ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA MENCIT RUMAH (Mus musculus castaneus) DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN SURABAYA DENGAN PCR-RFLP
Oleh : Diana Yulianti G04499071
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005
2
ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA MENCIT RUMAH (Mus musculus castaneus) DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN SURABAYA DENGAN PCR-RFLP
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Oleh : Diana Yulianti G04499071
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005
3
ABSTRAK DIANA YULIANTI. Analisis Keragaman D-loop DNA Mitokondria Mencit Rumah (Mus musculus castaneus) di Daerah Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan PCR-RFLP. Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan RONNY RACHMAN NOOR. Mencit rumah (Mus musculus) termasuk dalam kelas Mamalia, infrakelas Eutheria, ordo Rodentia, subordo Myomorpha dan famili Muridae. Spesies tersebut dalam perkembangannya terbagi menjadi subspesies Mus musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus castaneus dan Mus musculus bactrianus (Silver 1995). Subspesies yang tersebar di Indonesia adalah Mus musculus castaneus (Boeadi et al.1982). DNA mitokondria (mtDNA) sering digunakan sebagai penanda molekular sebagai salah satu cara untuk mengetahui keragaman genetik. Keragaman genetik mtDNA dapat diketahui dengan menggunakan metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Sepasang primer yang digunakan adalah CTDF dan CTDR. Sedangkan enzim restriksi yang digunakan adalah HaeIII, AluI dan RsaI. Sampel yang digunakan berasal dari Jakarta (10 ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9 ekor) sehingga total sampel menjadi 30 ekor. Dengan menggunakan metode PCR-RFLP ditemukan sembilan haplotipe pada ketiga puluh sampel mencit rumah. Pada populasi Jakarta ditemukan tiga haplotipe, Bandung tujuh haplotipe dan Surabaya lima haplotipe. Haplotipe lokal ditemukan di populasi Bandung (H-5 dan H-7) dan Surabaya (H-8 dan H-9). H-3 merupakan haplotipe umum yang terdapat di semua populasi.
ABSTRACT DIANA YULIANTI. Genetic Diversity Analysis of D-loop Mitochondrial DNA of House Mice (Mus musculus castaneus) in Jakarta, Bandung and Surabaya. Supervisors : DEDY DURYADI SOLIHIN and RONNY RACHMAN NOOR. House mice ( Mus musculus) belongs to class Mammal, infraclass Eutheria, Order Rodentia, suborder Myomorpha and family Muridae. This spesies divided into subspesies subspesies Mus musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus castaneus and Mus musculus bactrianus (Silver 1995). Subspesies which spread all over Indonesia is Mus musculus castaneus. Mitochondrial DNA (mtDNA) is often used as genetic marker to study genetic diversity. Genetic diversity of mtDNA can be obtained using PCR-RFLP. The Primers used for analysis were CTDF and CTDR. The restriction enzyme used were HaeIII, AluI and RsaI. The samples were from Jakarta (10 mice), Bandung (11 mice) and Surabaya (9 mice) so the total amount of samples were 30 mice. We generated pcr product 1384 bp in length using PCR-RFLP. Nine haplotype were found. In Jakarta population there were three haplotype, Bandung seven haplotype and Surabaya five haplotype. Local haplotypes were found in Bandung (H-5 and H-7) and Surabaya (H-8 and H-9). The H-3 was common haplotype that were found in all population.
4
: ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA MENCIT RUMAH (Mus musculus castaneus) DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN SURABAYA DENGAN PCR-RFLP. : Diana Yulianti : G04499071
Judul Nama NIM
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, M.Rur.Sc
NIP. 131415134
NIP. 131624188
Mengetahui, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.Si NIP. 131473999
Tanggal Lulus :
5
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2004 ini adalah analisis keragaman D-loop DNA mitokondria
mencit rumah (Mus
musculus castaneus) Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan PCR-RFLP. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, M.Rur.Sc selaku pembimbing dan penyandang dana penelitian ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan
kepada seluruh keluarga besar zoologi, Bapak
Achmad, Ibu Rika, Ibu Wita, Bapak Bambang dan Ibu Taruni untuk semua saran dan dukungannya. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Bapak Heri dan Bapak Nunu yang telah membantu dalam masalah tehnik laboratorium serta rekan-rekan kerja di laboratorium biologi molekuler Pusat Studi Ilmu Hayat IPB, Ibu Rini, Bapak Sarbaini, Bapak Jakaria, Evie, Virgo dan Ari untuk semua saran, nasehat dan jalan keluar setiap masalah yang penulis hadapi. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada sahabat-sahabat tercinta Pepen, Ucup, Yayak dan Bank 4di3 yang telah membantu selama pengumpulan sampel dan atas waktu luangnya menemani penulis dalam suka dan duka serta Kanthi, Gia, Marin, Andre, Agus, Chie, 14 dan Wina atas segala bentuk dorongan dan perhatiannya. Tak lupa kasih dan sayang kepada keluarga besar TM 7 dan teman-teman angkatan 36. Segala cinta dan terima kasih penulis ungkapkan kepada Papa, Mama dan adikku untuk dukungan moral, material, kesabaran, doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2005 Diana Yulianti
6
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 01 Juli 1981 dari ayah Ismail dan ibu Nurhasanah. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 1999 penulis lulus dari SMUN 21 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif di Himpunan Profesi Departemen Biologi (HIMABIO) sebagai anggota Departemen Informasi dan komunikasi pada periode tahun 1999/2000. Penulis melaksanakan praktik lapang selama dua bulan di Gelanggang Samudra Jaya Ancol, Jakarta. Penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2001/2002, Struktur dan Perkembangan Hewan tahun ajaran 2002/2003, Zoologi Vertebrata pada tahun ajaran 2003/2004, dan 2004/2005.
7
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL....................................................................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................
vi
PENDAHULUAN....................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE..........................................................................................................
2
Bahan................................................................................................................................
2
Metode..............................................................................................................................
2
Pengambilan Sampel...................................................................................................
2
Ekstraksi dan Isolasi DNA............................................................................................
2
Uji Kualitas DNA...........................................................................................................
2
Amplifikasi Daerah D-loop............................................................................................
2
Pemotongan dengan Enzim Restriksi..........................................................................
3
Analisis Hasil PCR-RFLP.............................................................................................
