AMINOKYSELINY
R
Obecná struktura
STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN 1. IZOLACE (jen v některých případech) 2. HYDROLÝZA • kyselá hydrolýza pomocí HCl ( c = 5 mol.dm-3) klasicky: 105 - 120°C, 18 - 24 h, inertní atmosféra, někdy přídavek thioglykolové kyseliny nově: mikrovlnný ohřev (trvá minuty)
)
destrukce některých AA za podminek hydrolýzy - tryptofan, sirné aminokyseliny, amidy aminokyselin (částečně serin, threonin)
Stanovení sirných aminokyselin ª
Kyselá hydrolýza – oxidace kyselinou permravenčí (kyselá hydrolýza)
CH2 CH COOH SH NH2
3 HCOOOH H-COOH - H-COOH
cystein
CH2 CH2 CH COOH S CH3 NH2 methionin
CH2
CH COOH
SO3H NH2 cysteová kyselina
2 HCOOOH H-COOH - 2 H-COOH
CH2 CH2 CH COOH O S CH3 NH2 O methioninsulfon
1
Stanovení tryprofanu ª po alkalické hydrolýze, nejčastěji Ba(OH)2 ( c = 5 mol.dm-3), 125 - 130 °C, 24 hodin Stanovení Stanovení asparaginu a glutaminu ª enzymovou hydrolýzou - pepsin - trypsin - papain - peptidasy
SEPARACE A KVANTIFIKACE AMINOKYSELIN
Chromatografie v plošném uspořádání KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE Plynová chromatografie Elektromigrační metody
Dělení aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě
2
DĚLENÍ AMINOKYSELIN POMOCÍ (HP)LC Různ ůzné typy separačních mechanismů
¾ Chromatografie (nízkotlaká) na měničích iontů silně kyselé katexy - mobilní fáze: pufry se vzrůstající hodnotou pH a iontovou sílou - nižší pH - neutrální a kyselé aminokyseliny - vzrůst pH - bazické aminokyseliny automatický analyzátor aminokyselin
¾ Chromatografie v reverzní fázi často předkolonová derivatizace
¾ Iontově párová chromatografie typicky pokolonová derivatitace - snadná automatizace, snazší manipulace se vzorkem
(B)
A = log P0/P ÎA = log 1/T
A = εbc
ÎA
= log 100/%T Î A = 2 - log %T
3
Otázka: jak detekovat aminokyseliny ? • • •
absorbce v UV - jen aromatické aminokyseliny fluorescence - tryptofan změna indexu lomu (refraktometrie) - nespecifické, málo citlivé
Ö potřeba derivatizace 1. TVORBA DERIVÁTŮ PRO (HP)LC základní aspekty zvažované při volbě derivatizační metody Dobrá LC separace analytů Snadnost přípravy derivátu, jeho stabilita, možnost automatizace Citlivost a selektivita detekce
A. Derivatizace před separací - prekolonová Ö Požadována tvorba stabilních projektů A1. fluoreskující produkty R SO 2Cl
SO 2NH CH COOH +
H3C
NH2 CH COOH R
N CH3
H3C
N CH3
dansylderivát
dansylchlorid
SO3H +
NH2 CH COOH R
CH3 4-toluensulfonová kyselina
SO2NH CH COOH R
CH3 tosylderivát
AQC (6-aminoquinolyl Nhydroxysuccinimidylcarbamate) - vznikají stabilní deriváty absorbující též v UV
4
A2. UVUV- absorbující produkty R NH CH COOH
F O 2N
O 2N
NH2 CH COOH R
+
+ HF NO 2
NO 2 2, 4-dinitrofluorbenzen
2, 4-dinitrofenylderivát
Fenylisothiokyanát
