie of vermeerdering van cellen inhouden maar ook inhibitie is een mogelijk gevolg. De synthese van groeifactoren kan gedeeltelijk gereguleerd worden door de eerder genoemde hormonen, maar veel van deze regulatiemechanismen zijn nog onbekend (Nilsson et al, 2005).

3

INLEIDING

B.

OESTROGENEN Eén van de belangrijkste regulatoren van longitudinale groei en het bot zijn oestrogenen. Deze steroïdale hormonen zijn oestradiol en oestron maar ook oestriol behoort tot de oestrogenen hoewel dit een inactieve metaboliet van oestradiol is. Oestrogenen worden gevormd uit androgenen, de mannelijke geslachtshormonen. Androsteendion en testosteron worden door middel van het enzym aromatase (zie verder) omgezet tot oestron en oestradiol resp., dit onder invloed van follikel stimulerend hormoon (FSH) (Simpson et al, 1994; Vanderschueren et al, 1997; Berne et al, 1998). De fysiologie van de hypothalamo-hypofysaire as (HH-as) voor de gonadale hormonen wordt weergegeven in figuur I.4 voor man en vrouw. Bij de vrouw is dit zeer complex, de belangrijkste bron aan oestrogenen is de (pre-ovulatoire) follikel in de ovaria en de serumspiegel varieert gedurende de menstruele cyclus. Er worden veel minder oestrogenen geproduceerd bij de man. De vruchtbaarheid is bij mannen afhankelijk van testosteron, het belangrijkste androgene hormoon.

Figuur I.4: Regulatie van de secretie van de gonadale hormonen volgens de hypothalamo-hypofysaire as.

Aromatase zorgt zowel bij mannen als bij vrouwen voor de vorming van oestrogenen uit androgene precursoren. Dit enzym heeft een P450-cytochoomstructuur en katalyseert de aromatisatie van de A-ring van C19-moleculen zoals testosteron (fig. B.5 in bijlage). Aromatase is het genproduct van de zogenaamde CYP19-genen en komt voor in de mitochondrieën van de meeste cellen: ovaria, placenta, vetweefsel, testis, bot, hersenen enz. (Simpson et al, 1994).

4

INLEIDING

Tabel I.1: Enkele doelwitorganen van oestrogenen. Bot: - Skeletale maturatie - Behoud en herstel van bot Gonadale stelsel Gastro-intestinaal stelsel Centraal zenuwstelsel Vetweefsel en vetmetabolisme Cardiovasculair stelsel

Oestrogenen zijn verantwoordelijk voor effecten in multipele orgaansystemen (tabel I.1) in het lichaam gemedieerd door de intracellullaire oestrogeenreceptor (ER). Deze zal na activatie het expressieprofiel van doelwitgenen in de kern beïnvloeden. De effecten die oestrogenen op het botweefsel hebben zijn belangrijk bij de regulatie van botturnover en botgroei en behoud van “bone mineral density” (BMD) (Grumbach et al, 1999).

Tabel I.2: Enkele risicofactoren voor osteoporose.

Het belang van oestrogenen op het bot blijkt uit het feit dat menopauzale vrouwen met oestrogeendepletie osteoporose ontwikkelen ten gevolge van een verhoogde botturnover en een verlies aan trabeculaire architectuur. Dit resulteert in zeer poreuze beenderen met een verhoogd fractuurrisico (Öz et al, 2000; Cowin, 2001; Goss et al, 2004; McPhee et al, 2006). Toch kunnen ook mannen aangetast worden. Er is een relatie met de zogenaamde andropauze. Oestrogenen en androgenen zijn belangrijke inhibitoren van osteoclasten en deze inhibitie zal in de meno- of andropauze wegvallen. De belangrijkste risicofactoren voor het ontwikkelen van osteoporose zijn weergegeven in tabel I.2 (Cowin, 2001).

Lage piekbotmassa Leeftijd en geslacht Voeding Levensstijl (alcohol, roken, …) Medicatie (glucocorticoïden, …) Immobilisatie

C.

REGULATIE TIJDENS DE PUBERTEIT De puberteit van de mens zet zich in wanneer de concentraties aan gonadale hormonen in het lichaam stijgen: de seksuele maturatie begint. Bij de vrouw zijn oestrogenen hiervoor verantwoordelijk terwijl dit bij de man androgenen zijn (Berne et al, 1998). Tegelijk is een stijging van de oestrogeenconcentratie ook de prikkel om de groeispurt in te zetten, zowel bij meisjes als jongens. De groeisnelheid stijgt omdat oestrogenen de vrijstelling van GH stimuleren (Frantz et al, 1965). Bovendien wordt de ER door chondrocyten in de groeischijf geëxpresseerd waardoor oestrogenen een rechtstreeks effect op de groeischijf kunnen uitoefenen: chondrocytproliferatie en -groei worden gestimuleerd (Vanderschueren et al, 1997; Öz et al, 2001). De sluiting van de groeischijf wordt enkel door oestrogeentussenkomst gemedieerd: naar het einde van de puberteit toe bereikt de oestrogeenconcentratie hoge waarden waardoor de groei zal stoppen. Hoewel androgenen eveneens belangrijk zijn voor de groei en ontwikkeling van botten, hebben deze geen invloed op het sluiten van de groeischijven en dus wordt ook bij jongens de groeistop door oestrogenen uitgelokt (Grumbach et al, 1999; Juul, 2001; Dunkel et al, 2003).

5

INLEIDING

2. Longitudinale botgroei bij pathologieën: oestrogeen-deficiëntie syndromen De effecten die oestrogenen op het bot en de groei hebben, zijn afgeleid uit enkele pathologieën die in de literatuur besproken werden. Er zijn twee typen oestrogeendeficiëntiesyndromen bekend: mutaties ter hoogte van de genen die coderen voor de oestrogeenreceptor (ER) (oestrogeenresistentie) of voor het enzym aromatase (oestrogeendeficiëntie). Er werd in de literatuur slechts één persoon beschreven met een mutatie van de ER-genen (Smith et al, 1994), nl. een man met hoge concentraties oestradiol en FSH/LH (lutineïserend hormoon) in het lichaam ten gevolge van een ontregeling van de HH-as (tabel I.3). Er waren geen vruchtbaarheidsproblemen, daar deze bij de man afhankelijk zijn van androgenen en de androgeenreceptor (AR) wel normaal werkt. Mutaties van CYP19-gen, of aromatasedeficiëntiesyndromen (ADS), werden meerdere malen gerapporteerd (Morishima et al, 1995; Carani et al, 1997) waaronder ook bij een aantal vrouwelijke patiënten die weinig tot geen secundaire geslachtskenmerken vertoonden. De hoge concentratie androgenen die zich in het lichaam heeft opgestapeld en de geringe concentratie oestrogenen, zorgen voor een masculinisatie, amenorhee en onvruchtbaarheid. De mannelijke patiënten die beschreven werden, waren wel vruchtbaar (tabel I.3) (Grumbach et al, 1999). Tabel I.3: Enkele klinische kenmerken van patiënten met een oestrogeendeficiëntie syndromen. “*” geeft de verschillen tussen de twee syndromen aan.

Lengte Seksuele maturatie Serum LH/FSH Plasma testosteron * Plasma oestradiol * Botleeftijd Botdensiteit

ER-mutatie Groot Ja Hoog Normaal Hoog Uitgesproken vertraging Uitgesproken osteoporose

ADS Groot Ja Hoog Hoog Zeer laag Uitgesproken vertraging Uitgesproken osteoporose

Deze mensen hebben een klinisch fenotype dat enorm op elkaar gelijkt: ze hebben geen groeispurt tijdens de puberteit maar blijven wel verder groeien gedurende het volwassen leven en hebben daardoor een grote gestalte. Er treedt geen epifyseale fusie op en ze behouden een botleeftijd vergelijkbaar met deze van een tiener in de puberteit. Deze patiënten hebben ernstige, onverklaarde botpijnen, vooral ter hoogte van de knie (Grumbach et al, 1999; Öz et al, 2000; Dunkel et al, 2003). In dit klinische beeld komt duidelijk naar voren hoe belangrijk oestrogenen zijn voor de regulatie van normale groei. Behandeling met oestrogenen lokt enkel bij ADS een groeispurt uit, gevolgd door een sluiting van de groeischijven. Dit biedt echter geen oplossing voor ER-genmutaties. Bovendien zullen vrouwen met CYP19-genmutaties zich dankzij de therapie seksueel ontwikkelen (Grumbach et al, 1999).

6

INLEIDING

3. Hypothese 3.1 Situering van het onderzoek Pediatrische afdelingen in ziekenhuizen, hebben frequent patiëntjes die problemen hebben met groei. In Nederland zijn dat zo`n 75000 kinderen tussen 0 en 15 jaar. Ze zijn te klein voor hun leeftijd en ouders maken zich zorgen of hun kind wel de normale lengte zal bereiken. Te klein zijn kan psychologische problemen veroorzaken: kinderen worden gepest op school en kunnen later problemen hebben om werk of een partner te vinden. Enkele mogelijke oorzaken voor achterblijvende groei zijn opgesomd in tabel I.4, hoewel bij het overgrote deel van de patiëntjes (95%!) geen specifieke oorzaak kan worden gevonden (idiopatisch klein gestalte, ISS) (Wit et al, 2007). Tabel I.4: Oorzaken van een kleine lengte bij kinderen. Idiopatisch klein gestalte Stoornissen in orgaansystemen - Bindweefsel - Nier - Darm Groeihormoondeficiëntie Psychosociale factoren Endocriene oorzaken - Diabetes mellitus - Cushing syndroom - Hypotyroidie Iatrogene factoren zoals - Systemische glucocorticoiden - Bestralingen Malnutritie

De conventionele behandeling voor deze kinderen is groeihormoon, bestaande uit inspuitingen voor enkele jaren. Dit kan voor kinderen mentaal zwaar zijn. Bovendien werkt deze vorm van behandeling niet bij alle kinderen met ISS (Wit et al, 2007).

De rol van oestrogenen bij de longitudinale groei is enorm belangrijk. Opmerkelijk is dat oestrogeenresistente en oestrogeendeficiënte personen juist heel lang worden. Door nabootsing van deze syndromen in te kleine kinderen zou in theorie hun groei gestimuleerd kunnen worden. Dit is mogelijk met behulp van aromataseremmende medicatie. Aromatase kan geïnhibeerd worden door bijvoorbeeld letrozole of anastrozole (reversibele imidazolverbindingen, kennen toepassingen in therapie bij oestrogeenafhankelijke borstkankers, Johannessen et al, 1997) maar in de huidige studie wordt exemestane gebruikt. Dit is een irreversibele steroïdale remmer met een structuur gelijkend op deze van androsteendion (Goss et al, 2004 b; fig. I.5). Hierdoor bindt het de substraatbindingsplaats van aromatase maar wordt activatie voorkomen.

7

INLEIDING

Figuur I.5: Stuctuur van exemestane.

3.2 Doel van het onderzoek De bedoeling van de huidige studie is om na te gaan of de groei bij kinderen kan gestimuleerd worden door toediening van een therapie die het aromatasedeficiëntiesyndroom (ADS) mimeert. Daartoe wordt een studieopzet op punt gesteld waarbij jonge ratten behandeld worden met exemestane, dat aromatase irreversibel inhibeert. Bijgevolg wordt de oestrogeensynthese geblokkeerd en ADS nagebootst. Het effect van aromataseremming op de groei en eventuele bijwerkingen op verschillende orgaansystemen (nieren, lever, thymus, hersenen, bijnieren, ovaria en uterus of testis) zullen in twee artikels van S. Van Gool1,2 besproken worden. Omwille van de belangrijke functies van oestrogenen met betrekking tot het bot, nl. regulatie van de botturnover en behoud van de botmassa, is het mogelijk dat bij dergelijke, oestrogeeninhiberende therapie osteopenie ontstaat. Dit is het eerste stadium van osteoporose en wordt gekenmerkt door een “verlies” aan gecalcifieerd weefsel. De doelstelling van deze thesis bestaat erin het trabeculaire bot van de rattenfemuren (t.h.v. knie) te onderzoeken met behulp van hoge resolutie X-stralen microtomografie (micro-CT). Een kwantitatieve beeldanalyse, waarbij parameters zoals trabeculair aantal en dikte van de trabekels, volume en calciumdensiteit bepaald worden, zal de mate van osteopenie kwantificeren. De analyses gebeuren zowel in metafyse als in epifyse. De groei van jonge ratten wordt in de literatuur nauwelijks besproken. Met behulp van micro-CT kan deze in kaart worden gebracht. Hiertoe worden enkele jonge dieren van vergelijkbare leeftijd op regelmatige tijdstippen gescand. De vorming van nieuw trabeculair bot wordt driedimensionaal gevisualiseerd en veranderingen van het trabeculair aantal en dikte ten gevolge van de groei worden vastgesteld. Dit opent een perspectief om in de toekomst de effecten van groeibevorderende therapieën - o.a. de inhibitie van de oestrogeensynthese met exemestane - verder te onderzoeken (dit valt echter buiten de opzet van deze eindverhandeling). 1

Van Gool S et al, Aromatase inhibition by exemestane increases axial and appendicular growth in female prepubertal rats, in voorbereiding. 2 Van Gool S et al, The effect of aromatase inhibition by exemestane on growth in male prepubertal rats, in voorbereiding.