3
Analisis Keragaman.....................................................................................................
3
HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................................................
3
Hasil..................................................................................................................................
3
Amplifikasi Daerah D-loop............................................................................................
3
Keragaman Fragmen D-loop dengan Menggunakan Enzim restriksi..........................
3
Pemotongan dengan HaeIII....................................................................................
4
Pemotongan dengan AluI.......................................................................................
4
Pemotongan dengan RsaI......................................................................................
4
Analisis Keragaman Haplotipe...............................................................................................
4
Pembahasan.....................................................................................................................
5
SIMPULAN DAN SARAN.......................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA...............................................................................................................
8
LAMPIRAN.............................................................................................................................
10
8
DAFTAR TABEL Halaman 1 Pola Pemotongan dengan Enzim Restriksi.......................................................................
4
2 Haplotipe dan Penyebarannya..........................................................................................
5
3 Perbandingan hasil PCR-RFLP dengan sekuens acuan..................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Penyebaran Mus musculus di dunia.................................................................................
11
2 Daftar Sampel...................................................................................................................
12
3 Hasil BLAST primer forward pada Mus musculus castaneus...........................................
13
4 Hasil BLAST primer reverse pada Mus musculus castaneus...........................................
14
5 Sekuen Mus musculus castaneus acuan..........................................................................
15
6 Hasil dan pola pemotongan dengan HaeIII.....................................................................
16
7 Hasil dan pola pemotongan dengan AluI..........................................................................
17
8 Hasil dan pola pemotongan dengan RsaI.........................................................................
18
9 Hasil PAGE 5.5% dengan silver staining..........................................................................
19
Mencit dapat digunakan sebagai hewan
PENDAHULUAN
model dalam penelitian bidang kedokteran dan Mencit rumah (Mus musculus) termasuk dalam kelas Mamalia, infrakelas Eutheria, ordo Rodentia, subordo Myomorpha dan famili Muridae. Famili Muridae awalnya diperkirakan berasal dari daerah India dan Asia Tenggara. Berdasarkan data paleontologi dan filogeni diperkirakan bahwa tikus berasal dari nenek moyang yang hidup 10-15 juta tahun SM. Sekitar enam juta tahun SM genus Mus ditemukan, kemudian berkembang menjadi beberapa spesies yang tersebar di sekitar India dan ke benua lain (Silver 1995). Pada 10.000 tahun lalu, Mus musculus telah mengalami pembagian menjadi empat populasi yang terpisah dan tidak mengalami tumpang tindih area di India dan benua lain. Spesies tersebut dalam perkembangannya terbagi menjadi subspesies Mus musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus
castaneus
dan
Mus
musculus
bactrianus (Silver 1995). Diperkirakan penyebaran M.m domesticus terfokus di pinggir wilayah Pakistan dan di India bagian barat. Sedangkan M.m musculus berada di utara india . M.m castaneus berada di daerah Bangladesh dan M.m bactrianus tetap berada di India (Silver 1995)(Lampiran 1). Subspesies yang tersebar di Indonesia adalah Mus musculus castaneus (Boeadi et al.1979). M.m castaneus berukuran kecil dan lincah. Hampir seluruh tubuhnya ditumbuhi oleh rambut bertekstur lembut dengan warna pada bagian dada tidak putih dan punggungnya coklat kelabu. Mencit ini memiliki ekor lebih panjang
dari
panjang
badannya
dengan
bentuk yang meruncing. Ekornya memiliki anulasi yang cukup jelas dan ditumbuhi oleh sedikit rambut. Formula puting susu yang dimiliki adalah tiga pasang di dada dan dua pasang di perut (Boeadi et al. 1979).
genetika karena memiliki banyak kelebihan antara lain waktu generasi kemampuan
adaptasi
yang
kemampuan
ratusan
gen
yang cepat, tinggi
dan
tunggalnya
bermutasi (Hartwell et al. 2000). Penggunaan
penanda
molekular
merupakan salah satu cara untuk mengetahui keragaman
genetik.
DNA
mitokondria
(mtDNA) sering digunakan sebagai penanda molekular karena memiliki banyak kelebihan antara lain jumlah kopi yang tinggi, ukuran yang relatif kecil (14-39 kb) dan pada bagian tertentu dari genom mitokondria berevolusi dengan kecepatan yang berbeda (Duryadi 1994). Mitokondria DNA terdiri dari 13 gen penyandi polipeptida, 22 gen tRNA dan 2 gen rRNA.
Urutan gen-gen mitokondria pada
umumnya
relatif
conserved
pada
semua
vertebrata (Brown 1980). Gen-gen tersebut tersusun dalam 2 utas yaitu utas Heavy (H) dan utas Light (L). Selain daerah penyandi, mtDNA juga memiliki daerah noncoding yang disebut D-loop. Brown 1980 mengatakan bahwa daerah D-loop bersifat hipervariabel, karena memiliki laju evolusi tertinggi. Dapat mencapai 5-10 kali lebih cepat dibandingkan dengan DNA inti. Keragaman
genetik
mtDNA
dapat
diketahui dengan reaksi perbanyakan DNA secara in vitro
pada sekuen target dengan
memanfaatkan cara replikasi DNA dengan bantuan
enzim
DNA
polimerase
dan
perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu. Metode ini dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR) (Saiki et al.1986). Produk menggunakan
PCR enzim
kemudian
dipotong
restriksi
(restriction
endonuclease). Sebuah enzim restriksi akan memotong DNA secara spesifik, terbatas pada urutan basa nukleotida yang dikenalinya.
10
restriksi
kemudian divortex. 500 ì l digestion buffer
(Sambrook & Russel 2001). Variasi yang
ditambahkan pada tabung dan dikocok hingga
dihasilkan oleh perbedaan panjang fragmen
homogen lalu diinkubasi semalam pada suhu
yang dipotong oleh enzim restriksi ini dikenal
55 C. Kemudian 500 ì l fenol ditambahkan dan
sebagai
Lenght
dikocok selama ± 20 menit lalu disentrifuse 3
1994).
menit
Urutan
basa
ini
disebut
Restriction
Polymorphism
situs
Fragment
(RFLP)
(Duryadi
o
pada
13.000
rpm.
Supernatan
Gabungan kedua metode tersebut dikenal
dipindahkan ke tabung baru lalu ditambahkan
dengan PCR-RFLP.
