Analitikai módszerek a 20. század közepén és az ezredfordulón Módszer
1950
Ezredforduló
Klasszikus módszerek
Gravimetria, titrimetria (vizes közegben, indikátoros végpontjelzéssel) Potenciometria, konduktometria, voltammetria, coulombmetria Termogravimetria, DTG UV (kolorimetria), fluorimetria IR, Raman (alapok) MS (alapok)
Titrimetria (vizes, nemvizes közegben, potenciometrikus végpontjelzéssel) Ugyanez + ionszelektív elektródok, szenzorok, elektrokémiai felületvizsgáló módszerek DTG, DTA, DSC, kapcsolt módszerek UV (diódasoros detektor), fluorimetria Fourier transzformációs IR és Raman MS/(MS), változatos ionizációs technikák, széleskörű alkalmazás NMR széleskörű alkalmazása, ESR Emissziós (ICP), atomabszorpciós, atomfluoreszcenciás, fotoelektronspektroszkópiás (PES, XPS, AES) módszerek Vékonyréteg- (TLC), nagyhatékonyságú folyadék- (HPLC), szuperkritikus folyadék- (SFC), kapilláris elektro- (CEC) kromatográfia, kapilláris- (CE), gél-elektroforézis, micelláris elektrokinetikus kromatográfia, stb. HPLC,CE,CEC,TLC,FIA/UV, GC(IR)/MS, HPLC,SFC,CE,CEC/MS, HPLC/NMR(MS), ICP/MS, stb. Por- és egykristály-diffraktometriás kristály és molekulaszerkezet vizsgálatok, felületanalitikai módszerek Ugyanezek továbbfejlesztései, radioimmunoassay (RIA), Mössbauer spektroszkópia, pozitron alapú analitika ORD-CD spektroszkópia, királis GC, HPLC, TLC, CE, SFC, CEC Radio-, enzim-, fluoreszcenciás immunoassay, ELISA, stb. Komputerizálás, automatizálás, robottechnika, kemometria
Elektroanalitika Termoanalitika Spektroszkópia
Kromatográfiás és elektroforetikus elválasztási módszerek
Emissziós spektroszkópia, lángfotometria, atom-, eletron-spektroszkópia (alapok) Papírkromatográfia, oszlopkromatográfia, gázkromatográfia (alapok), elektroforézis (alapok)
Kapcsolt módszerek
-
Röntgen módszerek
Diffraktometria, emissziós és fluoreszcenciás módszerek (alapok) Aktivációs analízis, izotóphigításos módszerek
Magkémiai módszerek Királis analitika Immun-analitika Automatikus elemzés
Optikai forgatóképesség mérése, ORD-CD spektroszkópia (alapok) -
Gyógyszeralapanyagok tartalmi meghatározására használt analitikai módszerek metodika szerinti megoszlása az Európai és az US Gyógyszerkönyvekben [12]* Módszer HPLC GC Titrálás Sav-bázis Vizes közeg Indikátoros Potenciometrikus Nem-vizes közeg Indikátoros Potenciometrikus Redox (Jodometria, nitritometria, stb.) Egyéb (komplexometria, argentometria, stb.)
Ph. Eur. 4 USP 27 15.5% 44% 2% 2.5% 69.5% 40.5% 57.5% 29.5% 21% 5.5% 6.5% 4.5% 14.5% 1% 36.5% 24% 9.5% 14% 27% 10% 6.5% 5.5% 5.5% 5.5%
UV-VIS spektrofotometria Saját fényelnyelés alapján Kémiai reakciókra alapozott kolorimetria Mikrobiologiai mérés (antibiotikumok) Egyéb (IR, NMR, polarimetria, fluorimetria, atomabszorpciós spectroszkópia, polarográfia, gravimetria, stb.)
9.5% 8.5% 1% 3% 0.5%
*
8.5% 6.5% 2.0% 2.5% 2%
Természetes és szintetikus szerves “kismolekulák”, szerves savak és bázisok sói. Nem tartalmazza a táblázat a szervetlen sókat, fehérjéket, enzimeket, egyéb makromolekulákat, radioaktív készítményeket, vérkészítmények, rekombináns DNS technológia termékeit és kiszerelési segédanyagokat.