8

II. MATERIAAL EN METHODE 1. Algemeen principe Hoge resolutie X-stralen microtomografie of micro-CT is een techniek die op een niet destructieve manier de inwendige details van een specimen zichtbaar kan maken dankzij de creatie van virtuele dwarsdoorsneden. Hiertoe worden X-stralen aangewend. Deze virtuele dwarsdoorsneden worden op basis van schaduwbeelden of X-stralenprojecties geconstrueerd (Hounsfield, 1973; Sasov et al, 1998). De specimens voor microtomografisch onderzoek kunnen allerlei biologische materialen zijn, zoals botweefsel of zachte weefsels, maar de techniek wordt ook gebruikt in het materiaalonderzoek. Bovendien biedt micro-CT de mogelijkheid tot constructie van driedimensionale beelden (fig. II.1) (De Clerck et al, 2003; Rüegsegger et al, 1996; Waarsing et al, 2004). a)

b)

c)

Figuur II.1: Basisprincipes van micro-CT. (a): schaduwbeeld, de basis voor de constructie van virtuele dwarsdoorsneden (b), die gebruikt worden voor de creatie van een 3D-beeld (c).

X-stralen zijn hoogenergetisch waardoor ze materialen en weefsels kunnen binnendringen. Ze behoren tot het elektromagnetische spectrum (fig. II.2) maar hebben een kortere golflengte dan visueel en ultraviolet licht, nl. tussen 0.1 en 10 nm. Bij interactie met materialen zullen X-fotonen, waaruit X-stralen zijn opgebouwd, door atomen in het materiaal geabsorbeerd óf doorgelaten worden. Dit wordt gedefinieerd als de attenuatie van de X-stralen door het specimen. De probabiliteit van absorptie van een X-foton is afhankelijk van de elementaire opbouw van het materiaal, met name het atoomnummer Z is belangrijk, en wordt uitgedrukt als de attenuatiecoefficiënt µ (Wehr et al, 1985).

9

MATERIAAL EN METHODE

Figuur II.2: Het elektromagnetische spectrum.

Bij de interactie van X-stralen met een specimen geldt de wet van Lambert-Beer (Wehr et al, 1985).

I = I0 e-µx Waarbij:

I0 de initiële intensiteit van de (opvallende) X-straal is, I de intensiteit van de X-straal na passage door het object, x de afgelegde weg, µ de attenuatiecoefficiënt van het specimen voorstelt. µ = -ln ρ waarbij ρ de kans op absorptie van een X-foton is (en dus afhankelijk van de atomen die het materiaal bevat en van de attentuatie voor elk van deze atomen).

Figuur II.3: Voorstelling van de wet van Lambert-Beer.

X-stralen zijn de conventionele manier om gecalcifieerd weefsel in beeld te brengen omdat calcium (Ca, Z 20) een atoom is met een hoge elektronendichtheid. Hierdoor is de interactie met X-stralen groter dan met zachte weefsels, die hoofdzakelijk uit waterstof, koolstof, stikstof en zuurstof (H, C, N en O) bestaan. Dit zijn elementen met lage atoomnummers (Z 1, 6, 7 en 8 resp.). Op beelden zal gecalcifieerd weefsel dan ook denser zijn dan zachte weefsels omdat de kans op absorptie van een X-foton stijgt met stijgend atoomnummer (fig. II.4) (Wehr et al, 1985; Postnov et al, 2003). Stel dat 1000 X-fotonen invallen op het te onderzoeken object. Bestaat dit object vooral uit gecalcifieerd weefsel, dan zullen bijvoorbeeld 400 fotonen geabsorbeerd worden en 600 fotonen passeren erdoor. Als het object uit zacht weefsel bestaat zullen er veel minder X-fotonen geabsorbeerd worden. De meeste fotonen gaan door het weefsel en de attenuatie van de X-stralenbundel is dus minimaal. Toch kunnen zachte weefsels met micro-CT onderzocht worden, mede dankzij contraststoffen (Postnov et al, 2005).

10

MATERIAAL EN METHODE

De attenuatie van X-fotonen is ook afhankelijk van de dikte van het materiaal en de energie van de X-fotonen. Hoe hoger deze energie, hoe dieper ze kunnen doordringen in het materiaal maar hoe minder gevoelig aan variaties in materiaaldensiteit en -samenstelling.

Figuur II.4: Vergelijking van de attenuatiecoefficiënten (µ) van calcium en water (waaruit zachte weefsels hoofdzakelijk bestaan). Hoe hoger het atoomnummer van een element, hoe hoger ook de attenuatiecoefficiënt. Calcium heeft een hoger atoomnummer dan water waardoor de kans op absorptie van een X-foton toeneemt.

2. Opstelling 2.1 De X-stralenbron

Figuur II.5: De X-stralenbron.

De X-stralenbron (fig. II.5) is een vacuüm buis waarin een gloeidraad elektrisch wordt verwarmd. Hierdoor worden elektronen vrijgesteld. Door een hoogspanning worden deze vrije elektronen versneld om vervolgens in een punt van 5-10 µm (“focal spot”) op een metalen plaatje te botsen. Dit kan bijvoorbeeld molybdeen (Mo, Z 42) of wolfraam (W, Z 74) zijn. Dit laatste metaal is een hittebestendig materiaal met hoog atoomnummer waardoor bij botsing de versnelde elektronen plots worden vertraagd of zelfs gestopt. Er

11

MATERIAAL EN METHODE

wordt “Brehmsstraling” of remstraling gegenereerd (fig. II.6a). Dit zijn X-stralen met een polychromatisch karakter (Wehr et al, 1985). Enkel als de energie van de vrijgestelde elektronen hoog genoeg is, zullen X-stralen geproduceerd worden volgens een typisch spectrum (fig. II.6b). Deze energie is afhankelijk van de aangelegde bronspanning (bv. 100kV). a)

b)

Figuur II.6: (a): Spectrum van Brehmsstraling voor verschillende bronspanningen voorgesteld. (b): Spectrum van de X-stralenbron. Dit bestaat zowel uit Brehmsstraling als uit een aantal pieken van karakteristieke X-stralen.

De generatie van X-stralen in een bron stelt enorm veel warmte vrij waardoor deze steeds voorzien is van een koelingssysteem op basis van water of lucht. Er bestaan bovendien bronnen die een monochromatische bundel X-stralen kunnen produceren, de zogenaamde synchrotrons. Deze zijn enorm duur (Peyrin et al, 1999).

2.2 Data acquisitie Wanneer de X-stralen op het object vallen, worden ze geattenueerd. De mate van attenuatie is afhankelijk van de energie van de X-fotonen alsook van het atoomnummer en de densiteit van het materiaal waaruit het object is opgebouwd (Postnov et al, 2003; De Clerck et al, 2007). Op basis van dit principe worden schaduwbeelden gemaakt. Er moet voldoende informatie in een schaduwbeeld aanwezig zijn om een virtuele dwarsdoorsnede te kunnen maken. Hiertoe dienen de X-stralen vanuit verschillende oriëntaties op het object in te vallen waarna de gemiddelde attenuatie kan berekend worden. Voor het variëren van de invalshoek bestaan twee mogelijkheden: ofwel roteert het specimen in de scanner (fig. II.7a) ofwel roteren de bron en de detector rond het object (fig. II.7b). Deze laatste manier is de meest gesofisticeerde maar ook de duurste en wordt gebruikt voor in-vivoscanning.

12

MATERIAAL EN METHODE

a)

b)

Figuur II.7: Twee mogelijke opstellingen van een micro-CT-scanner om schaduwbeelden uit verschillende oriëntaties te bekomen. (a): het object roteert, detector en bron zijn immobiel. (b): de bron en de detector draaien rond het vaste object.

Uit figuur II.8 blijkt dat door het verkleinen van de rotatiehoek, waardoor meer verschillende gezichtshoeken verkregen worden, de details van het object veel beter zichtbaar zullen worden. De kwaliteit van de schaduwbeelden is zeker een belangrijke parameter om goede virtuele dwarsdoorsneden te verkrijgen (De Clerck et al, 2007). a)

b)

c)

Figuur II.8: “Back projection” van een punt: verkleinen van de rotatiehoek zorgt voor een betere zichtbaarheid van details in de virtuele dwarse doorsneden (a: 4 projecties, b: 8 projecties, c: 40 projecties).

2.3 Detectie De X-stralen zullen na attenuatie gecapteerd worden door een detectiesysteem bestaande uit een scintillator en “charge coupled device” (CCD) camera (fig. II.9). De scintillator zet X-fotonen om tot fotonen van het zichtbare licht. Via een glasvezelplaat zullen de fotonen aan de CCD-camera worden doorgegeven. Deze camera is opgebouwd uit een siliciumraam (Si) bestaande uit individuele lichtsensitieve cellen, beter bekend als “picture elements” of “pixels”. Voor elk van deze pixels bestaat er een flinterdun glasvezeltje tussen scintillator en detector (fig. II.9). Alle pixels krijgen, onafhankelijk van elkaar en gescheiden in de ruimte, een ongekalibreerde willekeurige waarde toegekend naargelang het aantal bereikte fotonen (De Clerck et al, 2007). Al de pixels vormen zo een “floating point matrix” die als ruwe data in het computergeheugen worden opgeslagen. Detectors bestaan uit een tweedimensionaal veld van pixels, bijvoorbeeld 1024 x 1024 pixels.

13

MATERIAAL EN METHODE

Figuur II.9: Principe van detectie bij micro-CT. De X-fotonen worden omgezet tot fotonen van het zichtbare licht, die via een glasvezelplaat worden doorgegeven naar de CCD-camera. Er wordt een “floating point matrix” opgesteld die naar de computer wordt gestuurd.

Resolutie wordt gedefinieerd als de kleinste afstand tussen twee punten die nog van elkaar te onderscheiden zijn. Bij micro-CT wordt deze bepaald door de grootte van de focale spot van de X-stralenbron (5-10 µm) en door de pixelgrootte van de detector. De typische resolutie bedraagt ca. 10 µm. Bovendien is de resolutie isotroop wat zeker voor driedimensionale analyses belangrijk is (zie verder) (De Clerck et al, 2007).

2.4 Reconstructie Om een virtuele dwarsdoorsnede te creëren wordt een reconstructiealgoritme of “back projection” algortime gebruikt. Deze dwarsdoorsneden zijn beelden bestaande uit grijswaarden. Tijdens de reconstructie zal het reconstructiealgoritme de “floating point matrix” kalibreren tot een nieuwe gecomprimeerde matrix met waarden tussen 0 en 255. Elk van deze waarden staat voor een grijswaarde, waarbij wit 0 is en zwart door de waarde 255 wordt voorgesteld. Op deze manier wordt een visueel beeld gecreëerd (fig. II.1b) (Sasov et al, 1998). Door dit reconstructieproces te herhalen op verschillende hoogten van het object, worden telkens nieuwe dwarsdoorsneden bekomen. Deze kunnen op elkaar geplaatst worden om het volledige object opnieuw te construeren. Op deze wijze zal een pixel omgevormd worden tot een “voxel” of “volume element” (fig. II.10). Typisch voor micro-CT is dat deze voxels als kubussen kunnen beschouwd worden, met gelijke ribben in de 3 dimensies. Hierdoor is de bekomen informatie (en dus ook de resolutie) isotroop (De Clerck et al, 2007).