500 ì l Chloroform isoamil alkohol (CIAA)
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman
genetik
mencit
rumah
kemudian dikocok selama ± 20 menit. Lalu
M.m
disentrifuse 13.000 rpm selama 3 menit.
castaneus di Jakarta, Bandung dan Surabaya
Supernatan dipindahkan ke tabung baru. Jika
menggunakan metode PCR-RFLP.
sampel berasal dari otot, maka perlakuan
Penelitian ini dilaksanakan mulai Bulan November
2004
sampai
April
2005
di
fenol dan CIAA dilakukan 2 kali. Sebanyak 2 kali volume etanol absolut ditambahkan pada
Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Studi
supernatan lalu dikocok
Ilmu Hayat (PSIH), IPB, Bogor.
terdapat endapan putih DNA. Campuran
perlahan hingga
disentrifuse pada 13.000 rpm selam 5 menit
BAHAN DAN METODE
dan etanol absolut diganti dengan alkohol 70%. Kemudian disentrifuse kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit. Alkohol 70%
Bahan Bahan yang digunakan adalah sampel
dibuang dan endapan dikeringkan atau di
darah dan otot dari mencit rumah (M.m
vacuum. 100 ì l buffer T ris
E DT A (TE)
castaneus) dari beberapa lokasi di Jakarta (10
ditambahkan ke dalam tabung kemudian
ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9
disentrifuse pelan dan diinkubasi pada suhu
ekor) (lampiran 2). Total sampel 30 ekor.
37 C selama 15 menit lalu disimpan dalam
Metode
freezer.
o
Pengambilan sampel. Darah diambil dari
Uji kualitas DNA. DNA yang telah diisolasi
jantung menggunakan syringe yang telah
kemudian dielektroforesis menggunakan gel
berisi ethylene diamine tetra acetic acid
agarose 1.2 % dalam larutan 1xTBE (89 mM
(EDTA) 10% yang kemudian disimpan di suhu
Tris, 89 mM Asam Borat dan 2 mM EDTA, pH
rendah sebelum diisolasi. Sedangkan untuk
8,0) dalam piranti Submarine Electrophoresis
sampel dari otot menggunakan otot yang
(Hoefer).
berasal dari femur M.m castaneus yang sudah
bantuan s inar ultra violet (ë = 300 nm) setelah
dikuliti terlebih dahulu.
gel
Ekstraksi dan isolasi DNA. Ekstraksi fenol adalah prosedur umum yang digunakan
Pengamatan
diwarnai
dengan
dilakukan ethidium
dengan bromide
(0.5mg/ml). Amplifikasi daerah D-loop. Sepasang
untuk isolasi sampel DNA (Sambrook &
primer
Russel 2001). Sampel darah sebanyak 250-
sekuen D-loop dengan metode PCR. Primer
500 ì l dalam tabung eppendorf 1,5 ml
yang digunakan adalah CTD F 5’- TAA TAT
ditambah lysis buffer dengan volume yang
ACT GGT CTT GTA AAC C- 3’ dan CTD R 5’-
sama
GGC TGG CAC GAG ATT TAC CAA CCC- 3’.
dan
dikocok
sampai
homogen.
digunakan
untuk
mengamplifikasi
®
Disentrifuse selama 1 menit pada 6500 rpm.
PCR menggunakan mesin GeneAmp
PCR
E ndapan ditambah dengan 200 ì l rinse buffer
System 2400 (Perkin-Elmer). Kondisi PCR
11
o
pre-denaturasi
pada suhu 94 C selama 5
menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus
unweighted
pair-group
method
using
arithmetic averages (UPGMA).
o
utama yaitu denaturasi pada suhu 94 C o
HASIL DAN PEMBAHASAN
selama 45 detik, annealing pada suhu 52 C o
selama 1 menit, elongasi pada suhu 72 C selama 1 menit yang diulang sebanyak 35 o
siklus dan post-elongasi pada suhu 72 C selama 7 menit.
Hasil Amplifikasi daerah D-loop. Penggandaan in vitro sekuen D-loop pada
Total campuran untuk tiap reaksi PCR
mitokondria M.m castaneus menggunakan
adalah 50 ì l dengan kompos is i sampel DNA 2
primer CTDF yang didesain terletak di tRNA
ì l (10-100 ng), 10X buffer PCR mix 5 ì l, 25
Threonin untuk forwardnya dan CTDR yang
mM MgCl2 3 ì l, 10 mM dNTP mix 1 ì l, 25 pM
terletak
primer CTDF dan primer CTDR masing-
menghasilkan produk sebesar 1384 pasang
mas ing 2 ì l , dan 5 unit / ì l Taq DNA
basa (pb) untuk semua sampel. Hal ini sesuai
polymerase 0.2 ì l (Promega) dan air steril
dengan hasil BLAST GeneBank Database
s ebanyakl 34.8 ì l.
(NCBI) M.m castaneus dengan nomor akses
Pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim
restriksi
yang
digunakan
di
AJ286323
12S
rRNA
(Lampiran
pada
3)
reversenya
dan
AY057792
dalam
(Lampiran 4) yang telah disisipkan sekuen gen
penelitian ini merupakan enzim pemotong 4
tRNA phenil alanin sebesar 68 pb (Lampiran
basa (four-cutter enzyme) yaitu
5). Oleh karena sekuen asli
HaeIII (5’-
tRNA phenil
GG*CC-3’), AluI (5’- AG*CT) dan RsaI (5’-
alanin dari M.m castaneus belum diketahui,
GT*AC-3’) (Promega). Pemotongan dilakukan
maka
dengan cara menambahkan 3.5 ì l air s teril, 1
diambilkan dari sekuen tRNA phenil alanin
ì l Buffer dan 0.5 ì l enzim ke dalam tabung
M.m
eppendorf 0.5 ml yang beris i 5 ì l produk PCR.
NC005089).
Tabung disentrifugasi lemah beberapa detik
tersebut terdiri dari sekuen tRNA
agar campuran merata. Kemudian diinkubasi
prolin, D-loop, tRNA phenil alanin dan 12S
o
sekuen musculus
tRNA
phenil
(GenBank
alaninnya
nomor
akses
Dengan demikian produk PCR threonin,
selama ± 16 jam pada suhu 37 C (Syafitri
rRNA. Besarnya sekuen utuh D-loop M.m
2005).
castaneus adalah sebesar 952 pb.