Királis elválasztások Dr. Horváth Péter Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet
Akirális 0,32 % Természetes és félszintetikus 28 %
Racém 0,43 % Királis 27,68 % Enantiomer tiszta 27,15 %
Gyógyszeranyag 100 %
Akirális 43,2 % Szintetikus 72 %
Királis 28,8 %
Racém 25,24 % Enantiomer tiszta 3,56 %
EUTOMER -- DISZTOMER
A kiralitás megjelenési formái Centrális (C, N, S, P),
A
A D
B
E
B
E
D
Helikális Planáris
Axiális,
P
M O2N HO2C
CO2H NO2
Tofisopam ®
Királis centrumok (elemek) száma = n; optikai izomerek száma= 2n
Minden királis centrum ellentétes konfigurációjú = ENANTIOMER Minden más esetben =DIASZTEREOMER (speciális eset: epimer, anomer)
DIASZTEREOMEREK megkülönböztetése nem probléma (többnyire)
ENANTIOMEREK megkülönböztetése csak királspecifikus módszerekkel
Kiroptikai spektroszkópia (CD, ORD)
Királis elválasztástechnika
Királis elválasztás mechanizmusa I.
Kölcsönhatásokért felelős kötések:
Ionos, H-híd, dipol, töltésátvitel (p-p), hidrofób,
Királis elválasztás mechanizmusa II.
Konformációs szabadság – konformációs igazodás Topográfiai tulajdonságok – sztérikus illeszkedés A kötődést befolyásoló tényezők: • oldószer • hőmérséklet • pH
Hőmérséklet hatás Ketamin enantiomerek b-CD állófázison
20000
25C (1,249) 20C (1,292) 15C (1,355)
ABS
15000
10000
5000
0 15
20
Time (min)
25
Hőmérséklet hatás
Hőmérséklet hatás
nebivolol (Nebilet)
eltérő hatású enantioés diasztereomerek
Chiralpack AD, etanol
Oldószer hatás
pH hatás
Királis elválasztási lehetőségek (Diasztereomer-párképzés homokirális reagenssel)
I. On-line I/a.) Állófázison -- normál fázisú -- fordított fázisú
II. Pre-kromatográfiás Előzetes kémiai reakcióval Ideális esetben: (+)E; (-)E és (+)R
I/b.) Mozgófázissal
Termékek: +E+R és –E+R
R- és S-metilbenzilamin kámforszulfonsav-amid elválasztása fordított fázison
Példa: 80% -E és 20% +E enantiomer keverék 99% -R és 1% +R reagens -E (80%)
+E (20%)
-R (99%)
-E-R (79,2%)
+E-R (19,8%)
+R (1%)
-E+R (0,8%)
+E+R(0,2%)
Ebből enantiomer viszonyban van
- E-R
és +E+R összesen 79,4%
-E+R és +E-R összesen 20,6%
Kromatográfiás módszerek és a tipikusan alkalmazott elválasztási lehetőségek
Technika
Állófázis
Mozgófázis
GC
+
-
LC
+
+
TLC
++
(+)
CE
-
+
GC: gázkromatográfia; LC: folyadékkromatográfia; TLC: vékonyréteg kromatográfia; CE: kapilláris elektroforézis;
Állófázisok típusai:
biopolimerek: fehérjék, poli- és oligoszaharidok félszintetikus poli- és oligoszaharidok makrociklusus antibiotikumok szintetikus szelektorok
- Pirkle típusú - korona éterek - aminosav származékok - szintetikus helikális polimerek
Poliszaharid állófázisok (fizikailag kötött)
Cellulóz észterek: Amilóz karbamátok: triacetát (Chiracel OA) tris(3,5-dimetil-fenil karbamát) tribenzoát (Chiracel OB) (Chiralpak AD) tris(4-metilbenzoát) (Chiracel OJ) tris(1-feniletil karbamát) Cellulóz karbamátok: (Chiralpak AS) tris(fenil karbamát) (Chiracel OC) tris(3,5-dimetil-fenil karbamát) Ciracel (OD)
Makrociklusos glikopeptidek (antibiotikumok)
tulajdonság
vankomycin
teicoplanin
1449
1877
Sztereogén centr.