Figuur II.10: Omvormen van een tweedimensionale pixel naar een driedimensionale voxel.

14

MATERIAAL EN METHODE

De X-stralenbron is een puntbron met een divergerende bundel X-stralen (“fan beam”). Om toch de ideale situatie van parallelle bundels na te bootsen, zal er een bijkomend “fan beam” algoritme tijdens de reconstructie gebruikt worden (fig. II.11). De mathematische benadering van dit algoritme valt buiten het kader van deze eindverhandeling (Feldkamp et al, 1984).

Figuur II.11: Principe van een “fan beam” reconstructie algoritme om de ideale situatie met parallelle bundels na te bootsen.

2.5 Beam hardening effect (BHE) “Beam hardening effect” (BHE) is een nadelig effect dat optreedt ten gevolge van het polychromatisch spectrum van X-stralen dat de bron genereert. Dit houdt in dat de Xstralen verschillende energieën bezitten die telkens een andere penetratiediepte in het specimen hebben. Het object vertoont donkere randen op een beeld waardoor het de indruk geeft dat het materiaal daar denser is hoewel dat meestal niet het geval is. Uiteraard zal BHE de kwantitatieve analyse nadelig beïnvloeden. Dit effect kan gereduceerd worden door het gebruik van filters, bijvoorbeeld aluminium (Al), waardoor de zwakste X-stralen worden weggefilterd, maar de resterende X-straal is nog steeds polychromatisch (De Clerck et al, 2007). Er kan wel mathematisch gecorrigeerd worden met behulp van polynoomfuncties (Postnov et al, 2003).

15

MATERIAAL EN METHODE

3. Beeldanalyse 3.1 CT-Analyser CT-Analyser is een softwareprogramma voor morfometrische analyse van (virtuele) dwarsdoorsneden van specimens, in dit geval trabeculair bot. Kwantitatieve parameters, zoals de trabeculaire dikte en het aantal trabekels, het volume gecalcifieerd weefsel, de connectiviteit enz. kunnen zowel in twee als in drie dimensies bepaald worden. Hiervoor dient een “region of interest” (ROI) in een virtuele doorsnede gedefinieerd te worden, wat overeenstemt met een “volume of interest” (VOI) in drie dimensies. Voor deze analyse is een omzetting naar binaire beelden noodzakelijk, i.e. een drempelwaarde instellen. Hiertoe dient een grijswaarde gekozen te worden waarboven alle hogere waarden (donkerder op beeld) als gecalcifieerd weefsel worden beschouwd, en dus worden geanalyseerd, en alle lagere waarden als zacht weefsel of ruis. Elke analyse die later wordt uitgevoerd en dient vergeleken te worden met de eerste, moet een identieke drempel hebben (fig. II.13 en II.14b).

3.2 Metafysaire analyse Er wordt geopteerd voor een VOI gedefinieerd door een cilinder met vaste dimensies die idealiter bij elke analyse van een femur op dezelfde plaats ligt (fig. II.12a). Hiervoor is een goed reproduceerbaar referentiepunt noodzakelijk, bijvoorbeeld de groeischijf. Er wordt getracht om met voldoende precisie hetzelfde punt in elke femur terug te vinden, nl. de plaats in de groeischijf waar het kraakbeen fuseert (fig. II.12b). De vijftigste snede proximaal in de metafyse van deze plaats in de groeischijf, wordt als referentiesnede aangeduid. Dit is het basisvlak waarop het grondvlak van de cilinder wordt getekend, nl. een cirkel met diameter 163 pixels. De hoogte van de cilinder bedraagt 150 sneden (of 2073 µm).

a)

b)

Figuur II.12: (a): Voorstelling van de analyse volgens de cilindermethode van de metafyse van het femur. (b): Dwarsdoorsnede waarop de fusie van het kraakbeen ter hoogte van de groeischijf in het femur te zien is.

Zowel in twee als in drie dimensies wordt de cilinder geanalyseerd (ter hoogte van de virtuele dwarsdoorsnede of een model van de cilinder respectievelijk). Voor de 16

MATERIAAL EN METHODE

tweedimensionale analyse zal telkens om de tien sneden, vertrekkend van het grondvlak van de cilinder, de trabeculaire dikte en het aantal trabekels bepaald worden. Deze waarden kunnen worden weergegeven in functie van de afstand tot het referentievlak. Bij de driedimensionale analyse wordt een 3D-model gebouwd van de ganse cilinder. De analyse houdt in dat trabeculair aantal en dikte berekend worden evenals een distributie van de trabeculaire dikte en het volume aan gecalcifieerd weefsel (“volume of objects”, VOO) in de cilinder.

Figuur II.13: Analyse van de metafyse met behulp van de cilindermethode in CTAnalyser. De drempel staat ingesteld op grijswaarde 80.

3.3 Epifysaire analyse Bij deze manier van analyseren wordt het secundaire ossificatiecentrum ter hoogte van de knie onderzocht, waarbij eveneens de groeischijf van het femur een vast referentiepunt is. De eerste stap is een omzetting van virtuele dwarsdoorsneden, naar virtuele coronaire of longitudinale doorsneden omgezet omdat dan de epifyse duidelijker zichtbaar is. Om hierbij tijdsbesparend te werken wordt de resolutie tot de helft gereduceerd (fig. II.14a). De “region of interest” wordt manueel aangeduid waarna een driedimensionale analyse zal volgen. Ook hier is de keuze van de drempelwaarde in CT-Analyser belangrijk om de latere analyses te kunnen vergelijken met de eerste (fig. II.14b). Als de analyses van metafyse en epifyse van eenzelfde femur dienen vergeleken te worden, moet de drempel bij beide hetzelfde zijn.

Dankzij de analyses van het trabeculaire bot in het primaire én het secundaire ossificatiecentrum, kan een beeld worden verkregen van de mogelijke veranderingen die het trabeculair bot ondergaat wanneer door een behandeling de oestrogeensynthese wordt geïnhibeerd.

17

MATERIAAL EN METHODE a)

b)

Figuur II.14: (a): Drie verschillende doorsneden doorheen het femur ter hoogte van de knie. Linksboven de longitudinale doorsnede, linksonder de dwarsdoorsnede en rechtsonder de sagittale doorsnede. (b): Analyse van het secundaire ossificatiecentrum met behulp van longitudinale doorsneden in CT-Analyser. De epifyse is geselecteerd en de drempel ingesteld op grijswaarde 80.

De analyses van het trabeculair bot van het femur van de jonge gezonde ratjes worden op dezelfde manier volbracht. De resolutie bedraagt 36 µm na omzetting van de virtuele dwarsdoorsneden tot sagittale doorsneden. De drempelwaarde voor de omzetting tot binaire beelden bedraagt 85.

3.4 “Whole bone” analyse Omdat voorgaande analyses plaatsvinden op slechts een deel van het femur, wordt alsnog een analyse van de totale botten met behulp van een “full bone scan” uitgevoerd. Hierbij zullen parameters zoals het anatomisch volume, “bone volume” (botvolume) en totaal calcium bepaald worden, waaruit eveneens calciumdensiteit kan afgeleid worden. Het “bone volume” brengt enkel het gecalcifieerde weefsel van het bot in rekening, niet de holten in het bot die wel tot het anatomisch volume behoren. Beide parameters worden bepaald met speciaal hiervoor geschreven software. De bepaling van totaal calcium en calciumdensiteit wordt uitgevoerd volgens een methode beschreven in een artikel van A. Postnov3. Bovendien wordt de totale lengte van de femuren gemeten met behulp van een schuifmaat (0,1mm).

3

Postnov A et al (2003) Quantitative analysis of bone mineral content by X-ray microtomography. Physiol Meas 24, 165-178

18

MATERIAAL EN METHODE

4. Studieopzet 4.1 Proefdiermodel 36 mannelijk en vrouwelijke Wistar ratten (Harlan, Horst, Nederland) worden in 6 groepen van 6 dieren ingedeeld en onderworpen aan een behandeling met de aromataseremmer exemestane vanaf 26 dagen4. Op deze leeftijd is de seksuele maturatie van de dieren nog niet gestart. Exemestane wordt één maal per week in een dosis van 100 mg/kg door een intramusculaire injectie in de achterpoot toegediend. De controlegroep ontvangt een placebo-oplossing. Tabel II.1: Schema van het proefdiermodel. Vrouwtjesratten

Mannetjesratten

Placebo (Vp) Exemestane 100 (Ve100) Ovarectomie (Vovx)

Placebo (Mp) Exemestane 100 (Me100) Exemestane 3+3 (Me3+3)

Bij de vrouwelijke dieren is er een groep die bij aanvang van het experiment een ovarectomie ondergaat. Er is echter geen “sham-operated” groep omdat vorige experimenten reeds aangetoond hebben dat er geen verschil was tussen beide groepen (van der Eerden et al, 2004). De vrouwelijke dieren worden na drie weken behandeling gedood. De mannelijke dieren worden volgens twee protocollen behandeld: een groep ondergaat zes weken de behandeling met exemestane 100 mg/kg, een andere groep slechts drie weken met daaropvolgend drie weken toediening van een placebo-oplossing. Na zes weken behandeling worden de mannelijke dieren gedood. Na opoffering zullen eventuele nevenwerkingen van de exemestanebehandeling opgespoord worden aan de hand van histologie van oestrogeenafhankelijke organen zoals lever, nieren, thymus, ovaria, uterus of testis, enz. Bovendien worden ook histologische coupes gemaakt van de groeischijven in de tibia. Deze bepalingen behoren niet tot het kader van deze eindverhandeling (zie inleiding). Voor de in-vivostudie naar de groei bij de rat worden 8 vrouwelijke Wistar ratten van hooguit 28 dagen oud (Charles River Laboratories, Duitsland) aangewend. Per 3 dieren worden ze gehuisvest in kooien met ad libitum water en voedsel en een dagnachtcyclus van 12u. Eén maal per week zullen 5 dieren met behulp van een intaperitoneale injectie met nembutal (dosis 100 µl/100g) geanestheseerd en gescand worden. Tijdens de laatste fase van het experiment zullen ook de 3 controledieren meegenomen worden.

4.2 Scanparameters De rechterfemuren van de ratten worden gescand met behulp van een micro-CT-scanner SkyScan 1072 (Aartselaar, België). Er was geen voorafgaande decalcificatie of andere preparatie van het bot en ze werden bewaard in sterk water (formaline: 37% 4

Dit proefdiermodel werd opgesteld door S. van Gool, onderzoeksgroep pediatrie/endocrinologie van de universiteit van Leiden (LUMC), Nederland.

19

MATERIAAL EN METHODE

formaldehyde). De femuren worden in parafilm gewikkeld (ter voorkoming van uitdroging) en gefixeerd op het statief van de scanner. Dit statief heeft een rotatiestap van 0,9º, tot 180º bereikt wordt en bevindt zich op welbepaalde afstand tussen detector en scanner waardoor de vergroting 19,8x bedraagt (dit is aanpasbaar). De blootstellingstijd bedraagt 5.9s per rotatie-eenheid en er wordt met 4 frames gescand. Dit betekent dat er 4 schaduwbeelden per positie worden gemaakt waarvan een gemiddelde wordt berekend om een betere signaal-ruisverhouding te bekomen. Dit gemiddelde wordt als één schaduwbeeld opgeslagen en gebruikt voor reconstructie. Hoe meer frames bij het scannen, hoe minder ruis op de schaduwbeelden maar hoe langer de scantijd. De X-stralen vertrekken vanuit de bron (80 kV, 100 µA) en zullen na passage door een aluminiumfilter 1mm op het object invallen. De geattenueerde X-stralenbundel valt vervolgens in op een CCD-camera van 1024 x 1024 pixel. De resolutie bedraagt 14 µm. De SkyScan 1076 in-vivoscanner wordt aangewend om de geanestheseerde dieren te scannen. De rechterknieën van de ratten worden gestrekt, ingetapet en vervolgens in een speciale plastic houder gefixeerd om beweging te voorkomen. Enkel de knie zal bestraald worden. Er wordt een titaniumfilter (Ti) gebruikt en met 9 frames gescand (idem bronspanning als hiervoor). De scan duurt ca. 40 min. - waarbij het volledige gewricht gescand wordt - en de resolutie bedraagt 18 µm. Voor de “whole bone” analyse wordt ook gewerkt met Skyscan 1076 scanner (Aartselaar, België). Deze scanner is voorzien van een bron (90 kV, 110 µA) met een “focal spot” van 5 µm en een CCD-camera (4000 x 2300 pixels). De totale rotatiehoek is 180°, 0,84° rotatiestap. De blootstellingstijd bedraagt 4.7s per rotatie-eenheid, 12 frames. Er wordt een resolutie bereikt van 36 µm.