Analisis hasil PCR-RFLP. Fragmen DNA hasil
PCR-RFLP
dapat
diamati
dengan
elektroforesis menggunakan agarose 1.2% (85 V/ 1-1.5 jam) dengan pewarnaan EtBr. Untuk
Keragaman
D-loop
fragmen
dengan
menggunakan Enzim Restriksi. Untuk mengetahui keragaman produk PCR
mempertajam hasil digunakan PoliAcrylamide
tersebut
Gel Electrophoresis (PAGE) 5.5% (85 V/ 6
menggunakan tiga jenis enzim restriksi yaitu
jam)
HaeIII, AluI dan RsaI yang merupakan enzim
menggunakan
divisualisasikan
buffer
dengan
1X TBE silver
dan
staining.
restriksi
maka
empat
Standar DNA yang digunakan adalah ladder
penggunaan
100 bp (Promega).
adalah
dilakukan
basa.
enzim
dengan
Dasar
restriksi
harapan
dengan
pemilihan
empat
setiap
256
basa pb
Rekonstruksi
ditemukan satu situs restriksi. Maka dalam
dendogram menggunakan program Molecular
1384 pb diharapkan terdapat lima situs
Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) V.3.0
restriksi.
Analisis
(Kumar
et
keragaman.
al.1993)
dengan
metode
12
Pemotongan dengan HaeIII.
Pemotongan dengan AluI.
HaeIII merupakan enzim restriksi yang
AluI merupakan enzim restriksi yang akan
yang akan memotong pada sekuen GG*CC.
memotong pada sekuen AG*CT. Sampel yang
Pada
dipotong dengan AluI menghasilkan tiga pola
ketigapuluh
sampel
yang
dipotong
dengan HaeIII menghasilkan tiga pola potong
yang berbeda yaitu D, E dan F. Pada pola D
A, B dan C.
Pola A menghasilkan empat
hasil pemotongan terdiri dari enam fragmen
fragmen (X1, X4, X5 dan X6). Pola B
(X1, X2, X3, X4, X5 dan X7). Pada pola E
menghasilkan empat fragmen (X1, X3, X5 dan
menghasilkan lima fragmen (X1, X3, X4, X6
X7). Sedangkan pola C hanya menghasilkan
dan
tiga fragmen (X2, X7 dan X8). Total ragam
menghasilkan empat fragmen ( X1, X2, X4
fragmen yang dihasilkan oleh HaeIII adalah
dan
sebanyak delapan fragmen (Tabel 1).
dihasilkan oleh AluI adalah sebanyak delapan
X7). X8).
Sedangkan Total
pada
ragam
pola
fragmen
F
yang
fragmen (Tabel 1). Tabel 1 Pola pemotongan dengan enzim restriksi.
Enzim Restriksi
HaeIII GG*CC
Pemotongan dengan RsaI. RsaI merupakan enzim restriksi yang akan
Hasil pola pemotongan sampel (pb) A
B
C
X1 X4 X5 X6
X1 X3 X5 X7
X2 X7 X8
Ragam & besar fragmen sampel (pb) X1 = 136 X2 = 264 X3 = 283 X4 = 290 X5 = 470 X6 = 488 X7 = 495 X8 = 625
memotong pada sekuen GT*AC. Sampel yang dipotong dengan RsaI menghasilkan tiga pola yang berbeda yaitu G, H dan I. Pada pola G hasil pemotongan terdiri dari tiga fragmen (X1, X7 dan X9). Pola H terdiri dari lima fragmen (X1, X3, X4, X5 dan X8). Pola I terdiri dari tiga fragmen (X2, X6 dan X9). Total ragam fragmen yang dihasilkan oleh RsaI adalah sebanyak sembilan fragmen (Tabel 1). Analisis keragaman haplotipe Semua
data
dianalisis
menggunakan
program MEGA untuk merekonstruksi pohon filogenetik,
maka
didapatkan
sembilan
D
E
F
AluI
X1
X1
X1
X1 = 96
AG*CT
X2 X3 X4 X5 X7
X3 X4 X6 X7
X2 X4 X8
X2 = 123 X3 = 140 X4 = 200 X5 = 277 X6 = 400 X7 = 548 X8 = 965
tiga enzim restriksi. Penentuan haplotipe
haplotipe berdasarkan pemotongan dengan berdasarkan pada pola pemotongan tiap enzim
restriksi,
sehingga
haplotipe
yang
dihasilkan merupakan gabungan tiga pola potong masing-masing enzim (Tabel 2). Haplotipe 1 dan 2 hanya ditemukan pada sampel di wilayah Jakarta dan Bandung.
G
H
I
RsaI
X1
X1
X2
X1 = 140
Sedangkan haplotipe 4 dan 6 ditemukan pada
GT*AC
X7 X9
X3 X4
X6 X9
X2 = 155 X3 = 184
sampel di Bandung dan Surabaya. Haplotipe 5
X4 = 255 X5 = 320
Bandung, sedangkan haplotipe 8 dan 9 hanya
X5 X8
X6 = 445 X7 = 460 X8 = 485 X9 = 784
dan 7 hanya ditemukan pada sampel di terdapat pada sampel di Surabaya. Haplotipe 3 ditemukan pada sampel yang berasal dari ketiga kota tersebut (Tabel 2).
13
Tabel 2 Haplotipe dan penyebarannya
memiliki variasi yang relatif rendah maka daerah
Haplotipe
Total
Penyebaran Haplotipe
D-loop
yang
dengan mendesain primer yang terletak di
Bandung
Surabaya
1. ADG
3
1
0
4
2. ADH
5
4
0
9
3. BEH
2
2
2
6
Tabel 3
4. AEG
0
1
1
2
dengan sekuens acuan
5. BDG
0
1
0
1
6. AEH
0
1
2
3
7. BDH
0
1
0
1
8. BEG
0
0
2
2
9. CFI
0
0
2
2
Total
10
11
9
30
Pembahasan mitokondria
(mtDNA)
hewan
daerah tersebut. Perbandingan hasil PCR-RFLP
Enzim Restriksi
HaeIII GG*CC
merupakan molekul sirkular yang berukuran sekitar 16.000 pb dan diwariskan secara
Ragam & besar fragmen acuan (pb) #
Ragam & besar fragmen sampel (pb)
X1 = 62 X2 = 121 X3 = 229 X4 = 456 X5 = 516
X1 = 136 X2 = 264 X3 = 283 X4 = 290 X5 = 470 X6 = 488
maternal (Ryan et al. 2000). MtDNA berevolusi
X7 = 495 X8 = 625
jauh lebih cepat dibandingkan dengan laju evolusi DNA inti. Tetapi karena pentingnya fungsi mitokondria bagi kehidupan hewan, maka ada faktor-faktor yang menghambat laju evolusinya.
