Aktivitas Isolat Buah Mangifera casturi Kosterm. Sebagai Imunomodulator Secara In-Vitro

P ro sid ing Sem ina r Na siona l & Wo rkshop “Pe rkemba ngan Te rki ni Sa in s Fa rma si & K l in i k 5” | Padang , 6 -7 No vembe r 2015

Aktivitas Isolat Buah Mangifera casturi Kosterm. Sebagai Imunomodulator Secara In-Vitro (The

Isolate Activity Immunomodulator)

of

Mangifera

casturi

Kosterm

Fruits

As

In-Vitro

Sutomo1*; Subagus Wahyuono2; & Erna Prawita S.2; & A. Yuswanto3 1Program

Studi Famasi Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 3Bagian Kimia Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2Bagian

*Corresponding email: [email protected] ABSTRAK Tumbuhan M. casturi merupakan salah satu tumbuhan endemik Kalimantan yang keberadaannya sudah mulai langka. Eksplorasi senyawa aktif dari buah M. casturi masih belum banyak dilakukan, termasuk uji aktivitasnya sebagai imunomodulator. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi senyawa dari buah M. casturi dan uji aktivitasnya sebagai imunomodulator. Uji aktivitas imunomodulator dari senyawa hasil isolasi dilakukan secara in-vitro sesuai dengan metode Leijh dkk. Parameter aktivitas imunomodulator didasarkan pada kemampuan makrofag memfagositosis latex beads melalui hitungan rasio fagositosis dan index fagosistosis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rasio fagositosis isolat dari buah M. casturi pada konsentrasi (12,5; 25,0; dan 50,0)µg/mL signifikan terhadap kontrol negatifnya (P<0.05). Analisis terhadap index fagositosis menunjukkan bahwa isolat buah M. casturi pada konsentrasi 12,5 µg/mL sigifikan terhadap kontrol negatif (P<0.05). Isolat buah M. casturi bersifat imunostimulan. Kata Kunci: Mangifera casturi, isolat, imunomodulator, makrofag, in-vitro PENDAHULUAN World

2005 sebesar Rp. 2,9 triliun, Tahun 2009

Health

(WHO)

sebesar Rp. 5,2 triliun, dan pada Tahun 2010

memperkirakan penggunaan obat bahan alam

mencapai Rp. 7,2 triliun. Amerika Serikat

mencapai 80% dari jumlah penduduk di dunia.

menjadi pemasok terbesar obat di pasar

Menurut

domestik, disusul oleh Malaysia, Korea Selatan,

Charles

Organization

Saerang

(Ketua

Asosiasi

Gabungan Pengusaha Obat Tradisional), tahun

dan China (Kusdriana, 2012).

2009 omset industri jamu mencapai Rp. 8,5

Indonesia mempunyai keanekaragaman

triliun dan Tahun 2010 meningkat hingga Rp. 10

komparatif terhadap tumbuhan yang sebagian

triliun. Omset industri jamu per Januari sampai

bersifat endemik dan dapat dimanfaatkan

Juni 2011 mencapai Rp. 5,6 triliun, meningkat

sebagai bahan obat. Salah satu tumbuhan

10% dibandingkan periode sebelumnya, yaitu

endemik

Rp. 5 triliun. Persentase pertumbuhan obat

Masyarakat

herbal Tahun 2003 sebesar Rp. 2 triliun, Tahun

(Mangifera casturi Kosterm.). Tumbuhan ini

dan

menjadi

Kalimantan

tumbuhan adalah

khas kasturi

260


meskipun sudah mulai langka, tetapi dapat

M. casturi dipotong-potong kecil, dikeringkan

tumbuh baik di beberapa daerah di Kalimantan.

oven (suhu 500C). Simplisia kering diserbukkan

Buah kasturi diolah oleh masyarakat menjadi

sesuai dengan derajad halus yang ditetapkan

jus, dan secara ilmiah telah dibuktikan sebagai

selanjutnya dilakukan ekstraksi.