4.3 Statistiek Significante verschillen tussen de groepen worden met behulp van een one-way “analysis of variance” (ANOVA) aangetoond in het statistische programma SPSS 13.0. Deze test wordt uitgevoerd voor de totale lengte van de femuren, de trabeculaire dikte en het trabeculair aantal. De “least significance difference” (LSD) test wordt als post hoc test gebruikt.

20

III. RESULATEN 1. “Whole bone” analyse Tabel III.1: Resultaten van de “whole bone” analyse (gemiddelde per groep). “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep. Groep

Anatomisch volume Va (mm3)

Botvolume Vb (mm3)

Femur lengte (mm)

Ratio Vb/Va

Totaal Calcium1

Calcium Densiteit1

Vp

277,8 ± 8,3

95,5 ± 4,4

26,6 ± 0,35

0,343

1

1

Vovx

279,2 ± 14,5

90,8 ± 5,1

27,0 ± 0,21

0,325

0,85

0,84

Ve100

287,3 ± 7,4

97,1 ± 5,1

27,6 ± 0,35 *

0,337

0,97

0,90

Mp

489,3 ± 35,8

167,1 ± 12,7

33,2 ± 0,35

0,341

2,58

1,25

Me100

454,0 ± 38,0

151,9 ± 11,7

32,9 ± 0,33

0,334

2,29

1,25

Me3+3

476,5 ± 25,2

160,0 ± 9,0

33,6 ± 0,42

0,335

2,36

1,22

1

De oorspronkelijke waarden zijn arbitrair en ongekalibreerd.

1.1 Volume Uit de gegevens van tabel III.1 blijkt dat de mannelijke dieren een groter totaal (anatomisch) botvolume bezitten dan de vrouwelijke dieren. Eveneens vertonen de controledieren het grootste botvolume tegenover de behandelde groepen en zullen bovendien als een referentie beschouwd worden. - Vrouwelijke dieren: enkel bij Vovx is er een klein verlies aan botvolume. Het femur in totaal heeft eveneens geen anatomisch volume verloren, maar heeft zelfs iets bijgewonnen. Er kunnen geen significante verschillen aangetoond worden. - Mannelijke dieren: een verlies aan bot is hier aanwezig bij Me100. De groep die maar de helft van de tijd behandeld was met exemestane (Me3+3) vertoont een aanmaak van bot. Ook voor het anatomische volume van de femuren is dit het geval, waar Me100 het meest volume is kwijtgeraakt en dat van Me3+3 terug tot 98% is genormaliseerd. Hier kunnen geen significante verschillen aangetoond worden. Opmerkelijk is dat de ratio van het botvolume tot het totaal volume relatief constant voor beide geslachten en tussen de groepen onderling.

1.2 Totaal calcium en Calciumdensiteit Analoog aan de vorige bevindingen zijn zowel totaal calcium als calciumdensiteit het hoogst bij de mannelijke dieren tegenover de vrouwelijke. - Vrouwelijke dieren: vooral Vovx verliest aan totaal calcium in vergelijking met Vp. Dit is ook het geval voor de calciumdensiteit.

21

RESULATEN

-

Mannelijke dieren: ook hier heeft Me100 het meest aan totaal calcium verloren. De inhaalbeweging die Me3+3 maakt om het totaal calcium te normaliseren, kon niet volbracht worden binnen de termijn van 3 weken. Bij deze dieren is er een minimale tot geen aantasting van de calciumdensiteit.

Uit deze twee bevindingen kan men concluderen dat de vrouwelijke ratten geen botweefsel verliezen, maar wel trabeculaire densiteit. Bij de mannelijke ratten is dit omgekeerd, er verdwijnt botweefsel hoewel de trabeculaire densiteit hetzelfde blijft. Er is blijkbaar een verschillend gedrag van de trabeculaire ombouw in beide geslachten.

1.3 Lengte Ten gevolge van de behandeling met exemestane hebben de vrouwelijke ratten een langere femur ontwikkeld (tabel III.1). Ook de femuren bij Vovx zijn langer geworden, maar niet significant.

2. Analyse van trabeculair bot: vrouwelijke dieren Tabel III.2: Resulaten van de analyse van de vrouwelijke ratten (gemiddelde per groep). “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Vovx. Groep

“Volume of objects” (mm3)

Trabeculaire dikte (µm)

Trabeculair aantal (1/mm)

Epifyse Vp

25,6 ± 1,4

143,1 ± 1,0

1,78 ± 0,03

Vovx

20,2 ± 1,8 *

139,6 ± 3,2 *

1,42 ± 0,07 *

Ve100

22,4 ± 1,6 *^

139,4 ± 2,3 *

1,56 ± 0,15 *^

Metafyse Vp

2,49 ± 0,37

85,1 ± 3,3

3,55 ± 0,46

Vovx

1,84 ± 0,31 *

78,5 ± 3,1 *

2,85 ± 0,41 *

Ve100

1,85 ± 0,25 *

75,9 ± 2,9 *

2,96 ± 0,31 *

Een exemestanebehandeling veroorzaakt bij vrouwelijke ratten een daling aan gecalcifieerd weefsel in het VOI (i.e. VOO) omdat er trabekels verdwijnen en dunner worden. De waarden voor VOO liggen lager in de metafyse dan in epifyse omdat het VOI nu een cilinder is met een kleiner volume dan dat van de geanalyseerde epifyse. Bovendien zijn in de metafyse véél dunne trabekels tegenover de epifyse.

22

RESULATEN

2.1 Epifyse a)

b)

Figuur III.1: Histogrammen van de analyse in de epifyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep.

Het histogram van figuur III.1a stelt een distributie van het volume voor, ingenomen door trabekels van een bepaalde dikte. Hierdoor geeft dit informatie over de grootte van de trabekels in het VOI. Het totaal volume van de onderzochte epifyse kan bepaald worden door de volumes van elk dikte-interval samen te tellen. Dit varieert echter per dier. De controlegroep vertoont een groter volume aan alle soorten trabekels. De gemiddelden van Vovx liggen het laagst waardoor dit de ergst aangetaste groep is. Tussen Vp en Vovx ligt Ve100. Dit betekent dat een behandeling met exemestane de toestand van ovarectomie wel benadert maar niet volledig kan nabootsen. Histogram III.1b geeft het percentage trabekels aan van een bepaalde dikte die het specimen bevat en toont dus een relatieve distributie van de grootte van de trabekels in één specimen. Hierdoor kan informatie over de structuur van het trabeculaire netwerk bekomen worden. De histogrammen zijn genormaliseerd voor het volume. Uit dit histogram blijkt dat de behandelde groepen méér dunne trabekels hebben dan Vp (significanties vooral voor Ve100 duidelijk), maar minder dikkere trabekels. Tussen Ve100 en Vovx kan geen significant verschil aangetoond worden. Ve100 ondergaat kennelijk een aanpassing vergelijkbaar met Vovx t.g.v. de exemestanebehandeling.

23

RESULATEN

2.2 Metafyse a)

b)

Figuur III.2: Histogrammen van de analyse in de metafyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Vovx.

De controle is weer de groep die het grootste volume inneemt tegenover de behandelde groepen (fig. III.2a). Dit geldt niet voor heel dunne en dikke trabekels. Vovx en Ve100 zijn statistisch nagenoeg hetzelfde en ook de gemiddelden benaderen elkaar beter dan in de analyse van de epifyse. Vergelijkbaar met de analyse in de epifyse, bezitten de behandelde groepen méér dunne trabekels en minder dikke tegenover de controlegroep (fig. III.2b). Ve100 heeft bijvoorbeeld 44% méér trabekels van 3-5 pixels dik en 45% minder trabekels van 7-9 pixels in vergelijking met Vp. a)

b)

Figuur III.3: Verloop van trabeculair aantal (a) en dikte (b) i.f.v. de afstand tot het referentievlak.

Er bestaat een verschil in aantal trabekels tussen Vp en Vovx ver van de groeischijf maar niet dichtbij. Figuur III.3b geeft weer dat Vovx en Ve100 dunne trabekels hebben dicht bij de groeischijf. Dit kan erop wijzen dat nieuwe, maar dunne trabekels gevormd worden als aanpassing bij ovarectomie (fig. III.1 en III.2).

24

RESULATEN

2.3 Bijkomende effecten van de exemestanebehandeling De oestrogeendeficiënte dieren vertonen een toegenomen lengtegroei tegenover de controlegroep (fig. III.4). Vooral Vovx ondergaat een opvallende groeistimulatie al vanaf de eerste week. Ve100 benadert deze groep.

Figuur III.4: Groeicurve van de vrouwelijke dieren. Vovx heeft de grootste toename in lengte, ca. 6,5 cm op 3 weken, gevolgd door Ve100, ca. 5,5 cm. a)

b)

c)

Figuur III.5: Histologische coupe van de groeischijven in de tibia. (a) Vp, (b) Ve100, (c) Vovx. De groeischijf bij Vovx is het dikst ten gevolge van de exemestanebehandeling, wat wijst op een toegenomen groei.

Bij het onderzoek naar de effecten op oestrogeenafhankelijke organen kunnen cysten worden vastgesteld in de ovaria van de exemestanebehandelde dieren (fig. III.6). Lever, nieren, hersenen, thymus, bijnieren, testes en uterus vertoonden geen abnormaliteiten5.

5

Van Gool S et al, Aromatase inhibition by exemestane increases axial and appendicular growth in female prepubertal rats, in voorbereiding.

25

RESULATEN a)

b)

Figuur III.6: Histologische coupe van de ovaria. (a): Vp, (b): Ve100 (40x). CL: corpus luteum, M: rijpe follikel, C: cyste, pijl: eileiderweefsel.

3. Analyse van trabeculair bot: mannelijke dieren Tabel III.3: Resulaten van de analyse van de mannelijke ratten (gemiddelde per groep). “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Me100. Groep

“Volume of objects” (mm3)

Trabeculaire dikte (µm)

Trabeculair aantal (1/mm)

Epifyse Mp

48,4 ± 4,8

189,1 ± 9,1

1,62 ± 0,26

Me100

41,0 ± 3,5 *

178,3 ± 4,0 *

1,55 ± 0,30

Me3+3

43,9 ± 2,3

182,1 ± 5,0

1,66 ± 0,21

Metafyse Mp

1,83 ± 0,21

84,9 ± 3,1

2,62 ± 0,24

Me100

1,42 ± 0,19 *

81,9 ± 2,9

2,10 ± 0,21 *

Me3+3

1,75 ± 0,26 ^

80,6 ± 3,0 *

2,63 ± 0,32

Ook bij de mannelijke ratten is er een daling van VOO, in de epifyse enkel ten gevolge van het dunner worden van de trabekels en niet omdat er een verlies aan trabekels optreedt. In de metafyse is de daling van het VOO te wijten aan een verlies van trabekels. Hier is er een significant verschil tussen Me100 en Me3+3 voor VOO omdat Me3+3 dit tijdens de drie weken placebobehandeling tracht te normaliseren: er worden nieuwe trabekels gevormd maar deze zijn nog niet dik genoeg.

26

RESULATEN

3.1 Epifyse a)

b)

Figuur III.7: Histogrammen van de analyse in de epifyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Me100.

Deze grafieken volgen meer een normale verdeling dan deze van de vrouwelijke dieren (fig. III.1). Hierdoor heeft het trabeculair bot van de mannelijke dieren meer volume dat ingenomen wordt door de dikke, zwaardere trabekels. Me100 is het langst met exemestane behandeld en heeft ook het kleinste gemiddelde (fig. III.7a). Me3+3 is behandeld met exemestane voor een halve periode en tracht Mp in te halen. Opmerkelijk is dat er eveneens geen verschil kan worden aangetoond tussen Me100 en Me3+3. Dit wijst op de inhaalbeweging van Me3+3, die niet binnen de termijn van 3 weken kon worden voltooid. De controlegroep heeft minder dunne trabekels in vergelijking met de behandelde groepen maar wel méér dikke (fig. III.7b). De balken van Me100 en Me3+3 schuiven op: de trabekels met dikte 3-5 pixel worden nu trabekels met een dikte van 5-7 pixel. Ook hier is de inhaalbeweging van Me3+3 naar Mp te zien.

