Analisis Hayati PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIKA SECARA MIKROBIOLOGI
Oleh : Dr. Harmita
Pendahuluan • Aktivitas (potensi) antibiotika dapat ditunjukkan pada
•
kondisi yang sesuai dengan efek daya hambatan terhadap mikroorganisme. Suatu penurunan aktivitas antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi biasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas. Bab ini meringkaskan cara kerja penetapan antibiotika dengan pengujian secara mikrobiologi. Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitu penetapan dengan lempeng-silinder atau “lempeng” dan penetapan dengan cara “tabung” atau turbidimetri
Peralatan • Semua peralatan harus dicuci bersih
sebelum dan sesudah digunakan. Peralatan gelas untuk menyimpan dan memindahkan mikroorganisme uji, disterilkan dengan pemanasan kering atau dengan uap air.
Pengendalian Suhu • Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa tahap penetapan secara mikrobiologi, waktu membiakkan mikroorganisme dan penyiapan inokulanya, selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan tabung. Suhu pada penetapan dengan cara lempeng dipertahankan pada lebih kurang 0,5°C dari suhu yang dipilih. Pengendalian suhu yang lebih dekat (lebih kurang 0,1°C dari suhu yang dipilih) sangat penting untuk inkubasi pada penetapan dengan cara tabung, hal ini dapat diperoleh dengan sirkulasi udara atau air, kapasitas panas dari air yang lebih besar lebih menguntungkan daripada sirkulasi udara.
Spektrofotometer • Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yang
sempit, membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai sumber cahaya panjang gelombang yang dapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 530 nm untuk pengukuran serapan pada pengujian dengan cara tabung. Untuk tujuan tersebut, alat dapat diatur hingga dapat menerima tabung yang digunakan untuk inkubasi dan menggunakan sel yang dimodifikasi yang dilengkapi dengan pipa pembuangan untuk memudahkan pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang mempunyai saluran untuk pengaliran secara sinambung selama pengukuran. Atur serapan dengan blangko untuk serapan nol menggunakan media cair yang jernih tanpa inokula yang disiapkan seperti dinyatakan untuk masing-masing antibiotika, termasuk sejumlah yang sesuai larutan uji dan formaldehida dalam setiap contoh.
Wadah Untuk Penetapan Secara Lempeng-Silinder • Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawan petri kaca atau plastik (lebih kurang 20 mm x 100 mm) yang mempunyai tutup dari bahan yang sesuai. Untuk silinder, gunakan silinder besi tahan karat atau porselen dengan toleransi ukuran masing-masing lebih kurang 0,1 mm; diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi 10 mm. Cuci silinder dengan saksama untuk membersihkan semua residu, kadangkadang diperlukan suatu asam seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat
Wadah Untuk Penetapan Secara Turbidimetri • Untuk penetapan dengan cara tabung reaksi
kaca atau plastik dengan ukuran misalnya 16 mm x 125 mm x atau 18 mm x 150 mm yang panjang, diameter dan ketebalannya relatif seragam serta permukaannya tidak cacat dan tidak tergores. Tabung yang akan ditempatkan pada spektrofotometer harus yang sesuai, tanpa goresan dan tidak cacat. Bersihkan saksama tabung dari semua residu antibiotika dan sisa larutan pembersih, dan sterilkan sebelum digunakan untuk penetapan berikutnya.
Media • Media yang diperlukan untuk penyiapan inokula
mikroorganisme dibuat dari bahan-bahan yang tertera di bawah ini. Sedikit modifikasi dari masing-masing bahan, atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukan dengan syarat media yang dihasilkan mempunyai daya menumbuhkan yang sama atau lebih baik dan memberikan respons kurva baku yang sama. Larutkan bahan-bahan dalam air hingga 1 L, dan atur pH larutan menggunakan natrium hidroksida 1 N atau asam klorida 1 N, hingga sesudah sterilisasi uap air didapatkan pH media sesuai.