B. derivatizace po separaci - pokolonová Ömusí být velmi rychlá, stabilita derivátu není rozhodující Nejčastější činidla: ¾ OPA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i prekolonově) ¾ ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra
Nejčastější činidla: ¾ OPA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i prekolonově) ¾ ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra O
O R CH COOH NH2
C + C
OH
C
OH
C
H OH
C O
C + C
+ R-CH=O + NH3 + +CO2
O
O ninhydrin O(trioxohydrindenhydrát)O
C
H OH
OH OH
+ NH3
O dioxohydroxyhydringen O
OH C N
+ 3 H2O
C O
O
5
2. TVORBA DERIVÁTŮ PRO GC požadavek: těkavé produkty Ö nutné derivatizovat obě funkční skupiny A. estery NN-acylaminokyselin esterifikační činidla (derivatizace (derivatizace COOH): COOH) isopropanol, isobutanol, n-butanol, metanol, isobutanol…+ 3M HCl N-acylační činidla (derivatizace (derivatizace aminoskupiny): aminoskupiny): anhydridy kyselin - pentafluor- propionové, heptafluormáselné, trifluoroctové R CH COOH NH2
+ R´OH
R CH COOR´ R´´(CO) O 2 NH2
R CH COOR´ NHCOR´´
+ R´´COOH
B. Trimethylsilylestery N-trimethylsilyl aminokyselin R CH COOH + (CH3)3SiX
R CH COOSi(CH3)3
+ HX
NH Si(CH3)3
NH2
ANALÝZA AMINOKYSELIN specielní aspekty volné - izolace po okyselení (obtíže s rozpustností leucinu, cysteinu aj.) fDůkaz aminokyselin a) Reakce s kovovými ionty Æ barevné komplexy s Cu2+, Fe3+ aj.
R CH CO NH2 Me
O
b) Reakce s ninhydrinem (Streckerova degradace aminokyselin)
6
A. STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU AMINOKYSELIN f Formolová titrace R CH COOH NH2
+ H2C=O
R CH COOH
další produkty
NH CH2OH
f Titrace karboxylové skupiny alkalimetricky f Manometrická van Slykeova metoda R CH COOH NH2
+ HNO2
R CH COOH + N2 + H2O
OH
3 HNO2 → HNO3 + 2 NO + H2O 2 NO + O2 + H2O → HNO3 + HNO2 HNO2 + HNO3 + 2 NaOH → NaNO2 + NaNO3 + 2 H2O
4. Spektrofotometrické metody f Reakce s ninhydrinem - měření fialového zbarvení viz důkaz aminokyselin f Reakce s 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou kyselinou NO2
NO2 O2N
SO3H + NH2 CH COOH NO2
R
O2N
SO2 NH CH COOH + H2O NO2
R
B. STANOVENÍ NĚKTERÝCH POTRAVINÁŘSKY DŮLEŽITÝCH AMINOKYSELIN
•
Stanovení lysinu CELKOVÝ OBSAH
f Spektrofotometrická metoda -vznik komplexu s Cu (II) a derivatizace ε-aminoskupiny 2,4dinitrofluorbenzenem, redukce vzniklého produktu
7
2 CH2 (CH2)3 CH COOH NH2
NH2
Cu2+ - 2 H+
NH2 (CH2)4 CH C O
O
NH2
O C Cu
O
H2N
CH (CH2)4 NH2
+ NO2 2
O2N
F
- 2 HF NO2 O2N
NH (CH2)4 CH C
O C Cu
O
O
O
NH2
H2N
CH (CH2)4 NH
NO2
NO2
NO2 O2N
NH (CH2)4 CH COOH NH2
f Enzymová metoda • L-lysinkarboxylasa, EC 4.1.1.18. (= lysindekarboxylasa) Æ měření uvolněného oxidu uhličitého či kadaverinu CH2 (CH2)3 CH COOH
CH2 (CH2)3 CH2
NH2
NH2
NH2 lysin
NH2
+ CO2
kadaverin
CHARAKTERIZACE ENZYMOVÝCH METOD
&