3.2 Metafyse a)

b)

Figuur III.8: Histogrammen van de analyse in de metafyse. “*” p < 0,05 t.o.v. controlegroep, “^” p < 0,05 t.o.v. Me100.

27

RESULATEN

Me100 heeft het kleinste volume ingenomen door trabekels tegenover Mp (fig. III.8a). Me3+3 daarentegen tracht volume op te bouwen om Mp in te halen, door veel dunne trabekels te vormen, waardoor deze balk stijgt boven deze van Mp. Net zoals bij de vrouwelijke dieren zijn er méér dunne trabekels bij de behandelde groepen dan bij de controlegroep (fig. III.8b). Me100 heeft 16% méér trabekels van 3-5 pixels dik dan Mp en Me3+3 19%. Het omgekeerde geldt voor dikkere trabekels (7-9 pixels), waarvan Me100 14% minder heeft en Me3+3 21%. Deze behoren nu tot de dunnere trabekels. Blijkbaar zijn de trabekels bij Me3+3 tijdens de drie weken placebobehandeling niet dikker geworden. De grafieken van trabeculair aantal en dikte i.f.v. de afstand tot de groeischijf, geven bij de mannelijke ratten weinig relevante informatie en zijn in de bijlage gerapporteerd (fig. B.6).

3.3 Bijkomende effecten van de exemestanebehandeling De mannelijke dieren vertonen in tegenstelling tot de vrouwelijke, geen duidelijke toename van de groei (fig. III.9). Onderzoek van de lever, nieren, hersenen, thymus, bijnieren en testis wijst geen abnormaliteiten aan ten gevolge van een oestrogeendepletie6.

Figuur III.9: Groeicurve van de mannelijke dieren waaruit blijkt dat de behandelde dieren geen stimulatie van de groei kennen zoals dat bij de vrouwelijke dieren wel het geval is.

6

Van Gool et al, The effect of aromatase inhibition by exemestane on growth in male prepubertal rats, in voorbereiding.

28

RESULATEN a)

b)

c)

Figuur III.10: Histologische coupe van de groeischijven in de tibia. (a): Mp, (b): Me100, (c): Me3+3. Er is geen effect van de exemestanebehandeling op de dikte van de groeischijf.

4. Conclusie van de in-vitrostudie Algemeen kan geconcludeerd worden dat er een aantasting is van de trabekels met een dikte van 5 tot 11 pixels ten gevolge van een behandeling met exemestane maar dat dikke trabekels (> 11 pixels) hieraan ongevoelig zijn. Dit uit zich in duidelijke verschillen voor het trabeculair volume tussen de controlegroepen en de behandelde, waarbij deze laatste groepen méér dunne maar minder dikke trabekels hebben. De algemene structuur van het trabeculaire netwerk zal niet zozeer lijden onder een exemestanebehandeling. Er is bij beide geslachten een daling in VOO. Bij de vrouwelijke ratten is dit te wijten aan een reductie van zowel de dikte als het aantal trabekels ten gevolge van een exemestanebehandeling. Bij de mannelijke dieren is in de epifyse een daling van de trabeculaire dikte hiervoor verantwoordelijk. In de metafyse is er wel een aantasting van het trabeculair aantal. Beide mechanismen staan in voor een daling van het VOO bij de behandelde groepen. De trabeculaire ombouw die ontstaat als reactie op een oestrogeeninhibitie, is dus verschillend bij beide geslachten zoals ook blijkt uit de “whole bone” analyse.

29

RESULATEN

5. Longitudinale opvolging van trabeculair bot tijdens groei in jonge ratten Tabel III.4: Analyse van het trabeculair bot in de epifyse gedurende de groei van jonge ratjes. Leeftijd (weken)

Gewicht (g)

“Volume of objects” (mm3)

Trabeculaire dikte (µm)

Trabeculair aantal (1/mm)

5

98

15,4

138,7

1,19

6

130

24,8

155,5

1,62

7

153

30,2

173,3

1,56

8

180

33,8

181,0

1,58

8 (Controle)

183

28,8

165,1

1,46

a)

b)

Figuur III.11: Histogrammen van de analyse in de epifyse.

De resultaten die hier worden weergegeven zijn afkomstig van 1 testdier en 1 controledier, wat een statistische analyse onmogelijk maakt. Uit tabel III.4 blijkt dat er nieuwe trabekels gevormd worden tot ongeveer week 6. Daarna stijgt het trabeculair aantal niet meer en worden de trabekels dikker. Dit wordt bevestigd door de grafieken (fig. III.11): de dieren hebben méér dunne trabekels als ze jong zijn en deze worden dikker bij het ouder worden want de balken schuiven op naar een dikkere categorie.

Figuur III.12: Driedimensionale voorstelling van de groei van de rat (groen: 6 weken, blauw: 7 weken, rood: 8 weken). Een duidelijk maturatieproces is waarneembaar: corticaal bot verdikt, sommige trabekels verdwijnen, overblijvende trabekels worden dikker.

30

IV. DISCUSSIE 1. Evaluatie van de gebruikte techniek 1.1 Data acquisitie Hoge resolutie microtomografie of micro-CT is een geschikte techniek om een beeld te krijgen van trabeculaire botremodelling bij bepaalde pathologieën. Het is een nietinvasieve techniek waarbij driedimensionale beelden en analyses kunnen uitgevoerd worden. Deze techniek wordt dan ook frequent gebruikt in onderzoek naar osteoporose, leeftijdgerelateerd botverlies, enzovoort. Er zijn ook enkele nadelen aan deze techniek verbonden, nl. de radiatiedosis en de scantijden. Een hoge resolutie vraagt lange scantijden - om voldoende data te kunnen collecteren - waardoor de stralingsdosis die het specimen ontvangt oploopt. Er werden tot op heden geen zichtbare gezondheidsproblemen bij in-vivoanalyses opgemerkt (De Clerck et al, 2003; Waarsing et al, 2004, 2006). Er bestaan een aantal grote verschillen tussen de twee types scanners waarmee in het kader van deze eindverhandeling wordt gewerkt. Allereerst is de opstelling tegenovergesteld, bij de in-vivoscanner (SkyScan 1076) is het object immobiel, bij de invitroscanner (SkyScan 1072) zijn dit de detector en de camera maar roteert het object (zie fig. II.7). Bovendien is de energie van de bron in de in-vivoscanner hoger. Het laatste verschilpunt is dat de in-vivoscanner de mogelijkheid heeft om de afstand tussen object en detector aan te passen, waardoor de vergroting verandert. Bij de in-vivoscanner is deze afstand een vaste waarde waardoor de resolutie 9 µm is. Deze kan wel veranderen, bv. 18 µm als de pixels per 4 worden samengenomen (“binning”). Bovendien is de resolutie bij micro-CT dezelfde in de drie dimensies, wat men als isotroop definieert. A.

IN VITRO De femuren van de ratten worden zonder voorafgaande preparatie of kleuring gescand, ook dit is een van de voordelen van micro-CT (Sasov et al, 1998). Om beam hardening zo veel mogelijk te voorkomen, werd gebruik gemaakt van een aluminium filter (1 mm). De bereikte resolutie bedraagt 14 µm, wat een vergelijkbare waarde is met eerdere studies waarin trabeculair bot onderzocht werd (Laib et al, 2001; Yang et al, 2003; Waarsing et al, 2006). De scantijd bedraagt circa 2u, een aanvaardbare tijd voor in-vitroscanning. B.

IN VIVO Bij in-vivostudies wordt sterk rekening gehouden met de scantijden om de ontvangen stralingsdosis zo laag mogelijk te houden. De geselecteerde scanparameters maken dat de totale scantijd circa 40 min. bedraagt. Dit is relatief lang voor levende dieren. Om het zo veilig mogelijk te maken voor het dier, wordt de knie volledig gestrekt waardoor die zich verder van het lichaam bevindt en minder door zacht weefsel is omringd. Enkel de knie zal met X-stralen worden bestraald en niet het volledige lichaam.

31

DISCUSSIE

Het grote probleem dat zich stelt wanneer levende, weliswaar geanestheseerde, dieren gescand worden, is beweging (ademhaling, hartslag, darmmotiliteit,...). Als er beweging optreedt tijdens de scan, zal het beeld veel onscherper zijn, wat de analyse nadelig beïnvloedt. In het huidige onderzoek zal de impact van mogelijke bewegingen minimaal zijn omdat de poot goed kan geïmmobiliseerd worden m.b.v. de speciale houder en een klemmetje dat over het verband om de poot wordt geklemd. Bovendien zal door de spanning uitgeoefend op de poot de gewrichtsholte groter worden. Dit varieert per dier waardoor dit geen reproduceerbare parameter is. De dimensies van de groeischijf zijn wél een goede maat voor de groei op dat moment maar vragen gespecialiseerde metingen. Voor zover in de literatuur na te trekken valt is de onderzoeksgroep van Waarsing de enige die ook in-vivoscanning uitvoert (2004, 2006). Ook hier wordt de SkyScan 1076 gebruikt om de tibia van ratten te scannen met 20 µm resolutie.

1.2 Reconstructie: Beam hardening effect (BHE) Beam hardening effect treedt op omdat de X-stralenbron een polychromatisch spectrum genereert. De stralen hebben verschillende energieën en zullen daardoor ook een verschillende penetratiediepte in het object vertonen. Dit betekent dat als de stralen zwakker zijn (lagere energie) er méér stralen geabsorbeerd worden dan wanneer de stralen een hogere energie hebben. Er wordt een aluminiumfilter gebruikt om het spectrum van de bron te vernauwen zodat de zwakke X-stralen weggefilterd worden. Hierdoor zal BHE verminderd zijn maar is het nog niet gecorrigeerd. Dit wordt gerealiseerd door een polynoomfunctie tijdens de reconstructie van de schaduwbeelden.

1.3 Analysemethode: keuze van “region of interest” (ROI) Hoewel analyses van de metafyse op basis van de cilinder frequent in de literatuur worden gebruikt (Alexander et al, 2001; Liab et al, 2001; Yang et al, 2003), bestaan er ernstige twijfels over de goede reproduceerbaarheid ervan. Uit eigen onderzoek blijkt dat de keuze van een referentiesnede moeilijk te standaardiseren is maar het is een absolute noodzaak steeds hetzelfde deel van het trabeculaire netwerk te analyseren. Als de “region of interest” (ROI) telkens verschillend is, zullen vergelijkingen tussen dieren onmogelijk zijn. Daarom rees het idee om het secundaire ossificatiecentrum of de epifyse nader te bekijken (Waarsing et al, 2004; Waarsing et al, 2006). De epifyse is het duidelijkst zichtbaar op coronale (longitudinale) doorsneden. De virtuele dwarsdoorsneden dienen dus omgezet te worden maar omdat de dataset van de epifyse zeer groot is, wordt de resolutie tot de helft gereduceerd, nl. van 14 µm naar 28 µm. Dit is voor de analyse in de epifyse geen probleem, daar de trabekels in deze regio dikker zijn dan in de metafyse. De trabekels zijn ± 180 µm dik (voor mannelijke dieren) waardoor een resolutie van 28 µm nog steeds hoog genoeg is voor nauwkeurige analyses. Bij de analyse van de epifyse wordt de ROI manueel aangeduid, waardoor het “volume of interst” (VOI) ietwat varieert. Om de reproduceerbaarheid te testen werd de manuele selectie van de ROI voor één analyse uitgevoerd door twee onafhankelijke personen. Het resultaat was nagenoeg hetzelfde. Dit in tegenstelling tot de analyse in de metafyse, die

32

DISCUSSIE

verschillende resultaten opleverde maar waar de dimensies van de VOI vastliggen, nl. deze van de cilinder. Het voordeel van de analyse in de epifyse zoals hier uitgevoerd, is dat deze zeer reproduceerbaar is en onafhankelijk van de observeerder. De analyse van de metafyse is subjectiever omdat er eerst een referentiesnede moet gekozen worden ter hoogte van de groeischijf. Nochtans wordt de metafyse zo goed als altijd geanalyseerd, omdat deze plaats de meeste dynamiek heeft. Het trabeculaire netwerk wordt hier opgebouwd en mogelijke effecten van behandelingen komen hier het snelst tot uiting. Om vergelijkingen mogelijk te maken tussen eerder beschreven studies en de huidige studie is ervoor gekozen om naast de epifyse ook de metafyse te analyseren. Vervolgens is de omzetting van een beeld uit grijswaarden naar een binair beeld een belangrijke stap omdat een drempel dient ingesteld te worden. Deze drempel bepaalt of een pixel als gecalcifieerd weefsel of als zacht weefsel wordt beschouwd. Enkel het gecalcifieerd weefsel moet worden geselecteerd (zie fig. II.13 en II.14b). De keuze van de drempelwaarde is belangrijk om een goede signaal-ruisverhouding te bekomen: als de drempel te laag ingesteld is, wordt te veel ongecalcifieerd weefsel als gecalcifieerd beschouwd en wordt te veel ruis meegenomen in de analyse. Als de drempel te hoog is, verliest men gecalcifieerd weefsel. Bovendien moet voor alle analyses die later met elkaar vergeleken worden, de drempel dezelfde zijn.