Brown et al. 1979 mengatakan
AluI AG*CT
X1 = 91 X2 = 116 X3 = 188 X4 = 445 X5 = 544
X1 = 96 X2 = 123 X3 = 140 X4 = 200 X5 = 277 X6 = 400 X7 = 548 X8 = 965
RsaI GT*AC
X1 = 8 X2 = 17
X1 = 140 X2 = 155
X3 = 17 X4 = 35
X3 = 184 X4 = 255
X5 = 121 X6 = 392
X5 = 320 X6 = 445
X7= 794
X7 = 460 X8 = 485 X9 = 784
bahwa semakin penting fungsi suatu gen atau protein maka
laju evolusi gen atau protein
tersebut akan berjalan lebih lambat. Evolusi molekular
didominasi oleh mutasi–mutasi
yang terakumulasi dengan laju yang stabil pada garis keturunan yang masih bertahan hidup (Vigilant et al. 1991). MtDNA sebagian besar terdiri atas 90% sekuen
yang
menyandikan,
sedangkan
sekuen D-loop merupakan sekuen yang tidak menyandikan. daerah
Daerah
non-coding
D-loop
utama
merupakan
pada
mtDNA.
Sekuen D-loop memiliki peran dalam proses replikasi utas berat ( Heavy strand) dan transkripsi mtDNA (Clayton 1982).
tumpuan
kemungkinan keragaman dapat terdeteksi
Jakarta
DNA
menjadi
D-loop
terletak di antara gen tRNA prolina dan tRNA Phenil alanin (Anderson et al. 1982). Oleh karena daerah tRNA threonin, prolin, phenil alanin dan 12S rRNA relatif conserved dan
# Hasil BLAST AY057792 dan AJ286323 dengan phenil alanin M.m castaneus no. akses NC005089
14
Dari hasil amplifikasi D-loop dengan
lamban. Sedangkan pada daerah tepinya
menggunakan sepasang primer CTDF dan
terjadi mutasi titik, indel, dan sejumlah
CTDR menghasilkan produk PCR yang
pengulangan tandem (Variable number of
seragam dan sesuai dengan besar sekuen
tandem repeats / VNTRs) yang
M.m castaneus acuan. Dapat disimpulkan
akumulasinya terjadi dengan cepat.
bahwa pada sekuen daerah target tidak mengalami insersi atau
delesi panjang
laju
Adanya perbedaan pola pemotongan pada
tiap-tiap
enzim
dijelaskan
berukuran sama, yaitu sebesar 1384 pb.
kehilangan salah satu atau beberapa situs
bahwa
daerah
D-loop
memiliki
penambahan
dapat
sehingga produk PCR ketiga puluh sampel Douzery dan Randi 1997 menyebutkan
dengan
restriksi
atau
restriksi karena adanya substitusi basa.
central
Selain itu faktor lain yang menyebabkan
conserved region (CCR) yang diapit oleh
perbedaan pola potong karena adanya adisi
daerah tepi (peripheral) kiri dekat dengan
atau delesi
gen tRNA prolin dan daerah tepi kanan dekat
Perbedaan metilasi pada tiap individu dapat
dengan gen tRNA phenil alanin. Daerah
juga merupakan sumber terjadinya variasi
CCR mengalami mutasi titik, insersi dan
(Brown 1980).
satu atau beberapa basa .
delesi (indel) yang terakumulasi secara
B7 B8 B2
0.060
B1 J1 0 J9
0.060
J8
H-2
J6 J2
0.060
0.064
B9 S4
0.060 0.060
B 11 J4
0.060
0.166
H-6
S5
H-7
J5 B4 B 10
H-3
S3
0.040 0.064
0.080 0.080
S9 S2 B5 B3
0.060
0.060
H-8
S8
S1 J1
H-5 H-4
J3
0.350
0.060
J7 B6 S6 S7
0. 05
Gambar 1 Dendogram dari 9 haplotipe
H-1 H-9
15
Vigilant
et
al.
1991
menyatakan
berukuran
600
pb
didapatkan
dari
perbedaan sekuen mtDNA pada daerah D-
penjumlahan fragmen 140 pb dan 460 pb.
loop dapat pula disebabkan karena transisi
Sedangkan pada pola I fragmen 600 pb
dan transversi. Pada simpanse dan manusia
merupakan penjumlahan fragmen 155 pb
pemunculan
transversi
dan 445 pb. Pada pola H fragmen sebesar
memiliki perbandingan 15 : 1. Sehingga dari
759 pb merupakan penjumlahan fragmen
189 individu yang diamati ditemukan 135 tipe
184 pb, 255 pb dan 320 pb. Fragmen 759 pb
mtDNA (daerah D-loop).
disetarakan dengan fragmen 784 pb pada
transisi
dengan
Transisi dan transversi tersebut dapat menerangkan adanya perbedaan letak situs
pola G dan I (Lampiran 8). Adanya
sembilan
haplotipe
yang
restriksi antara M.m castaneus acuan untuk
ditemukan di tiga populasi menunjukkan
masing-masing enzim dengan sampel yang
tingkat polimorfisme yang cukup tinggi pada
ada (Tabel 3). Substitusi basa yang terjadi
M.m castaneus (Gambar 1).
pada
2000 menyebutkan pada M.m domesticus di
mtDNA
dapat
menyebabkan
perbedaan letak situs restriksi
sehingga
Ryan et al.