antioksidan (Edyson, et al., 2008, Sutomo, et al., 2014). Ekstrak metanol daun kasturi dilaporkan memiliki

aktivitas

sebagai

inflamasi

Bahan yang digunakan meliputi : etanol

(Sanjaya, et al., 2009). Walaupun belum banyak

(p.a), metanol (pa), asam asetat anhidrida (p.a),

penelitian

H2SO4,

terhadap

buah

anti

Bahan Kimia dan Pendukung

kasturi,

tetapi

kloroform

(p.a),

n-heksana

(p.a),

beberapa famili anacardiaceae memiliki manfaat

etilasetat (p.a), Amonium hidroksida, HCl,

sebagai obat. Kim, et al., (2010) melaporkan

serium sulfat, kalium bromida, FeCl3, silika gel

adanya efek dari ekstrak etanol daging buah dan

60 for column chromatography (Merck), silika

kulit Mangifera indica sebagai antioksidan dan

gel 60 GF254 for thin layer chromatrography

antiproliferatif. Ekstrak dekok Mangifera indica

(Merck), silika gel 60 PF254 for preparative

dosis 50 – 250 mg/kgBB dapat menghambat

layer chromatography (Merck), akuades, 1,1-

aktivitas

difenil-2-pikrilhidrazil

makrofag

(mengurangi

jumlah

(DPPH),

latex

beads

makrofag pada eksudat peritoneal) (Garcia, et

diameter 3 μm (sigma chem.Co.), Roswell Park

al., 2002).

Memorial

Penelitian ini akan melakukan isolasi senyawa

dari

aktivitasnya

buah

sebagai

M.

casturi

dan

imunomodulator.

uji Dari

Institute

Phosphate

(RPMI)

buffered

saline

1640

(Sigma),

(PBS),

plat

kromatografi lapis tipis (KLT), aquadest, giemsa 20% b/v.

studi pustaka dilaporkan bahwa senyawa yang terindikasi sebagai antioksidan ternyata juga memiliki aktivitas sebagai imunomodulator. Senyawa-senyawa tersebut diantaranya adalah apigenin (golongan flavonoid) (Romanova, et al., 2001 dan Kumar, et al., 2011), sinomenine (golongan alkaloid) (Kumar, et al., 2011 dan Li, et

al.,

2009),

andrographolide

(golongan

terpenoid) (Trivedi, at al., 2007, Wang, et al., 2010, Vasu, 2010, dan Kumar, 2011). Diperlukan eksplorasi senyawa kimia dalam buah M. casturi untuk

memastikan

jennis

senyawa

Hewan Uji Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit galur Balb/C berumur 2-4 bulan, berat badan 20-25 g. Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit diadaptasikan terlebih dahulu selama

kurang

lebih

satu

minggu

untuk

penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan

berat

badan

serta

menyeragamkan

makanannya.

yang

dikandungnya..

Alat Alat yang digunakan meliputi : neraca

METODE PENELITIAN Bahan Tumbuhan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah M.casturi) masak yang diperoleh dari Kalimantan Selatan. Daging bersama kulit buah

analitik, blender, seperangkat alat maserasi, erlenmeyer, rotary vakum evaporasi, pipet ukur, labu

ukur,

corong

pisah,

alat-alat

gelas,

seperangkat alat KLT, kromatografi vakum cair (KVC), seperangkat alat kromatografi lapis tipis

261


preparatif

(KLTP),

seperangkat

alat

dipilih pada bagian yang tidak berlemak dan

kromatografi kolom, Freezer, lemari asam, Oven,

jauh dari usus. Jarum yang berisi bahan aspirasi

kapiler, lampu ultra violet 254 nm dan 366 nm,

diletakkan pada gelas becker yang berisi es,

inkubator 5% CO2, sumuran, mikroskop, FT-IR,

kemudian suspensi tersebut dimasukkan ke

microplate,

mikropipet,

tabung sentrifugasi. Aspirat disentrifugasi pada

hemositometer, mikroskop cahaya, laminary

1.200 rpm 40C selama 10 menit. Supernatan

flow hood.

dibuang, kemudian ditambahkan 3 ml medium

sentrifuga,

komplit pada pellet yang didapat. Jumlah sel Ekstraksi

dihitung

Dua kilogram serbuk simplisia buah M. casturi

diekstraksi

diresuspensikan

hemositometer dengan

kemudian

medium

komplit

metode

sehingga didapat suspensi sel dengan kepadatan

adalah

2,5x106/ml. Suspensi sel yang telah dihitung

metanol pa hingga semua zat tersari. Ekstrak

dikultur pada plate 24 yang telah diberi

dipekatkan dengan rotary evaporator hingga

coverslips bulat, setiap sumuran 200 μl (5x105

didapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental di

sel). Inkubasikan dalam inkubator CO2 5%,

pindahkan dalam cawan porselin dan sisa

370C selama 30 mnt, kemudian ditambahkan

metanol diuapkan dengan suhu terkontrol

medium

hingga pelarut dinyatakan habis.

diinkubasikan lagi selama 2 jam. Sel dicuci dg

maserasi.