2. Vergelijking epifyseale en metafyseale analyse De metafyse, of het primair ossificatiecentrum, bevat trabeculair bot dat vanaf de groeischijf naar de diafyse toe groeit. De grafieken van de tweedimensionale analyse in de metafyse (fig III.3 en B.6), waarin de afstand van de groeischijf wordt weergegeven, kunnen dus ook geïnterpreteerd worden als een tijdsverloop. Trabekels ver van de groeischijf zijn oude trabekels. Ten gevolge van een exemestanetherapie zal het trabeculair bot, dat dan gevormd wordt, aangetast zijn. In de literatuur kunnen geen artikels worden teruggevonden die bespreken hoe snel het trabeculair bot van de metafyse vanuit de groeischijf groeit. De epifyse, of het secundair ossificatiecentrum, bestaat uit dikkere trabekels dan de metafyse, waar bijna dubbel zo veel dunnere trabekels aanwezig zijn. Het is niet verwonderlijk dat in de epifyse de effecten van een behandeling trager tot uiting komen dan in de metafyse. De effecten van de behandeling met exemestane op het trabeculaire bot van de metafyse en epifyse zijn vergelijkbaar. Het trabeculaire netwerk van de behandelde ratten vertoont een osteoporotisch karakter: er is een verlies aan gecalcifieerd weefsel omdat trabekels dunner worden en soms zelfs verdwijnen, vooral in de metafyse. Omdat de trabekels in de epifyse dikker zijn, is de daling in trabeculaire dikte minder uitgesproken dan in de metafyse. Baldock et al (1998) kon geen daling van het trabeculair aantal in de epifyse terugvinden vergelijkbaar met de metafyse na ovarectomie bij zes maanden oude ratten. Hij stelde

33

DISCUSSIE

verschillende oorzaken voor, zoals structurele verschillen tussen de regio`s, verschillen in mechanische belasting, basisniveau van botturnover, enz. Ondertussen hebben een aantal onderzoekers, o.a. Waarsing et al (2004, 2006), toch aanpassingen opgemerkt van het trabeculair bot in de epifyse. Men weet nog steeds niet hoe het komt dat cellen van het bot (osteoblasten, osteoclasten,...) zich verschillend gedragen in bepaalde regio`s onder dezelfde omstandigheden, in dit geval een oestrogeendepletie (Waarsing et al, 2004). Het is belangrijk te vermelden dat de meeste onderzoeken van het trabeculaire bot verricht worden op volwassen dieren, o.a. deze van Baldock et al (1998); Laib et al (2001); Goss et al (2004, a en b); Waarsing et al (2004, 2006);... De dieren die in de huidige studie gebruikt worden, zijn amper een maand oud. Het is mogelijk dat de effecten daardoor scherper aftekenen omdat de botturnover in groeiende dieren sneller is dan in volwassen, trager groeiende ratten.

3. Relevantie t.o.v. algemeen botonderzoek Het behandelingsmodel is een nieuw, nooit eerder onderzocht, protocol om de groei te stimuleren in jonge ratten. Het model met ovarectomie daarentegen kent veel toepassingen omdat dit representatief is voor menopauzale osteoporose (Kalu et al, 1991; Wronski et al, 1991) of oestrogeendepletie bij de mens. Aangezien micro-CT frequent wordt gebruikt in onderzoek van trabeculair botweefsel, zijn de analyses uitgevoerd in het huidige onderzoek niet uniek. Nochtans waren voorgaande analyses niet zo uitgebreid: meestal worden parameters zoals trabeculaire dikte, aantal en ruimte tussen de trabekels, dikte van het corticale bot,... bepaald. Het vernieuwende aspect van de huidige analyse ligt erin dat op basis van trabeculaire diktedistributies kan nagegaan worden hoe het trabeculaire netwerk is aangetast. De resultaten bekomen met micro-CT kunnen met histologie gevalideerd worden. Deze techniek is echter destructief waardoor geen verdere testen meer kunnen uitgevoerd worden op het bot, bijvoorbeeld om de mechanische eigenschappen ervan te bepalen (Goss et al, 2004, a en b). Ook dient het weefsel gedecalcifieerd te worden. Histologie, of histomorfometrie, is een veel gebruikte tweedimensionale beeldvormingsmethode (Baldock et al, 1998; Öz et al, 2000; Alexander et al, 2001; Goss et al, 2004, a en b) waarbij de resolutie niet isotroop is. Architecturale parameters (driedimensionale analyses) kunnen maar moeilijk bepaald worden omdat dit digitalisatie van de beelden vraagt. Bijgevolg is dit zeer arbeidsintensief. Het netwerk van trabekels kan wél probleemloos met micro-CT geanalyseerd worden. Het verloop van trabekels en veranderingen kunnen goed bestudeerd worden. Een andere niet invasieve techniek die nogal gebruikt wordt in het botonderzoek is “dual energy X-ray absorptiometry” of DEXA (Vanderschueren en al, 1997; Goss et al, 2004, a en b). Vooral “bone mineral density” (BMD) wordt hiermee bepaald, zonder visualisatie van de botstructuren. Een in-vivostudie naar de groei bij jonge ratjes is in de literatuur nog niet aangehaald. Het experiment dat werd uitgevoerd kan als een pilootstudie worden beschouwd waarop verder onderzoek gebaseerd kan worden.

34

DISCUSSIE

4. Evaluatie van het proefdiermodel De rat met ovarectomie is het conventionele model voor menopauzale osteoporose bij de mens (Kalu et al, 1991; Wronski et al, 1991). De veranderingen in het bot ten gevolge van een oestrogeendepletie zijn zeer vergelijkbaar met deze van de mens. Ook in de huidige studie wordt voor een rat gekozen. Hoewel bij ratten de groeischijven nooit sluiten, en ze dus gedurende het ganse leven blijven groeien, is de expressie van oestrogeenreceptoren én van aromatase in de groeischijf zeer vergelijkbaar met de mens (Öz et al, 2000, 2001). De effecten van de gonadale steroïden op de groei bij ratten zijn dus nauw verwant aan die bij de mens. In theorie zal een inhibitie van de oestrogeensysthese door exemestane, zoals in de huidige studie, effecten uitlokken die bij de mens ook gezien worden in geval van oestrogeendepletie. Het botverlies bij de rat met ovarectomie kan verschillen tussen rassen, waardoor vergelijkingen tussen studies soms moeilijk zijn. Bij muizen zijn deze verschillen nog meer uitgesproken en kennen daarom weinig toepassingen. Bovendien zijn de trabekels bij muizen veel kleiner dan bij ratten wat een accurate analyse bemoeilijkt. Wel kunnen muizen gebruikt worden om genen op te sporen die betrokken zouden zijn bij osteoporose (Alexander et al, 2001). Aromatase is een enzym dat wijd verspreid is in het lichaam, zo ook in osteoblasten en osteoclasten in de groeischijf (Öz et al, 2000, 2001). Dat betekent dat oestrogenen lokaal in het bot gevormd kunnen worden en dus een paracrien, autocrien, maar - waarschijnlijk nog belangrijker - intracrien effect hebben op behoud van botmassa en normale botgroei. Exemestane is een selectieve aromatase-inhibitor. Dit werd aangetoond door Johannessen et al (1997) die geen daling ontdekte van cortisol, 17-hydroxyprogesteron, androsteendion, testosteron en andere steroïden. Dit betekent dat exemestane de enzymen die instaan voor de adrenale steroïd synthese niet beïnvloedt, waardoor ook geen neveneffecten verwacht worden met betrekking tot deze eindproducten. De in deze studie toegediende dosis is de hoogst mogelijke waarbij naar een volledige inhibitie van de oestrogeensynthese wordt gestreefd. De behandeling van de dieren start voor de aanvang van de seksuele maturatie, nl. als ze 26 dagen oud zijn. Bijgevolg heeft er nog geen blootstelling aan hoge oestrogeenspiegels plaatsgevonden want de oestrogeenconcentratie vóór de seksuele maturatie is laag. Bij de vrouwelijke ratten ondergaat één groep bij aanvang van het experiment een ovarectomie zodanig dat er géén oestrogenen meer aangemaakt worden met als gevolg een totale oestrogeendepletie. Deze groep fungeert als controlegroep voor de behandeling. Idealiter zou ten gevolge van een behandeling met exemestane eenzelfde effect verwacht worden, want dat zou betekenen dat de inhibitie van aromatase volledig is. Wanneer aromatase in de ratten geïnhibeerd wordt, kunnen er geen oestrogenen vanuit androgenen gevormd worden. De androgeenconcentratie zal verhoogd zijn en de oestrogeenconcentratie is lager dan normaal of zelfs helemaal afwezig. Bevestiging hiervan kan niet bekomen worden door plasmabepalingen omdat de metabolieten van exemestane, oa. 17-hydroexemestane (17-H-exemestane), interfereren met oestradiol en testosteron in de beschikbare assays. Bovendien heeft 17-H-exemestane een intrisieke androgene activiteit vanwege een structureel verwantschap met androsteendion (Goss et

35

DISCUSSIE

al, 2004, b; Johannessen et al, 2004). Ook androgenen stimuleren de groei omdat de aanwezigheid van de androgeenreceptor (AR) werd aangetoond in de groeischijf (Abu et al, 1997). Men stelt echter dat de groeistimulerende effecten van androgenen pas na omzetting tot oestrogenen tot uiting komen omdat ook aromatase in de groeischijf aanwezig is (Nilsson et al, 2005). Androgenen worden wel verantwoordelijk gesteld voor skeletale verschillen tussen de geslachten vanwege hun invloed op o.a. de verdikking van het corticale bot omdat de AR reeds werd aangetoond in humane botcellen (Colvard et al, 1989).