Unit dan Baku Pembanding • Potensi antibiotika dinyatakan dalam “unit” atau “µg” aktivitas •
•
antibiotika. Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI) dikalibrasi terhadap baku primer antibiotika yang bersangkutan. Antibiotika BPFI dibuat dan diedarkan oleh instansi yang berwenang. Pengertian “µg” aktivitas berasal dari sediaan antibiotika yang dipilih sebagai baku pembanding yang dianggap secara keseluruhan terdiri dari bahan kimia tunggal, dan oleh karena itu dinyatakan potensi 1000 “µg” per mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metode pembuatan dan pemurnian antibiotika tertentu, aktivitas sediaan dapat lebih dari 1000 “µg” per mg. Karenanya dapat dimengerti bahwa sediaan yang demikian mempunyai aktivitas yang setara dengan jumlah tertentu “µg” baku pembanding asli. Tetapi pada umumnya “µg” aktivitas adalah tepat setara secara numerik dengan µg (bobot) sediaan murni. Kesulitan timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotika terdiri dari bentuk basa bebas dan garamnya, dan “µg” aktivitas dinyatakan untuk salah satu dari bentuk tersebut, bahan antibiotika terdiri dari sejumlah komponen yang memiliki sifat kimia yang sangat mirip tetapi mempunyai aktivitas antibiotika yang berbeda; atau potensi dari satu kelompok antibiotika dinyatakan dengan baku pembanding yang merupakan salah satu antibiotika anggotanya, tetapi sediaan itu sendiri dapat tidak serba sama (heterogen). Dalam hal ini “µg” aktivitas dinyatakan dalam “unit”. “µg”aktivitas harus tidak dianggap sama dengan µg (bobot) dari bahan antibiotika.
Penyiapan Baku • Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah
baku pembanding antibiotika yang ditimbang saksama dan sebelumnya telah dikeringkan seperti yang tertera pada Tabel 2.1, atau seluruh isi satu vial, jika diperlukan, dalam pelarut seperti yang tertera pada tabel 2.1. tersebut, kemudian encerkan hingga kadar yang dikehendaki. Simpan dalam lemari pendingin dan gunakan dalam waktu yang ditentukan. Pada hari penetapan, buat pengenceran dari larutan persediaan 5 atau lebih larutan untuk pengujian dengan kadar perbandingan 1:1,25 untuk penetapan dengan cara lempeng silinder atau lebih kecil untuk penetapan turbidimetri. Gunakan pengencer akhir yang dinyatakan dan urutan kadar dengan dosis tengah yang ditentukan.
Mikroorganisme dan Inokula Mikroorganisme Uji • Mikroorganisme uji untuk setiap antibiotika tertera pada Tabel 2.2 beserta nomor identifikasi American Type Culture Collection (ATCC) yang bersangkutan. Metode penetapan dengan mikroorganisme uji tersebut tertera pada Tabel 2.1. pelihara biakan pada media agar miring dengan kondisi inkubasi seperti tertera pada Tabel 2.3 dan pindahkan setiap minggu pada agar miring yang baru. Untuk Klebsiella pneumoniae gunakan biakan tidak berkapsul.
Penyiapan Inokula • Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan segar
mikroorganisme dari agar miring atau biakan lain ke permukaan 250 ml media agar dalam sebuah botol Roux, kecuali untuk Streptococcus faccium dibiakkan dalam media cair. Sebarkan suspensi secara merata ke atas permukaan agar suspensi dengan bantuan butiran kaca steril dan inkubasikan pada suhu yang ditetapkan selama waktu tertentu. Pada akhir periode inkubasi, buat suspensi persediaan dengan mengumpulkan biakan permukaan ke dalam 50 ml larutan natrium klorida 0,9 % steril kecuali untuk Bleomisin (gunakan 50 ml Media 34)
Cara Pengujian. • Rancangan Penetapan.
