Alkalmazott transzgénikus
állattechnológiák TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSA HUMÁN BETEGSÉGMODELL CÉLJÁBÓL
BŐSZE ZSUZSANNA NAIK-MBK 2016
MIÉRT JELENT A NYÚL MINT MODELLÁLLAT VALÓS ALTENATÍVÁT AZ EGÉRHEZ KÉPEST ? • A NYÚL-FŐEMLŐS FILOGENETIKAI TÁVOLSÁG AZONOS A RÁGCSÁLÓFŐEMLŐSSEL • A RÁGCSÁLÓ SZEKVENCIÁK EVOLÚCIÓJA GYORSABB EZÉRT A NYÚL GÉNEK KÖZELEBB ÁLLNAK A HUMÁNHOZ
• A NYÚL LÉNYEGESEN KÖZELEBB ÁLL AZ EMBERHEZ MINT BÁRMELY MÁS HÁZIÁLLAT
GÉN SZABÁLYOZÁS
Transzlációs kutatások, gyógyszerkutatás
TR NYÚL MINT HUMÁN BETEGSÉGEK MODELLÁLLATA I. LIPID ANYAGCSERE, ÉRELMESZESEDÉS • RÉGÓTA ISMERT HOGY A KOLESZTERIN GAZDAG DIÉTA SULYOS HIPERKOLESZTERIMÉNIÁT ÉS GYORSAN KIFEJLŐDŐ ÉRELMESZESEDÉST OKOZ ÚJZÉLANDI FEHÉR NYULAKBANLABORATÓRIUMI EGÉRTÖRZSEKBEN NEM • TÖBB OLYAN SPONTÁN MUTÁCIÓT HORDOZÓ NYÚLTÖRZSET IRTAK LE ÉS TARTANAK FENN, AMELYEK KÜLÖNBÖZŐ HUMÁN LIPID ANYAGCSERE BETEGSÉGEK MODELLJEI • WATANABE ÖRÖKLŐDŐEN HIPERLIPIDÉMIÁS NYULAK: CSALÁDI HIPERKOLESZTEROLÉMIA MODELLJEI- AZ ILYEN NYULAK SZÍVINFARKTUST KAPNAK 2 ÉVES KORIG EMBEREKNÉL A BETEGSÉG KIALAKULÁSÁÉRT FELELŐS HOMOZIGÓTA MUTÁNS GÉNT HORDOZÓ GYEREKEK A NORMÁLISNÁL 3-7X MAGASABB KOLESZTEROL SZINTŰEK ÉS GYAKRAN INFARKUST KAPNAK MÉG TINÉDZSER KORUKBAN
Normal
Normal
WHHL
Normál
Mérsékelt
Súlyos
HUMÁN BETEGSÉG MODELLÁLLATA II. LIPID ANYAGCSERE, ÉRELMESZESEDÉS • A NYÚL LIPID ANYAGCSERÉJE, ENZIMJEI, A LIPOPROTEINEK KÉMIAI ÖSSZETÉTELE NAGYMÉRTÉKBEN HASONLÓ AZ EMBERÉHEZ, MÍG AZ EGÉRÉ KÜLÖNBÖZIK ATTÓL
• NAGY SZÁMÚ TRANSZGENIKUS NYÚLTÖRZSET ÁLLITOTTAK ELŐ, MELYEKET EGYMÁSSAL ILLETVE A MUTÁNS NYÚLTÖRZSEKKEL KERESZTEZVE VIZSGÁLHATÓAK A LIPIDANYAGCSERE FEHÉRJEFEHÉRJE KÖLCSÖNHATÁSAI
MAGAS KOLESZTERIN TARTALMÚ DIÉTÁVAL KIVÁLTOTT ATHEROSZKELRÓZIS HUMAN apo(a) TRANSZGENIKUS NYULAKBAN / Fan and Watanabe 2003/
Lipid festés az aortában
Koronáriák csökkent átmérője transzgenikus nyulakban
HUMÁN BETEGSÉG MODELLÁLLATA SZIVIZOM SZERKEZET- MŰKÖDÉS, SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK
• A NYÚL SZÍV- SZEMBEN AZ EGÉRÉVEL - MÉRETÉNÉL ÉS FEHÉRJE ÖSSZETÉTELÉNÉL FOGVA IS JOBBAN HASONLÓ AZ EMBERÉHEZ, EZÉRT • KÖNNYEN ADAPTÁLHATÓAK A HUMÁN CÉLRA KIFEJLESZTETT MŰSZEREK • A SZÍVIZOM ÖSSZEHÚZÓDÁSOK IDŐTARTAMA KÖZELEBB ÁLL AZ EMBERÉHEZ