5. Evaluatie van de resultaten 5.1 Vrouwelijke dieren In theorie zal een exemestanebehandeling zorgen voor toename van de lengtegroei van deze ratten. Er wordt gestreefd naar volledige inhibitie van de oestrogeensynthese, maar aangezien deze dieren hogere oestrogeenconcentraties hebben vergeleken met de mannelijke dieren, is inhibitie door exemestane mogelijk onvolledig, waardoor nog steeds een efficiënte hoeveelheid oestrogenen zou kunnen overblijven om de groei in te zetten. Tengevolge van een ovarectomie ontwikkelen de dieren een totale oestrogeendepletie en deze groep vertoont de sterkste toename in lengte. De oestrogeenspiegel wordt laag gehouden waardoor er geen piek is die de groeistop inzet. Ook Waarsing et al rapporteerden in 2004 een longitudinale groei van een tien maanden oude rat met ovarectomie, waarbij een daling van de oestrogeenconcentratie de oorzaak was! De groeischijven bij de normale rat (niet behandeld met exemestane) sluiten nooit, maar tijdens het volwassen leven is de groeisnelheid tot een minimum gereduceerd. De groep met ovarectomie is de meest aangetaste groep. Ze verliezen het meest gecalcifieerd weefsel ten gevolge van een verdunning van de trabekels en er worden meer trabekels geresorbeerd in vergelijking met de placebobehandelde controlegroep. De femuren van deze groep kennen geen reductie van het anatomisch volume, maar wel van de hoeveelheid bot binnen dit volume. Vovx heeft ook de laagste calciumdensiteit. Men spreekt van osteopenie. Dit is het eerste stadium van osteoporose en wordt algemeen gedefinieerd als een vermindering van de hoeveelheid botweefsel. Bij osteoporose is de trabeculaire architectuur ernstig aangetast waardoor een verhoogd fractuurrisico ontstaat. Een duidelijk onderscheid tussen osteopenie en osteoporose is zeer moeilijk te maken. Er bestaan geen numerieke grenzen die bepalen wanneer osteopenie osteoporose wordt. Ve100, in theorie hetzelfde als de groep met ovarectomie, ondergaat dezelfde aanpassingen maar minder uitgesproken. De behandeling met exemestane bij Ve100 mimeert de toestand van ovarectomie: ook hier treedt een verlies aan gecalcifieerd weefsel op met osteoporotische karakteristieken, enkel niet zo uitgesproken als Vovx. Dit wijst op een onvolledige inhibitie van aromatase bij vrouwelijke dieren, waardoor toch een minimale hoeveelheid werkzame oestrogenen wordt aangemaakt. Een andere mogelijkheid is dat Ve100 ten gevolge van de aromatase-inhibitie een hogere concentratie androgenen heeft. Deze hebben een anabool effect op het bot en werken dus beschermend (Goss et al, 2004, a en b). De totale structuur van het trabeculaire netwerk

36

DISCUSSIE

zal nauwelijks worden aangetast, enkel dunne trabekels zullen verdwijnen. Dit is conform met de literatuur, ook al wordt frequent de tibia gebruikt voor onderzoek (Öz et al, 2000; Laib et al, 2001; Yang et al, 2003; Waarsing et al, 2006). De behandeling van de vrouwtjesratten in deze studie duurde slechts 3 weken, wat kan betekenen dat de mogelijke effecten nog niet uitgesproken zijn om een significant verschil aan te geven. Ook de anabole effecten, die te verwachten zijn ten gevolge van een hoge androgeenconcentratie, blijven uit (Vanderschueren et al, 1997; Goss et al, 2004, a en b). Er werd gekozen voor deze korte therapieduur omdat uit vorige experimenten bleek dat ovariectomie dramatische effecten op de groei had in een dergelijke korte periode (van der Eerden et al, 2003). Waarsing et al (2004, 2006) gaven aan dat een verlies van trabekels gepaard gaat met het verdikken van de overblijvende trabekels. De ratten van dit onderzoek waren reeds tien maanden oud wanneer een ovarectomie werd uitgevoerd en werden gedurende 54 weken gevolgd. Een langere behandeling met exemestane zou dus mogelijk hetzelfde effect kunnen hebben maar wordt niet toegepast omwille van de eventuele problemen die bij de mens kunnen optreden: de inhibitie van de oestrogeensynthese mag niet té lang aanhouden want dan zullen de kinderen te laat in de puberteit komen, wat allerlei fysische en psychosociale gevolgen kan hebben. Waarsing et al stellen ook dat bij de mens, vrouwen met osteoporose bot verliezen door volledige resorptie van trabekels en de resultaten van de huidige studie op vrouwelijke ratten bevestigt deze waarneming. Öz et al formuleerden in 2000 de hypothese dat een aromatasedeficiëntie zorgt voor langere beenderen, maar met osteoporose. De vrouwelijke aromatase knock-out muizen van 5-7 maanden oud hadden geen significant verschil in lengte vergeleken met wildtype muizen maar het femorale trabeculaire bot vertoonde een osteoporotisch fenotype. Op deze leeftijd hebben normale muizen de piek bot densiteit (PBD) al bereikt en groeien ze aan een lage groeisnelheid. Dit sluit gedeeltelijk aan bij de bevindingen van deze studie, waarin de femuren van de vrouwelijke ratten eveneens osteoporotische eigenschappen vertoonden, maar ook een significante toename van de lengte vergeleken met placebobehandelde controleratten. De vergelijking tussen de studie van Öz et al en de huidige resultaten is niet eenvoudig omdat de groeiregulatie van muizen en ratten sterke verschillen kent. Bovendien was er in de studie van Öz et al sprake van een complete oestrogeendeficiëntie, die al aanwezig was in het foetale stadium, terwijl in de vrouwelijke ratten van de huidige studie een incomplete oestrogeendeficiëntie geïnduceerd werd vlak voor de periode van geslachtsrijping. Goss et al (2004, a en b) testten de hypothese dat exemestane botverlies kan tegengaan bij de rat met ovarectomie. Ten gevolge van de ovarectomie treedt een verhoogde botturnover op met een verlies aan gecalcifieerd weefsel, gedefinieerd als osteopenie, zoals ook af te leiden uit de huidige resultaten. Als bij deze dieren exemestane wordt toegediend, merkte Goss een daling op van de verhoogde botturnover: er was minder resorptie en meer botvomring. Hiervoor is een verhoogde concentratie androgenen verantwoordelijk, die botpreseverend en anabool inwerken op het bot en dus beschermen tegen osteopenie. In de huidige studie is geen exemestane toegediend aan groep Vovx,

37

DISCUSSIE

maar met het oog op de studie van Goss et al zou dit leiden tot toename van de lengtegroei ten gevolge van een lage oestrogeenconcentratie en tegelijkertijd osteopenie voorkomen door toedoen van een hoge androgeenconcentratie.

5.2 Mannelijke dieren In tegenstelling tot de vrouwelijke ratten, kan bij de mannelijke ratten geen toename maar een (niet-significante) afname van de lengtegroei vastgesteld worden vergeleken met placebobehandelde controles. Een verklaring hiervoor kan gevonden worden in het feit dat normale mannelijke ratten een lage oestrogeenconcentratie hebben. Inhibitie van de aromataseactiviteit door exemestane zal in theorie de oestrogeenconcentratie laten dalen tot onder een drempelwaarde die noodzakelijk is voor de start van de groei bij het begin van de seksuele maturatie. Deze resultaten zijn in tegenstrijd met een klinische trial van Dunkel et al (2003), waarin aromatase-inhibitie bij jongens met een kleine gestalte werd toegepast om de lengtegroei te doen toenemen, hetgeen ook bereikt werd. Wat het onderliggend mechanisme is om de groei bij humane jongens toch te stimuleren, is onbekend. Het verschil in groei tussen beide geslachten bij de rat, kan mogelijk verklaard worden doordat de vrouwelijke dieren slechts drie weken met exemestane behandeld werden en de mannelijke zes weken. Dat betekent dus dat de mannetjes drie weken ouder zijn. Het leeftijdsverschil kan echter niet verklaren waarom de vrouwtjesdieren groter worden en de mannetjesdieren kleiner dan onbehandelde controledieren. Het lijkt erop dat geslachtsspecifieke mechanismen een rol spelen. In dit verband is verder onderzoek vereist. Er is een duidelijke invloed van de behandeling bij groep Me100. Het verlies aan trabeculair bot is het grootst en osteoporotische eigenschappen worden duidelijk, een deel van het anatomisch volume is verdwenen en ook het botvolume is gedaald. Deze dieren werden het langst behandeld. Me3+3 werd maar voor de helft van de periode behandeld met exemestane, daarna met een placebo. Tijdens deze laatste drie weken is het mogelijk om een deel van de schade te reduceren. Het volume gecalcifieerd weefsel wordt terug opgebouwd door nieuwe, dunne trabekels te vormen en bestaande trabekels te verdikken. Waarsing et al (2006) stellen dat bij de mens, mannen vooral bot verliezen omdat de trabekels verdunnen. De resultaten van de huidige studie op ratten bevestigt de waarnemingen van hun onderzoek. Opmerkelijk is de constante ratio die er bestaat tussen anatomisch (totaal) volume en botvolume (zie tabel III.1). Dit kan betekenen dat als een bot langer wordt, het tegelijkertijd ook smaller wordt. Deze hypothese is echter tot op heden niet onderzocht maar zou wel eens een belangrijke parameter kunnen zijn wanneer ook bij andere diersoorten dergelijke constante kan worden bepaald. Dit vergt verder onderzoek.

38

DISCUSSIE

5.3 Groei bij jonge ratjes In de eerste plaats dient opgemerkt dat het opvolgen van de groei bij jonge ratjes slechts een pilootstudie is die als voorbeeld kan gebruikt worden door verder onderzoek. Er overleden drie van de vijf testratjes voor het einde van de studie bereikt werd. Mogelijke oorzaken zijn beweging tijdens de injectie of de tong die in de keel valt wanneer de dieren op hun rug liggen in het scanbed (verstikking). Bovendien zijn de ratjes nog erg jong: uit ervaring weet men dat anesthesie bij zulke dieren problemen met zich meebrengt. Fixatie van de poot is vooral moeilijk wanneer de dieren nog klein zijn. Naarmate de lengte van de poot toeneemt kan een eenvoudig (zacht knijpend) klemmetje gebruikt worden om de knie te strekken en zo ver mogelijk van het lichaam weg te brengen. Er worden in de hele studie twee verschillende doorsneden gebruikt om de epifyse te analyseren: coronale en sagittale sneden. In theorie heeft de keuze van deze virtuele sneden geen belang omdat het uiteindelijke VOI hetzelfde is. De analyse wordt dus niet beïnvloed door de keuze van de virtuele sneden. Er wordt geopteerd om de sagittale doorsneden aan te wenden bij de analyse van de levende dieren omwille van de andere oriëntatie van het femur tegenover de in vitro gescande botten. Vanwege de enorme grootte van de dataset wordt de resolutie teruggebracht tot 36 µm i.p.v. 18 µm. Door hetzelfde dier regelmatig te scannen is elk dier zijn eigen controle. Dankzij dergelijke longitudinale studie kan de evolutie van de groei opgevolgd worden. Tot ca. zes weken stijgt het trabeculair aantal omdat nieuwe trabekels aangemaakt worden, waarna de trabekels verdikken. Deze bevindingen kunnen moeilijk aan deze van de controle gelinkt worden omdat dit dier slechts éénmalig gescand is. Dit betekent dat er bij deze rat geen evolutie kan besproken worden. De verschillen tussen de controlerat en de besproken rat zijn te wijten aan interindividuele variatie. De evolutie van de groei is zichtbaar op figuur III.11 en III.12. Het stukje bot hier afgebeeld ondergaat duidelijk een maturatieproces. Hierbij moet worden vermeld dat de regio die is afgebeeld op figuur III.12 niet tot het VOI behoort dat numeriek geanalyseerd werd. Het corticale bot wordt dikker en er worden veel trabekels geresorbeerd hoewel de overblijvende trabekels verdikken, dit alles in een periode van drie weken. Dit proces is conform met dat van de enchondrale botvorming ter hoogte van de groeischijf. Na de geprogrammeerde celdood van de chondrocyten vormen de ongeresorbeerde kraakbeensepta een substraat waarop de osteoblasten zich kunnen vasthechten. Op deze manier wordt trabeculair bot gevormd, wat het bot zijn stevigheid geeft. Wanneer het corticaal bot dikker wordt, wint het bot aan stevigheid en dan zijn veel trabeculaire structuren niet noodzakelijk, enkele zullen volstaan. Bovendien is dit geen onbekend proces: ook Waarsing et al (2006) rapporteerden dit mechanisme bij volwassen ratten met ovarectomie in een periode van ong. een jaar. Deze dieren hebben een trager botmetabolisme dan de jonge ratjes die hier gescand werden. Wegens tijdsgebrek was het niet mogelijk om de snelheid te bepalen waarmee het trabeculaire bot gevormd wordt vanuit de groeischijf. Dit vraagt een gecompliceerde methode en werd nooit eerder uitgevoerd. Een mogelijke methode hiervoor is werken met merkers die in het bot worden ingebouwd. Wanneer hetzelfde dier dan regelmatig gescand wordt, kan de trabeculaire botvorming tijdens de groei gevolgd worden.