Penetapan secara mikrobiologi memperoleh presisi yang meyakinkan melalui pemisahan sumber-sumber penyebab kesalahan potensial serta bias yang relatif besar dengan menggunakan rancangan penetapan yang sesuai. Pada penetapan dengan metode lempeng-silinder, perbandingan pokok dibatasi hubungan pengukuran diameter hambatan antar lempeng, tidak termasuk variasi di antara lempeng pada penyiapannya dan penanganan berikutnya. Untuk melaksanakan penetapan turbidimetri sehingga perbedaan kekeruhan yang diamati akan menggambarkan perbedaan kadar antibiotika, diperlukan keseragaman suhu tabung melalui pengendali termostatik dalam inkubator dan penghindaran bias sistematik dengan penempatan tabung secara acak dalam rak terpisah, setiap rak terdiri dari satu set perlakuan yang lengkap. Perbandingan pokok kemudian dibatasi pada hubungan antara kekeruhan yang diamati pada setiap rak.
Metode Lempeng Silinder • Pada
penyiapan lempeng penetapan menggunakan cawan petri, tuang 21 ml Media 2 dalam masing-masing dari sejumlah cawan yang diperlukan dan biarkan memadat sebagai lapisan dasar yang licin dengan ketebalan seragam, kecuali untuk Amfoterisin B, dan Nistatin, tidak digunakan lapisan dasar yang terpisah
Metode Turbidimetri • Pada hari penetapan, dipakai dosis yang diperlukan dengan
mengencerkan larutan persediaan baku dan setiap larutan uji. Tambahkan 1 ml setiap dosis pada masing-masing 3 tabung reaksi yang telah disiapkan dan tempatkan 3 replikat tabung dengan posisi secara acak pada rak tabung. Secara bersamaan letakkan pada setiap rak 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi 1 ml pengencer tetapi tanpa antibiotika. Setelah selesai semua pengisian larutan (untuk Kandisidin dalam waktu 30 menit ketika air ditambahkan pada larutan persediaan metil sulfoksida), tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam setiap tabung pada rak dan setelah lengkap pengisian rak segera ditempatkan dalam inkubator atau tangas air dengan suhu yang dipertahankan pada 36°C sampai 37,5°C selama 2 jam sampai 4 jam, kecuali untuk Kandisidin (inkubasi pada suhu 27°C sampai 29°C selama 16 jam sampai 18 jam). Setelah inkubasi, tambahkan 0,5 ml larutan formaldehida encer ke dalam setiap tabung pada satu rak dalam waktu yang bersamaan, dan ukur transmitans atau serapan pada 530 nm.
Cara Menghitung Potensi. • Untuk menghitung potensi dari data yang diperoleh
dengan metode lempeng silinder atau turbidimetri dilakukan dengan menggunakan metode garis lurus transformasi log dengan prosedur penyesuaian kuadrat terkecil dan uji linieritas. Bila sejumlah penetapan dari bahan uji yang sama dilakukan menggunakan kurva baku yang sama, hitung koefisien variasi dari hasil semua penetapan bahan uji. Bila lebih dari satu penetapan dilakukan untuk bahan uji yang sama dengan kurva baku yang berbeda, buat rata-rata dari dua atau lebih nilai potensi
Pemasangan silinder / cakram filter pada lapisan agar dalam cawan petri • Letakkan silinder besi tahan karat atau cakram kertas dengan jarak satu sama lain + 20-25 mm.
Cara meneteskan larutan uji (U) dan larutan standar(S) • Urutan penetesan seperti pada gambar. • Teteskan setiap pengenceran 20 µl pada silinder atau cakram kertas (diameter 6 mm) • Pada waktu meneteskan pada silinder besi tahan karat jangan kena dinding silinder. • Inkubasi selama 18-24 jam suhu 37°C.