Pelarut

menggunakan

dengan

yang

digunakan

komplit

1

ml/sumuran

dan

RPMI 2 x kemudian ditambhkan medium Isolasi dan Identifikasi

komplit 1 ml/sumuran dan inkubasi dilanjutkan

Isolasi dilakukan terhadap salah satu senyawa

hingga 24 jam.

dari ekstrak buah M. casturi menggunakan kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi

Uji Fagositosis Makrofag Dengan Lateks

lapis tipis preparatif (KLTP). dan kromatografi

Beads

kolom

(KK).

Identifikasi

struktur

kimia

Uji kemampuan fagositosis non spesifik

menggunakan spektroskopi FT-IR, NMR, DEPT,

dilakukan in-vitro dengan menggunakan lateks

dan LCMS.

beads diameter 3 μm (sigma chem.Co.). Lateks beads

Linearitas Kurva Baku Hewan

uji

disuspensikan

dalam

PBS

sehingga

didapat konsentrasi 2,2 x 107/ml. Isolat (mencit)

dianastesi

ditambahkan dalam media RPMI 400 μL dengan

menggunakan kloroform untuk selanjutnya

beberapa konsentrasi, yaitu 25 μg/mL, 50

dilakukan pembedahan. Mencit ditelentangkan,

μg/mL,

kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan

menggunakan kontrol media pelarut DMSO

selubung peritoneumnya degan alkohol 70%

0,0025%. Makrofag peritonium yang dikultur

v/b, kemudian disuntikan 10 ml RPMI dingin ke

sehari sebelumnya dicuci 2 kali dengan RPMI,

rongga peritoneum, ditunggu 3 menit sambil

ditambahkan suspensi lateks 200 μl/sumuran

diguling-gulingkan

Cairan

dan diinkubasikan selama 60 menit pada 370C,

peritoneal dikeluarkan dari rongga peritonium

CO2 5% . Sel kemudian dicuci dengan PBS 3 kali

dengan cara menekan organ dalam dengan 2

untuk

jari, cairan di aspirasi dengan jarum suntik,

difagositosis

secara

perlahan.

100

μg/mL,

menghilangkan dan

dan

200

μg/mL

partikel

yang

tidak

dikeringkan

pada

suhu 262


ruangan dan difiksasi dangan metanol absolud.

didapatkan 8 bercak (gambar 1a). Hasil isolasi

Setelah kering coverslips dipulas dengan Giemsa

terhadap senyawa buah M. casturi didapatkan

20% b/v selama 30 menit. Dicuci dengan air

senyawa tunggal dengan nilai HRf 40 (gambar

suling, diangkat dari sumuran kultur dan

1b).

dikeringkan pada suhu kamar. Persentasi sel

Uji aktivitas imunomodulator dari isolat

yang memfagositosis partikel lateks dihitung

menunjukkan

adanya

respon

stimulasi

dari 100 sel yang diperiksa dengan mikroskop

makrofag terhadap fagositasi latek beads. Pada

cahaya. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali

konsentrasi 6,25 µg/mL dan 12,5 µg/mL isolat

(Leijh, et al., 1986).

menunjukkan peningkatan stimulasi makrofag dalam memfagositasi latex tetapi menurun

HASIL DAN DISKUSI

kembali

setelah

konsentrasi

ditingkatkan

Serbuk simplisia buah M. casturi (2,0 kg)

menjadi 25,0; 50,0; dan 100,0 µg/mL (tabel 1

hasil maserasi didapatkan ekstrak sebanyak

dan gambar 3). Stimulasi makrofag terhadap

0,76 kg (37,9%) berwarna hijau tua, rasa agak

fagositasi

pahit dengan aroma yang khas. Uji kualitatif

menempelnya atau tertelannya partikel latex

senyawa kimia dari ekstrak metanol dan

beads kedalam sel makrofag (gambar 2).

senyawa

hasil

isolasi

menggunakan

latex

bead

ditandai

dengan

KLT

Gambar 1. a) kromatogram ekstrak metanol dan b) kromatogram senyawa hasil isolasi

Gambar 2. a) Fagositasi makrofag terhadap latex bead (kontrol) dan b) Fagositasi makrofag terhadap latex bead (isolat)

263


Tabel 1. Persentase makrofag aktif yang memfagositasi latex setelah pemberian isolat Konsentrasi (µg/mL) 6,25 12,50 25,00 50,00 100,00 Kontrol (-)

Gambar 3.