SZIVIZOM SZERKEZET- MŰKÖDÉS, SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK • A SZÍVKAMRA FAL FELÉPÍTÉSÉBEN EMBERBEN ÉS NYÚLBAN -MIOZIN NEHÉZ LÁNC VAN TÖBBSÉGBEN, MÍG AZ EGÉRBEN -MIOZIN • A -MIOZIN MUTÁCIÓJA EMBERBEN ÖRÖKLŐDŐ SZÍVNAGYOBBODÁST OKOZ- MELYNEK MODELLEZÉSÉRE TRANSZGENIKUS NYULAKAT ÁLLÍTOTTAK ELŐ • A MUTÁNS -MIOZINT HORDOZÓ TRANSZGENIKUS NYULAK FENOTÍPUSA NAGYMÉRTÉKBEN AZONOS AZ EMBERÉVEL, EZÉRT ALKALMAS KLINIKAI VIZSGÁLATOKRA, PL. DOPPLER ANALIZIS A SZIVIZOMÖSSZEHÚZÓDÁSOK VIZSGÁLATÁRA, GYÓGYSZERKIPRÓBÁLÁSRA
EGY PÉLDA SZÍVIZOMSZERKEZET MEGVÁLTOZATÁSÁRA: MUTÁNS HUMÁN TROPONIN1- T TERMELŐ TRANSZGENIKUS NYULAK ELŐÁLLÍTÁSA Familiar hypertrophic cardiomyopathy (FHC)- modell Mutáns troponin 1 (arg/gly csere) megnövekedett Ca2+ érzékenységet okoz emberben, majd kamrai tachykardia, fibrilláció, hirtelen szívhalál Transzgénben: nyúl béta miozin promóter: szívkamra specifikus, kópiaszám függő expresszió Egy tr vonal a normál troponin1-el Három tr vonal a mutánssal
Sanbe et al. Circulation 111. 2330. 2005
MUTÁNS HUMÁN TROPONIN1- T TERMELŐ TRANSZGENIKUS NYULAK SZÍVIZOMSZERKEZETE Sanbe et al. Circulation 111. 2330. 2005
Magas tr kópiaszám = 40-50%-nál nagyobb mutáns fehérje arány = egy hetes kor körüli elhalálozás szívműködési zavar következtében ! Alacsony kópiaszám /2/ = 28% mutáns fehérje, fiatalon tünetmentes Másfél kétéves korban fokális fibrózis, izomsejtek random elrendeződése, kamra fal megvastagodás A normál troponin 1 túltermeltetése tünetmentes!
TRANSZGENIKUS NYÚLMODELLEK SZÍVRITMUS ZAVAROKRA ÉS HIRTELEN HALÁLRA
• •
AZ EGÉR SZÍV 10x GYORSABBAN VER MINT AZ EMBER A NYÚL SZÍVBEN Ca 2+ ÁRAMOK KONTRAKCIÓKOR HASONLATOSABBAK AZ EMBERÉHEZ
•
HUMÁN ÉS FELNŐTT NYÚL PITVAR ALFA MIOZIN NEHÉZ LÁNCOT, MÍG A KAMRA BÉTA MIOZIN NEHÉZ LÁNCOT TERMEL, AZ EGÉRBAN CSAK ALFA MIOZIN VAN
•
A SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS TACHYKARDIÁK MELYEK GYAKRAN HIRTELEN SZÍVHALÁLHOZ VEZETNEK TR EGÉRMODELLEKEN NEM TAPASZTALHATÓAK
VERSUS
SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation 118. 2246. 2008. LONG QT SZINDRÓMA: ÖRÖKLŐDŐ BEETEGSÉG, MELYET AZ ECG QT INTERVALLUM MEGHOSSZABBODÁSA, KAMRAI TACHYKARDIA ÉS FIATAL KORI HIRTELEN SZÍVHALÁL JELLEMEZ A REPOLARIZÁCIÓBAN RÉSZT VEVŐ K+ CSATORNA ALKOTÓ FEHÉRJÉK MUTÁCIÓI OKOZZÁK
LQT 1 ÉS LQT 2 TIPUSÚ BETEGSÉGEKET MODELLEZTEK TR NYULAKBAN
SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation 118. 2246. 2008.