• Cara 1: Untuk pengujian 3 dosis setiap sediaaan Jumlah zona kons. rendah Jumlah zona kons. menengah Jumlah zona kons. tinggi Jumlah sediaan Kontras linier
b=
LS + LU (d − 1) Inh
YS =
S nd
Standar (S)
Uji (U)
S1 S2 S3 S1+S2+S3=S S3-S1=LS
U1 U2 U3 U1+U2+U3=U U3-U1=LU
YU =
MU =
U nd
YU − YS b
• Rasio Potensi RU = antilog MU • Potensi = RU x 100% Keterangan : b = slope regresi zona log kons. semua sediaan d = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3 h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2 n = banyaknya penggandaan setiap perlakuan = 6 I = interval log konsentrasi berdampingan (log S1-log S2 = log S2- log S3)
• Cara 2 :
Untuk 2 dosis setiap sediaan U1 & S1 = diameter hambatan dosis tinggi U2 & S2 = diameter hambatan dosis rendah
U (U + U ) − (S1 + S2 ) log = 1 2 × log 4 S (U1 + S1 ) − (U 2 + S2 )
↓↓ log P S1 = 1 μg 4x ==>log 4 S2 = 4 μg S1 = 1 μg 2x ==>log 2 S2 = 2 μg
U1 & S1 = diameter hambatan dosis tinggi U2 & S2 = diameter hambatan dosis rendah
Cara 4 Dengan 3 dosis atau 4 dosis setiap sediaan Larutan uji Dibuat larutan uji menggunakan pelarut yang sesuai untuk uji potensial sehingga diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100 μg/ml (100 ppm) Encerkan larutan stok ini hingga diperoleh larutan dengan kadar seperti di bawah ini: U8 0,2 ppm U4 0,1 ppm U2 0,05 ppm U1 0,025 ppm Larutan sampel Siapkan larutan sampel yang konsentrasinya berada di antara konsentrasi larutan uji S8 ± 0,2 ppm S4 ± 0,1 ppm S2 ± 0,05 ppm S1 ± 0,025 ppm
• Cara 3 :
Untuk 2 dosis setiap sediaan Potensi = antilog (F/E x log KT/KR) x potensi standar (dalam μg/g atau %) E = 1/2 (ST – SR + BT – BR) F = 1/2 (ST + SR – BT – BR) ST = rata-rata zona hambatan larutan sampel tinggi SR = rata-rata zona hambatan larutan sampel rendah BT = rata-rata zona hambatan larutan baku tinggi BR = rata-rata zona hambatan larutan baku rendah KT = konsentrasi tinggi KR = konsentrasi rendah Contoh uji potensi untuk 2 dosis setiap sediaan U1 = 25 mm S1 = 24,8 mm U2 = 20 mm S2 = 20 mm KT = 10 μg/ml KR = 5 μg/ml
Cara penetapan potensi. • Lakukan uji menggunakan cawan petri yang diisi
•
•
dengan 4 konsentrasi larutan uji (U1, U2, U4, U8) dan konsentrasi larutan sampel (S1, S2, S4, S8). Jarak masing-masing cakram tidak kurang dari 30 mm, karena diduga konsentrasi yang dijarakkan akan memberi diameter hambatan sekitar 10-13 mm. Lakukan inkubasi selama 24 jam.
Cara perhitungan 1. Untuk 3 dosis setiap sediaan log P =
(U 1 + U 2 + U 4 ) − (S1 + S 2 + S 4 ) × log 3 (U 4 + S 4 ) − (U 1 + S1 )
atau =
(U 2 + U 4 + U 8 ) − (S 2 + S 4 + S 8 ) × log 3 (U 8 + S8 ) − (U 2 + S 2 )
2. Untuk 4 dosis setiap sediaan log P =
(U1 + U 2 + U 4 + U 8 ) − (S1 + S2 + S4 + S8 ) x log 4 (U 4 + U 8 + S4 + S8 ) − (U1 + U 2 + S1 + S2 )
Con’d • Perhitungan potensi antibiotika secara turbidimetri Rumus : L = 3a + H=
2b + c - e 5
3e + 2d + c - a 5
L = Harga serapan (A) yang terendah yang dihasilkan kosentrasi terendah pada kurva kalibrasi H = Harga serapan (A) tertinggi yang boleh dihasilkan oleh konsentrasi pada kurva kalibrasi a, b, c, d, e = Harga serapan yang dihasilkan dari konsentrasi terendah (a) sampai konsentrasi tertinggi (e) Dengan memasukkan harga serapan dari sampel ke kurva kalibrasi akan diperoleh potensi (µg/ml) dari sampel.