18
23
Makrociklus
3
4
Cukor komponens
2
3
Aromás gyűrű
5
7
Hidroxil-csoport
9
15
Amid-csoport
7
7
Amin-csoport
2
1
pH tartomány
4-7
3,8-6,5
Mw
vankomycin
teicoplanin
Fehérjék fehérje
Mw (kD)
Szénhidrát tart%
IEP
HSA
66
0
4,7
BSA
65
0
4,7
AGP
41
45
2,7
Ovoglükoprotein
30
25
4,1
Avidin
66
7
10
64
6
3,9
34,6
0
<1
ALBUMINOK
GLUKOPROTEINEK
ENZIMEK Cellobiohidroláz Pepsin
Kis molekulasúlyú szintetikus királis szelektorok Chirex állófázisok (amid és urea)
Pirkle
Kis molekulasúlyú szintetikus királis szelektorok A: DNP-fenilglicin N-(3,5-dinitrobenzoil)-fenilglicin-amid
B: Chy-Ro-Sine-A N-(3,5-dinitrobenzoil)-tyrozin-butilamid
C: b-GEM 1
N-(3,5-dinitrobenzoil)-3-amino-3-fenil-2(1,1-dimetil-etil)-propanoát
D: Whelk-O 1 1-N-(3,5-dinitrobenzamido)1,2,3,4tetrahidrofenantrén
E: ULMO N-(3,5-dinitrobenzoil)-1,2-difenil-1,2diaminoetán
Ciklodextrin álló- és mozgófázisok
Néhány fontosabb ciklodextrin származék
bCD
C18; MetOH-víz 20:80 SF127_8 /2 5
SF127-8 /3
29,49667
H
O N
2
3
H
2
N H
N H
OH H
O
Abs
4
Abs
18,98 21,74333
3
H
1
1,58667
1
0
1,53 0 -1
-1 -2
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
5
10
Time (min)
15
20
25
30
Time (min)
SF127-12 /1
SF127-12 /3
5
31,78667
3
4
H H H H 1,50667
N H
N
2
1
2
N
O
Abs
Abs
3
O
H
1
0
HO
0 -1 -1 -2 0
10
20
Time (min)
30
40
0
5
10
15
Time (min)
20
25
30
BCD stationary phase 40000 1000
S 35000
0
30000
-500 25000
R
-1000
20000
RP18 stationary phase + BCD
10
20
Time (min)
45000 500
0
40000
-1000
-1500
30000
-2000 25000 0
5
10
Time (min)
15
20
UV
CD
-500 35000
30
40
UV
CD
500
Gentamicin izomerek forgatóképességi detektálása alapanyagokban és tejben
Contaminated Milk Sample
A kettős detektáláson alapuló enantiomer meghatározás elve
G
c l c l
-100
3.0
-150 2.5 -200 -250
2.0
-300
A
1.5 -350 Ellipticitás (bal)
-400 -450 0.3
1.0
G (bal) Abszorpció (jobb)
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
D-fenilglicin koncentráció (mMol/l)
200 150 100
G
50 0 -50 -100 -150 -200
c szenny 0
20
40
60
D-phenylglycine concentration [%]
80
100
Gtiszta - Gmért 100 2 Gtiszta
Oxazepam hemisuccinate a: S 78% b: S 40.9% c: R 37% d: R 76.8 % Hypersil CN hexan/methylen chlorid/ethanol/AcH
50:50:1:0.5, 1 ml/min, 265 nm
Bertucci, Andrisano, Cavrini, Castiglioni; Chirality 12 (2000) 84-92
A kettős detektálás egyéb felhasználási lehetőségei 150
30
0,3
20.a
20.b 100
CD [mdeg] (bal))
24
50
UV [AU] (jobb)
0,2 18 0
12 0,1
-50
6 -100
0
0,0 -150
0
0,3
120
240
360
480
600
720
840
30
U V detektor jel
20.c
0
960
120
240
360
480
600
720
840
20.d
kodein jele a f elbontás után
C D detektor jel [m deg]
hidrokodon jele a f elbontás után
kodein jele a f elbontás után hidrokodon jele a f elbontás után
20
0,2
960
10 0,1
0 0,0 0 0
120
240
360
480
600
720
840
960
120
240
360
480 Time [sec]
600
720
840
960