Rasio Fagositasi (%) (mean ± SD) 31,33 ± 3,52 36,00 ± 12,00 33,66 ± 4,09 32,00 ± 1,00 24,66 ± 1,33 13,33 ± 0,88

N 3 3 3 3 3 3

Indek Fagositasi (mean ± SD) 48,00 ± 6,92 58,50 ± 9,85 50,00 ± 8,31 48,66 ± 5,27 30,66 ± 2,68 14,66 ± 0,93

Boxplot hubungan antara konsentrasi dengan rasio fagositasi makrofag dan index fagositasi setelah pemberian isolat

Pemberian senyawa hasil isolasi dengan

yaitu efek meningkat setelah diberikan hingga

konsentrasi yang lebih besar secara invitro

konsentrasi

dapat

kembali setelah diberikan dengan konsentrasi

menekan

memfagosit

jumlah

latex.

makrofag

Terjadinya

yang

penurunan

tersebut

selanjutnya

menurun

yang lebih besar.

aktivitas makrofag dapat disebabkan karena sifat dari senyawa yang bersifat toksik terhadap

Interpretasi Spektrum Inframerah dan

sel makrofag setelah melampaui konsentrasi

NMR - DEPT

optimum analisis

dari sampel yang diberikan. Hasil pada

spektroskopi

yang

Interpretasi spektrum FT-IR didasarkan pada

diberikan dengan konsentrasi 12,5; 25,0; dan

pita-pita serapan gugus fungsi yang sangat

50,0 µg/mL berdampak signifikan terhadap RF,

spesifik pada bilangan gelombang (ṽ) tertentu.

tetapi untuk parameter IF efek yang signifikan

Spektrum infra merah dengan puncak pita

terjadi pada konsentrasi 12,5 µg/mL. Uji

serapan (vmax) yang luas pada 3427.45 cm-1

aktivitas dari isolat menunjukkan bahwa efek

menunjukkan adanya gugus hidroksi (-OH).

optimun terjadi pada konsentrasi 12,5 µg/mL

Serapan puncak pita yang kuat pada 2960.94,

diketahui

kepercayaan

Isolat murni dianalisis menggunakan

95%

(P<0,05)

ANOVA

13C-

bahwa

isolat

2

FT-IR

dalam

pelet

KBr.

264


2938.35, dan 2869.21cm-1 mengidikasikan

serapan dengan intensitas lemah yang muncul

adanya gugus C-H alifatik streching. Puncak pita

pada

daerah

1641.94

cm-1

menunjukkan adanya gugus C = C

1. Simplisia buah kasturi (Mangefera casturi

terisolasi. Puncak pita serapan (medium) yang

Kosterm.) dapat diekstraksi dengan baik

muncul pada vmax 1464.34 cm-1 menunjukkan

menggunakan pelarut metanol.

adanya kelompok gugus CH2 sedangkan puncak

2. Senyawa terisolasi merupakan golongan

pita serapan pada 1056.99 cm-1 menunjukkan

terpenoid dengan memiliki gugus hidroksi

adanya gugus cycloalkane (Pateh, et al., 2009;

(-OH), C-H alifatik streching, C = C

Kamboj & Saluja, 2011).

terisolasi, CH2, dan cycloalkan dengan 3

Interpretasi spektrum 13C-NMR - DEPT

atom karbon quarterner (C), 9 atom metin

dapat diketahui bahwa isolat mengandung 3

(CH), 11 atom metilen (CH2), dan 6 atom

atom karbon quarterner (C), 9 atom metin (CH),

metil (CH3).

11 atom metilen (CH2), dan 6 atom metil (CH3)

3. Isolat

memiliki

potensi

sebagai

.Hasil analisis kualitatif, senyawa terisolasi

imunomodulator dimana pada dosis 12,5;

merupakan golongan terpenoid.