39

DISCUSSIE

De femuren geïsoleerd na opoffering van de ratten (exemestanestudie) hebben een leeftijd van ca. zeven weken (26 dagen plus 3 weken behandelingsperiode). Er bestaat een correlatie tussen de waarnemingen in de levende dieren en deze van de exemestanestudie: trabeculaire dikte en aantal behoren tot eenzelfde grootteorde. Een meer gedetailleerde vergelijking tussen deze dieren en de even oude levende ratjes is moeilijk. Allereerst is een verschillende scanner gebruikt met verschillende filters maar ook de drempelwaarde voor de omzetting naar binaire beelden is verschillend. Verder onderzoek is noodzakelijk om de groei van gezonde jonge ratten op een statistisch verantwoorde manier te beschrijven. Dit kan zeer goed met micro-CT opgevolgd worden. De hier uitgevoerde pilootstudie kan een goede basis zijn voor verder onderzoek naar de invloed van groeibevorderende therapiën, zoals exemestane, op het trabeculaire bot.

6. Conclusie Het mimeren van syndromen zoals aromatasedeficiëntiesyndroom (ADS) bij jonge vrouwelijke ratjes zal de groei stimuleren. Ondanks het feit dat resultaten van proefdierstudies nooit volledig te extrapoleren zijn naar de mens, toonde deze studie aan dat de gebruikte aromataseremmende therapie niet zonder gevolgen is. De belangrijkste waarneming van de botanalyse is dat alle dieren, ook de mannelijke, osteopenie vertoonden, het beginstadium van osteoporose. Het onderzoek van andere oestrogeenafhankelijke organen bracht een belangrijk additioneel neveneffect van de behandeling aan het licht: de ovaria van de vrouwelijke ratten vertoonden vele cysten. Dit betekent dat de dieren minder tot zelfs niet vruchtbaar waren. De seksuele maturatie van de vrouwtjes zal ten gevolge van een inhibitie van de oestrogeensynthese ernstige afwijkingen vertonen. Dit is een aandoening voor het leven die mogelijk ook bij jonge meisjes optreedt. Een therapie waarbij de oestrogeensynthese (met behulp van de irreversibele aromataseremmer exemestane) wordt stilgelegd om de groei te stimuleren is dus niet zonder risico omwille van de hier aangetoonde belangrijke neveneffecten. Deze studie op basis van een proefdiermodel toont aan dat ernstige overwegingen gemaakt moeten worden wanneer gedacht wordt aan het starten van dergelijke therapie bij kinderen.

40

REFERENTIES

Abu E O, Horner A, Kusec V, Triffitt J T, Compston J E (1997) The lokalization of androgen receptors in human bone. J Clin Endocrinol Metab 82, 3493-3497 Alexander JM, Bab I, Fish S, Müller R, Uchiyama T, Gronowicz G, Nahounou M, Zhao Q, White DW, Chorev M, Gazit D en Rosenblatt M (2001) Human paratyroid hormone 1-34 reverses bone loss in ovariectomized mice. J Bone Miner Res 16, 1665-1673 Baldock P, Morris H, Need A, Moore R, Durbridge T (1998) Variation in short-term changes in one cell activity an three regions of the distal femur immediately following ovarectomy. J Bone Miner Res 13, 1451-1457 Berne R, Levy M, Koeppen B, Stanton B (1998) The endocrine system. In: Physiology, 4th ed., Mosby, St.-Louis, pp.717-978 Carani C, Qin K, Simoni M, Faustini-Fustini M, Serpente S, Boyd J, Korach KS, Simpson E (1997) Effect of testosterone and oestradiolin a man with aromatase deficiency. N Eng J Med 337, 91-95 Colvard D S, Eriksen E F, Keeting P E, Wilson E M, Lubahn D B, French F R, Riggs B L, Spelsberg T C (1989) Identification of androgen receptors in normal human osteoblast-like cells. Proc Natl Acad Sci 86, 854-857 Cowin S (2001) Bone mechanics handbook, CRC Press LLC, 2nd edtition De Clerck N, Van Dyck D en Postnov A (2003) Non-invasibe high-resolution µCT of the inner structure of living animals. Microscopy ans analysis (Euro) 81, 13-15 De Clerck N, Postnov A (to be published in 2007) High resolution X-ray microtomography: applications in biomedical research. In: International textbook of in vivo imaging in vertebrate, Bertrand Tavitian, Anne Leroy-Willig and Vasilis Ntziachristos, pp. 59-79 Dunkel L, Wickman S (2003) Novel treatement of short stature with aromatase inhibitors. J Steroid Biochem Mol Biol 86, 345-356 Feldkamp L, Davis L, Kress J (1984) Practical cone-beam algorithm. J. Opt. Soc. Am. A 1, 612-619 Frantz A, Rabkin M (1965) Effect of oestrogen and sex difference on secretion of human growth hormone. J Clinic Endocrinol 25, 1470-1480 Goss P, Qi S, Josse R, Pritzker K, Mendes M, Hu H, Waldman S, Grynpas M (2004) The steroidal aromatase inhibitor exemestane prevents bone loss in overiactomized rats. Bone 34, 384-392 (a) Goss P, Qi S, Cheung A, Hu H, Mendes M, Pritzker K (2004) Effects of the steroidal aromatase inhibitor exemestane and the nonsteroidal aromatase inhibitor letrozole on bone and lipid metabolism in ovariectomized rats. Clin Cancer Res 10, 5717-5723 (b) Grumbach M, Auchus R (1999) Estrogen: consequences and implications of human mutations in synthesis and action. J Clin Endocrinol Metab 84, 4677-4694 Hounsfield G (1980) Computerized transversed axial scanning (tomography): part I. Description of system. Brit J Radiol 46, 1016-1022 Johannessen D, Engan T, Di Salle E, Zurlo M, Paolini J, Ornati G, Piscitelli G, Kvinnsland S, Lonning P (1997) Endorcrine and clinical effects of exemestane, a novel steroidal aromatase inhibitor, in postmenopausel breast cancer patients: a phase I study. Clin Cancer Res 3, 1101-1108

41

Junqueira L en Carneiro J bewerkt door Wisse E, Nieuwenhuis P, Ginsel L (2004) Functionele histologie, Elsevier Gezondheidszorg, 10de druk Juul A (2001) The effects of oestrogens on linear bone growth. Hum Reprod Update 7(3), 303-313 Kalu D (1991) The ovarectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone Miner 15, 175-192 Laib A, Kumer JL, Majumdar S en Lane NE (2001) The temporal changes of trabecular architecture in ovariectomized rats assessed by micro-CT. Osteoporos Int 12, 936-941 Marshall WA, Tanner JM (1969) Variations in patterns of pubertal changes in girls. Arch Dis Child 44, 291-298 Marshall WA, Tanner JM (1970) Variations in patterns of pubertal changes in boys. Arch Dis Child 45, 13-19 McPhee S, Ganong W (2006) Disorders of the parathyroids and calcium metabolism. In: Pathophysiology of disease, an introduction to clincal medicine, 5th ed., Lange Medical Books, pp. 457481. Morishima A, Grumbach M, Simpson E, Fisher C, Qin K (1995) Aromatase deficiency in male and female siblings caused by a novel mutation and the physiological role of oestrogens. J Clin Endocrinol Metab 80, 3689-3698 Nilsson O, Marino R, De Luca F, Phillip M, Baron J (2005) Endocrine regulation of the growth plate. Horm Res 64, 157-165 Ohlsson C, Isgaard J, Nilsson A, Isaksson OGP, Lindahl A (1993) Endocrine regulation of longitudinal bone growth. Acta Paedriatr suppl 391, 33-40 Öz O, Zerwikh J, Fisher C, Graves K, Nanu L, Millsaps R, Simpson E (2000) Bone has a sexually dimorphic response to aromatase deficiency. J Bone Miner Res 15, 507-514 Öz O, Millsaps R, Welch R, Birch L, Zerwekh J (2001) Expression of aromatase in the human growth plate. J Mol Endocrinol 27, 249-253 Peyrin F, Salomé M, Cloetens M, Odet C, Laval-Jeantet A, Baruchel J, Spanne P (1999) A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Medical Physics 26 (10), 2194-2204 Postnov A, Vinogradov A, Van Dyck D, Saveliev S en De Clerck N (2003) Quantitaive analysis of bone mineral content by X-ray microtomography. Physiol. Meas. 24, 165-178 Postnov A, Meurrens K, Weilers H, Van Dyck D, Xu H, Terpstra P en De Clerck N (2005) In vivo assessment of emphysema in mice by high resolution X-ray microtomography. Journal of microscopy 220, 70-75 Robson H, Siebler T, Shalet SM, Williams GR (2002) Interactions between GH, IGF-I, glucocorticoids, and thyroid hormones during skeletal growth. Pediatr Res 52, 137-147 Rüegsegger P, Koller B en Müller R (1996) A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int 58, 24-29 Salmon WD, Daughaday WH (1957) A hormonally controlled serum factor which stimulates sulfate incorporation by cartalige in vitro. J Lab Clin Med 49, 825-836 Sasov A, Van Dyck D (1998) Desktop X-ray microscopy and microtomography. J Microsc 191, 151158 Simpson E, Mahendroo M, Means G, Kilgore M, Hilshelwood M, Graham-Lorence S, Amarneh B, Ito Y, Fisher C, Michael M, Mendelson C, Bulun S (1994) Aromatase cytochrome P450, the enzyme responsible fot oestrogen biosynthesis. Endocr Rev 15, 342-355

42

Smith EP, Boyd J, Frank GR, Takahashi H, Cohen RM, Specker B, Williams TC, Lubahn DB, Korach KS (1994) Estrogen resistance caused by a mutation in the oestrogen-receptor gene in a man. N Eng J Med 331, 1056-1061 Van der Eerden B, Karperien M, Wit J M (2003) Systemic and local regulation of the growth plate. Endocr Rev 24, 782-801 Van der Eerden BC, Lowik CW, Wit JM, and Karperien M (2004) Expression of estrogen receptors and enzymes involved in sex steroid metabolism in the rat tibia during sexual maturation. J. Endocrinol 180 (3): 457-467 Vanderschueren D, Van Herck E, Nijs J, Ederveen A, De Coster R, Bouillon R (1997) Aromatase inhibition impairs skeletal modeling and decreases bone mineral density in growing male rats. Endocrinology 138, 2301-2307 Waarsing J, Day J, van der Linden J, Ederveen A, Spanjers C, De Clerck N, Sasov A, Verhaar J en Weinans H (2004) Detecting and tracking local changes in the tibia of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone 34 (1), 163-169 Waarsing J, Judd S, Verhaar J, Ederveen A en Weinans H (2006) Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats. Inc J Orthop Res 24, 926-935 Wehr M, Richards J, Adair T (1985) X-rays. In: Physics of the atom, 4th edition, Addison-Wesley Publishing Company, pp. 217-260 Werther GA, Haynes K, Edmonson O, Oakes S, Buchanan CJ, Herington AC, Waters MJ (1993) Identification of growth hormone receptors on human plate chondrocytes. Acta Paedriatr Suppl 82 Suppl 391, 50-53. WF Boron & E Boulpaep (2003) Medical Physiology, Saunders, Elsevier Science, 1st edition Wit J M, Verrijn Stuart, Bakker-Van Waarde (to be published in 2007) Werkboek Endocrinologie Wronski T, Yen C-F (1991) The ovariectomized rat as an animal model for postmenopausal bone loss. Cell Mater suppl 1, 69-74 Yang J, DMD, MS, MMS, DDS, Son M Pham, MS, Crabbe D en MD (2003) High-resolution microCT evaluation of mid- to long-term effects of oestrogen deficiency on rat trabecular bone. Acad radiol 10, 1153-1158

http://www.skyscan.be/

43

BIJLAGE

Figuur B.1: Groeicurve Vlaamse jongens.

Figuur B.2: BMI en groeisnelheid Vlaamse jongens.

Figuur B.3: Groeicurve Vlaamse meisjes.

Figuur B.4: BMI en groeisnelheid Vlaamse meisjes.

Figuur B.5: Synthese van de gonadale steroïdhormonen. De testis produceert vooral testosteron en de ovaria oestradiol en progesteron. (1): 20,22-desmolase; (2): 17-hydroxylase; (3): 17,20-desmolase; (4): 17β-OH-steroïd dehydrogenase; (5): 3β-ol-dehydrogenase en ∆4,5-isomerase; (6): 5α-reductase; (7): 3α-reductase; (8): aromatase.

a)

b)

Figuur B.6: Verloop van trabeculair aantal (a) en dikte (b) i.f.v. de afstand tot het referentievlak (mannelijke dieren). Het is moeilijk uit deze figuur conclusies te trekken omdat het effect van de exemestanebehandeling niet goed tot uiting komt.