TRANSZGÉN: NYÚL BÉTA MIOZIN PROMÓTER ÉS MUTÁNS HUMÁN CSATORNAFEHÉRJE cDNS-e
SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation 118. 2246. 2008. Extrasystole in LQT2 rabbit
Kamrai tachykardia LQT2
Normál nyúl kamrai tachykardia
Az LQT egy speciális esete: a reporalizációs tartalék csökkenése • A reporalizációs tartalék: az ioncsatornák egymást helyettesítő képessége • Oka: öröklött v. szerzett (gyógyszer szedés következménye) • A gyógyszerkísérleteket érintetlen reporalizációs tartalékkal rendelkező alanyokon végzik • Olyan aritmiát előrejelző tesztre lenne szükség,ahol mérhető különbséget okoz a repolarizációs tartalék megváltozása, ehhez új állatmodell kell
ARITMIA ELŐREJELZÉS 1. HOSSZABBODÁS MÉRTÉKE alapján
Pl: 70% -val több aritmiát előre jelezhet
10%-os QT megnyúlás
Vagy 67%os QT variabilitás 2. HOSSZ VÁLTOZATOSSÁGA alapján
KÉSŐI EGYENIRÁNYÍTÓI KÁLIUM CSATORNA LASSÚ KOMPONENSE (IKS) A platófázisban 2. fázisában kapcsol be Alfa alegység:
pórust alkotó fehérjék
Béta alegység: a pórust SZABÁLYOZÓ:
KCNE1 fehérje
alegység:
pórust alkotó fehérjék
TRANSZMEMBRÁN FEHÉRJE A PÓLUS AKTIVITÁSÁÉRT – INAKTIVITÁSÁÉRT FELEL
TRANSZGÉN -MHC promoter 4533 bp Nyúl, béta miozin promóter
KCNE1 407 bp
humán
Kamra specifikus expresszió
G52R
(James et al., 2000)
pA
A létrehozott KCNE1 mutáció tesztelése CHO sejtvonalban
G52R KCNE1 (mutáns)
KCNE1 60 mV 40 mV
20 mV
0mV
K. Odening Univ Clinic Freiburg
A CHO sejteket transzfektáltak: alfa alegységgel és a G52R-KCNE1 vagy a KCNE1-vel,
mivel a rendszerben NEM VOLT másik ioncsatorna. Így jól látszik mutáció okozta hatás.
1 vonal Tg.
endogén
+Humán
4 alapító
+ AGY
SZÍVKAMRA SPECIFIKUS EXPRESSZIÓ
+ SIMA I. + PITVAR + KAMRA
ÜLTETETT EMBRIÓK: 466 db
EXPRESSZIÓ: RNS (RT-PCR)
+ HAR.I.
EXPRESSZIÓ: DNS
EXPRESSZIÓ: FEHÉRJE IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS (simple western, Nanopro 1000)
Western blot 600
nyúl KCNE1
500 400
25kDa
RELATIVE BAND INTENSITY
1,5
1
0,5
0
(Ellenanyag: (Abcam: 1:2000) (human-KCNE1)
humán G52R -KCNE1
300 200 100 0
Tg nyúl szív 4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
minta
pI
terület %
nyúl KCNE1
4,88
100
humán mutáns
0,00
0,0
nyúl KCNE1
4,88
37,49
humán mutáns
5,13
62,51
pI
ÉLETTANI HATÁS: QT variabilitás kontroll
G52R-KCNE1 Szűkült repol. tartalék A 2. ioncsatorna gátolt (IKr+IKs)
1 ioncsatorna gátolt (IKs) gyógyszer nélkül
gyógyszer nélkül
+ gyógyszer (ioncsatorna gátló)
+ gyógyszer (ioncsatorna gátló)
1. Gyógyszer nélkül is nagyobb a QT variabilitása 2. Gyógyszer (másik ioncsatornát elcsendesít) növeli QT variabilitást
ÉLETTANI HATÁS
Q-T HOSSZ NÖVEKEDÉS
Q
T
ARITMIÁK gyakorisága
Transzgenikus nyúl mint a retina degeneráció modellje Kondo és mtsai. 2009
• A retina pálcikák és csapok progressziv degenerációja 1:4000 gyakoriság • Számos gén mutációja okozhatja, leggyakoribb a rodopszin domináns negatív mutációja (25-40%) • A nyúl nagy szeme fontos a kezelések kifejlesztésében
150 kb hosszú BAC klón,az 5. exonban mutáció Red/ET BAC rekombinációval
BAC klón tisztítása PFGE-vel és Southern analízis az alapítók detektálására
Immunhisztológia a pálcikák és csapok kimutatására
A 48 hetes transzgenikus nyulak retinájából hiányoznak a pálcikák
GFP NYÚL • A ZÖLD FLUORESZCENS FEHÉRJÉT MINDEN SEJTJÜKBEN TERMELŐ NYULAK UV FÉNNYEL MEGVILÁGÍTVA ZÖLDEK (Boulanger et al. 2002) •
A GFP NYULAKAT EGYEBEK KÖZÖTT RECEHÁRTYA ÁTÜLTETÉS KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLJÁK
• A GFP NYÚL /ALBA/ MŰVÉSZI TELJESÍTMÉNYEKRE ÖSZTÖNZÖTT SZÁMOS MŰVÉSZT http://www.ekac.org/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor • HATÁSÁRA SZÉLESKÖRŰ VITA BONTAKOZOTT KI FRANCIAORSZÁGBAN A GMO ÁLLATOK SZEREPÉRŐL ÉS ELFOGADOTTSÁGÁRÓL
Fényképalbum szerző: Bősze Zsuzsa