Irlandia memiliki polimorfisme yang tinggi
besar dan jumlah fragmen yang dihasilkan
karena
dapat
1997
beberapa haplotipe. Dibandingkan dengan
pada manusia laju
populasi di Jakarta dan Surabaya, populasi
substitusi basa di daerah D-loop sebesar 7 x
di kota Bandung memiliki lebih banyak
berbeda-beda.
mengatakan bahwa
Ohno
-8
10 / situs pertahun. Hal
ini
dapat
dalam
satu
sarang
ditemukan
haplotipe yaitu tujuh haplotipe (Tabel 2). Hal dilihat
pada
hasil
ini mungkin disebabkan adanya emigrasi dari
pemotongan dengan ketiga enzim restriksi.
M.m
Pada pola A dan B dengan pemotongan
beradaptasi dengan lingkungan sekitar. Kota
menggunakan enzim HaeIII dapat dilihat
Bandung juga memiliki kondisi cuaca yang
bahwa pembagian menjadi dua blok sebesar
cukup berbeda dibandingkan Kota Jakarta
606 pb dan 778 pb. Pada blok 606 pb
dan Surabaya yang memiliki kondisi cuaca
merupakan penjumlahan dari 136 pb dan
relatif sama. Haplotipe lokal 8 dan 9
470 pb (X1 + X5).
Sedangkan pola C
populasi Surabaya diperkirakan karena daya
merupakan pengecualian yang merupakan
adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan
kemungkinan
sekitar,
terjadinya
substitusi
basa
(Lampiran 6).
castaneus
dari
wilayah
lain
dan
pada
kemungkinan adanya genetic drift
dari wilayah lain ( pulau lain) yang terbawa
Pada pola E dari pemotongan enzim AluI
melalui alat transportasi (kapal laut / feri) dan
meghasilkan fragmen berukuran 400 pb
perbedaan jarak geografis yang cukup jauh
yang merupakan penjumlahan fragmen 123
dari dua populasi lainnya.
pb dan 277 pb pada pola D (penambahan
Ryan et al. 2000, menyebutkan bahwa
situs restriksi). Sedangkan pada pola F
distribusi
fragmen
disebabkan
sebesar
965
pb
merupakan
haplotipe
mtDNA
dapat
karena emigrasi dari suatu
penjumlahan fragmen 140 pb, 277 pb dan
kondisi padat yang menyebabkan suatu
548 pb pada pola D. Dengan demikian pola
individu harus meninggalkan populasinya.
F kehilangan dua situs restriksi (Lampiran 7).
Distribusi haplotipe dapat berubah seiring
RsaI
waktu dan ditemukannya korelasi antara
menghasilkan dua blok fragmen sebesar 784
Pemotongan
dengan
enzim
keragaman sekuen dengan jarak geografis
pb dan 600 pb. Pada pola G fragmen
yang ada. Distribusi mtDNA haplotipe dapat
16
dijelaskan dengan founder effect dan genetic drift.
Boeadi A, Suyanto , S. Adi Soemanto. 1979. Cara
sederhana
mengenal
tikus.
Prosiding lokakarya pengendalian hama
SIMPULAN DAN SARAN
tikus. Bogor : Direktorat Perlindungan Penggandaan
fragmen
DNA
Tanaman.
menggunakan primer CTDF dan CTDR menghasilkan produk sebesar 1384 pb. Dari
Brown WM, George M.JR., Wilson AC. 1979.
hasil pemotongan dengan masing-masing
Rapid evolution of animal mitochondrial
enzim restriksi empat basa HaeIII, AluI dan
DNA. Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 76 (4)
RsaI (single digest) ditemukan sembilan
: 1967-1971.
haplotipe dari ketiga populasi. Populasi
Brown
WM.
1980.
Polymorphism
Jakarta memiliki tiga jenis haplotipe dan
mitochondrial
bukan
lokal.
revealed by restriction endonuclease
Sedangkan populasi Bandung memiliki tujuh
analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77
haplotipe.
(6) : 3605-3609.
merupakan Dua
haplotipe
diantaranya
merupakan
DNA
of
in
human
as
haplotipe lokal, yaitu haplotipe 5 dan 7. Populasi Surabaya memiliki lima haplotipe. Haplotipe 8 dan 9 merupakan haplotipe
Clayton DA. 1982. Replication of animal mitochondrial DNA. Cell 28: 693-705.
lokal. Haplotipe 3 merupakan haplotipe umum karena ditemukan pada sampel yang
Douzery
E,
Randi
mitochondrial
berasal dari ketiga kota tersebut.
E.
control
1997. region
The of
perlu
Cervidae : Evolutionary Patterns and
dilakukan sequensing produk PCR agar data
Phylogenetic content. Mol. Biol. Evol.
yang dihasilkan lebih akurat. Selain itu untuk
14(11) : 1154-1166.
Untuk
penelitian
selanjutnya
mendapatkan data yang lebih variatif maka perlu lebih banyak sampel dari berbagai
Duryadi D. 1994. Peran DNA mitokondria
tempat yang memiliki perbedaan cuaca dan
(mtDNA)
jarak
genetik dan biologi populasi pada
geografis
yang
cukup
signifikan.
dan
dengan
metode
Gene
menghasilkan hasil yang lebih variatif lagi.
DAFTAR PUSTAKA
Gene
of bovine mitochondrial DNA : conserved the
mammalian
mitochondrial genome. J. Mol. Biol. 156 : 683-717.
Bank Database .http :// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer .fcgi?ab=nucleotide&val=16555384 Bank
Database.
http
://
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer. fcgi?ab=nucleotide&val=8919707
Anderson et al. 1982. Complete Sequence of
keragaman
yang
berbeda seperti halnya double digest. Dapat
features
studi
hewan. Hayati 1 (1) : 1-4.
Penambahan jumlah enzim restriksi yang digunakan
dalam
Gene
Bank Database. http. :// www. ebi.ac.uk/cgibin/abfetch?ab=embl&style=htm&id=A B042432
17
Hartwell LH et al., 2000. Genetics from
Vigilant L, Stoneking M, Harpending H,
genes to genomes. New York : Mc
Hawkes K, Wilson AC. 1991. African
Grow Hill.
populations and the evolution of human mitochondrial
Kumar S, Tamura K, Nei M. 1993. MEGA ; Molecular evolutionary genetic analysis version 1.01. USA: The Pennsylvania State Univ. Ohno S. 1997. The ancestor per generation rule
and
three
other
rules
of
mitochondrial inheritance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 8033-8035. Ryan AW, Montgomery I, Duke EJ. 2000. Short
communication
:
Microgeographic distribution of House mouse,
Mus
domesticus
,
Mitochondrial DNA type on farmland in North-East
Ireland.