25,0; dan 50,0 µg/mL secara in-vitro menunjukkan

efek

yang

signifikan

KESIMPULAN

(P<0,05) dibandingkan dengan kontrol

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat

negatifnya.

diambil suatu kesimpulan antara lain : DAFTAR PUSTAKA Edyson, Fujiyati, and Yasmina, A., (2008). Pengaruh Antioksidan Jus Daging Buah Kasturi (Mangifera casturi) Terhadap Senyawa Karbonil Pada Tikus Putih (Rattus novergicus) Galur Wistar Yang Diinduksi Radang, J. Kedokteran dan Kesehatan 1 (7), 45 – 51 Garcia, D., Delgado, R., Ubeira, F.M., and Leiro, J., (2002). Modulation of Rat Macrophage Function by the Mangifera indica L. Extracts Vimang and Mangiferin, International immunology, (2), 797-806. Kamboj, A., and Saluja, A.K., (2011). Isolation stigmasterol and β-sitosterol from petroleum ether extract of aerial parts of Ageratum conyzoides (Asteraceae), International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 1 (3), 94-96. Kim, H., Moon, J.Y., Kim, H., Lee, D., Cho, M., Choi, K., Kim, Y.S., Mosadduk, A., and Cho, S.K., (2010). Antioxidant and Antiproliferative Activities of Mango (Mangifera indica L.) Flesh and Peel, Food Chemistry (121), 429-436. Kumar, D., Arya, V., Kaur, R., and Bhat, Z.A., (2012). A review of immunomodulators in the Indian traditional health care system, J. Microbiology, Immunology and Infection , 45, 165–184. Kusdriana, H.D., (2012). Daftar Peraturan Obat Tradisional Di Indonesia.

Li, X., Zhou, Y., Liu, Y., Guo, M., Zhu, Q., Xie, Y., and Fan, Z., (2009). Preparation and evaluation of sinomenine spray, J. Chinese Pharmaceutical Sciences, 18 (1), 43 – 48. Leijh, P.C.J., Furth, R.V., and Swet, T.L.V., (1986). in vitro determination of phagocytosis and intracellular killing by polymorphonuclear and mononuclear phagocytes dalam Weir, D.M., Cellular immunology, Vol 2., backwell scientific publication, london. Pateh, U.U., Haruna, A.K., Garba, M., Iliya, I., Sule, I.M., Abubakar, M.S., and Ambi, A.A., (2009). Isolation of stigmasterol, β-sitosterol, and 2hydroxyhexadecanoic acid methyl ester from the rhizomes of Stylochiton lancifolius Pyer and Kotchy (Araceae), Nigerian Journal of Pharmaceutical Sciences, 1 (7), 19-25 Romanová, D., Vachálková, A., Cipák, L., Ovesná, Z., and Rauko, P., (2001). Study of antioxidant effect of apigenin, luteolin and quercetin by DNA protective method, Neoplasma, 48 (2), 104 – 107. Sanjaya, L, Sutomo, and Ratnapuri, P.H., (2009). Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Kasturi (Mangifera casturi) Terhadap Mencit (Mus musculus) Yang Diinduksi Karagenin, Laporan Penelitian, Universitas Lambung Mangkurat, Banjarmasin.

265


Sutomo, Wahyuono, S., Setyowati, E.P., Rianto, S., and Yuswanto, A., (2014). Antioxidant Activity Assay of Extracts and Active Fractions of Kasturi fruit (Mangifera casturi Kosterm.) Using 1, 1-diphenyl-2picrylhydrazyl Method. Journal of Natural Products. (7), 124-130 Trivedi, N.P., Rawal, U.M., and Patel, B.P., (2007). Hepatoprotective effect of Andrographolide Against Hexachlorocyclohexane-induced Oxidative Injuri, diakses 25 Juni 2012,

Vasu, S., Palaniyappan, V., and Badami, S., (2010). A novel microwave-assisted extraction for the isolation of andrographolide from Andrographis paniculata and its in vitro antioxidant activity, Natural Product Research, 24, 1560 – 1567. Wang, H.W., Liu, Y.Q., Wei, S.L., Yan, Z.J., and Lu, K., (2010). Comparison of Microwave-Assisted and Conventional Hydrodistillation in the Extraction of Essential Oils from Mango (Mangifera indica L.) Flowers. Molecules, 15, 7715-7723.

266

Aktivitas Isolat Buah Mangifera casturi Kosterm. Sebagai Imunomodulator Secara In-Vitro

Recommend Documents