• reakce jsou specifické Ö není třeba selektivně izolovat analyt ze vzorku Öjednoduché provedení specifita enzymu - ve vztahu k typu katalyzované reakce - pro daný substrát, který je konvertován
'
• nelze získat informaci o jednotlivých komponentách spektra sloučenin, měří se jednotlivé analyty
8
y Využitelný lysin f Spektrofotometrická metoda NO2 R NH CH CO R´
+
(CH2)4 NH2
O2N
R NH CH CO R´ (CH2)4 NH
NO2
F
H2O
R NH CH COOH (CH2)4 NH
(HCl)
NO2
NO2
NO2
y Stanovení hydroxyprolinu f Spektrofotometrická metoda H3C OH
H2O2 N H
COOH
- 2 H2O
H3C
N
H3C
H2N CH C CH CH COOH
CH OH CH O
N
H3C - H2O
OH
CH N CH C CH CH COOH OH
Využití: Stanovení obsahu kolagenu v masných výrobcích (příliš vysoký obsah kolagenu je známkou nadměrného obsahu pojivové tkáně) Obsah kolagenu se získá vynásobením obsahu hydroxyprolinu faktorem 8.0
y Stanovení tryptofanu f Spektrofotometrická metoda měření intenzity zbarvení s N, N - dimethylaminobenzaldehydem v přítomnosti HNO2 y Stanovení glutamové kyseliny f Enzymové metody Varianta A CH2 CH2 CH COOH COOH
NH2
L-glutamát 1-karboxylasa
CH2 CH2 CH2 COOH
+ CO2
NH2
možno stanovit 4-aminomáselnou kyselinu nebo CO2
9
Varianta B L-glutamát: NAD oxidoreduktasa CH2 CH2 CH COOH COOH
NAD+, H2O
NH2
CH2 CH2 CH COOH COOH
+ NADH + NH4+
NH2
možno stanovit 2oxoglutarovou kyselinu nebo NADH (přímo v ultrafialové oblasti spektra nebo po následné enzymové reakci
1.
2.
NADH + H+ + diaforasa-FAD (red. NAD: lipoamid oxidoreduktasa, EC 1.6.1.3.) → NAD+ + diaforasa-FADH2 diaforasa-FADH2 + tetrazolinová sůl → diaforasa-FAD + formazan N R3
C
N N
N
+
R1
X- XH
tetrazoliová sùl
R3
C
COOH
N
N
R2
formazan L-glutamát: FAD oxidoreduktasa
CH2 CH2 CH COOH
NH R1
N
2 H
R2
FAD, O2, H2O
NH2
CH2 CH2 CH COOH COOH
O
+ FADH2 + H2O2 + NH3
možno stanovit 2-oxoglutarovou kys., kyslík nebo peroxid vodíku
y Stanovení sirných aminokyselin • Titrační argentometrická metoda 2 R-SH + 2 AgNO3 → R-S-S-R + 2 Ag + HNO3 redukce disulfidů : R-S-S-R + Na2SO3 + H2O → 2 R-SH + Na2SO4 • Spektrofotometrická metoda CO CH CH3 CH2N + CO CH
CH2 CH COOH SH NH2
CO CH2 CH3 CH2N CO CH SCH2 CH COOH
N-ethylmaleinimid
NH2
redukce disulfidů: R-S-S-R + NaCN + H2O → 2 RSH + NaCNO
10
y Stanovení různých aminokyselin • • • •
Prolin (ninhydrin, HCOOH) Arginin (8-hydroxycholin, HCOOH) Kreatin, resp. kreatinfosfát (biacetyl, 2-naftol; enzymové stanovení) Kreatinin (pikrová kyselina, enzymové stanovení)
ANALÝZA PEPTIDŮ Karnosin, anserin: histidylalaninové peptidy reakce s 2, 4-dinitrofluorbenzenem 2, 6-dioxopiperaziny ( cyklické dipeptidy) chromatografické metody Vyšší peptidy - chromatografické metody, LC/MS
Další dusíkaté sloučeniny • nukleotidy (volné nukleotidy), nukleosidy, báze nukleových kyselin • aminy, biogenní aminy • dusitany, dusičnany
Stanovení nukleotidů v hovězích játrech (HPLC/UV, ionex)
11