Biology
and
environment : Proceeding of the royal Irish Acad. 100B (3): 159-163. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory press. Saiki
et
al.
1986.
Specific
enzymatic
amplification of DNA in vitro ; The polymerase chain reaction. Cold spring harbor
symposia
on
quantitative
biology. Silver LM. 1995. Mouse genetics concepts an applications. Oxford : Univ. Pr. Syafitri S. 2005. Keragaman fragmen DNA mitokondria daerah D-loop Rusa Timor (Cervus
timorensis)
asal
Sulawesi
Tenggara. [skripsi]. Bogor : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor .
1503-1507.
DNA.
Science
253:
18
LAMPIRAN
19
Lampiran 1 Pola penyebaran Mus musculus di dunia (Silver 1995)
Penyebaran Mus musculus yang terbagi menjadi empat subspecies : - Mus musculus musculus - Mus musculus domesticus - Mus musculus bactrianus - Mus musculus castaneus
20
Lampiran 2 Daftar sampel NO
NAMA
TEMPAT PENGAMBILAN
1
J1
Pasar Ampera,
2
J2
Rawamangun,
3
J3
Jakarta Timur
4
J4
Pasar Koja Baru,
5
J5
Jakarta Utara
6
J6
Pasar Cempaka Putih,
7
J7
Jakarta Pusat
8
J8
Pasar Tomang, Jakarta Barat
9
J9
Pasar Tebet,
10
J10
Jakarta Selatan
11
B1
Pasar Baru,
12
B2
Bandung Tengah
13
B3
Pasar Kosambi,
14
B4
Bandung Timur
15
B5
16
B6
Pasar Induk Caringin,
17
B7
Bandung Selatan
18
B8
19
B9
Pasar Suci, Bandung Utara
20
B10
Pasar Balubur,
21
B11
Bandung Utara
22
S1
Pasar Genteng, Surabaya Pusat
23
S2
24
S3
Pasar Turi,
25
S4
Surabaya Pusat
26
S5
27
S6
Pasar Rungkut,
28
S7
Surabaya Timur
29
S8
Pasar Genteng,
30
S9
Surabaya Pusat
ASAL SAMPEL
JAKARTA
BANDUNG
SURABAYA
21
Lampiran 3 Hasil BLAST primer forward pada Mus musculus castaneus ORGANISM Mus musculus castaneus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus. AUTHORS Gunduz,I., Tez,C., Malikov,V., Vaziri,A., Polyakov,A.V. and Searle,J.B. TITLE Mitochondrial DNA and chromosomal studies of wild mice (Mus) from Turkey and Iran JOURNAL Heredity 84 (Pt 4), 458-467 (2000) MEDLINE 20307679 PUBMED 10849070 AUTHORS Gunduz,I. TITLE Direct Submission FEATURES source
gene tRNA
gene tRNA
D-loop ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081
ngtcttgata tcaagacatc ttaaactact acattaaact acaacaacta aatgttttaa ctaaatacat gtcataaact atcctccgtg aacttggggg aaatgcgtta tcagcccatg ctttcatcaa gtgaagaatc acataaatgc gcgccaaacc atgtcctgat ttttacaaaa ttaacaa
Location/Qualifiers 1..1087 /organism="Mus musculus castaneus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /strain="wild" /sub_species="castaneus" /db_xref="taxon:10091" /haplotype="casIran.6" /country="Iran:Kerman province" /note="The sequence was obtained from 100% ethanol preserved tail" 1..67 /gene="tRNA-Thr" 1..67 /gene="tRNA-Thr" /product="tRNA-Thr" /evidence=experimental 68..134 /gene="tRNA-Pro" 68..134 /gene="tRNA-Pro" /product="tRNA-Pro" /evidence=experimental 135..1087 /evidence=experimental gtataaatat aagaagaagg tcttgagtac attttcccca tcaacataaa agacatattt caaattaatg cttctcttcc aaaccaacaa tagctaaact tcgcccatac accaacataa catagccgtc attagtccgc tactcaatac ccaaaaacac caattctagt tcatgctccg
tactctggtc aactactccc ataaatttac agcatataag ctgatataca gtgttatctg ttttaaagac atatgactat cccgcccacc gaaactttat gttcccctta ctgtggtgtc aaggcatgag aaaacccaat tgaattttaa taagaacttg agttcccaaa tgaaccaaaa
ttgtaaacct caccaccagc atagtacaat caagtacatt ccatgaatat actaaactga atatctgtgt ccccttcccc aatgcccctc cagacatctg aataagacat atgcatttgg aggacagcac cacctaaggc ctctccaaac aaagacatat atatgactca ctctaatcac
gaaatgaaga acccaaagct agtacatcta aaatcaatga tatattaaat tatacatcat tatctgacat atttggtcta ttctcgctcc gttcttactt ctcgatggta tattttttta acagtctaga taattattca cccccaaccc attattaact tattttagta actctattac
tcttctcttc ggtattctaa tgtatatcgt tatcggtcat acatcaaatt gaatattata acaccataca ttaatctacc gggcccatta cagggccatc tcgggtctaa ttttggccta cgcacctacg tgcttgttag cctcctctta atcaaaccct cttgtaaaaa gcaataaaca
22
Lampiran 4 Hasil BLAST primer reverse pada Mus musculus castaneus ORGANISM Mus musculus castaneus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus. REFERENCE 1 (bases 1 to 956) AUTHORS Lundrigan,B.L., Jansa,S.A. and Tucker,P.K. TITLE Phylogenetic relationships in the genus mus, based on paternally, maternally, and biparentally inherited characters JOURNAL Syst. Biol. 51 (3), 410-431 (2002) MEDLINE 22075680 PUBMED 12079642 REFERENCE 2 (bases 1 to 956) AUTHORS Lundrigan,B.L., Jansa,S.A. and Tucker,P.K. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (27-SEP-2001) Museum of Zoology and Department of Biology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1079, USA FEATURES Location/Qualifiers source 1..956 /organism="Mus musculus castaneus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /sub_species="castaneus" /db_xref="taxon:10091" rRNA 1..956 /product="12S ribosomal RNA" ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901
caaaggtttg tagaccggtg attaaaatag tattaagcaa ccagccaccg ctataaataa taaactcaat tgggattaga atttgccaga ccatctagag aattcagcct gaatcaaaca cattttctta tagtagtaaa cccgtcaccc tgagaggaga
gtcctggcct taaaatccct cttaagacac taaacgaaag cggtcatacg ataaatagaa aacgaaagta taccccacta gaactactag gagcctgttc atataccgcc taaaaacgtt taaaagaaca ttaagaatag tcctcaaatt taagtcgtaa
tataattaat taaacattta cttgcctagc tttgactaag attaacccaa ttaaaatcca attctaatca tgcttagcca ccacagctta tataatcgat atcttcagca aggtcaaggt ttactatacc agagcttaat aaattaaact caaggtaagc
tagaggtaaa cttaaacttt cacaccccca ttatacctct actaattatt acttatatgt tttataatac taaacctaaa aaactcaaag aaaccccgct aaccctaaaa gtagccaatg ctttatgaaa tgaattgagc taacataaat atactggaaa
attacacatg aaggagaggg cgggactcag tagggttggt ttcggcgtaa gaaaattcat acgacagcta taattaaatt gacttggcgg ctacctcacc aggtattaaa aaatgggaag ctaaaggact aatgaagtac aatttctaga gtgtgcttgg
caaacctcca tatcaagcac cagtgataaa aaatttcgtg aacgtgtcaa tgttaggacc agacccaaac taacaaaact tactttatat atctcttgct gtaagcaaaa aaatgggcta aaggaggatt gcacacaccg catccattta aataat
23
Lampiran 5 Sekuens Mus musculus castaneus (hasil BLAST AY057792 dan AJ286323) dengan gen phenil alanin Mus musculus ( no. akses NC005089) Produk PCR sebesar 1384 pb.
121
TRNA-Thr CTD F ngtcttgata gtataaatat tactctggtc ttgtaaacct gaaatgaaga tcttctcttc tRNA-Pro tcaagacatc aagaagaagg aactactccc caccaccagc acccaaagct ggtattctaa D-loop ttaaactact tcttgagtac ataaatttac atagtacaat agtacatcta tgtatatcgt
181
acattaaact attttcccca agcatataag caagtacatt aaatcaatga tatcggtcat
241
acaacaacta tcaacataaa ctgatataca ccatgaatat tatattaaat acatcaaatt
301
aatgttttaa agacatattt gtgttatctg actaaactga tatacatcat gaatattata
361
ctaaatacat caaattaatg ttttaaagac atatctgtgt tatctgacat acaccataca
421
gtcataaact cttctcttcc atatgactat ccccttcccc atttggtcta ttaatctacc
481
atcctccgtg aaaccaacaa cccgcccacc aatgcccctc ttctcgctcc gggcccatta
541
aacttggggg tagctaaact gaaactttat cagacatctg gttcttactt cagggccatc
601
aaatgcgtta tcgcccatac gttcccctta aataagacat ctcgatggta tcgggtataa
661
tcagcccatg accaacataa ctgtggtgtc atgcatttgg tattttttta ttttggccta
721
ctttcatcaa catagccgtc aaggcatgag aggacagcac acagtctaga cgcacctacg
781
gtgaacaatc attagtccgc aaaacccaat cacctaaggc taattattca tgcttgttag
841
acataaatgc tactcaatac tgaattttaa ctctccaaac cccccaaccc cctcctctta
901
gcgccaaacc ccaaaaacac taagaacttg aaagacatat attattaact atcaaaccct
961
atgtcctgat caattctagt agttcccaaa atatgactca tattttagta cttgtaaaaa
1021
1141
ttttacaaaa tcatgctccg tgaaccaaaa ctctaatcac actctattac gcaataaaca tRNA-Phe ttaacaagtt aatgtagctt aataacaaag caaagcactg aaaatgctta gatggataat 12S rRNA tgtatcccat aaacacaaag gtttggtcct ggccttataa ttaattagag gtaaaattac
1201
acatgcaaac ctccatagac cggtgtaaaa tcccttaaac atttacttaa actttaagga
1261
gagggtatca agcacattaa aatagcttaa gacaccttgc ctagccacac ccccacggga
1321
ctcagcagtg ataaatatta agcaataaac gaaagtttga ctaagttata cctcttaggg
1381
ttggtaaatt tcgtgccagc caccg
1 61
1081
HaeIII AluI RsaI
= 5’-gg*cc-3’ = 5’-ag*ct-3’ = 5’-gt*ac-3’
24
Lampiran 6 Hasil dan pola pemotongan dengan HaeIII
A 136 pb
290 pb
470 pb
488 pb
136 pb
283 pb
470 pb
495 pb
B
C 264 pb
A
475 pb
606 pb (136 pb + 470 pb)
625 pb
778 pb (290 pb + 488 pb)
B 606 pb (136 pb + 470 pb)
C
475 pb
778 pb (283 pb + 495 pb)
889 pb (264 + 625 pb)
25
Lampiran 7 Hasil dan pola pemotongan dengan AluI
D
96 pb 123 pb 140 pb 200 pb
277 pb
548 pb
E 96 pb 140 pb
200 pb
96 pb 123 pb pb
200 pb
400 pb
548 pb
F
D 96 pb 123 pb 140 pb E
96 pbpb 140 pb
F 96 pb pb
123 pb
965 pb
200 pb
277 pb
400 pb 200 pb (123 pb + 277pb)
200 pb
548 pb
548 pb
965 pb (140 pb + 277 pb + 548 pb)
26
Lampiran 8 Hasil dan pola pemotongan dengan RsaI
G
140 pb
460 pb
784 pb
H 140 pb 184 pb
255 pb
320 pb
485 pb
I 155 pb
G
445 pb
600 pb ( 140 pb + 460 pb )
H 625 pb (140 pb + 485 pb )
784 pb
784 pb
759 pb ( 184 pb + 255 pb + 320 pb )
I 600 pb (155 pb + 445 pb )
784 pb
27
Lampiran 9 Hasil PAGE 5.5% dengan silver staining
Pemotongan dengan HaeIII
Pemotongan dengan AluI
Pemotongan dengan RsaI
